Регулирование содержания жира

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается регулирования содержания жира в организме. Для этого осуществляют стабилизацию альфа субъединицы индуцируемого гипоксией факторного белка (HIFα). Для стабилизации HIFα вводят эффективные количества соединения, ингибирующего активность HIF гидроксилазы. Изобретения обеспечивают уменьшение образования и отложения жира за счет регулирования его метаболизма. 9 н. и 14 з.п. ф-лы, 11 ил.

 

В настоящей заявка заявлен приоритет предварительной патентной заявки США с порядковым номером 60/431351, поданной 6 декабря 2002 года; предварительной патентной заявки США с порядковым номером 60/476331, поданной 6 июня 2003 года; и предварительной патентной заявки США с порядковым номером 60/476726, поданной 6 июня 2003 года, каждая из которых приводится здесь в виде ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гомеостазу и метаболизму жира и регулированию веса тела.

Предпосылки создания изобретения

Ожирение, обычно определяемое в виде показателя массы тела (BMI) с величиной, равной 30 или выше, представляет собой основную проблему здоровья, особенно в индустриально развитых странах. Подсчитано, что в настоящее время ожирению подвержено 250 миллионов человек среди взрослого населения, и ожидается, что это количество существенно возрастет, как только подростки с чрезмерным весом достигнут возраста взрослых людей, страдающих ожирением. Как отмечалось выше, ожирение связывают со многими опасными для здоровья явлениями, включающими повышенный риск развития диабета и болезни сердца. Было показано, в частности, что абдоминальное ожирение, распространение избыточной жировой ткани в абдоминальной области, коррелируются с диабетом, заболеванием сердца, например, метаболическим синдромом. Избыточное содержание жира коррелируется с повышенной возможностью сердечного приступа, инсульта или другого типа сердечно-сосудистого заболевания; высоким давлением крови, высоким содержанием холестерина, диабетом; раком, включая постклимактерический рак молочной железы и рак матки, толстой кишки и почки; артритом, желчно-каменными заболеваниями, апноэ во сне и появлением астмы у взрослых людей. Существует, таким образом, необходимость в данной области в эффективном средстве для регулирования метаболизма жира и осуществимых способах для достижения снижения веса тела и сведения к минимуму опасности развития или прогрессирования сопутствующих состояний.

Ввиду многочисленных опасных состояний, связанных с измененным или нарушенным метаболизмом жира и гомеостазом жира, увеличением частоты ожирения и нерегулируемого увеличения веса, существует необходимость в способах регулирования метаболизма жира. Кроме того, в данной области существует необходимость в способах регулирования веса тела путем регулирования продуцирования, утилизации и накопления жира. Кроме того, в данной области существует необходимость в способах и соединениях для лечения ожирения.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и соединениям для регулирования метаболизма жира в организме человека, достижения гомеостаза жира, регулирования веса тела, снижения жировых накоплений и индуцирования потери веса у субъекта. Представлены также способы и соединения для лечения или профилактики ожирения, включая ожирение, стимулированное диетой, ожирение, связанное с диабетом, и т.д.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, субъектом является клетка, ткань или орган. В других вариантах настоящего изобретения субъектом является животное, предпочтительно, млекопитающее, более предпочтительно, человек. Когда субъектом является клетка, в изобретении конкретно рассматривают тот факт, что клетка может быть изолированной клеткой, либо прокариотической или эукариотической клеткой. В случае, когда субъектом является ткань, изобретение конкретно рассматривает и эндогенные ткани, и ткани in vitro, например, ткани, выращенные в культуре. В предпочтительных вариантах, субъектом является животное, в частности, животное млекопитающего вида, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь и вид примата. В наиболее предпочтительном варианте, субъектом является человек.

В настоящем изобретении представлены способы регулирования метаболизма жира у субъекта. В одном из аспектов изобретения, способы настоящего изобретения включают регулирование метаболизма жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, регулируя таким образом метаболизм жира у субъекта. В различных аспектах изобретения, HIFα представляет собой HIF-1α, HIF-2α или HIF-3α. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, стабилизирование субъединицы HIFα включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность, таким образом стабилизируя HIFα.

Стабилизацию HIFα можно осуществлять любым из способов, доступных специалисту в данной области, и эта стабилизация может включать использование любого агента, который взаимодействует с HIFα, связывает HIFα, или модифицирует HIFα, или может включать использование факторов, которые взаимодействуют с HIFα, включая, например, ферменты, для которых HIFα является субстратом. В конкретных аспектах, в настоящем изобретении представлено создание конститутивно устойчивого варианта HIFα, например, устойчивых HIF мутеинов и т.д., или полинуклеотида, кодирующего такой вариант. В другом аспекте, в настоящем изобретении рассматривают тот факт, что стабилизирование HIFα включает введение агента, который стабилизирует HIFα. Агент может состоять из полинуклеотидов; полипептидов; антител; других белков; углеводов; жиров; липидов и органических и неорганических веществ, например, небольших молекул и т.д. В предпочтительном варианте, в настоящем изобретении представлено стабилизирование HIFα, например, у субъекта путем введения субъекту агента, который стабилизирует HIFα, где агент представляет собой соединение, например, низкомолекулярное соединение и т.д., которое стабилизирует HIFα.

В настоящем изобретении, кроме того, представлены способы регулирования метаболизма жира у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, таким образом, регулируя метаболизм жира у субъекта. В одном из аспектов изобретения, соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В предпочтительном аспекте изобретения, соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF пролилгидроксилазную активность. В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения, HIF гидроксилазу выбирают из группы, состоящей из EGLN1, EGLN2 и EGLN3.

В настоящем изобретении, кроме того, представлены способы регулирования процесса метаболизма жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта или путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым регулируя процесс метаболизма жира у субъекта. В различных вариантах настоящего изобретения, процесс метаболизма жира выбирают из группы, состоящей, например, из поглощения жира, транспорта жира, накопления жира, процессинга жира, утилизации жира и синтеза жира.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, представлены способы изменения экспрессии регуляторного фактора жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта или путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым изменяя экспрессию регуляторного фактора жира у субъекта.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, представлен способ увеличения экспрессии регуляторного фактора жира у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта или путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым увеличивая экспрессию регуляторного фактора жира у субъекта. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, регуляторный фактор жира выбирают из группы, состоящей из лептина, аполипопротеина A-IV, цитозольной ацил-СоА-тиоэстеразы-1, связующего белка инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1, карнитин-ацетилтрансферазы и PAI-1. В конкретном аспекте настоящего изобретения, увеличение экспрессии регуляторного фактора жира у субъекта представляет собой непрерывное увеличение.

Представлены, кроме того, способы изменения экспрессии адипогенных факторов. В одном из вариантов осуществления изобретения, настоящее изобретение включает способы увеличения экспрессии DEC1/Stra 13 у субъекта, включающие стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым уменьшая экспрессию DEC1/Stra 13 у субъекта. В другом варианте осуществления изобретения, представлены способы снижения экспрессии пролифератором пероксисомы активированного рецептора (PPAR)-γ у субъекта, спосо6, включающий стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту соединения настоящего изобретения, тем самым уменьшая экспрессию (PPAR)-γ у субъекта.

В настоящем изобретении представлены способы достижения гомеостаза жира у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают достижение гомеостаза жира у субъекта, путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым достигая гомеостаза жира у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения представляют достижение гомеостаза жира у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым достигая гомеостаза жира у субъекта.

В настоящем изобретении представлены способы регулирования веса тела у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают регулирование веса тела у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым регулируя вес тела у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают регулирование веса тела у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым регулируя вес тела у субъекта.

В настоящем изобретении представлены способы снижения содержания жира в организме у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают снижение содержания жира в организме у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым достигая снижения содержания жира в организме у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают снижение содержания жира в организме у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым снижая содержание жира в организме у субъекта. В различных аспектах настоящего изобретения, жир в организме у субъекта представляет собой накопленный или отложенный жир, и снижение его содержания представляет собой снижение содержания накопленного жира (т.е. жировых накоплений). В других аспектах настоящего изобретения, применяют способы профилактики накопления или отложения жира, например, профилактики увеличения количества накопленного жира. В других аспектах настоящего изобретения, жир в организме у субъекта представляет собой висцеральный жир или абдоминальный жир.

В настоящем изобретении представлены способы индуцирования потери веса у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают индуцирование потери веса у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым индуцируя потерю веса. В другом аспекте, способы настоящего изобретения содержат индуцирование потери веса у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым индуцируя потерю веса. В предпочтительном аспекте изобретения, соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, представлены способы индуцирования потери веса у субъекта без сопутствующей потери веса мышц. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, потеря веса является зависимой от дозы.

В настоящем изобретении представлены способы лечения или профилактики ожирения у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают лечение или профилактику ожирения у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым осуществляя лечение или профилактику ожирения. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают лечение или профилактику ожирения у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым осуществляя лечение или профилактику ожирения. В конкретных аспектах настоящего изобретения предполагается, что ожирение является ожирением, индуцируемым диетой. В других аспектах настоящего изобретения, ожирение ассоциируют с диабетом, например, ожирение как фактор риска развития диабета, или ожирение, которое развивается вместе с прогрессированием заболевания или является результатом прогрессирования заболевания.

В настоящем изобретении представлены способы снижения потребления кислорода у субъекта. В одном из аспектов, способы настоящего изобретения включают снижение потребления кислорода у субъекта путем стабилизирования HIFα у субъекта, тем самым снижая потребление кислорода у субъекта. В другом аспекте, способы настоящего изобретения включают снижение потребления кислорода у субъекта путем введения субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым снижая потребление кислорода у субъекта. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, способами изобретения снижают потребность кислорода у субъекта. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, субъект представляет собой клетку, ткань, орган, систему, содержащую множество органов, или целый организм, включая животное, предпочтительно, млекопитающее, наиболее предпочтительно, человека. Кроме того, способы настоящего изобретения можно использовать, например, для снижения потребности в кислороде и увеличения метаболической эффективности у клеток, выращенных в культуре.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлены способы генерирования энергии у субъекта в условиях низкого содержания кислорода. В другом варианте осуществления изобретения, представлены способы, индуцирования метаболического сдвига в потреблении кислорода, например, снижения потребления кислорода. Конкретно представлены способы сведения к минимуму потребления кислорода, которые требуются для достижения и поддержания меняющихся уровней напряжения. Эти способы могут быть, в частности, полезными в случаях их применения при повышенных уровнях напряжения, например, атлетических занятиях, физическом напряжении, например, под водой, на большой высоте, в условиях сильного стресса, например, в условиях на поле сражения и т.д.

В указанных выше способах конкретно представлено использование соединения настоящего изобретения. В определенных аспектах изобретения, соединение настоящего изобретения выбирают из группы, состоящей из соединений А, В, С, D, Е, F, G и Н. В одном из аспектов изобретения, соединение представляет собой миметик 2-оксоглутарат-диоксигеназы. В другом аспекте изобретения, миметик 2-оксоглутарат-диоксигеназы представляет собой замещенный гетероциклический карбоксамид. В настоящем изобретении конкретно представлены варианты, в которых замещенный гетероциклический карбоксамид выбирают из группы, состоящей из хинолинов, изохинолинов, фенантролинов, пиридинов, пиримидинов, β-карболинов и т.д.

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, представлены композиции, или лекарственные препараты, или фармацевтические композиции, включающие соединения настоящего изобретения, и способы производства и использования таких композиций, или лекарственных препаратов, или фармацевтических композиций.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлены способы лечения или профилактики состояния, связанного с ухудшенным гомеостазом жира у субъекта исследования, страдающего таким состоянием, способы, включающие стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым осуществляя лечение или профилактику развития указанного состояния у субъекта исследования. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, состояние, связанное с ухудшенным гомеостазом жира, представляет собой ожирение, включающее ожирение, индуцированное диетой; генетически индуцированное ожирение; ожирение, которое является результатом определенных терапевтических лечений или развивается в связи с определенными терапевтическими лечениями, например, терапии на основе инсулина и т.д., гиперлипидемии, гиполипидемии, холестеринемии или атеросклероза.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлены способы лечения или профилактики состояния, связанного с ухудшенным метаболизмом жира у субъекта, страдающего таким состоянием, способы, включающие стабилизирование HIFα у субъекта или введение субъекту эффективного количества соединения настоящего изобретения, тем самым осуществляя лечение или профилактику развития указанного состояния у субъекта. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, состояние, связанное с ухудшенным гомеостазом жира, представляет собой ожирение, включающее ожирение, индуцированное диетой; генетически индуцированное ожирение; ожирение, которое является результатом определенных терапевтических лечений или развивается в связи с определенными терапевтическими лечениями, например, терапии на основе инсулина и т.д., гиперлипидемии, гиполипидемии, холестеринемии, атеросклероза и т.д.

Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения будут легко понятны специалистам в данной области в свете раскрываемого здесь ниже описания изобретения.

Краткое описание чертежей

На Фигурах 1А, 1В и 1C показаны уровни лептина в клеточной культурной среде человека после обработки различными соединениями настоящего изобретения. Линии клеток, показанные на чертежах, представляют собой преадипоциты, адипоциты, фибробласты крайней плоти человека (HFF), микрососудистые эндотелиальные клетки человека (НМЕС-1), эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), клетки гепатоклеточной карционмы человека (Нер 3В), фетальные эпителиальные клетки печени, трансформированные аденовирусом, (293А) и эпителиальные клетки карционмы шейки матки (HeLa).

На Фигурах 2А и 2В показано увеличение экспрессии генов, кодирующих белки, которые принимают участие в метаболизме жира, и распределение генов в печени животных, подвергнутых лечению соединением настоящего изобретения. На Фиг.2А показана экспрессия различных генов, которые принимают участие в метаболизме жира, включая аполипопротеин A-IV, ацил-СоА-тиоэстеразу, карнитин-ацетилтрансферазу и связующий белок инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1. На Фиг.2В показана экспрессия гена плазминогенного активаторного ингибитора (PAI)-1.

На Фигурах 3А, 3В и 3С показаны изменения экспрессии генов, кодирующих факторы, которые принимают участие в ответной реакции клеток на жирные кислоты и триглицериды. На Фиг.3А показаны изменения экспрессии DEC1/Stra 13 в течение времени после обработки соединением изобретения. На Фиг.3В показано увеличение экспрессии DEC1/Stra 13 в нескольких тканях после обработки. На Фиг.3С показано уменьшение экспрессии пролифератором пероксисомы активированного рецептора (PPAR)-γ после обработки соединениями изобретения.

На Фигурах 4А и 4В показаны изменения веса тела и веса органов у животных, подвергнутых лечению различными дозами соединения настоящего изобретения. На Фиг.4А показано зависимое от дозы замедление увеличения веса тела у животных, подвергнутых лечению соединением изобретения. На фигуре 4В показано, что потеря веса у животных не обусловлена потерей веса мышц и/или жизненных органов, как, например, сердца.

На Фиг.5 показано зависимое от дозы уменьшение содержания висцерального жира у животных, подвергнутых лечению соединением изобретения.

На Фигурах 6А, 6В и 6С показано уменьшение увеличения веса тела и веса абдоминальной жировой ткани у модели животного с ожирением, индуцированным диетой, при лечении соединением изобретения.

На Фигуре 7 показано снижение уровней содержания триглицеридов в сыворотке у модели животного с диабетом при лечении соединением изобретения.

На Фигурах 8А и 8В показана зависимая от дозы стабилизация HIF-1α в клетках, обработанных соединениями изобретения.

На Фигурах 9А и 9В показано индуцирование транспортера-1 глюкозы (GluT-1) и альдолазы в клетках, обработанных соединениями изобретения.

На Фигурах 10А, 10В и 10С показано увеличение экспрессии генов, принимающих участие в регулировании содержания глюкозы в почке, печени и легком, соответственно, у животных, подвергнутых лечению с использованием соединения изобретения.

На Фиг.11 показана ответная реакция на дозу потребления кислорода в клетках аденокарциномы шейки матки (HeLa) и в клетках трансформированной фетальной почки (293А), подвергнутых обработке соединением изобретения.

Описание изобретения

Прежде, чем будут описаны композиции и способы настоящего изобретения, следует понять, что изобретение не ограничивается отдельными методологиями, протоколами, клеточными линиями, анализами и описанными реагентами, так как эти параметры могут изменяться. Следует также понять, что терминология, используемая здесь, предназначается для описания конкретных вариантов применения настоящего изобретения, и никоим образом не предназначается для ограничения объема настоящего изобретения, которое определено в прилагаемой Формуле изобретения.

Следует отметить, что используемые здесь и в прилагаемой Формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множество, кроме тех случаев, если противоположное в контексте четко не оговорено. Таким образом, например, ссылка на "фрагмент" включает множество таких фрагментов, ссылка на "соединение" представляет собой ссылку на одно или большее количество соединений и его эквиваленты, которые описаны здесь и которые известны специалистам в данной области, и так далее.

