Сорбент для хроматографии оптических изомеров и способ его получения

Изобретение относится к сорбентам для хроматографии. Предложен сорбент на основе силикагеля с привитым через спейсер гибридным хиральным селектором, полученный путем модифицирования силикагеля эпоксигруппами, прививки эремомицина и хирального полианилина. Сорбент проявляет повышенную энантиоселективность к различным соединениям. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 9 ил.

 

Изобретение относится к сорбентам для хроматографии и может быть использовано для анализа и препаративной очистки оптически активных соединений.

Известны сорбенты для разделения оптически активных соединений на основе силикагеля с привитыми оптически активными соединениями для разделения энантиомеров. Известен, например, сорбент, содержащий на поверхности силикагеля производные хинина (SU 1429016, 1988).

Известен хиральный оптически активный сорбент, содержащий оптически активный полимер, ковалентно связанный с твердым носителем, при этом полимер представляет собой сетчатый полимер, содержащий оптически активные производные дикарбоновых кислот, диаминов, диолов или гидроксикислот, предпочтительно производные винной кислоты, а носитель представляет собой органический или неорганический материал. Способ получения данного сорбента включает закрепление производных винной кислоты на поверхности носителя, которое производят путем сетевой полимеризации через гидроксилирование в присутствии гидросилана и гидросилоксана и закрепляют на носителе в присутствии катализатора (RU 2121395, 1998).

Известен сорбент для разделения рацематов оптически активных соединений, содержащий носитель и хиральный селектор - пер-6-аминопроизводные α-, β-, или γ-циклодекстрина или их ацетилированные аналоги. Способ получения данного сорбента включает ковалентную иммобилизацию хиральных селекторов на носителе, которую осуществляют путем последовательного взаимодействия аминированного носителя с конденсирующим агентом, затем с реагентом, выбранным из группы: пер-6-амино-α-циклодекстрина, пер-6-амино-β-циклодекстрина, пер-6-амино-γ-циклодекстрина, а затем с боргидридом металла (RU 2203730, 2003).

Известен сорбент, проявляющий энантиоселективность в разделении изомеров фенилаланина на основе силикагеля с иммобилизованным хиральным полианилином, полученным путем химической окислительной полимеризации анилина (US 6265615, 2001).

Известны сорбенты на основе силикагеля с химически привитыми гликопептидными антибиотиками, такими как ванкомицин, тейкопланин, тейкопланин агликон и ристомицин (US 6669842, 2003).

Однако известные сорбенты обладают энантиоселективностью лишь к определенным классам веществ или обладают недостаточной энантиоселективностью.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является сорбент на основе силикагеля с химически привитым гликопептидным антибиотиком эремомицином, структурная формула которого приведена на фиг.1, а также способ его получения, описанный в RU 2255802, 2005, выбранный в качестве прототипа изобретения.

Фиг.1 илюстрирует структурную формулу эремомицина.

Сорбент проявляют селективность в разделении широкого круга энантиомеров как в водно-органических, так и в неводных элюентах. Однако не всегда энантиоселективность является достаточно высокой.

Способ получения известного сорбента заключается в обработке силикагеля 3-глицидооксипропилтриалкоксисиланом с последующим взаимодействием с эремомицином в водном или водно-органическом щелочном буферном растворе при температуре не выше 40°С.

Недостатком известного способа получения сорбента является наличие в составе распознающих хиральных центров только производных эремомицина.

Задачей настоящего изобретения является повышение селективности сорбента в разделении оптических изомеров и разработка способа, позволяющего обеспечить введение в состав хирального селектора сорбента спиралевидной хиральности.

Поставленная задача решается описываемым сорбентом для хроматографии оптических изомеров, содержащим силикагель, модифицированный гликопептидным антибиотиком - эремомицином и дополнительно хиральным полианилином.

Поставленная задача решается также описываемым способом получения сорбента для хроматографии оптических изомеров, включающим модифицирование поверхности силикагеля эпоксигруппами, иммобилизацию эремомицина на поверхности силикагеля с привитыми эпоксигруппами, промывку, сушку, в котором силикагель, модифицированный эремомицином, подвергают взаимодействию с анилином в присутствии фермента лакказы и энантиомера сульфокамфорной кислоты. Предпочтительно для модифицирования поверхности силикагеля эпоксигруппами используют обработку 3-глицидоксипропилтриэтоксисиланом.

В заявленном способе наилучшие результаты показал эремомицин, полученный с использованием штамма-продуцента Amicolatopsis orientalis subsp, согласно известному способу по RU 2110578, 1998.

Ниже приведены конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1.