Кроме тех случаев, когда противоположное не оговорено, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют те же самые значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области, к которой изобретение относится. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, можно использовать на практике или для тестирования настоящего изобретения, в настоящем случае описываются предпочтительные способы, устройства и материалы. Все приведенные здесь публикации упомянуты здесь в виде ссылки во всей их полноте с целью описания и раскрытия методологий, реагентов и оборудования, представленных в публикациях, которые можно использовать в связи с изобретением. Здесь нет ничего, что могло бы быть истолковано как признание того, что изобретение лишено права предвосхищать такое раскрытие изобретения благодаря предыдущему изобретению.

При практическом применении настоящего изобретения будут использоваться, если не указаны иные, традиционные способы химии, биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии, генетики, иммунологии и фармакологии, в пределах существующих областей наук. Такие технологии описаны подробно в литературе. Смотри, например, Gennaro, A.R., публикация (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд. Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E. и Gilman, A.G., публикации (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10-е изд., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. и соав., публикации. Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M. и Blackwell, C.C., публикации (1986) Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, Т. и соав., публикации (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Лабораторный справочник), 2-е издание, тома I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. и соав., публикации (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4-e издание, John Wiley & Sons; Ream и соав., публикации (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course (Интенсивный лабораторный курс), Academic Press; Newton, C.R. и Graham, А., публикации (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Serie), 2-е изд. Springer Verlag.

Определения

Термины "регулирование содержания жира" и "регулирование метаболизма жира", как они использованы здесь, относятся к процессам, посредством которых клетка, ткань, орган, система органов или организм в целом достигают и/или поддерживают гомеостаз жира путем изменения, например, усиления или ослабления специфических процессов метаболизма жира. Метаболизм жира охватывают процессы, посредством которых синтезируются, транспортируются, поглощаются, процессируются, утилизируются или накапливаются жиры, такие как триглицериды, жирные кислоты, холестерин, липиды и фосфолипиды. Специфические аспекты метаболизма и регулирования содержания жира включают экспрессию липопротеинов или ферментов, которые облегчают транспорт и перемещение жира в крови и сохранение или секрецию жира клеткой; изменение экспрессии и/или активности ферментов, вовлеченных в утилизацию или образование жира, включающих, например, липолитические и липогененные ферменты, такие как ацилтрансферазы, оксидазы, липоксигеназы и т.д.; и изменение распределения жира в пределах организма, например, в окружающих тканях, жировой ткани и т.д.; или в пределах культуральных жидкостей, включающих, например, внутритканевые (т.е. внеклеточные) и внутриклеточные текучие среды, кровь, мочу и им подобные текучие среды.

Термины "метаболическое состояние" и "метаболическое нарушение" используют взамен друг друга, и они относятся к любому нарушению, связанному с или обострившемуся за счет измененного регулирования содержания жира. Такие нарушения включают, но не ограничиваются ими, атеросклероз, болезнь сердца и ожирение.

Термин "ожирение" относится к избыточному содержанию жира в организме. Ожирение можно оценивать с помощью любого показателя, принятого и используемого специалистами в данной области. Обычно, принятым показателем ожирения является индекс массы тела (BMI), который является показателем веса тела в килограммах по отношению к квадрату высоты в метрах. Обычно для взрослого человека старше 20 лет, величина BMI между около 18,5 и 24,9 считается нормальной, в то время, как величина BMI между около 25,0 и 29,9 рассматривается как избыточный вес, величина BMI, равная или превышающая 30,0, рассматривается как ожирение, а величина BMI, равная или превышающая 40, рассматривается как болезненное ожирение. (Смотри, например, Gallagher и соав. (2000) Am J Clin Nutr 72:694-701.) Эти диапазоны BMI основаны на влиянии веса тела на повышенную опасность заболевания. Некоторые обычные состояния, связанные с избыточным весом и ожирением, включают сердечно-сосудистое заболевание, высокое давление крови, остеоартрит, рак и сахарный диабет. Хотя BMI коррелируется с жиром тела, отношение между ВМ и фактическим жиром тела отличается в зависимости от возраста и пола. Например, женщины с большей вероятностью имеют более высокое процентное содержание телесного жира, чем мужчины при том же самом значении BMI.

Другим показателем ожирения является процентное содержание телесного жира. Приемлемы различные способы для косвенной оценки содержания телесного жира, включая измерение морщинистости кожи, гидроденситометрию, биоэлектрический анализ импеданса (BIA), двухэнергетическую рентгеноспектральную абсорбциометрию, измерение общего содержания калия, и анализ активации нейтронов in vivo. Гидроденситометрия, или гидростатическое взвешивание (HW), определяет общий объем тела путем измерения различий между весом объекта исследования в воде и на воздухе. Аналогично, плетисмография методом вытеснения воздуха (АР) определяет общий объем тела путем измерения уменьшения объема камеры за счет введения объекта исследования в камеру с фиксированным объемом воздуха. Общая плотность тела и состав тела оценивают затем, используя общепринятые уравнения прогноза. С помощью BIA оценивают сопротивление тела, или импеданс, используя падение напряжения, создаваемое слабым электрическим током, проходящим межу электродами. Уровень импеданса, показатель воды и состава электролита тела используют затем для оценки содержания ткани без жира и объема воды в теле, используя усовершенствованные уравнения регрессии. Принимая в расчет гидратационную часть ткани без жира, используют дополнительные уравнения регрессии для оценки массы тела без жира и массы жира. Величина процентного содержания телесного жира у женщин обычно должна составлять около 17-27 процентов, хотя величина вплоть до около 31 процента считается приемлемой. У мужчин величина процентного содержания телесного жира обычно должна составлять около 10-20 процентов, хотя величина вплоть до около 25 процентов считается приемлемой.

Термин "HIFα" относится к альфа субъединице индуцируемого гипоксией факторного белка. HIFα может быть любым белком человека или другого млекопитающего, или его фрагментом, включая человеческие HIF-1α (Genbank, регистрационный № Q16665), HIF-2α (Genbank, регистрационный № AAB41495) и HIF-3α (Genbank, регистрационный № AAD22668); мышиные HIF-1α (Genbank, регистрационный № Q61221), HIF-2α (Genbank, регистрационный № ВАА20130 и ААВ41496) и HIF-3α (Genbank, регистрационный № ААС72734); крысиные HIF-1α (Genbank, регистрационный № САА70701), HIF-2α (Genbank, регистрационный № САВ96612) и HIF-3α (Genbank, регистрационный № САВ96611) и коровьи HIF-1α (Genbank, регистрационный № ВАА78675). HIFα может быть также любым белком немлекопитающего или его фрагментом, включая HIF-1α лягушки (Xenopus laevi) (Genbank, регистрационный № САВ96628), HIF-1α дрозофилы (Drosophila melanogaster) (Genbank, регистрационный № JC4851) и HIF-1α цыпленка (Genbank, регистрационный № ВАА34234). Можно также получать генные последовательности HIFα за счет рутинных технологий клонирования, например, используя всю или часть генной последовательности HIFα, описанной выше, в качестве зонда для обнаружения и определения последовательности гена HIFα в другом виде.

Фрагменты HIFα включают области, устанавливаемые HIF-1α человека от аминокислоты 401 до 603 (Huang и соав., см. выше), от аминокислоты 531 до 575 (Jiang и соав. (1997) J Biol Chem 272:19253-19260), от аминокислоты 556 до 575 (Tanimoto и соав., см. выше), от аминокислоты 557 до 571 (Srinivas и соав. (1999) Biochem Biophys Res Coinmun 260:557-561) и от аминокислоты 556 до 575 (Ivan и соав. (2001) Science 292:464-468). Кроме того, фрагмент HIFα включает любой фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один случай присутствия мотива LXXLAP, например, как это имеет место в нативной последовательности HIFα на участке L₃₉₇TLLAP и L₅₅₉EMLAP. Кроме того, фрагмент HIFα включает любой фрагмент, сохраняющий, по меньшей мере, одну функциональную или структуральную характеристику HIFα. Например, пептид HIF, используемый в опыте по скрининговому анализу, описанному в Примере 9, может включать последовательность DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID N0:1).

Термин "гидроксилаза HIF" относится к любому ферменту, который способен гидроксилировать остаток аминокислоты в белке HIF, конкретно в субъединице HIFα. Предпочтительно, остаток аминокислоты представляет собой остаток пролина и/или остаток аспарагина.

Термин "аспарагинилгидроксилаза HIF" относится к любому ферменту, который способен гидроксилировать остаток аспарагина в белке HIF. Предпочтительно, остаток аспарагина, гидроксилированный аспарагинилгидроксилазой HIF, включает, например, N₈₀₃ остаток HIF-1α или гомологичный остаток аспарагина в другой изоформе HIFα. Аспарагинилгидроксилаза HIF включает фактор, ингибирующий HIF (FIH), аспарагинилгидроксилазу, ответственную за регулирование трансактивации HIFα (Genbank, регистрационный № AAL27308; Mahon и соав. (2001) Genes Dev 15:2675-2686; Lando и соав. (2002) Science 295:858-861 и Lando и соав. (2002) Genes Dev 16:1466-1471. Также смотри Elkins и соав. (2002) J Biol Chem C200644200).

Термины "пролилгидроксилаза HIF" и "HIF PH" относятся к любому ферменту, который способен гидроксилировать остаток пролина в белке HIF. Предпочтительно, остаток пролина, гидроксилированный пролилгидроксилазой HIF, включает пролин, находящийся в пределах мотива LXXLAP, например, как это имеет место в нативной последовательности HIF-1α человека, соответствующей L₃₉₇ TLLAP и L₅₅₉EMLAP. HIF PH включает элементы семейства гена Egl-Nine (EGLN), описанного Taylor (2001, Gene 275:125-132) и охарактеризованного Aravind и Koonin (2001, Genome Biol 2:RESEARCH0007), Epstein и соав. (2001, Cell 107:43-54) и Bruick и McKnight (2001, Science 294:1337-1340). Примеры ферментов пролилгидроксилазы HIF включают человеческий SM-20 (EGLN1) (Genbank, регистрационный № AAG33965; Dupuy и соав. (2000) Genomics 69:348-54), изоформу 1 EGLN2 (Genbank, регистрационный № CAC42510; Taylor, см. выше), изоформу 2 EGLN2 (Genbank, регистрационный № NP_060025) и EGLN3 (Genbank, регистрационный № САС42511; Taylor, см. выше); мышиные EGLN1 (Genbank, регистрационный № САС42515), EGLN2 (Genbank, регистрационный № САС42511) и EGLN3 (SM-20) (Genbank, регистрационный № САС42517) и крысиный SM-20 (Genbank, регистрационный № ААА19321). Кроме того, пролилгидроксилаза HIF может включать генный продукт EGL-9 вида Caenorhabditis elegans (Genbank, регистрационный № AAD56365) и CG1114 вида Drosophila melanogaster (Genbank, регистрационный № AAF52050). Пролилгидроксилаза HIF включает также любой активный фрагмент вышеуказанных полноразмерных белков.

Термин "образец" может относиться к любому материалу, полученному либо прямо, либо косвенно из субъекта. Образцы можно получить или извлечь, например, из жидкостей, секреций, тканей, клеток тела, или из клеток культуры, включающих, но не ограничивающихся ими, слюну, кровь, мочу, сыворотку, плазму, стекловидное тело, синовиальную жидкость, спинномозговую жидкость, околоплодные воды и ткань органов (например, биопсируемую ткань); из хромосом, органелл, или других мембран, выделенных из клетки; из геномных ДНК, кДНК, РНК, мРНК и пр.; и из просветленных клеток или тканей, или блотов, или отпечатков таких клеток, или тканей. Образцы можно извлечь из любого источника, такого как, например, объекта исследования в виде человека, или млекопитающего, не являющегося человеком, и т.д. Подвергаются также изучению образцы, извлеченные из любой модели животного, подверженного заболеванию. Образцы могут находиться в растворе или же могут, например, фиксироваться или связываться с субстратом. Образец может относиться к любому материалу, пригодному для испытания с целью выявления присутствия транскриптов или белков, связанных с регулированием метаболизма; или для измерения уровней содержания жира и глюкозы. Способы для получения таких образцов общеизвестны в данной области.

Термин "субъект" может относиться к выделенным клеткам, либо прокариотическим, либо эукариотическим, или ткани, выращенной в культуре; или, предпочтительно, субъект относится к животным, конкретно, к видам млекопитающего, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь., и примата, конкретно человека.

Изобретение

Настоящее изобретение представляет способы и соединения для регулирования метаболизма жира и достижения гомеостаза жира, а также для лечения и профилактики, а также сведения к минимуму риска развития состояний, связанных с измененным или ухудшенным гомеостазом и метаболизмом жира. Такие состояния включают, но не ограничиваются ими, ожирение и т.д. Представлены также способы и соединения для регулирования уровней содержания накопленного жира; для поддержания или уменьшения веса тела и для регулирования процессинга, поглощения, транспорта, накопления, синтеза, утилизации и распределения жира. В изобретении конкретно представлены способы лечения или профилактики ожирения, например, профилактики или уменьшения увеличения веса и/или индуцирования потери в содержании жира. В одном из аспектов изобретения, это осуществляют путем фармакологического индуцирования метаболического сдвига в направлении использования жира и/или жирных кислот в качестве основного источника энергии для клеток.

Изобретение связано с открытием того, что стабилизация альфа субъединицы индуцируемого гипоксией фактора (HIFα) ведет к снижению отложения жира и что стабилизация HIFα регулирует метаболизм жира. Кроме того, в изобретении представлены способы и соединения, которые снижают образование жировой ткани и отложение жира и эффективно регулируют процессы метаболизма жира, например, транспорт, поглощение, процессинг, утилизацию, накопление жира и т.д.

Индуцируемый гипоксией фактор (HIF) принимает участие в ответной реакции клеток, тканей и органов на снижение содержания кислорода, т.е. на гипоксию. Как известно, воздействие гипоксии, например, на большой высоте, вызывает потерю аппетита и потерю веса (Смотри, например, Fushiki и соав. (1992) Can J Physiol Pharmacol 70:1522-1524; Gunga и соав. (2003) Eur J Appl Physiol 88:497-505 и Tschop и Morrison (2001) В: Гипоксия: От генов до ухода за больными (Hypoxia: From genes to the bedside) (RC Roach и соав. Публикации), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.). HIFα представляет собой субъединицу, деградированную в нормоксических, т.е. нормальных кислородных условиях, и стабилизированную в гипоксических, т.е. в условиях низкого содержания кислорода. При стабилизации, HIFα объединяется с HIFα, продуцируя ряд последующих эффектов. Недавно было установлено, что гидроксилирование конкретных остатков на субъединице HIFα делает HIFα мишенью для деградации, предотвращая таким образом формирование стабильного комплекса HIF в нормальных кислородных условиях, и было установлено, что гидроксилирование является следствием активности определенных ферментов гидроксилазы HIF. (Смотри, например, Ivan и соав. (2001) Science 292:464-468; Jaakkola и соав. (2001) Science 292:468-472; Epstein и соав. (2001) Cell 107:43-54 и Bruick и McKnight (2001) Science 294:1337-1340.) Эти гидроксилазные ферменты HIF принадлежат к семейству ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы. Эти ферменты являются кислород-зависимыми и, в условиях низкого содержания кислорода (т.е. в гипоксических условиях), гидроксилирование остатков HIFα ингибируется. Терапевтическая стабилизация HIFα и стабилизация HIFα посредством ингибирования гидроксилирования HIFα ранее уже были описаны. (Смотри, например, международную публикацию заявки за номером WO 03/049686, введенную здесь в виде ссылки во всей полноте.)

Способы

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведения в активное состояние жировых накоплений, регулирования метаболизма жира и достижения гомеостаза жира путем стабилизирования HIFα у субъекта. В другом аспекте настоящего изобретения, способы включают уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования гидроксилирования HIFα у субъекта. В предпочтительном аспекте изобретения, способы настоящего изобретения включают уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования активности по меньшей мере одного фермента гидроксилазы HIF у субъекта. В наиболее предпочтительном аспекте изобретения, способы изобретения включают уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования активности фермента пролилгидроксилазы HIF.

Стабилизацию HIFα можно осуществлять посредством любого из способов, доступных и известных специалистам в данной области, и она может включать использование любого агента, который взаимодействует, связывается или модифицирует HIFα или факторы, которые взаимодействуют с HIFα, включая, например, ферменты, для которых HIFα является субстратом. В конкретных аспектах настоящего изобретения рассматривают создание конститутивно устойчивого варианта HIFα, например, стабильных мутеинов HIF и пр., или полинуклеотидное кодирование такого варианта. (Смотри, например, патент США за номером 6562799 и 6124131 и патент США за номером 6432927.) В других аспектах изобретения предполагается, что стабилизирование HIFα включает введение агента, который стабилизирует HIFα. Агент может состоять из полинуклеотидов, например, антисмысловых последовательностей (смотри, например, международную публикацию за номером WO 03/045440); полипептидов; антител; других белков; углеводов; жиров; липидов и органических и неорганических веществ, например, небольших молекул и пр. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предполагается стабилизирование HIFα, например, у субъекта, путем введения субъекту агента, который стабилизирует HIFα, где агент представляет собой соединение, например, низкомолекулярное соединение, и пр., которое стабилизирует HIFα.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения, способы изобретения включают стабилизирование HIFα путем ингибирования активности, по меньшей мере, одного фермента, выбранного из семейства 2-оксоглутарат-диоксигеназы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, фермент представляет собой фермент гидроксилазы HIF, например, EGLN-1, EGLN-2, EGLN-3, FIH и пр. (Смотри, например, Taylor (2001) Gene 275:125-132; Epstein и соав. (2001) см. выше; Bruick и McKnight (2001) см. выше; Mahon и соав., см. выше и Lando и соав., см. выше.) Однако, конкретно предполагается, что фермент может быть любым ферментом, выбранным из семейства ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы, включая, например, проколлаген-лизилгидроксилазу (LH)-1, -2 и -3; проколлаген-пролил-3-гидроксилазу, проколлаген-пролил-4-гидроксилазу α(I) и α(II), Тимин-7-гидроксилазу, аспартил-(аспарагинил-) β-гидроксилазу, ε-N-триметиллизин-гидроксилазу и γ-бутиробетаин-гидроксилазу и т.д. (Смотри, например, Majamaa и соав. (1985) Biochem J 229:127-133; Myllyharju и Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180; Thornburg и соав. (1993) 32:14023-14033 и Jia и соав. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231.)

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, способы изобретения содержат уменьшение формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем ингибирования гидроксилирования определенных остатков HIFα, например, остатков пролина, остатков аспарагина и пр. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, остатки представляют собой остатки пролина. В специфических вариантах осуществления изобретения, остатки могут быть остатком Р₅₆₄ в HIF-1α или гомологичным пролином в другой изоформе HIFα, или остатком P₄₀₂ в HIF-1α или гомологичным пролином в другой изоформе HIFα и т.д. В других вариантах осуществления изобретения, способы настоящего изобретения могут содержать ингибирование гидроксилирования остатков аспарагина в HIFα, например, остатка N₈₀₃ в HIFα или гомологичного остатка аспарагина в другой изоформе HIFα.

Соединения

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем введения соединения изобретения субъекту. Соединение изобретения представляет собой любое соединение, которое ингибирует или иначе модулирует активность фермента 2-оксоглутарат-диоксигеназы. Ферменты 2-оксоглутарат-диоксигеназы включают, но не ограничиваются ими, ферменты гидроксилазы. Ферменты гидроксилазы гидроксилируют остатки субстрата-мишени и включают, например, пролил, лизил, аспарагинил (аспарагил, аспартил) гидроксилазы и пр. Гидроксилазы характеризуют иногда посредством субстрата-мишени, например, HIF гидроксилаз, проколлаген-гидроксилаз и пр., и/или посредством остатков, являющихся мишенями в субстрате, например, пролилгидроксилазами, лизилгидроксилазами и пр., или посредством и субстрата, и остатка, например, HIF пролилгидроксилазами, проколлаген-пролил гидроксилазами и пр. Репрезентативные ферменты 2-оксоглутарат-диоксигеназы включают, но не ограничиваются ими, HIF гидроксилазы, включающие HIF пролилгидроксилазы, например, EGLN1, EGLN2, и EGLN3, HIF аспарагинилгидроксилазы, например, фактор, ингибирующий HIF (FIH) и пр.; проколлаген-гидроксилазы, например, проколлаген-лизилгидроксилазы, проколлаген-пролилгидроксилазы, например, проколлаген-пролил-3-гидроксилаза, проколлаген-пролил-4-гидроксилаза α(I) и α(II) и т.д.; тимин-7-гидроксилазу; аспартил-(аспарагинил)-β-гидроксилазу; ε-N-триметиллизин-гидроксилазу; γ-бутиробетаин-гидроксилазу и т.д. Хотя ферментативная активность может включать любую активность, связанную с любой 2-оксоглутарат диоксигеназой, конкретно предполагается гидроксилирование остатков аминокислот в субстрате. Хотя гидроксилирование остатков пролина и/или аспарагина в субстрате конкретно присутствует, гидроксилирование других аминокислот также предполагается.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, соединение представляет собой соединение, которое ингибирует гидроксилазную активность. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, соединение изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В различных вариантах осуществления изобретения, активность обусловлена HIF пролилгидроксилазой, такой как, например, EGLN1, EGLN2, или EGLN3 и т.д. В других вариантах осуществления изобретения, активность обусловлена HIF аспарагинилгидроксилазой, включающей, но не ограничивающейся FIH.

В одном из аспектов, соединение изобретения, которое проявляет ингибиторную активность в отношении одного или большего количества ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы, может проявлять также ингибиторную активность в отношении одного или большего количества дополнительных ферментов 2-оксоглутарат-диоксигеназы, например, соединение, которое ингибирует активность HIF гидроксилазы, может дополнительно ингибировать активность коллаген-пролилгидроксилазы, соединение, которое ингибирует активность HIF пролилгидроксилазы, может дополнительно ингибировать активность HIF аспарагинилгидроксилазы и т.д.

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, регулирование метаболизма жира и достижение гомеостаза жира путем введения соединения изобретения субъекту. Соединение изобретения может быть, например, низкомолекулярным соединением, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, соединение изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует HIF пролилгидроксилазную активность. Ингибирование может быть прямым или косвенным, может быть конкурентным и неконкурентным и т.д. Ниже, в виде примеров, представлены соединения и способы для идентификации дополнительных соединений настоящего изобретения.

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы уменьшения формирования жировой ткани и отложения жира, приведение в активное состояние жировых накоплений, модулирование регулирования жира и достижение гомеостаза жира путем введения соединения изобретения субъекту. Соединения настоящего изобретения можно использовать для регулирования веса тела или для облегчения снижения веса тела, например, чрезмерного веса или ожирения у субъекта. Дополнительно, соединения изобретения можно использовать для лечения нарушений или состояний, связанных с метаболизмом жира, включая, но не ограничиваясь ими, атеросклероз, ожирение и пр.

В одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы использования соединений для профилактики или лечения нарушений, способы, включающие введение эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли или его пропрепарата либо отдельно, либо в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем пациенту, нуждающемуся в лечении. В одном из вариантов осуществления изобретения, соединение можно вводить на основании предварительно установленных состояний, например, при трудно контролируемом весе тела или ожирении.

Соединения можно вводить в комбинации с разнообразными другими терапевтическими подходами. В одном из вариантов осуществления изобретения, соединение вводят вместе или вместо другого терапевтического агента, имеющего такой же или иной характер действия, например, глюкокортикоида, экзогенного инсулина, например, рекомбинантного инсулина человека, агониста PPARγ, например, тиазолидиндионов, или препарата для подавления аппетита.

Экспрессия регуляторных факторов жира

В способах настоящего изобретения представлены средства для изменения экспрессии регуляторных факторов, принимающих участие в метаболизме жира, например, транспорте, поглощении, утилизации, синтезе, процессинге и накоплении жира во всем теле. В одном из аспектов, способы изобретения устраняют дефекты в природном механизме организма в регулировании таких процессов, например, благодаря измененному продуцированию физиологических факторов и/или благодаря ответной реакции на физиологические факторы, такие как лептин, плазминогенный активаторный ингибитор (PAI)-1, инсулин и т.д. В другом аспекте, способы изобретения модулируют, например, повышают или снижают, уровни и/или активность регуляторных факторов, например, транскрипционных регуляторов, принимающих участие в транспорте, поглощении и утилизации жира, таких как DEC1/Stra13, пролифератором пероксисомы ассоциированных рецепторов (PPAR) и т.д.

Лептин является ключевым регулятором веса тела, оказывая влияние и на потребление пищи, и на расходование энергии. Хотя адипоциты являются главным источником продуцирования лептина, другие ткани, включая плаценту, скелетные мышцы, ткани слизистой оболочки желудка, и эпителиальные ткани молочной железы, также продуцируют лептин. (Смотри, например, Ahima и Flier (2000) Armu Rev Physiol 62:413-437; Fantuzzi и Faggioni (2000) J Leukocyte Biol 68:437-446.) У мышей (ob/ob) с дефицитом лептина наблюдается крайне избыточный вес вследствие хронического чрезмерного поглощения пищи, и введение экзогенного лептина ob/ob мышам продуцирует существенное снижение поглощения пищи и потерю веса (Zhang и соав. (1994) Nature 372:425-431; Pelleymounter и соав. (1995) Science 269:540-543; Halaas и соав. (1995) Science 269:543-546 и Campfield и соав. (1995) Science 269:546-549.) Аналогично, мыши с дефицитом лептинового рецептора (db/db) также имеют избыточный вес. Кроме того, повышающее регулирование активаторного ингибитора (PAI-1), основного гена, индуцируемого стрессом с установленным эффектом противоожирения, может давать пользу при нарушениях, связанных с гомеостазом жира, таких как ожирение и диабет.

Так как способы и соединения настоящего изобретения увеличивают экспрессию лептина, способы и соединения изобретения являются полезными для регулирования метаболизма жира, утилизации энергии и насыщения. Способы изобретения могут быть особенно полезными для предупреждения увеличения веса у субъекта. Кроме того, способы и соединения осуществления настоящего изобретения увеличивают экспрессию плазминогенного активаторного ингибитора (PAI)-1. Таким образом, способы изобретения являются также полезными для регулирования веса у субъекта, в частности, принося пользу при нарушениях, связанных с гомеостазом жира, таких как ожирение и диабет.

Семейство активированных лигандом транскрипционных факторов, называемых PPARs, регулирует ответную реакцию клеток на жирные кислоты и триглицериды. Известно, что DEC1/Stra13, элемент Drosophila hairy/энхансера из семейства расщепленных траскрипционных репрессоров, подавляет экспрессию, например, PPAR-γ2, транскрипционного фактора, необходимого для дифференциации адипоцитов и связанного с ожирением и диабетом типа 2. (Смотри, например, Yun и соав. (2002) Dev Cell 2:331-341; Giusti и соав. (2003) Diabetes 52:1673-1676 и Muller и соав. (2003) Diabetes 52:1864-1871.) Таким образом, модуляция DEC1/Stra13, и/или PPARs, например, PPAR-γ2, может давать дополнительную пользу за счет регулирования экспрессии адипогенных факторов, включая факторы, которые принимают участие в поглощении жира и клеточном процессинге.

Так как способы и соединения настоящего изобретения модулируют уровни факторов, включая DEC1/Stra13 и пролифератором пероксисомы ассоциированные рецепторы (PPAR), принимающие участие в ответной реакции клеток на уровни содержания жира, способы и соединения настоящего изобретения являются полезными для регулирования экспрессии генов, принимающие участие в ответной реакции клеток на жир, в частности, при поглощении и процессинге клетками жирных кислот и триглицеридов.

В настоящем изобретении представлены способы для координированного регулирования генов, чьи продукты принимают участие в метаболизме жира. Такие гены включают, но не ограничиваются ими, гены, имеющие отношение к поглощению и транспорту пищевого жира, синтезу и транспорту жира de novo, и процессингу (разложению) жира, утилизации жира и т.д., включая, например, глицерол-3-фосфат-ацетилтрансферазу (GPAT), длинноцепочечную жирную ацил-СоА-синтазу, карнитин-ацетилтрансферазу и т.д. Терапевтическое повышающее регулирование ферментов метаболизма жира и факторов насыщения будет эффективно снижать накопление жира, уменьшать вес тела и тем самым продуцировать полезный эффект у пациентов с метаболическими нарушениями, например, диабетом. Еще в одном варианте осуществления изобретения, в способах изобретения представлено координированное регулирование генов, чьи продукты включаются в транспорт жира. Такие гены включают, но не ограничиваются ими, аполипопротеин (Аро) А-IV.

Например, СоА-тиоэстеразы (СТЕ) и карнитин-ацетилтрансферазы (CAT) регулируют уровни содержания ацил-СоА в клетках. (Van der Liej и соав. (2000) Mol Genet Metab 71:139-153; Huhtinen и соав. (2002) J Biol Chem 277:3424-3432). Длинноцепочечные ацил-СоА эфиры используют в синтезе и β-окислении триглицерида. Кроме того, длинноцепочечные ацил-СоА эфиры могут стимулировать активность пролифератором пероксисомы активированного рецептора (PPAR)-α, тем самым оказывая влияние на транскрипцию гена. ApoA-IV представляет собой компонент хиломикронов и частиц липопротеина высокой плотности (HDL), и, когда он находится в состоянии сверхэкспрессии, то ускоряет отток холестерина из холестерин-нагруженных клеток (Cohen и соав. (1997) J Clin Invest 99:1906-1916.) Сверхэкспрессия ApoA-IV защищает также от атеросклероза (Duverger и соав. (1996) Science 273:966-968. Смотри также, например, Ordovas и соав. (1989) J Biol Chem 264:16339-16342; Otha и соав. (1985) J Clin Invest 76:1252-1260 и Verges (1995) Diabetes Metab 21:99-105.) Таким образом, повышенная экспрессия генов, принимающих участие в регулировании жира, например, СТЕ-1, и ApoA-IV, как демонстрируется в настоящем изобретении с использованием соединений и способов изобретения, может обеспечивать как прямое, так и косвенное регулирование метаболизма и транспорта жира.

Поэтому, соединения и способы настоящего изобретения модулируют уровни факторов, принимающих участие в метаболизме жира, и являются полезными для регулирования метаболизма жира у субъекта. В одном из аспектов изобретения, способы изобретения регулируют экспрессию белков, принимающих участие в продуцировании и/или утилизации триглицерида. Терапевтическое повышающее регулирование ферментов метаболизма жира будет эффективно снижать накопление жира, уменьшать вес тела и тем самым продуцировать полезный эффект у пациентов с метаболическими нарушениями, например, ожирением. Кроме того, способы и соединения настоящего изобретения модулируют уровни факторов, таких как аполипопротеины, принимающих участие в транспорте жира. Поэтому способы изобретения могут использоваться для регулирования процессинга и транспорта жирных кислот и триглицеридов между клетками, включая клетки мышц, печени, сердца и жировые клетки. Изменение процессов транспорта направляет, кроме того, использование жира, благоприятствуя утилизации жира по сравнению с накоплением.

В изобретении конкретно представлено селективное конструирование пропрепаратов так, чтобы они активировались при поглощении конкретными органами. Например, так как печень продуцирует многие белки, принимающие участие в гомеостазе жира, изобретение рассматривает способы настоящего изобретения, селективно нацеленные на печень. Селективной повышающей регуляции генов, например, ApoA-IV, в печени можно достигать, используя соединения, которые превращаются из неактивной в активную форму с помощью специфических ферментов печени. Например, карбоновую кислоту в активном соединении можно заменить соответствующим спиртом. Активность алкоголь-дегидрогеназы (ADH) в печени может превращать такое соединение в активную форму. Так как в других органах отсутствует активность ADH, соединение можно селективно активировать только в печени. Аналогично, соединения, используемые в способе настоящего изобретения, можно нацеливать на другие органы, например, на жировую ткань, почку, скелетные мышцы, сердце и т.д.

Метаболический сдвиг в продуцировании энергии

Организм получает энергию при утилизации жирных кислот и углеводов. И глюкоза, и жирные кислоты могут использоваться в качестве энергии немедленно при поглощении, но их количества, которые потребляются сверх текущей энергетической потребности, аккумулируются для последующего использования. Так как только ограниченное количество глюкозы может накапливаться в виде гликогена, большая часть потребляемой глюкозы превращается в жирные кислоты и аккумулируется в жировой ткани. Таким образом, жировая ткань содержит большую часть энергетического резерва для организма. Кроме того, жировая ткань служит не только в качестве источника аккумулирования энергии, но она выполняет также множество эндокринных и терморегуляторных функций и принимает участие в регуляции метаболизма глюкозы.

Как обсуждалось выше, печень также принимает участие в метаболизме жира и глюкозы, выполняя важную и центральную роль в поддержании соответствующих уровней содержания в крови этих жизненных питательных веществ. Хотя глюкоза является основным топливом для нейронов и эритроцитов, большинство других тканей зависит от содержания жирных кислот для обеспечения своих основных энергетических потребностей. При восстановлении нормальных уровней содержания глюкозы в крови, печень разрушает гликоген, а жировая ткань разрушает триглицериды, чтобы обеспечить кровь глюкозой и жирными кислотами, соответственно. Инсулин является важным регулятором этого метаболического равновесия, стимулируя поглощение глюкозы в жире и мышцах, синтез гликогена и липогенез. Низкие уровни содержания инсулина снижают поглощение глюкозы в инсулин-чувствительных тканях, ускоряют глюконеогенез и гликогенолиз в печени, снижают синтез гликогена и ускоряют мобилизацию накопленных жирных кислот из жировой ткани.