50,4 г силикагеля Kromasil KR100-7-SIL суспендировали в 250 мл 0,1 М раствора ацетата натрия, доведенного ледяной уксусной кислотой до рН 5,5. К полученной суспензии добавили 40 мл 3-глицидоксипропилтриэтоксисилана. Реакционную смесь интенсивно перемешивали в течение 2 часов, а затем оставили без нагревания и перемешивания на 4 суток. По окончании реакции модифицированный силикагель промыли водой, этанолом, ацетоном и отфильтровали. Сушили при температуре 105°С. По данным элементного анализа содержание углерода составляет 7,3%.

Получен силикагель, модифицированный эпоксигруппами. Затем 15 г макроциклического антибиотика - эремомицина растворили в 230 мл дистиллированной воды. Довели рН до значения 8,58, прибавляя по каплям 1 М водный раствор КОН. Полученный раствор смешали с 56,1 г силикагеля с привитыми эпоксигруппами. Полученную реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре, периодически перемешивая, в течение 1 недели. После окончания реакции сорбент отфильтровали и отмыли последовательно водой, метанолом и ацетоном. Сушили в сушильном шкафу при 50°С в течение 20 часов. По данным элементного анализа содержание углерода составляет 13,9%.

Реакционную смесь объемом 60 мл (рН 2,8), содержащую свежеперегнанный анилин (0,15 М) и S-сульфокамфорную кислоту (0,155 М), перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин. Затем в раствор добавляли 6 г сорбента с иммобилизованным эремомицином. После этого рН реакционной смеси сдвигалась до значения 3,6. Реакцию окислительной полимеризации анилина инициировали добавлением фермента - лакказы (концентрация в реакционной смеси 1,6·10^-7M) в суспензию сорбента. Синтез проводили при 4°С и постоянном перемешивании в течение 24 часов. После окончания синтеза сорбент отделяли центрифугированием (4000 об/мин), промывали бидистиллированной водой (5 раз по 100 мл) для удаления избытка исходных реагентов и 2 раза этиловым спиртом для удаления образовавшихся растворимых олигомеров. Полученные модифицированные сорбенты высушивали под вакуумом в течение 6 часов при непрерывной откачке. По данным элементного анализа содержание углерода составляет 14,4%.

Таким образом, получен силикагель с привитым через спейсер гибридным хиральным селектором:

Силикагель - Si-(СН₂)₃О-СН₂-СН(ОН)-СН₂-Эремомицин-хиральный полианилин

Пример 2

Сорбент с иммобилизованным эремомицином получали по примеру 1. Далее реакционную смесь объемом 60 мл (рН 2,8), содержащую свежеперегнанный анилин (0,15 М) и S-сульфокамфорную кислоту (0,155 М), перемешивали на магнитной мешалке в течение 1 часа для установления электростатического равновесия. Затем в раствор добавляли 6 г сорбента и обрабатывали полученную суспензию ультразвуком для увеличения смачиваемости пор сорбента. Значение рН реакционной смеси доводили до 2,8 S-сульфокамфорной кислотой. Полимеризацию анилина и отмывку полученного гибридного сорбента проводили, как описано в примере 1.

По данным элементного анализа содержание углерода составляет 14,5%.

Подтверждение модификации поверхности сорбентов полианилином дополнительно осуществлено с помощью КД-спектров в растворе диметилсульфоксида.

Полученный в соответствии с настоящим изобретением сорбент был испытан при разделении оптических изомеров в следующих условиях.

Сорбент по примеру 1 упаковали суспензионным методом в колонку из нержавеющей стали 2×100 мм и проводили разделение оптических изомеров профенов с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Сорбент по примеру 2 упаковали суспензионным методом в колонку из нержавеющей стали размером 4,0×250 мм и проводили разделение оптических изомеров аминокислот и их производных с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Хроматографический анализ осуществляли на ВЭЖХ хроматографе фирмы KNAUER (Германия) в составе: насос К-1001, спектрофотометрический детектор К-2501, термостат колонок Jetstream, с возможностью контроля температуры в диапазоне 5-85°С с точностью 0,1°С, ручной кран-дозатор с петлей на 20 мкл. Объем пробы 5-20 мкл. Хроматографические пики детектировали в диапазоне 210-280 нм, в соответствии с максимумами поглощения разделяемых соединений.

Запись хроматограмм и расчеты факторов удерживания разделенных компонентов k, селективности α и разрешения R_s проводили с помощью программно-аппаратного комплекса «Мультихром» (Амперсенд, Россия).

В качестве подвижной фазы использовали метанольные и водно-метанольные буферные растворы.

Пример 3

В таблице 1 представлены результаты хроматографического разделения профенов (значения факторов удерживания (А) и энантиоселективности (α)) на колонке с сорбентом, полученным по примеру 1 с привитым гибридным селектором. Разделение осуществляли в элюенте состава: 40% метанол - 60% фосфатный буфер (рН 6.5). Скорость: 0.3 мл/мин.