Было бы желательно сдвинуть продуцирование энергии организма так, чтобы привести в действие ход метаболизма, требующий жир в качестве источника энергии. В условиях низких уровней содержания глюкозы в крови или ухудшенного регулирования глюкозы, например, диабета, использование жира в качестве источника энергии может обеспечить альтернативное топливо для большинства тканей, делая таким образом потенциально ограниченные количества глюкозы доступными для органов, которым она требуется. Кроме того, повышенная утилизация жира в качестве источника энергии может приводить к снижению накопленного жира, тем самым индуцируя потерю веса, например, у пациента с ожирением, или предупреждать развитие и прогрессирование ожирения, связанного с такими состояниями, как диабет. Настоящее изобретение предлагает способы и соединения для увеличения утилизации жира путем регулирования метаболизма жира, например, за счет повышенной экспрессии регуляторных факторов жира и т.д., снижая жировые накопления и предупреждая дополнительное отложение жира (см., например, Примеры 3, 5 и 6 ниже). Поэтому, в одном из аспектов изобретения, в способах и соединениях настоящего изобретения представлен метаболический сдвиг, увеличивающий утилизацию жира тела в качестве источника энергии, т.е. метаболический сдвиг в отношении использования жира в качестве источника энергии, т.е. продуцирование энергии из жира.

Регулирование липогенных ферментов (см., например. Пример 3) протекает вместе с регулированием транспорта глюкозы, гликолизом и гликонеогенезом по причинам, обсуждавшимся выше. Например, кормление животных, при предварительном голодании, пищей с высоким содержанием углеводов и низким содержанием жира приводит к увеличению ферментов, которые включаются в биосинтез и гликолиз жирных кислот и триацилглицеринов, а также к увеличению поглощения глюкозы с помощью транспортеров глюкозы (смотри, например, Sul и Wang (1998) Annu Rev Nutr 18:331-351). Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения, в способах настоящего изобретения представлено координированное регулирование генов, чьи продукты вовлекаются в поглощение и утилизацию глюкозы. Такие гены включают, но не ограничиваются ими, гликолитические ферменты, включая фосфофруктокиназу, енолазу, лактатдегидрогеназу, альдолазу и гексокиназы; и траспортеры глюкозы (GluT). Увеличение гликолиза приводит к повышенному поглощению и утилизации глюкозы, которые могут ассоциироваться со снижением уровней содержания глюкозы в крови. Так как способы настоящего изобретения можно одновременно применять для усиления экспрессии регуляторных факторов жира и увеличения способности организма использовать жир в качестве источника энергии, настоящее изобретение, таким образом, представляет защитный механизм для одновременного достижения и/или сохранения гомеостаза глюкозы и жира. Способы и соединения настоящего изобретения являются, таким образом, особенно применимыми для лечения или профилактики таких состояний, как, например, диабет, при которых измененное или ухудшенное регулирование глюкозы и жира - такое, которое подтверждается повышенными уровнями содержания глюкозы и ожирением или тенденцией к ожирению - может быть причинно обусловлено.

Кроме того, сдвиг к увеличенному гликолизу, анаэробному процессу и повышенной утилизации жирных кислот может эффективно снижать общее потребление кислорода (см., например, Пример 12). Метаболический сдвиг в использовании энергии и сопровождающееся снижение веса согласуются с сообщениями о том, что гипоксия, связанная с большой высотой, индуцирует потерю веса, конкретно проявляющуюся в виде уменьшения жира в организме. (См., например, Fushiki и соав., см. выше; Gunga и соав., см. выше и Tschop и Morrison, см. выше) Этот подход можно использовать, например, для сохранения или увеличения способности организма генерировать энергию. Это может быть желательным, например, в условиях с низким содержанием кислорода, или в условиях, в которых является желательным повышение способности организма поддерживать и/или увеличивать физическое напряжение, и т.д. Поэтому, в одном из аспектов, в настоящем изобретении представлены способы и соединения для индуцирования метаболического сдвига в потреблении кислорода, т.е. продуцирования зависимого от дозы снижения потребления кислорода в клетках без какого-либо воздействия на жизнеспособность клеток. В настоящем изобретении предполагается, что сдвиг к анаэробному продуцированию энергии, менее эффективному процессу, чем аэробное дыхание, будет увеличивать потребность организма в возврате к жиру в качестве источника энергии, таким образом, оказывая влияние на дополнительный метаболический сдвиг, например, по направлению к жиру как основному источнику энергии.

В одном из вариантов осуществления изобретения, представлен способ индуцирования снижения аэробного метаболизма и сопутствующего повышения анаэробного метаболизма у субъекта, спосо6, включающий: (а) изменение экспрессии гликолитического фактора и (b) изменение координированного способа действия регуляторного фактора жира. В различных вариантах осуществления изобретения, гликолитический фактор выбирают из группы, состоящей из PFK-P, PFK-L, енолазы-1, GluT-1, лактатдегидрогеназы, альдолазы-1, гексокиназы-1, IGFBP-1 и IGF, а регуляторные факторы жира выбирают из группы, состоящей из лептина, аполипопротеина А-IV, цитозольной ацил-СоА-тиоэстеразы-1, связующего белка инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1, карнитин-ацетилтрансферазы, PAI-1, DEC1/Stra13 и PPAR-γ.

В настоящем изобретении конкретно представлен координированный терапевтический подход, посредством которого введением одного из соединений настоящего изобретения одновременно достигается координированное повышающее регулирование, по меньшей мере, одного из регуляторных факторов жира и, по меньшей мере, одного из регуляторных факторов глюкозы.

В то время, как настоящее изобретение никоим образом не ограничивается процессом, приведенным в качестве примера и описанным ниже, предполагается, что повышенная утилизация жира в качестве источника энергии, как это подтверждено, например, уменьшением содержания телесного жира (смотри, например, Примеры 5 и 6 и т.д.) и кратковременным увеличением содержания триглицеридов (смотри, например. Пример 13), эффективно снижает общую эффективность энергии, заставляя субъект сжигать больше калорий для продуцирования энергии, и таким образом индуцируя потерю веса. Длительное снижение уровней содержания триглицеридов (смотри, например, Пример 8) представляет собой подтверждение этой теории, демонстрируя, что основной эффект способов настоящего изобретения при регулировании метаболических процессов жира заключается в том, чтобы приводить в действие организм для достижения и поддержания гомеостаза жира.

Поэтому, в одном из аспектов, представлен способ снижения эффективности энергии у субъекта, чтобы тем самым индуцировать потерю веса, включающий стабилизирование HIFα у субъекта.

Терапевтические способы

В настоящем изобретении представлены способы и соединения для лечения метаболических нарушений, связанных с метаболизмом и гомеостазом жира. Кроме того, в изобретении представлены способы лечения пациента, у которого наблюдается высокая вероятность развития метаболического нарушения, например, пациентов с высоким риском развития атеросклероза, диабета и т.д., используя соединения, описанные здесь. Факторы риска развития атеросклероза и диабета включают, например, гиперлипидемию и абдоминальное ожирение.

Метаболическое состояние субъекта физиологически контролируют с помощью факторов, которые дают ответную реакцию на уровни ключевых метаболитов в плазме и изменяют экспрессию группы генов, которые соответствующим образом управляют утилизацией и накоплением питательных веществ. Например, при метаболическом гомеостазе жировой ткани требуется баланс между поглощением и накоплением глюкозы и триглицерида и высвобождением жирной кислоты. В настоящем изобретении представлены способы и соединения для регулирования метаболического состояния субъекта, где субъект может быть клеткой, выращенной в культуре, или животным, предпочтительно, когда животное является млекопитающим и, более предпочтительно, когда млекопитающее является человеком.

Измененный или ухудшенный метаболизм жира, или избыток или отсутствие накопления жира, может приводить, в случае избытка накопления жира, к ожирению, включая абдоминальное ожирение, ухудшающему фактору для диабета; в случае истощения или незначительного накопления жира, к нарушенным иммунным функциям и другим метаболическим отклонениям.

Ожирение, особенно абдоминальное или центральное ожирение, является вполне обычным для пациентов с диабетом типа 2. Адипоциты являются основным органом-мишенью для инсулина; адипоциты также секретируют ряд биологических продуктов, таких как лептин, фактор-α некроза опухоли и свободные жирные кислоты, которые модулируют секрецию и действие инсулина. Таким образом, избыточная жировая ткань может способствовать резистентности к инсулину. Например, мутации потеря функции в гене, который кодирует лептин, ассоциируются с предрасположенностью к диабету у грызунов (Chen и соав. (1996) Cell 84:491-495).

Оказалось, что несколько других белков, которые связаны с регулированием жира, выполняют также полезную роль при диабете и сосудистом заболевании. Например, ApoA-IV обладает антиатерогенными свойствами; и мыши, у которых отсутствует PAI-1, в меньшей степени способны контролировать вес тела, увеличивая вес быстрее на диете с высоким содержанием жира, чем мыши дикого типа (см., например, Cohen и соав. (1997) J Clin Invest 99:1906-1916; Verges (1995) Diabetes Metab 21:99-105; Ostos и соав. (2000) Atherosclerosis 153:209-217 и Morange и соав. (2000) Arterioscler Thromb Vase Biol 20:1150-1154). Кроме того, экспрессия PAI-1 усиливается за счет прокахектического цитокина TNF-α и за счет антидиабетических соединений тиазолидиндионного типа (Cigolini и соав. (1999) Atherosclerosis 143:81-90 и lhara и соав. (2001) FASEB J 15:1233-1235). Кроме того, экспрессия белков, таких как связующий белок инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1, приводит к повышенной чувствительности к инсулину и способствует уменьшению массы телесного жира.

Ожирение можно связывать также с повышенной активностью симпатической нервной системы, повышенными уровнями в плазме вазоконстрикторного эндотелина-1 и ухудшенной инсулин-индуцируемой эндотелий-зависимой вазодилатацией. Кроме того, адипоциты могут секретировать вазогенные пептиды, такой как ангиотензиноген. Диабет типа 2, висцеральное ожирение, артериальная гипертензия и липидные нарушения могут принадлежать синдрому, вызванному пониженной чувствительностью к инсулину с компенсаторной гиперинсулинемией, которая создает значительную коронарную опасность (Muller-Wieland и соав. (1998) Basic Res Cardiol 93:131-134).

Соответственно, способы настоящего изобретения можно применять, чтобы фармакологически стабилизировать HIFα и тем самым продуцировать подавление аппетита и последующую потерю веса, ассоциируемую со стимулами гипоксической окружающей среды. В настоящем изобретении демонстрируют, что способы, описанные здесь, приводят к селективному уменьшению телесного жира, которое макроскопически наблюдается в виде исчезновения абдоминальной жировой ткани и уменьшения относительного веса органов, у животных моделей. Эти эффекты наблюдаются у генетически нормальных животных, демонстрируя, что способы изобретения способны соответствующим образом обеспечивать повышающую регуляцию всех факторов, которые необходимы для эффективного уменьшения массы телесного жира.

Так способы изобретения эффективно модулируют многочисленные аспекты регулирования жира, включая транспорт, поглощение, процессинг, утилизацию и накопление жира, способы изобретения являются полезными для лечения или профилактики нарушений, связанных с регулированием жира. Такие нарушения включают, но не ограничиваются ими, ожирение, атеросклероз и т.д. Так как известно, что избыток жира и липидов способствуют появлению опасностей, связанных с развитием диабета, лечение существующими в настоящее время способами может оказывать благоприятное влияние на уменьшение вероятности, частоты или серьезности диабета. Кроме того, известно, что высокие уровни содержания в сыворотке свободных жирных кислот или липидов повышают резистентность к инсулину, что в дальнейшем обостряет патофизиологию диабета.

Соединения и способы настоящего изобретения можно использовать для регулирования веса тела, индуцируя потерю или снижение массы тела без сопутствующей потери массы мышц. Конкретно, способы настоящего изобретения можно использовать для снижения уровней содержания и отложения висцерального жира. Также, способами изобретения потенциально снижают адипогенез и регулируют накопление жира, эффективно контролируя таким образом увеличение веса. Такие способы являются полезными для лечения нарушений в метаболизме жира или для облегчения поддержания соответствующего веса тела. Кроме того, способы и соединения изобретения являются эффективными при уменьшении увеличения веса даже в процессе избыточного калорийного поглощения. Таким образом, фармакологическое регулирование стабилизации HIF создает новый терапевтический подход для лечения или профилактики осложнений, заболеваний и патологий, связанных с регулированием жира, например, ожирения. Путем увеличения анти-липогенных факторов, таких как лептин, PAI-1, ApoA-IV и IGFBP, стабилизация HIF создает терапевтические преимущества для лечения ожирения и связанных с ним осложнений.

Фармацевтические композиции и пути их введения

Композиции настоящего изобретения можно вводить непосредственно или в виде фармацевтических композиций, содержащих наполнители, которые хорошо известны в данной области. Способы лечения настоящего изобретения могут включать введение эффективного количества соединения настоящего изобретения субъекту с метаболическими нарушениями или с риском появления метаболических нарушений; в частности, нарушения, связанного с регулированием жира, например, атеросклероза, ожирения, диабета и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, субъект представляет собой млекопитающее, и в наиболее предпочтительном варианте, субъект представляет собой человека.

Эффективное количество, например, дозу, соединения или лекарственного средства можно легко определять с помощью рутинного экспериментирования, которое может обеспечить эффективный и удобный путь введения и соответствующую композицию. Различные композиции и системы доставки лекарств являются доступными в данной области (Смотри, например, Gennaro, публикация. (2000) Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше и Hardman, Limbird и Gilman, публикации (2001) Фармокологическая основа терапевтики (The Pharmacological Basis of Therapeutic) см. выше.)

Пригодные пути введения могут, например, включать оральное, ректальное, местное, носовое, легочное, глазное, кишечное и парентеральное введение. Первичные пути парентерального введения включают внутривенное, внутримышечное и подкожное введение. Вторичные пути введения включают внутрибрюшинное, внутриартериальное, внутрисуставное, внутрисердечное, интрацистернальное, интрадермальное, интралезиональное, внутриглазное, интраплевральное, внутриоболочечное, внутриматочное и интравентрикулярное введение. Показания для лечения, вместе с физическими, химическими и биологическими свойствами лекарственного средства, диктуют тип композиции и путь введения, который будет применяться, а также какая, точечная или системная, доставка будет предпочтительной.

Фармацевтические формы дозировок соединения настоящего изобретения можно создавать в форме немедленного высвобождения, контролированного высвобождения, замедленного высвобождения, или системы с направленной доставкой лекарственного средства. Обычно используемые формы дозировок включают, например, растворы и суспензии, (микро-) эмульсии, мази, гели и пластыри, липосомы, таблетки, драже, капсулы в твердой или мягкой оболочке, суппозитории, овули, имплантаты, аморфные или кристаллические порошки, аэрозоли и лиофилизованные композиции. В зависимости от используемого пути введения, могут потребоваться специальные устройства для применения или введения лекарственного препарата, такие как, например, шприцы и иглы, ингаляторы, насосы, емкости для инъекций (injection pen), аппликаторы или специальные колбы. Фармацевтические формы дозировок часто состоят из лекарственного средства, наполнителя(лей) и контейнера/закрытой системы. Один или несколько наполнителей, к тому же относящихся к неактивным ингредиентам, можно добавлять к соединению настоящего изобретения для улучшения или облегчения производства, стабильности, введения и безопасности лекарственного средства, и эти наполнители могут обеспечить необходимое условие для достижения желаемого уровня высвобождения лекарственного средства. Поэтому, тип наполнителя(лей), который добавляют к лекарственному средству, может зависеть от различных факторов, таких как, например, физические и химические свойства лекарственного средства, пути введения и способа производства. Фармацевтически приемлемые наполнители являются доступными в данной области и включают те соединения, которые приведены в различных фармакопеях. (Смотри, например, фармакопею США (USP), Японскую фармакопею (IP), Европейскую фармакопею (ЕР) и Британскую фармакопею (ВР); the U.S. Food and Drug Administration (www.fda.gov) Center for Drug Evaluation and Research (CEDR) публикации, например, Inactive Ingredient Guide (1996); Ash and Ash, публикации (2002) Handbook of Pharmaceutical Additives, Synapse Information Resources, Inc., Endicott NY и т.д.).

Фармацевтические формы дозировок соединения настоящего изобретения можно изготавливать с помощью любого из способов, хорошо известных в данной области, таких как, например, обычного смешивания, рассева, растворения, плавления, гранулирования, производства драже, таблетирования, суспендирования, экструзии, распылительной сушки, растирания в порошок, эмульгирования, (нано-/микро-) капсулирования, покрытия оболочкой, или процессов лиофилизации. Как отмечалось выше, композиции настоящего изобретения могут включать один или большее количество физиологически приемлемых неактивных ингредиентов, которые облегчают процессинг активных соединений в препаратах для фармацевтического применения.

Соответствующая композиция зависит от желаемого пути введения. Для внутривенной инъекции, например, композицию можно изготавливать в виде водного раствора, если необходимо, с использованием физиологически совместимых буферных растворов, включая, например, фосфаты, гистидин или цитрат для регулирования рН композиции, и тонизирующий агент, такой как, например, хлорид натрия или декстроза. Для введения через слизистую оболочку или носового введения могут быть предпочтительными полутвердые, жидкие композиции, или пластыри, возможно содержащие усилители проницаемости. Такие усилители проницаемости обычно известны в данной области. Для орального введения, соединения можно готовить в виде жидких или твердых форм дозировок и в виде растворимых композиций или композиций с контролированным/замедленным высвобождением. Пригодные формы дозирования для орального приема объектом исследования включают таблетки, пилюли, драже, капсулы в твердой и мягкой оболочке, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и эмульсии. Соединения можно также готовить в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычную суппозиторную основу, такую как масло какао или другие глицериды.

Твердые оральные формы дозировок можно получать с использованием наполнителей, которые могут включать заполнители, дезинтегранты, связующие агенты (сухие или мокрые), замедлители растворения, смазывающие агенты, глиданты, антиадгезирующие добавки, катионообменные смолы, смачивающие агенты, антиоксиданты, консерванты, окрашивающие агенты и ароматизаторы. Эти наполнители могут быть синтетическими или из природных источников. Примеры таких наполнителей включают производные целлюлозы, лимонную кислоту, дикальций фосфат, желатин, карбонат магния, магний/натрий лаурилсульфат, маннитол, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, силикаты, диоксид кремния, бензоат натрия, сорбит, крахмалы, стеариновую кислоту или ее соль, сахара (т.е. декстрозу, сахарозу, лактозу и т.д.), тальк, трагакантовый клей, растительные масла (гидрированные) и воска. Этанол и вода могут служить в качестве гранулирующих добавок. В некоторых случаях, может быть желательным, например, покрытие таблеток пленкой, маскирующей вкус, пленкой, защищающей от воздействия желудочной кислоты, или пленкой для обеспечения замедленного высвобождения. Природные и синтетические полимеры в комбинации с окрашивающими агентами, сахарами и органическими растворителями или водой, часто используют для покрытия таблеток, что приводит к получению драже. Если капсула является предпочтительной по сравнению с таблеткой, то порошок лекарственного средства, суспензия или его раствор можно ввести в капсулу с твердой или мягкой оболочкой.

В одном из вариантов осуществления изобретения, соединения настоящего изобретения можно вводить местно, например, через пластырь на коже, с помощью полутвердой или жидкой композиции, например, геля, (микро-) эмульсии, мази, раствора, (нано-/микро-) суспензии или пены. Проникновение лекарственного средства в кожу и нижележащие ткани можно регулировать, например, используя усилители степени проникновения; соответствующего выбора и комбинации липофильных, гидрофильных и амфифильных наполнителей, включая воду, органические растворители, воска, масла, синтетические и природные полимеры, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы; путем регулирования рН; и использования комплексообразующих агентов. Для регулирования проникновения в кожу соединения настоящего изобретения, можно использовать другие приемы, такие как ионофорез. Трансдермальное или местное введение может быть предпочтительным, например, в ситуациях, в которых является желательной местная доставка с минимальным систематическим временем воздействия.

Для введения лекарственного средства путем ингаляции, или путем введения в нос, соединения для использования согласно настоящему изобретению обычно вводят в форме раствора, суспензии, эмульсии или полутвердого аэрозоля из герметизированных баллончиков, или распылителя, обычно с использованием газа-вытеснителя, например, галогенизированных углеводородов, полученных из метана и этана, диоксида углерода, или любого другого пригодного газа. Для местных аэрозолей, полезными являются углеводороды, подобные бутану, изобутану и пентану. В случае герметизированного аэрозоля, соответствующее дозирующее устройство можно регулировать путем обеспечения клапана для доставки дозированного количества. Можно изготавливать капсулы и картриджи, например, из желатина, для использования в ингаляторе или аппарате для вдувания. Эти продукты обычно содержат порошкообразную смесь соединения изобретения и пригодную порошкообразную основу, такую как лактоза или крахмал.

Композиции, приготовленные для парентерального введения путем инъекции, являются обычно стерильными и могут содержаться в формах для стандартного дозирования, например, ампулах, шприцах, емкостях для инъекций или в контейнерах с большим количеством доз, причем последние обычно содержат консервант. Композиции могут быть в виде суспензий, растворов или эмульсий в масле или в связующем на водной основе и могут содержать агенты композиции, такие как буферные растворы, тонизирующие агенты, загущающие агенты, поверхностно-активные вещества, суспендирующие и диспергирующие агенты, антиоксиданты, биосовместимые полимеры, хелатирующие агенты и консерванты. В зависимости от участка инъекции, наполнитель может содержать воду, синтетическое или растительное масло, и/или органические сорастворители. В конкретных примерах, таких как лиофилизованный продукт или концентрат, парентеральную композицию можно заново составлять или разбавлять до введения. Базовые композиции, обеспечивающие контролированное или замедленное высвобождение соединения настоящего изобретения, могут включать суспензии для инъекции, состоящие из нано/микро частиц или нано/микро или немикронизованных кристаллов. Полимеры, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота или их сополимеры, могут служить в качестве матриц контролированного/замедленного высвобождения, в дополнение к другим, хорошо известным в данной области соединениям. Другие базовые системы доставки могут быть представлены в форме имплантатов и насосов, для которых требуются разрезы.

Пригодные носители для внутривенной инъекции соединений настоящего изобретения хорошо известны в данной области и включают растворы на водной основе, содержащие основания, такие как, например, гидроксид натрия, для образования ионизируемых соединений, сахарозу или хлорид натрия в качестве тонизирующего агента, например, буферного раствора, содержащего фосфат или гистидин. Можно добавлять сорастворители, такие как, например, полиэтиленгликоли. Эти системы на водной основе являются эффективными при разбавлении соединений настоящего изобретения и обеспечивают низкую токсичность при систематическом введении. Соотношение компонентов системы раствора можно значительно изменять, без изменения растворимости и характеристик токсичности. Кроме того, можно изменять природу компонентов. Например, можно использовать низкотоксичные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты или полоксамеры, так же как можно добавлять такие соединения, как полиэтиленгликоль или другие сорастворители, биосовместимые полимеры, такие как поливинилпирролидон, а другие сахара и полиолы можно заменять на декстрозу.

Для композиции, пригодной для способов лечения, представленных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно рассчитать предварительно, используя множество методов, хорошо известных в данной области. Первоначальные дозы, используемые при исследованиях на животных, могут базироваться на эффективных концентрациях, установленных при анализах клеточных культур. Диапазоны дозирования, соответствующие субъектам в виде человека, можно определять, например, используя данные, полученные из исследований на животных и анализов клеточных культур.

Эффективное количество или терапевтически эффективное количество или доза агента, например, соединения по настоящему изобретению, относится к количеству соединения или агента, которое приводит к улучшению симптомов или пролонгированию выживания у субъекта. Токсичность и терапевтическую эффективность таких молекул можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур на культурах клеток или на экспериментальных животных, например, путем определения величины LD₅₀ (летальной дозы у 50% популяции) и ED₅₀ (терапевтически эффективной дозы у 50% популяции). Дозовое соотношение токсичности к терапевтической эффективности представляет собой терапевтический индекс, который можно выражать в виде отношения LD₅₀/ED₅₀. Агенты, которые показывают высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными.

Эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество соединения или фармацевтической композиции, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, которые находятся в поле зрения исследователя, ветеринара, медицинского врача или другого клинициста, например, будет регулировать метаболизм жира, снижать содержание жира в организме, регулировать вес тела, обеспечивать лечение или профилактику нарушения, например, ожирения и т.д.

Дозировки препаратов, предпочтительно, находятся в пределах диапазона обычных концентраций, который включает ED₅₀ с малой токсичностью или с отсутствием токсичности. Дозировки препаратов могут изменяться в пределах этого диапазона в зависимости от применяемой формы дозирования и/или используемого пути введения. Точный состав, путь введения, дозировка и интервал дозирования должны выбираться в соответствии со способами, известными в данной области, и в соответствии с конкретным состоянием субъекта.

Дозируемое количество и интервал дозирования можно регулировать индивидуально для обеспечения уровней активного остатка в плазме, которые будут достаточными для достижения желаемых эффектов, например, для регулирования метаболизма жира, снижения веса тела, уменьшения накопления жира и т.д., т.е. для создания минимальной эффективной концентрации (МЕС). Величина МЕС будет изменяться для каждого соединения, но ее можно рассчитать, используя, например, данные in vitro и данные экспериментов на животных. Дозирующие количества, необходимые для достижения МЕС, будут зависеть от индивидуальных характеристик и путей введения препаратов. В случаях местного введения или селективного поглощения, эффективная местная концентрация лекарственного препарата может быть не связана с концентрацией его в плазме.

Вводимое количество агента или композиции может зависеть от множества факторов, включающих пол, возраст и вес субъекта, который подвергается лечению, серьезность поражения болезнью, способ введения и заключение лечащего врача.

Композиции настоящего изобретения, если желательно, можно содержать в упаковке или в раздаточном устройстве, которое имеет в своем составе одну или большее количество форм стандартного дозирования активного ингредиента. В такой упаковке или раздаточном устройстве, могут, например, использовать металлическую или пластиковую фольгу, такую, как в облатке, или стеклянные и каучуковые пробки, такие как в пузырьках. К упаковкам или раздаточным устройствам можно прикладывать инструкции по введению лекарственных препаратов. Можно также приготовить композиции, содержащие соединение настоящего изобретения, рецептированное вместе с фармацевтически приемлемым носителем, и поместить их в соответствующий контейнер с наклейкой, содержащей предписание для лечения медицински показанного состояния.

Соединения и способы их скрининга

Соединение настоящего изобретения представляет собой соединение, которое ингибирует активность гидроксилазы, где конкретно активность гидроксилазы является активностью фермента 2-оксоглутарат-диоксигеназы. Более предпочтительно, активность гидроксилазы является активностью фермента HIF гидроксилазы. И наиболее предпочтительно, активность гидроксилазы является активностью фермента HIF пролилгидроксилазы.

Способ настоящего изобретения представляет собой спосо6, который зависит от стабилизации HIFα для достижения конкретного результата у субъекта. Предпочтительно, способы настоящего изобретения осуществляют путем введения соединения настоящего изобретения для стабилизации HIFα и для достижения конкретного результата у субъекта. Более предпочтительно, способы настоящего изобретения осуществляют путем введения соединения настоящего изобретения.

Соединения настоящего изобретения приводятся в виде примеров для использования в способах настоящего изобретения, которые относятся к стабилизации HIFα. В частности, в настоящем изобретении представлены соединения и способы для скрининга и идентификации дополнительных соединений, которые ингибируют HIF гидроксилазную активность и/или HIFα гидроксилирование, стабилизацию HIFα и т.д. Соединения настоящего изобретения включают такие соединения, которые ингибируют гидроксилазную активность, предпочтительно такую гидроксилазную активность, которая представляет собой активность фермента 2-оксоглутарат-диоксигеназы и, более предпочтительно, такую гидроксилазную активность, которая представляет собой активность HIF гидроксилазы. HIF гидроксилаза может гидроксилировать любую аминокислоту, включая, например, остаток пролина или остаток аспаргина, и.т.д., в HIF белке, предпочтительно, в субъединице HIFα. В особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения, гидроксилазная активность представляет собой активность HIF пролилгидроксилазы и/или HIF аспарагинилгидроксилазы.

Ингибиторы активности 2-оксоглутарат-диоксигеназы известны в данной области. Например, были идентифицированы несколько низкомолекулярных ингибиторов проколлаген-пролил-4-гидроксилазы. (Смотри, например, Majamaa и соав. (1984) Eur J Biochem 138:239-245; Majamaa и соав. (1985) Biochem J 229:127-133; Kivirikko и Myllyharju (1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel и соав. (1998) Hepatology 28:404-411; Friedman и соав. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741 и Franklin и соав. (2001) Biochem J 353:333-338; все введенные здесь в виде ссылки во всей полноте.). Были также идентифицированы низкомолекулярные ингибиторы HIF гидроксилаз. (Смотри, например, международные публикации WO 02/074981, WO 03/049686 и WO 03/080566, все введенные здесь в виде ссылки во всей полноте.) В настоящем изобретении конкретно представлено использование этих и других соединений, которые можно идентифицировать, используя способы, известные в данной области.

Для всех ферментов в семействе 2-оксоглутарат-диоксигеназы требуются кислород, соединения Fe²⁺, 2-оксоглутарат и аскорбиновая кислота для их гидроксилазной активности. (Смотри, например, Majamaa и соав. (1985) Biochem J 229:127-133; Myllyharju и Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180; Thornburg и соав. (1993) 32:14023-14033 и Jia и соав. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231.) Поэтому, соединения настоящего изобретения включают, но не ограничиваются ими, соединения, хелатирующие железо, миметики 2-оксаглутарата и модифицированные аминокислоты, например, пролиновые или аспарагиновые аналоги.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения представлено использование структурных миметиков 2-оксоглутарата. Такие соединения могут ингибировать фермент 2-оксоглутарат-диоксигеназы, выступающий в качестве мишени, конкурентно по отношению к 2-оксоглутарату и неконкурентно по отношению к железу. (Majamaa и соавт. (1984) см. выше и Majamaa и соавт. (1985) см. выше). Конкретно рассматриваются описанные соединения, например у Majamaa и соавт. см. выше; Kivirikko и Myllyharju (1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel и соав. (1998) Hepatology 28:404-411; Friedman и соав. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741; Franklin (1991) Biochem Soc Trans 19:812-815; Franklin и соав. (2001) Biochem J 353:333-338 и международная публикация за номером WO 03/049686, все введенные здесь в виде ссылки во всей их полноте.

Примеры соединений включают фенантролины, включающие, но не ограничивающиеся ими, такие соединения, которые описаны в Патентах США 5916898 и 6200974 и международной публикации WO 99/21860; гетероциклические карбонилглицины, включающие, но не ограничивающиеся ими, замещенные хинолин-2-карбоксамиды и их эфиры, которые описаны, например, в Патентах США 5719164 и 5726305; замещенные изохинолин-3-карбоксамиды и их эфиры, которые описаны, например, в Патенте США 6093730; 3-метоксипиридин карбонилглицины и их эфиры, которые описаны, например, в Европейской патентной заявке ЕР 0650961 и патенте США 5658933; 3-гидроксипиридин карбонилглицины и их эфиры, которые описаны, например, в патентах США 5620995 и 6020350; 5-сульфонамидокарбонил пиридинкарбоксилаты и их эфиры, которые описаны, например, в патентах США 5607954, 5610172 и 5620996. Все соединения, приведенные в этих патентах, в частности, все те соединения, которые приведены в пунктах Формулы изобретения, касающихся соединений, и в конечных продуктах рабочих примеров, вводятся в настоящую заявку в виде ссылки.

Поэтому, предпочтительные соединения настоящего изобретения включают, например, гетероциклические карбоксамиды. Конкретно, предпочтительные гетероциклические карбоксамиды включают, например, изохинолины, хинолины, пиридины, циннолины, карболины и т.д. Кроме того, структурные классы предпочтительных соединений включают антрахиноны, азафлуорены, азафенантролины, бензимидазолы, бензофураны, бензопираны, бензотиофены, катехолы, хроманоны, α-дикетоны, фураны, N-гидроксамиды, N-гидроксимочевины, имидазолы, индазолы, индолы, изотиадиазолы, изотиазолы, изоксадиазолы, изоксазолы, α-кето-кислоты, α-кето-амиды, α-кето-эфиры, α-кето-имины, оксадиазолы, оксалиламиды, оксазолы, оксазолины, пурины, пираны, пиразины, пиразолы, пиразолины, пиридазины, пиридины, хиназолины, фенантролины, тетразолы, тиадиазолы, тиазолы, тиазолины, тиофены и триазолы.

Для демонстрации способов настоящего изобретения, описанных здесь, в качестве примеров используют соединения:[(7-Хлор-3-гидрокси-хинолин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение А), [(1-Хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение В), [(4-Гидрокси-7-фенокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение С), 4-Оксо-1,4-дигидро-[1,10]фенантролин-3-карбоновую кислоту (соединение D), [1-Хлор-4-гидрокси-7-метокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение Е), [(3-Гидрокси-6-изопропокси-хинолин-2-карбонил)амино]-уксусную кислоту (соединение F), [(3-Гидрокси-пиридин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение G) и Метиловый эфир [(7-бензилокси-1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусной кислоты (соединение Н).