Таблица 1
Соединение	k1	k2	α
Кетопрофен	3.64	4.12	1.13
Ибупрофен	1.47	1.79	1.22

Из таблицы видно, что сорбент проявляет высокую энантиоселективность к данному классу соединений (α-оксикислоты).

Пример 4.

В таблице 2 представлены результаты хроматографического разделения аминокислот и некоторых их производных на колонке с сорбентом, полученным по примеру 2 с привитым гибридным селектором в сравнении с сорбентом, полученным известным способом. (RU 2255802, 2004). Разделение осуществляли в элюенте одинакового состава: 20%СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄ на колонках 4×250 мм. Поток 0,7 мл/мин.

Таблица 2
Соединение	Колонка с сорбентом по примеру 2	Колонка с сорбентом, полученным известным способом
Аминокислота	k'1	k'2	α	Rs	α
Фенилаланин	0.70	3.12	4.5	7.76	4,33
Триптофан	3.35	6.06	1.8	4.23	1,73
м-Фтор-тирозин	1.06	3.16	3.0	6.69	-
3,4-Дигидрокси-фенилаланин	1.30	5.53	4.3	8.76	-
Тирозин	0.87	4.03	4.6	9.54	-
(2-Тиенил)-аланин	1.11	3.00	2.7	7.03	2,75
Гистидин	0.07	0.24	3.9	1.80
Метионин	0.26	0.67	2.6	3.99	2,21
Аланин	0.15	0.68	4.5	5.44	2,86
α-Аминомасляная кислота	0.16	0.84	5.3	6.32	-
Валин	0.16	0.85	5.3	6.23	3,29
Норвалин	0.27	0.96	3.6	5.25	3,32
Лейцин	0.29	0.90	3.1	5.05	-
Норлейцин	0.23	0.59	2.6	3.60	2,0
Аспарагиновая кислота	2.45	3.74	1.5	4.27	-
Глутаминовая кислота	2.03	4.81	2.4	7.65	-
Цитрулин	0.34	0.63	1.9	2.54	1,58
Треонин	0.07	0.16	2.3	0.96	1,35
Серии	0.12	0.23	1.9	1.46	1,50

Из полученных результатов видно, что заявленный сорбент в большинстве случаев обеспечивает более высокие результаты по энантиоселективности (α), чем известный. Хроматограммы разделения некоторых соединений представлены на фиг.3-9.

Фиг.1. Химическая структура эремомицина.

Фиг.2. Химическая структура полианилина.

Фиг.3. Хроматограмма разделения DL-DOPA на колонке с иммобилизованным гибридным селектором. Элюент: 20% СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄; 0,7 мл/мин. Детектирование: УФ 280 нм. Температура: 22°С.

Фиг.4. Хроматограмма разделения DL-Met на колонке с иммобилизованным гибридным селектором. Элюент: 20% СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄; 0,7 мл/мин. Детектирование: УФ 210 нм. Температура: 22°С.

Фиг.5. Хроматограмма разделения DL-His на колонке с иммобилизованным гибридным селектором. Элюент: 20% СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄; 0,7 мл/мин. Детектирование: УФ 220 нм. Температура: 22°С.

Фиг.6. Хроматограмма разделения DL-Asp на колонке с иммобилизованным гибридным селектором. Элюент: 20% СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄; 0,7 мл/мин. Детектирование: УФ 210 нм. Температура: 22°С.

Фиг.7. Хроматограмма разделения DL-Phe на колонке с иммобилизованным гибридным селектором. Элюент: 20% СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄; 0,7 мл/мин. Детектирование: УФ 220 нм. Температура: 22°С.

Фиг.8. Хроматограмма разделения DL-Cit на колонке с иммобилизованным гибридным селектором. Элюент: 20% СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄; 0,7 мл/мин. Детектирование: УФ 210 нм. Температура: 22°С.

Фиг.9. Хроматограмма разделения DL-Ala на колонке с иммобилизованным гибридным селектором. Элюент: 20% СН₃ОН - 80% 0,1 М NaH₂PO₄; 0,7 мл/мин. Детектирование: УФ 210 нм. Температура: 22°С.

1. Сорбент для хроматографии оптических изомеров, содержащий силикагель, модифицированный гликопептидным антибиотиком эремомицином, отличающийся тем, что он дополнительно модифицирован хиральным полианилином.

2. Способ получения сорбента для хроматографии оптических изомеров, включающий модифицирование поверхности силикагеля эпоксигруппами, иммобилизацию эремомицина на поверхности силикагеля с привитыми эпоксигруппами, промывку, сушку, отличающийся тем, что силикагель, модифицированный эремомицином, подвергают взаимодействию с анилином в присутствии фермента лакказы и энантиомера сульфокамфорной кислоты.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что для модифицирования поверхности силикагеля эпоксигруппами используют обработку 3-глицидоксипропилтриэтоксисиланом.