Для идентификации соединений настоящего изобретения, т.е. соединений, которые ингибируют гидроксилазную активность, можно использовать различные методы анализа и способы скрининга, включая те, которые описаны ниже. Эти соединения являются пригодными для использования в способах настоящего изобретения. Кроме того, соединения, пригодные для использования в способах настоящего изобретения, т.е. соединения, которые стабилизируют субъединицу HIFα, могут идентифицировать специалисты в данной области, используя доступную методологию анализа и скрининга.

Для обнаруживаемых сигналов, связанных с расходом реакционного субстрата или образованием продукта реакции, обычно будет предусматриваться анализ. Продукты обнаружения могут включать, например, флуоресцентные метки, радиоактивные изотопы, конъюгаты фермента и другие обнаруживаемые метки, хорошо известные в данной области. Могут быть получены количественные или качественные результаты. Выделение продукта реакции можно облегчить за счет использования метки, такой как биотиновая или гистидиновая метка, которая позволяет очищать продукт от других компонентов реакции путем осаждения или афинной хроматографии.

Анализы на гидроксилазную активность являются стандартными в данной области. Такие анализы могут непосредственно или косвенно определять гидроксилазную активность. Например, анализ может определять содержание гидроксилированных остатков, например, пролина, аспарагина и т.д., присутствие в ферментном субстрате, например, белка, выступающего в качестве мишени, синтетического пептидного миметика, или его фрагмента (См., например, Palmerini и соавт. (1985) J Chromatogr 339:285-292). Уменьшение содержания гидроксилированного остатка, например, пролина или аспарагина, в присутствии соединения настоящего изобретения является показателем того, что указанное соединение ингибирует гидроксилазную активность. Альтернативно, анализы могут оценивать другие продукты реакции гидроксилирования, например, образование сукцината из 2-оксоглутарата (См., например, Cunliffe и соав. (1986) Biochem J 240:617-619) Kaule и Gunzler (1990; Anal Biochem 184:291-297) описывают в качестве примера процедуру, с помощью которой оценивают образование сукцината из 2-оксоглутарата.

Процедуры, подобные описанным выше, можно использовать для идентификации соединений, которые модулируют HIF гидроксилазную активность. Пример такой процедуры описывают в Примере 8 (приведенном ниже). Белок, выступающий в качестве мишени, может включать HIFα или ее фрагмент, например, HIF (556-575); например, субстрат, который выступает в качестве примера для использования в анализе, описанном в Примере 9, представляет собой DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID NO:1). Фермент может включать, например, HIF пролилгидроксилазу (см., например, поступление в Генбанк за номером AAG33965 и т.д.) или HIF аспарагинилгидроксилазу (см., например, Genbank, регистрационный № AAL27308 и т.д.), полученные из любого источника. Фермент может также присутствовать в неочищенном клеточном лизате или в частично очищенной форме. Например, процедуры, с помощью которых измеряют HIF гидроксилазную активность, непосредственно описаны у Ivan и соавт. (2001, Science 292:464-468 и 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99:13459-13464) и Hirsila и соав. (2003, J Biol Chem 278:30772-30780); дополнительные способы описаны в Международной заявке WO 03/049686. Измерение и сравнение активности фермента в отсутствие и в присутствии соединения настоящего изобретения будут идентифицировать соединения, которые ингибируют гидроксилирование HIFα.

Анализы стабилизации HIFα и/или HIF активации могут включать прямое измерение HIFα в образце (Смотри, например, Пример 8, ниже), косвенное измерение HIFα, например, с помощью измерения уменьшения содержания HIFα, связанного с белком Hippel Lindau (смотри, например. Международную заявку WO 00/69908), или активацию HIF ответных генов, выступающих в качестве мишени или конструктов репортеров (см., например, патент США 5942434). Измерение и сравнение уровней HIF и/или HIF ответных белков, выступающих в качестве мишени, в отсутствие и в присутствии соединения настоящего изобретения будет идентифицировать соединения, которые стабилизируют HIFα и/или активируют HIF.

Представления об этих и других вариантах осуществления настоящего изобретения будут легко возникать у специалистов в данной области, имея в виду приведенное здесь описание.

Примеры

Далее изобретение будет рассматриваться со ссылкой на следующие примеры, которые представляют собой лишь характерные образцы изобретения. Эти примеры приводятся единственно для иллюстрации заявленного изобретения. Настоящее изобретение не ограничивается в объеме вариантами, приведенными в качестве примеров, которые предназначаются в качестве иллюстраций лишь единичных аспектов изобретения. Любые способы, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема изобретения. Различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным здесь, будут очевидны специалистам в данной области на основе вышеприведенного описания и сопровождающих чертежей. Предполагается, что такие модификации находятся в пределах объема прилагаемой Формулы изобретения.

Пример 1: Материалы для теста

В основном, соединения настоящего изобретения синтезировали с помощью стандартных химических методов, известных специалистам в данной области. Соединения подвергали анализу на чистоту с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и хранили при комнатной температуре защищенными от света. В процессе разработки рецептуры для различных применений, соединения подвергали микронизации в суспензии при скорости либо 500 об/мин в течение 25 минут, либо при скорости 750 об/мин в течение 10 минут, используя планетарную микромельницу PULVERISETTE 7 (Fritsch GMBH, Germany) для создания частиц однородного размера.

Суспензии микронизованного соединения для орального введения через желудочный зонд готовили непосредственно перед использованием. Соединение суспендировали в водном растворе, содержащем 0,5% натрий карбоксиметилцеллюлозы (CMC; Spectrum Chemical, Gardena CA), 0,1% полисорбата 80 (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg NJ), и постоянно перемешивали, используя магнитную мешалку или ротационный шейкер, во время введения дозы. Концентрацию суспензий рассчитывали для достижения намеченного уровня дозы в данном объеме. В альтернативных процедурах, соединение взвешивали и помещали в желатиновые капсулы с соответствующим размером для орального введения, в то время как контрольные животные получали пустые капсулы такого же размера; или же соединение растворяли в 100 мМ растворе гистидина (Mallinckrodt Baker) и давали по желанию (ad libikum) вместо воды.

Для введения путем инъекции, соединение вначале смешивали с эквимолярным количеством гидроксида натрия, или в водном растворе 10% глюкозы (Spectrum) или в растворе 25 мМ гистидина вместе с хлоридом натрия для получения изотонического раствора (Mallinckrodt Baker).

Пример 2: Повышенная экспрессия лептина in vitro в выбранных типах клеток

Влияние способов и соединений изобретения на регулирование содержания жира и, конкретно, на экспрессию факторов, связанных с метаболизмом жира и чувством насыщения, исследовали следующим образом. Клетки HeLa (эпителиальной карциномы шейки матки) человека, 293 А (эпителия фетальной почки, трансформированного аденовирусом; Qbiogene, Carlsbad CA), НерЗВ (гепатоцеллюлярной карциномы), HFF (фибробласта крайней плоти), НМЕС-1 (микрососудистые эндотелиальные клетки), HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены) и клетки адипоцита раздельно высевали в 24-луночные чашки для культур из расчета 100000 клеток на чашку и выращивали в течение одного дня при 37°С, в атмосфере 20% O₂, 5% СО₂ в следующей среде: клетки HeLa, 293A и НерЗВ в DMEM, содержащем 1% FBS и 1% пеницилин-стрептомицина; НМЕС-1 и HUVEC в среде для эндотелиального роста (EGM-2; Cambrex, Walkersville MD), клетки HFF в DMEM, содержащем 10% FBS и 1% пеницилин-стрептомицина, и клетки адипоцита в среде Adipocyte (Zen-Bio, Research Triangle Park NC). Среду затем заменяли свежей средой, подобной вышеописанной, за исключением того, что уровни содержания сыворотки в культурах HeLa, 293A, НерЗВ и HFF снижали до 0,5% FBS. В клетки добавляли наполнитель (0,5% DMSO) в качестве контрольного соединения, а также соединение В, и клетки инкубировали в течение дополнительных 3 дней. Затем собирали бесклеточные надосадочные жидкости и подсчитывали уровни содержания лептина, используя иммуноанализ QUATNTTKINE (R&D Systems, Inc., Minneapolis MN) согласно предписаниям производителя.

Как показано на Фиг.1А, повышенную экспрессию лептина наблюдали в адипоцитах, но не в других типах клеток, после обработки соединением настоящего изобретения.

В отдельном эксперименте, преадипоциты помещали в 24-луночные планшеты, из расчета 45000 клеток на лунку, и выращивали в течение 3 дней в преадипоцитной среде (Zen-Bio). Среду затем изменяли на дифференциационную среду (Zen-Bio) и клетки обрабатывали либо наполнителем, в качестве контрольного соединения (0,5% DMSO), либо соединением В в количестве 25 или 50 мкМ вплоть до 12 дней. Половину культуральной среды заменяли каждые 3 дня, а надосадочные жидкости культур, не содержащие клеток, генерировали и анализировали для определения уровней содержания секреции лептина, используя иммуноанализ QUANTIKINE (R&D System) согласно предписаниям производителя.

Как показано на Фиг.1В, обработка преадипоцитов соединением В продуцировала зависимое от дозы увеличение секреции лептина по сравнению с клетками, обработанными контрольным наполнителем, и уровни содержания лептина продолжали повышаться в течение всего 12-дневного периода.

В аналогичном эксперименте, адипоциты высевали в 24-луночные планшеты, из расчета 100000 клеток на лунку, в адипоцитной среде (Zen-Bio) и обрабатывали либо наполнителем, в качестве контрольного соединения, соединением А, соединением Е, либо соединением F в количестве 25 мкМ, либо соединением В в количестве 25 или 50 мкМ. Половину культуральной среды заменяли каждые 3 дня, а надосадочные жидкости культур, не содержащие клеток, генерировали и анализировали для определения уровней содержания секреции лептина, используя иммуноанализ QUANTIKINE (R&D System) согласно предписаниям производителя.

Как показано на Фиг.1C, обработка адипоцитов соединениями изобретения продуцировала увеличение секреции лептина по сравнению с клетками, обработанными контрольным наполнителем, и уровни содержания лептина продолжали повышаться в течение всего 12-дневного периода.

Лептин представляет собой регуляторный фактор, принимающий участие в регулировании и метаболизме жира - транспорте, накоплении, процессинге, утилизации и т.д. - и в подавлении аппетита и т.д. Способность соединений и способов настоящего изобретения регулировать экспрессию лептина дает основание использовать соединения и способы изобретения для регулирования метаболизма жира и, применительно к конкретным субъектам, для уменьшения или профилактики увеличения веса, или даже для индуцирования потери веса.

Пример 3: Повышенная экспрессия факторов, принимающих участие в регулировании содержания жира

Способность соединений и способов настоящего изобретения регулировать метаболизм жира, в частности, повышать экспрессию факторов, принимающих участие в транспорте, утилизации и накоплении жира, анализировали следующим образом. Для установления характера индукции гена с течением времени, от фирмы Simonsen, Inc. были получены двадцать четыре самца мышей Swiss Webster (весом 30-32 грамма) и подвергнуты оральному кормлению через желудочный зонд раствором из расчета 4 мл/кг либо 0,5% раствором карбоксиметилцеллюлозы (CMC; Sigma-Aldrich, St. Louis МО) (0 мг/кг), либо 1,25% раствором соединения В (25 мг/мл в 0,5% CMC) (100 мг/кг). На 4, 8, 16, 24, 48 или 72 часы после конечной дозы, животных анестезировали изофлураном. Мышей затем умерщвляли и образцы ткани почки, печени, мозга, легкого и сердца выделяли и хранили в растворе RNALATER (Ambion) при температуре -80°С.

Выделение РНК проводили, используя следующий протокол. Часть каждого органа, соответствующую 50 мг, нарезали в форме кубиков, добавляли 875 мкл буферного раствора RLT (набор KNEASY; Qiagen Inc., Valencia CA), и кусочки гомогенизировали в течение около 20 секунд, используя ротор-статорный гомогенизатор POLYTRON (Kinematica, Inc., Cincinnati ОН). Гомогенат микроцентрифугировали в течение 3 минут для гранулирования нерастворимого материала, надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и выделяли РНК, используя набор RNEASY (Qiagen), согласно предписаниям производителя. РНК элюировали в 80 мкл воды и подвергали количественному анализу, используя реагент RIBOGREEN (Молекулярные пробы, Eugene OR). Геномную ДНК затем удаляли из РНК, используя набор DNA-FREE (Ambion Inc., Austin TX), согласно предписаниям производителя. Оптическую плотность измеряли при 260 и 280 нм для определения чистоты и концентрации РНК.

Альтернативно, образцы ткани нарезали в форме кубиков и гомогенизировали в реагенте TRIZOL (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA), используя ротор-статорный гомогенизатор POLYTRON (Kinematica). Гомогенаты доводили до комнатной температуры, добавляли 0,2 объема хлороформа, и образцы энергично перемешивали. Смеси инкубировали при комнатной температуре в течение нескольких минут и затем центрифугировали при скорости 12000 g в течение 15 минут при 4°С. Водную фазу собирали и добавляли 0,5 объема изопропанола. Образцы перемешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугировали в течение 10 минут при скорости 12000 g при 4°С. Надосадочную жидкость удаляли и гранулированный материал промывали раствором 75% EtOH и центрифугировали при скорости 7500 g в течение 5 мин при температуре 4°С. Геномную ДНК затем удаляли из РНК, используя набор DNA-FREE (Ambion Inc., Austin TX) согласно предписаниям производителя. Оптическую плотность измеряли при 260 и 280 нм для определения чистоты и концентрации РНК.

РНК осаждали в 0,3 М растворе ацетата натрия (рН 5,2), 50 нг/мл гликогена и 2,5 объемах этанола в течение одного часа при 20°С. Образцы центрифугировали и гранулированный материал промывали холодным 80% этанолом, высушивали и повторно суспендировали в воде. Двухцепочечную кДНК синтезировали, используя первый цепочечный праймер T7-(dT)24 (Affymetrix, Inc., Santa Clara CA) и систему SUPERSCRIPT CHOICE (Invitrogen) согласно предписаниям производителя. Конечную кДНК экстрагировали равным объемом смеси 25:24:1 фенола:хлороформа:изоамилового спирта, используя инсерт PHASE LOCK GEL (Brinkman, Inc., Westbury NY). Жидкую фазу собирали и кДНК осаждали, используя 0,5 объема 7,5 М раствора ацетата аммония и 2,5 объема этанола. Альтернативно, кДНК очищали, используя модуль для очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) согласно предписаниям производителя.

Биотин-меченую кРНК синтезировали из кДНК в реакции трансляции in vitro (IVT), используя набор для мечения транскрипта BIOARRAY HIGHYIELD RNA (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY) согласно предписаниям производителя. Конечный меченый продукт очищали и фрагментировали, используя модуль для очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) согласно предписаниям производителя.

Гибридизационный коктейль готовили путем доведения 5 мкг зонда до 100 мкл в смеси 1 х гибридизационный буферный раствор (100 мМ MES, 1 М [Na⁺], 20 мМ EDTA, 0,01% Tween 20), 100 мкг/мл ДНК спермы сельди, 500 мкг/мл ацетилированного BSA, 0,03 нМ контрольное oligo B2 (Affymetrix), и в 1 х контрольной пробе GENECHIP на эукариотическую гибридизацию (Affymetrix). Коктейль последовательно инкубировали при 99°С в течение 5 минут и 45°С в течение 5 минут и затем центрифугировали в течение 5 минут. Массу мышиного генома U74AV2 (MG-U74Av2; Affymetrix) доводили до комнатной температуры и затем подвергали предварительной гибридизации 1 х гибридизационным буферным раствором при 45°С в течение 10 минут с вращением. Буферный раствор заменяли затем 80 мкл гибридизационного коктейля и массу подвергали гибридизации в течение 16 часов при 45°С со скоростью вращения 60 об/мин в одну и другую сторону. После гибридизации, массы промывали один раз, используя 6 х SSPE, 0,1% Tween 20 и затем промывали и окрашивали, используя R-фикоэритрин-конъюгированный стрептавидин (Молекулярные пробы, Eugene OR), биотинилированное овечье анти-стрептавидиновое антитело (Векторные лаборатории, Burlingame CA), и оборудование GENECHIP Fluidics Station 400 согласно micro_lvl протокола предписания изготовителя (Affymetrix). Массы анализировали, используя сканер GENEARRAY (Affymetrix) и программное обеспечение Microarray Suite (Affymetrix).

Масса мышиного генома U74AV2 (Affymetrix) представляет все последовательности (˜6000) в конструкции 74 UniGene в базе данных мышей (Национальный центр биотехнологической информации, Bethesda MD), которые были функционально охарактеризованы, и, приблизительно, 6000 неаннотированных кластеров с меткой экспрессированной последовательности (EST).

Как показано на Фиг.2А, экспрессия генов, кодирующих белки, принимающих участие в метаболизме и транспорте жира, увеличивается в печени координированным образом после обработки соединением изобретения. Характеристики транскрипта, представленные на Фиг.2А, включают (1) аполипопротеин А-IV, (2) цитозольную ацил-СоА-тиоэстеразу-1, (3) связующий белок инсулиноподобного фактора роста (IGFBP)-1 и (4) карнитин-ацетилтрансферазу. В ходе представленного проведения испытания, уровни содержания мРНК для этих белков сначала возрастали, затем возвращались до контролируемых уровней после 24 часов. На Фиг.2В показана специфическая экспрессия во время испытания для PAI-1, который проявил аналогичную, хотя и более раннюю индукцию экспрессии после обработки соединениями настоящего изобретения.

Эти данные показывают, что способы и соединения настоящего изобретения регулируют метаболизм жира путем повышения экспрессии in vivo факторов, связанных с накоплением, поглощением, транспортом, синтезом, процессингом и утилизацией жира прямо (например, ApoA-IV, карнитин-тиоэстеразы, карнитин-ацетилтрансферазы, PAIs и т.д.) или косвенно (например, IGFBP-1 и т.д.). Способы и соединения настоящего изобретения можно применять терапевтически для лечения или профилактики состояний, связанных с высоким содержанием холестерина, например, атеросклероза и т.д., и ухудшенным метаболизмом жира.

Пример 4: Измененная экспрессия регуляторных факторов, принимающих участие в адипоцитной дифференциации

Для дальнейшего исследования влияния способов и соединений настоящего изобретения на экспрессию генов, связанных с метаболизмом и адипогенезом жира, в экспериментах, которые выполняли, как описано в Примере 3 выше, анализировали специфические адипогенные факторы. Как показано на Фиг.3А, экспрессия DEC1/Stra13 вначале повышалась в печени животных, которых лечили соединением В, а затем постепенно возвращалась к исходному уровню через 72 часа после дозирования лекарственных препаратов. Известно, что DEC1/Stra13 подавляет экспрессию ядерного рецептора гормона PPAR-γ2, которая необходима для дифференциации адипоцитов. (Смотри, например, Yun и соав., см. выше; Giusti и соав., см. выше и Muller и соав., см. выше.) Таким образом, когда экспрессия DEC1/Stra13 возрастает, следует ожидать, что экспрессия PPAR-γ будет уменьшаться, снижая ответную реакцию клеток на жирные кислоты и, в частности, задерживая дифференциацию адипоцитов и генерирование жировой ткани.

Для дальнейшего исследования влияния способов и соединений настоящего изобретения на экспрессию адипогенных факторов, двенадцать самцов мышей Swiss Webster (весом 30-32 грамма), полученные от Simonsen, Inc., подвергали оральному кормлению через желудочный зонд один раз в сутки в течение 4 дней раствором из расчета 4 мл/кг либо 0,5% раствором CMC (0 мг/кг/сутки), 25 мг/мл соединения D в 0,5% CMC (100 мг/кг/сутки), либо 7,5 мг/мл и 25 мг/мл соединения В в 0,5% растворе CMC (30 и 100 мг/кг/сутки, соответственно). Через четыре часа после конечной дозы, животных анестезировали, умерщвляли и приблизительно 150 мг жировой ткани, сердца, почки печени, легкого и мышц выделяли и хранили в растворе KNALATER (Ambion) при температуре -20°С. Выделение РНК и анализ экспрессии гена выполняли, как описано выше в Примере 3.

Как показано на Фиг.3В, введение либо соединения D, либо соединения В приводило к увеличению экспрессии DEC1/Stra13 в нескольких тканях, включая жировую ткань, почку, печень и мышцы. Соединение В также повышало экспрессию DEC1/Stra13 в легком и сердце (Фиг.3В). Кроме того, повышенная экспрессия была все еще очевидна спустя 4 дня после обработки. Также, введение либо соединения D, либо соединения В, как описано выше, приводило к снижению экспрессии PPAR-γ2, например, в ткани сердца (Фиг.3С).

Эти данные показывают, что способы и соединения настоящего изобретения регулируют метаболизм жира путем изменения экспрессии факторов, принимающих участие в ответной реакции клеток на жир, включая синтез, утилизацию, транспорт и накопление триглицеридов. В частности, способы и соединения настоящего изобретения можно использовать для модулирования дифференциации адипоцитов и уменьшения накопления жира.

Пример 5: Регулирование in vivo веса тела и содержания жира

Влияние соединений и способов настоящего изобретения на регулирование веса тела и содержание жира, например, посредством воздействия на накопления жира, исследовали следующим образом. Пятидесяти самцам крыс Sprague Dawley (6-7-недельного возраста), полученным от Simonsen. Inc., вводили дозы продуктов, содержащих 0,5% раствор CMC (Sigma-Aldrich) или соединения В, соответствующие 20, 60, 100 или 200 мг/кг веса тела, путем орального введения через желудочный зонд один раз в сутки в течение 14 последующих дней. Животных подвергали контролю в отношении изменений веса тела и признаков очевидной токсичности и смертности. На 15 день, после голодания в течение ночи при наличии воды при желании, животных анестезировали изофлураном, вскрывали брюшную полость и собирали кровь из полой нижней вены. Один образец цельной крови, приблизительно 1 мл, собирали в пробирки, содержащие EDTA для гематологического анализа, а второй образец, приблизительно 1 мл, собирали в пробирку без какого-либо антикоагулянта для химического анализа сыворотки. Анализы образцов крови проводили с использованием IDEXX (West Sacramento, CA). После отбора образцов крови, рассекали диафрагму животного и животных умерщвляли. Макроскопические наблюдения фиксировали для каждого животного, и для биохимической и/или гистологической оценки извлекали печень, почки, сердце, селезенку, легкие, желудок, малую кишку и большую кишку.

Как показано на Фиг 4А, у животных, которых подвергали лечению соединениями настоящего изобретения, проявлялось зависимое от дозы замедление увеличения веса тела. Исследования животных показали, что не наблюдалось общего замедления в росте, так как абсолютный вес большинства органов у животных, подвергавшихся лечению, не отличался значительно от веса соответствующих органов у контрольных животных, которых не подвергали лечению. Например, абсолютный вес сердца у животных, подвергавшихся лечению соединением настоящего изобретения, был, в основном, таким же, как абсолютный вес сердца у контрольных животных, которые не подвергали лечению (Фиг.4В). Однако, относительный вес органа, выраженный в виде доли общего веса тела, значительно отличался у животных, подвергавшихся лечению, по сравнению с весом органа у контрольных животных, не подвергавшихся лечению соединением настоящего изобретения. Например, относительный вес сердца у животных, подвергавшихся лечению соединением настоящего изобретения, по сравнению с относительным весом сердца у контрольных животных, был значительно выше (р=0,036, однофакторный тест ANOVA/Tukey').

Так как абсолютный вес органа уменьшался незначительно, не наблюдалось процесса общего замедления роста у животных, подвергавшихся лечению; однако, так как относительный вес органа значительно увеличивался, наблюдалась селективная потеря другой ткани. Как показано на Фиг.5, у животных, которых подвергали лечению соединением изобретения, проявлялось зависимое от дозы уменьшение висцерального (абдоминального) жира. Стрелкой на верхнем чертеже показано присутствие висцеральной жировой ткани у животных, подвергавшихся лечению низкими дозами соединения изобретения, тогда как на нижнем чертеже показано полное отсутствие жировой ткани у животных, подвергавшихся лечению более высокими дозами соединения изобретения.

Эти результаты указывают на то, что соединения и способы настоящего изобретения можно использовать для регулирования веса тела. В частности, способы и соединения настоящего изобретения можно применять для профилактики или снижения увеличения веса без сопутствующей потери массы мускулов. Соединения и способы настоящего изобретения можно применять для модулирования регулирования содержания жира, например, путем уменьшения накопления абдоминального и висцерального жира.

Пример 6: Пониженное увеличение веса тела у модели животного с индуцированным диетой ожирением

Влияние соединений и способов настоящего изобретения на регулирование содержания жира, например, на поглощение и накопление и т.д., и на регулирование веса тела анализировали следующим образом. У C57BL/6J мышей, которых держали на диете с высоким содержанием жира, развивались сильное ожирение, гипергликемия и гиперинсулинемия, и эти мыши представляют собой модель индуцированного диетой ожирения, диабета типа 2 и пониженной толерантности к глюкозе. Сорок самцов мышей C57BL/6J, полученных из Jackson Laboratory (Bar Harbor ME), разделяли на следующие экспериментальные группы: Группа 1: контрольные животные, которые получают стандартную пищу мышей с наполнителем (n=10); Группа 2: контрольные животные, которые получают пищу мышей с высоким содержанием жира (45% жир от Research Diet) и с наполнителем (n=10); Группа 3: животные, которые получают пищу мышей с высоким содержанием жира и которым вводят 75 мг/кг/сутки соединения Е оральным способом через желудочный зонд (n=10); Группа 4: животные, которые получают пищу мышей с высоким содержанием жира и которым вводят 75 мг/кг/сутки соединения А оральным способом через желудочный зонд (n=10). Режим кормления продолжался в течение 28 суток с измерением веса тела каждую неделю. Животных затем умерщвляли и их органы и жировые ткани собирали и взвешивали.

Как показано на Фиг.6А, животные, которых держали на диете с высоким содержанием жира (группа 2), имели значительно больший вес тела, чем животные, которых кормили стандартной пищей (группа 1) (р<0,05). Однако, у животных, которых держали на диете с высоким содержанием жира, но одновременно вводили соединение Е или соединение А (группа 3 и группа 4, соответственно), проявлялось значительно меньшее увеличение веса (р<0,05). Фактически, несмотря на диету с высоким содержанием жира, животные, которых лечили соединением изобретения, имели, по существу, такой же вес, как и животные, которые находились на нормальной диете (сравните группу 3 и группу 4 с группой 1). Аналогично, как показано на Фиг.6В, животные, которых держали на диете с высоким содержанием жира (группа 2), имели значительное увеличение веса абдоминальной жировой ткани по сравнению как с животными, которых кормили стандартной пищей (группа 1), так и с животными, которых держали на диете с высоким содержанием жира, но также лечили соединением настоящего изобретения (группа 3 и группа 4). Как видно на Фиг.6В, животные, которых держали на диете с высоким содержанием жира и лечили соединением настоящего изобретения, имели, по существу, тот же вес жировой ткани, как и животные, которых держали на нормальной диете. На Фиг.6С показано, что влияние соединений было специфичным по отношению к весу жировой ткани, так как вес других органов, включая почку, печень и сердце, был, по существу, одинаковым во всех экспериментальных группах.

Эти результаты указывают на то, что наблюдаемые различия в весе тела между животными, которых держали на диете с высоким содержанием жира с или без введения соединения изобретения, были конкретно обусловлены уменьшением жировых накоплений, а не снижением скорости роста. Кроме того, эти данные показывают, что лечение животных соединениями настоящего изобретения исключает избыточное увеличение веса тела, связанное с потреблением пищи, имеющей высокое содержание жира. Также, анализ уровней экспрессии, полученных для каждой группы, свидетельствует, что соединения изобретения нормализуют экспрессию генов, таких как белка-3, связывающего жирные кислоты, и митохондриального нерасщепляющегося белка 1, которые подвергаются повышающей регуляции у животных Группы 2 (данные не показаны). Таким образом, соединения изобретения являются полезными для терапевтического способа снижения увеличения веса даже в условиях приема неблагоприятной пищи. Кроме того, регулирование увеличения веса с помощью способов и соединений настоящего изобретения подтверждает, что такие соединения являются полезными при терапевтических методах облегчения потери веса у пациентов с ожирением.

Пример 7: Потеря веса у мышей с ожирением

Влияние введения соединений настоящего изобретения на потерю веса у животных изучали следующим образом. C57BL/6J мышей получали из Jackson Laboratory (Bar Harber ME). У C57BL/6J мышей, которых держали на диете с высоким содержанием жира, развивались сильное ожирение, гипергликемия и гиперинсулинемия, и они представляют собой модель ожирения индуцированного диетой диабета типа 2 и пониженной толерантности к глюкозе. Мышей кормили пищей с высоким содержанием жира (45% калорий из жира) в течение 8 недель, после чего у мышей появлялось ожирение. Мышей с ожирением делили на две экспериментальные группы: животные Группы 1 представляли собой контрольную группу мышей с ожирением, а животные Группы 2 представляли собой группу мышей с ожирением, которых подвергали лечению соединением настоящего изобретения. Дополнительная группа мышей соответствующего возраста, не страдающая ожирением, также была включена в исследование. Затем животных подвергали ежедневно воздействию соединения настоящего изобретения или контрольного наполнителя. Вес тела мышей определяли дважды в неделю в течение 21 дня. На 21 сутки животных взвешивали и затем умерщвляли. Абдоминальную жировую ткань, печень, почки и сердце извлекали и взвешивали для анализа.

Потеря веса тела, при введении соединения настоящего изобретения, указывает на то, что соединения настоящего изобретения являются полезными для терапевтического снижения веса тела у пациентов с ожирением.

Пример 8: Длительное снижение содержания триглицеридов в сыворотке

Влияние введения соединения настоящего изобретения на уровни содержания триглицеридов в сыворотке исследовали с использованием модели мыши с диабетом следующим образом. Были получены двадцать самцов db/db мышей (Harlan, Indianapolis, Indiana), которые имели гомозиготную мутацию с потерей функции в лептиновом рецепторе. Мышам давали либо наполнитель (100 мМ гистидина), либо соединение А (0,5 мг/мл в 100 мМ гистидина) в питьевой воде, по желанию, в течение 8-недельного периода. После этого животным не давали пищу в течение ночи, и у них были взяты образцы крови из каудальной полой вены при полной анестезии и помещены в сывороточные пробирки для центрифугирования. Анализы образцов крови проводили с помощью Quility Clinical Labs (Mountain View, CA).

Уровни содержания триглицеридов у db/db мышей, по крайней мере, в 1,5-2,0 раза выше по сравнению с уровнями содержания триглицеридов у нормальных мышей и прогрессивно увеличиваются с возрастом. (Смотри, например, Nishina и соавт. (1994) Metabolism 43:549-553 и Tuman и Doisy (1997) Diabetologia 13:7-11). Как показано на Фиг.7, уровни содержания триглицеридов в конце эксперимента составляли приблизительно 120 мг/дл у контрольных db/db мышей. Однако, уровень содержания триглицеридов у животных, которые подвергались лечению соединением настоящего изобретения, составлял приблизительно 85 мг/дл, т.е. был значительно более низким, чем у контрольных мышей. Повышенные уровни содержания триглицеридов ассоциируются с повышенной опасностью сердечно-сосудистого заболевания, и повышенное содержание триглицеридов является компонентом метаболического синдрома. Так как соединения и способы настоящего изобретения эффективно снижают или поддерживают уровни содержания триглицеридов при состояниях, которые обычно ассоциируются с повышенными уровнями содержания триглицеридов, например, диабетом, синдромом X, макрососудистым заболеванием, или другой дислипидемией, способы настоящего изобретения являются полезными для лечения индивидуумов с опасными состояниями или риском появления таких состояний.

Пример 9: Идентификация соединений, которые стабилизируют HIFα и ингибируют HIF гидроксилазную активность

Соединения настоящего изобретения, которые используют в способах настоящего изобретения, стабилизируют HIFα, ингибируют HIF гидроксилазную активность и/или гидроксилирование HIFα и т.д. Таким образом, соединения можно идентифицировать, например, благодаря их активности при стабилизации HIFα. Стабилизацию HIFα с использованием соединений и способов настоящего изобретения исследовали следующим образом. Человеческие клетки, выделенные из тканей эпителия фетальной почки, трансформированного аденовирусом (293А), эпителиальной аденокарциномы (HeLa), гепатоклеточной карциномы шейки матки (НерЗВ), плоскоклеточной карциномы (SCC-25) и фибробласта легкого (HLF) (См., например, American Type Culture Collection, Manassas VA и Qbiogeny, Carlsbad CA), раздельно высевали в 100 мм чашки для культур и выращивали при 37°С, в атмосфере 20% O₂, 5% CO₂ следующим образом: клетки HeLa в среде Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM), 2% фетальной бычьей сыворотки (FB); HLF клетки в DMEM, 10% FBS; 293А клетки в DMEM, 5% FBS и Нер3В клетки в Minimal Essential Medium (MEM), Earle's BBS (Mediatech Inc., Herndon VA), 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ не незаменимых аминоксилот, 1 мМ пирувата натрия, 10% FBS. Когда клеточные слои достигали слияния, среду заменяли OPTI-MEM средой (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA) и клеточные слои инкубировали в течение приблизительно 24 часов в атмосфере, состоящей из 20% О₂, 5% CO₂ при 37°С. Затем добавляли соединение настоящего изобретения (соединение В, D, F, G или Н) или наполнитель в качестве контрольного соединения (0,5-1,0% DMSO) к существующей среде и инкубирование продолжали в течение ночи.

После инкубирования клетки два раза промывали в холодном фосфатном забуференном солевом растворе (РВ) и затем подвергали лизированию в 1 мл 10 мМ раствора Tris (pH 7,4), 1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 0,5% IGEPAL (Sigma-Aldrich, St Louis МО), и смеси ингибитора протеазы (Roche Molecular Biochemical) в течение 15 минут на льду. Клеточные лизаты центрифугировали при 3000 × g в течение 5 минут при 4°С и собирали цитозольную фракцию (надосадочную жидкость). Ядра (гранулы) ресуспендировали и подвергали лизированию в 100 мкл 20 мМ HEPES (pH 7,2), 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитола и смеси протеаз (Roche Molecular Biochemical), центрифугировали при 13000 × g в течение 5 минут при 4°С и собирали фракции ядер белка (надосадочную жидкость).

Фракции ядер нормализовали на основе концентрации белка и загружали в 4-12% TG гель и фракционировали в восстановительных условиях. Белки переносили на PVDF мембрану (Invitrogen Corp., Carlsbad CA), где подвергали воздействию тока 500 мА в течение 1,5 часов. Мембрану блокировали в растворе T-TBS, 2% молоке в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи антителами мышиных анти-человеческих субъединиц HIF-1α (BD Biosciences, Bedford МА), разбавляли 1:250 в растворе T-TBS, 2% молоке. Блот готовили, используя SUPERSIGNAL WEST хемилюминесцентный субстрат (Pierce, Rockford IL). Как показано на Фиг.8А, репрезентативное соединение настоящего изобретения (соединение D) стабилизировало HIFα в различных типах клеток, давая возможность HIFα аккумулироваться внутри клеток.

Альтернативно, фракции ядер готовили с использованием набора экстрактов ядер (Active Motif, Carlsbad CA) и анализировали на наличие HIFα с использованием набора TRANSAM HIF-1 ELISA (Active Motif) в соответствии с предписаниями производителя. Как показано на Фиг.8В, эпителиальные клетки (293А) и клетки гепатоцита (Нер3В), обработанные различными соединениями настоящего изобретения (соединениями В, F, Cu Н), оказывали стабилизирующее влияние и аккумуляцию HIFα по сравнению с контрольными клетками, обработанными наполнителем.

Соединения настоящего изобретения, которые используют в способах настоящего изобретения, можно идентифицировать также, благодаря их способности модулировать HIF-специфическую пролилгидроксилазную активность. Модуляцию HIF пролилгидроксилазной активности можно идентифицировать, используя анализ базирующийся на гидроксилировании-сопряженном декарбоксилировании 2-оксо[1-¹⁴C]-глутарата. (См. Hirsila и соавт. (2003) J. Biol. Chem. 278:30772-30780). Реакцию проводят в 1,0 мл реакционного объема, содержащего 10-100 мкл поверхностно-активного вещества, например, Triton-X-100, солюбилизированный клеточный экстракт, полученный из клеток экспрессирующих либо эндогенную HIF пролилгидроксилазу, либо рекомбинантную HIF пролилгидроксилазу; 0,05 мкМ пептида субстрата, например, DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID N0:1); 0,005 мМ FeSO₄, 0,16 мМ 2-оксо [1-¹⁴C] глутарата, 2 мкМ аскорбата, 60 мкг каталазы, 0,1 мкМ дитиотреитола и 50 мкМ Трис-HCl буфера, доведенного до рН 7,8 при 25°С. Ферментативную реакцию проводят при 37°С в течение 20 минут. ¹⁴СО₂, продуцируемый в процессе реакции, поглощают суспендированным бумажным фильтром, импрегнированным основанием, в атмосфере над реакционной смесью и подсчитывают в сцинтилляционном счетчике.

Пример 10: Экспрессия регуляторных факторов, принимающих участие в поглощении и утилизации глюкозы

Так как соединения и способы настоящего изобретения регулируют метаболизм жира, который тесно связан с регулированием глюкозы, было проанализировано влияние соединений и способов изобретения на поглощение и метаболизм глюкозы. Клетки человека SCC-25 (плоскоклеточная карцинома) или клетки крысы Н9с2 (вентрикулярный кардиомиоцит) выращивали до образования сплошной массы на 100 мм чашках для культуры при 37°С, в среде, состоящей из 10% СО₂ в DMEM с 10% фетальной сыворотки теленка. Клетки затем промывали дважды раствором PBS и инкубировали с наполнителем в качестве контроля, соединением D (10 и 25 мкМ), или соединением С (5, 10 и 20 мкМ) в течение 16 часов. Чашки затем помещали на лед, надосадочную культуральную жидкость удаляли и добавляли лизисный буферный раствор-1 (LB-1: 10 мМ Tris pH 7,4, 1 мМ EDTA, 150 мМ хлорида натрия, 0,5% IGEPAL). Клетки собирали путем соскабливания, инкубировали в течение 15 минут на льду и затем центрифугировали при скорости 3000 × g в течение 5 минут при 4°С. Надосадочную жидкость, которая представляла собой цитозольную фракцию, собирали, и цитозольные белки выделяли при восстановительных условиях, используя SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), причем равные количества белка загружали на дорожку.

SDS-PAGE проводили при напряжении 150 В в течение 2 часов, после чего белки перемещали на PVDF мембрану, где их подвергали воздействию тока 400 мА в течение 1,5 часов при 4°С. Мембрану инкубировали в блокирующем буферном растворе в течение 2 часов или в течение ночи и промывали один раз раствором T-TBS перед добавлением раствора анти-GluT-1 антитела (Alpha Diagnostic), разбавленного до рабочей концентрации в блокирующем буферном растворе. После инкубирования в течение ночи с осторожным помешиванием при 4°С, мембраны промывали 4 раза раствором T-TBS, после чего инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с раствором конъюгированного вторичного антитела, разбавленного в блокирующем буферном растворе. Мембрану затем промывали четыре раза раствором T-TBS до проявления и визуализации, используя рентгеновскую пленку и ECL SUPERSIGNAL WEST PICO хемилюминесцентный субстрат (Pierce Chemical Co., Rockford IL) согласно предписаниям производителя.

На Фиг.9А показано, что как соединение D, так и соединение С, повышали уровни содержания белка GluT-1, основного индуцируемого транспортера глюкозы, способствующего поглощению глюкозы, в SCC-25 и Н9с2 клетках, соответственно. Эти результаты показывают, что соединения и способы настоящего изобретения потенциально увеличивают экспрессию белков, принимающих участие в поглощении глюкозы, и таким образом представляют терапевтический подход для увеличения поглощения глюкозы.

В другом анализе влияния способов и соединений настоящего изобретения на регулирование глюкозы, клетки 293А человека помещали в виде сплошной массы на 35 мм чашки для культуры и культивировали в течение 1 суток при 37°С, в среде, содержащей 10% СО₂ в DMEM, содержащем 5% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина. Указанную среду изменяли на среду Opti-Mem и инкубацию продолжали в течение дополнительных 18-24 часов. Затем в среду добавляли либо наполнитель в качестве контроля, либо соединение В, и клетки инкубировали в течение дополнительных 24, 48 или 72 часов. Чашки помещали на лед, надосадочную культуральную жидкость удаляли и добавляли лизисный буферный раствор-1 (LB-1: 10 мМ Tris pH 7,4, 1 мМ EDTA, 150 мМ хлорида натрия, 0,5% IGEPAL). Клеточные лизаты собирали, цитозольные фракции также собирали, и цитозольные белки выделяли, используя SDS-PAGE, как описано выше. После выделения, белки перемещали на PVDF мембрану, где их подвергали воздействию тока 400 мА в течение 1,5 часов при 4°С. Мембрану инкубировали в блокирующем буферном растворе в течение 2 часов или в течение ночи и промывали один раз раствором T-TBS перед добавлением раствора анти-альдолазного антитела, разбавленного до рабочей концентрации в блокирующем буферном растворе. После инкубирования в течение ночи с осторожным помешиванием при 4°С, мембраны промывали 4 раза раствором T-TBS, после чего инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре с раствором конъюгированного вторичного антитела, разбавленного в блокирующем буферном растворе. Мембрану затем промывали четыре раза раствором T-TBS до проявления и визуализации, используя рентгеновскую пленку и ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO или PICO хемилюминесцентный субстрат (Pierce Chemical Co., Rockford IL) согласно предписаниям производителя.

Как видно на Фиг.9В, экспрессия альдолазы увеличивалась со временем в клетках, обработанных соединением В в течение 24, 48 и 72 часов, в то время, как культуры, обработанные контрольным наполнителем, не показали увеличения экспрессии альдолазы. Культуры, обработанные соединением В, не показали какого-либо увеличения β-тубулин экспрессии, указывая на то, что увеличение экспрессии у альдолазы было специфическим и не связано с общим увеличением экспрессии белков.

Эти результаты также показали, что соединения и способы изобретения изменяют регулирование глюкозы, и это говорит о том, что обработка соединением настоящего изобретения потенциально создает метаболический сдвиг в продуцировании энергии за счет модулирования гомеостаза жира и глюкозы.

Пример 11: Увеличенная экспрессия регуляторных факторов, принимающих участие в регулировании содержания глюкозы

Для демонстрации того, что соединения и способы изобретения изменяют поглощение и утилизацию глюкозы in vivo, образцы, полученные как в Примере 3, описанном выше, дополнительно анализировали для идентификации изменений в характере индукции гликолитических генов с течением времени. Как показано на Фигурах 10А, 10В и 10С, экспрессия генов, кодирующих ферменты, принимающие участие в регулировании содержания глюкозы, увеличивается координированным образом после обработки соединением В. Характеристики транскрипта, представленные на Фигурах 10А, 10В и 10С, включают фосфофруктокиназу (PFK)-P тромбоцитного типа (1), PFK-L печеночного типа (2), енолазу-1 (3), транспортеров глюкозы (GluT)-1 (4), лактатдегидрогеназу-1 (5), альдолазу-1 (6) и гексокиназу-1 (7). В ходе проведения испытания, большинство уровней содержания мРНК возрастали после введения соединения, затем возвращались до контролируемых уровней после 24-48 часов. Кроме того, хотя экспрессия генов, кодирующих гликолитические ферменты, была аналогичной среди различных органов, почка (Фиг.10А), печень (Фиг.10В) и легкое (Фиг.10С), обнаружили различия как в повышении относительных уровней экспрессии, так и в продолжительности повышения в конкретных молекулах мРНК. Эти различия относятся, в частности, к различной степени, до которой гликолитическая активность обеспечивает основной источник энергии для соответствующей ткани, особенно во время стресса. Эти результаты показывают, что соединения изобретения специфически индуцируют гликолитические эффекты и что эти эффекты могут отличаться в зависимости от ткани.

Пример 12: Влияние соединений на потребление кислорода

Продуцирование энергии из жира и глюкозы происходит обычно при окислительной респирации. Однако, при гипоксических условиях, в утилизации энергии наблюдается сдвиг на компенсацию пониженных уровней содержания кислорода. Обычно, анаэробный гликолиз увеличивается, и окисление жирных кислот используется до того предела, который возможен на основе доступности кислорода. В основном, потребность в кислороде, которая соответствует суммарным энергетическим потребностям, должна уменьшаться. Следующий эксперимент проводили для установления, снижают ли способы изобретения, при изменении утилизации энергии, потребность клеток в кислороде. Клетки 293А и HeLa человека (American Type Culture Collection) выращивали раздельно до слияния в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Mediatech, Inc., Herndon VA) и 1% фетальной бычьей сыворотки при температуре 37°С, в среде, содержащей 10% СО₂. Клетки собирали и повторно суспендировали в среде с плотностью 500000 клеток/мл, и 0,2 мл клеточной суспензии добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета Oxygen Biosensor (BD Biosciences, Bedford MA). Планшеты Oxygen Sensor (BD Bioscience) содержат комплекс рутения, который является более флуоресцентным в отсутствие кислорода. Следовательно, флуоресцентная индикация увеличивается за счет присутствия на планшете кислород-потребляющих клеток, которые изменяют состояние равновесия в сторону более низкой кислородной насыщенности и более высокой флуоресценции.

Для утроения содержимого наборов лунок, в 10 мкл объемы добавляли следующие агенты обработки: 1) 0,5% DMSO (наполнитель в качестве контрольного соединения); 2) 200 мкМ додецила сульфата натрия (SDS; в качестве положительного контрольного соединения при отсутствии потребления кислорода); 3) 5, 25 или 50 мкМ соединения В; 4) 10, 100 или 1000 мкМ десферриоксамин мезилата (DFO) и 5) только среду. Кроме того, 0,2 мл только среды или среды со 100 мМ SDS также инкубировали в лунках без клеток с целью обеспечения соответствующего контроля для фоновой флуоресценции планшета.

Культуры инкубировали в течение дополнительных 72 часов и затем измеряли флуоресценцию в флуориметре FL600 (Biotek Instruments, Inc., Winooski VT) при длине волны возбуждения, равной 485 нм, и при длине волны излучения, равной 590 нм. Данные были нанесены на график в виде функции флуоресценции, и был проведен описательный статистический анализ с использованием компьютерной программы EXCEL (Microsoft Corp., Bellevue WA).

Как клетки HeLa, так и клетки 293А, обработанные соединением изобретения, демонстрировали зависимое от дозы снижение флуоресценции, указывая на уменьшение потребления кислорода по сравнению с клетками, обработанными наполнителем в качестве контрольного соединения (смотри Фиг.11). Как было установлено с использованием колориметрического анализа WST-1 (Roche), уменьшенное потребление кислорода произошло не по причине потери активности или жизнеспособности у клеток, наводящей на мысль о возможной цитотоксичности. Дополнительные эксперименты с использованием других типов клеток и конечных точек подтвердили, что уменьшение потребления кислорода не связано с цитотоксичностью соединения.

Данные показывают, что обработка клеток из тканей различного происхождения соединениями изобретения приводит к сдвигу в метаболизме клеток, который уменьшает общее потребление кислорода.

Пример 13: Кратковременное уменьшение содержания триглицеридов в плазме

Крыс Sprague Dawley подвергали обработке и образцы собирали, как описано в Примере 5. Анализ образцов крови показал, что способы изобретения приводят к значительному увеличению содержания в плазме триглицеридов при дозах соединения В, равных 60, 100 и 200 мг/кг. Однако, никакого соответствующего увеличения содержания в плазме холестерина не наблюдалось. Таким образом, похоже, что увеличение содержания триглицеридов обязано метаболическому сдвигу в направлении утилизации жировых накоплений для удовлетворения энергетических потребностей. Кроме того, любое увеличение гликолиза при отсутствии кислород-требующего цикла потенциально генерирует триглицерид в качестве побочного продукта.

Различные модификации изобретения, в дополнение к тем, которые здесь показаны и описаны, будут очевидны специалистам в данной области. Имеется в виду, что такие модификации находятся в пределах объема Формулы изобретения.

Все ссылки, приведенные здесь, вводятся во всей их полноте.

1. Способ регулирования метаболизма жира или процесса метаболизма жира у субъекта путем стабилизирования альфа-субъединицы индуцируемого гипоксией факторного белка (HIFα), включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что HIF гидроксилазная активность представляет собой HIF пролилгодроксилазную активность.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизирующее действие осуществляют in vitro.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабилизирующее действие осуществляют in vivo.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъект выбирают из группы, состоящей из клетки, ткани и органа.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъектом является животное.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъектом является млекопитающее.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъектом является человек.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс метаболизма жира выбирают из группы, состоящей из поглощения жира, транспорта жира, накопления жира, процессинга жира, синтеза жира и утилизации жира.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что HIFα выбирают из группы, состоящей из HIF1α, HIF2α и HIF3α.

11. Способ по п.2, отличающийся тем, что пролилгидроксилазу выбирают из группы, состоящей из EGLN1, EGLN2 и EGLN3.

12. Способ достижения гомеостаза жира у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

13. Способ лечения или профилактики ожирения у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

14. Способ регулирования веса тела у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

15. Способ уменьшения содержания телесного жира у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что телесный жира у субъекта представляет собой висцеральный жир.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что телесный жира у субъекта представляет собой абдоминальный жир.

18. Способ индуцирования потери веса у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

19. Способ увеличения экспрессии регуляторного фактора жира у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

20. Способ по п.21, отличающийся тем, что регуляторный фактор жира выбирают из группы, состоящей из лептина, аполипопротеина A-IV, цитозольной ацил-СоА-тиоэстеразы-1, связующего белка инсулиноподобного фактора роста (IGFBP-1), карнитин-ацетилтрансферазы, PAI-1, DEC1/Stra13 и PPAR-γ.

21. Способ уменьшения потребления кислорода у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

22. Способ индуцирования метаболического сдвига в утилизации жира у субъекта путем стабилизирования HIFα, включающий введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует HIF гидроксилазную активность.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что осуществляется индуцирование метаболического сдвига в направлении анаэробного метаболизма путем стабилизирования HIFα у субъекта.