Способ определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале

Авторы патента:

Омельченко Владимир Александрович (RU)

G01N31 - Исследование или анализ небиологических материалов химическими способами, упомянутыми в подгруппах данной группы (определение эффективности или завершенности процессов стерилизации без использования ферментов или микроорганизмов A61L 2/28; способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов C12Q 1/00); приборы, специально предназначенные для осуществления этих способов

G01N30/02 - колоночная хроматография

B01J20/283 - Составы твердых сорбентов или составы фильтрующих материалов; способы их получения, регенерации или реактивации (использование составов сорбентов при разделении жидкостей B01D 15/00; использование добавок для ускорения фильтрования B01D 37/02; использование составов сорбентов при разделении газов B01D 53/02,B01D 53/14; сорбирующие материалы для колоночной хроматографии G01N 30/48)

Владельцы патента RU 2319142:

Шорманов Владимир Камбулатович (RU)
Омельченко Владимир Александрович (RU)

Изобретение относится к биологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций и химико-токсикологических лабораторий. Анализируемую пробу измельчают, дважды настаивают с ацетонитрилом (каждый раз в течение 45 минут), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей гексан - ацетон (8,5:1,5), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 μ с использованием подвижной фазы гексан - ацетон (8,5:1,5), фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил - вода (4:6) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил - вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Достигается повышение точности и чувствительности, а также - ускорение анализа. 3 табл.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение суток), объединения вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления его водой с последующей экстракцией анализируемых соединений сначала из кислого, а затем из щелочного раствора (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.119-123).

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения 2,4,6-тринитрометилбензола и малой селективностью.

Известен способ определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале, заключающийся в неоднократном настаивании биологического объекта с диэтиловым эфиром при возможном добавлении к биологическому объекту безводного сульфата натрия, отделении эфирных извлечений, их объединении, испарении эфира, растворении остатка в ацетоне с последующей обработкой этанольным раствором гидроксида натрия и измерением оптической плотности образующегося окрашенного раствора (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращения и определение промышленных органических ядов в организме. - Л.: Медицина, 1971. - С.254-255).

Способ характеризуется низкой чувствительностью, недостаточно высокими селективностью и точностью определения.

Наиболее близким является способ определения 2,4,6-тринитрометилбензола в биологическом материале путем измельчения биологического объекта, настаивания с равным по массе количеством 95% этанола в течение 24 часов, прибавления к смеси дистиллированной воды до получения раствора с содержанием этанола 15%, фильтрования смеси, неоднократной экстракции эфиром, объединения экстрактов, испарения части объединенного эфирного извлечения до сухого остатка, растворения остатка в ацетоне с последующим определением анализируемого вещества методом газожидкостной хроматографии в колонке длиной 122 см, заполненной сорбентом OV-17 на хромосорбе W, с использованием азотно-фосфорного детектора и гелия в качестве подвижной фазы при скорости подачи гелия 40 мл/мин, воздуха 280 мл/мин, водорода 2 мл/мин, температуре детектора 270°С, инжектора 230°С, колонки 185°С.

Способ характеризуется длительностью выполнения, недостаточно высокой степенью извлечения анализируемого вещества из биоматериала, относительно низкими точностью и чувствительностью (Комаров П.П., Котлярова Э.Л., Сергеев С.Н. Методика обнаружения тринитротолуола в биологических объектах. // Судебно-медицинская экспертиза. - 1990. - Т.33, №3. - С.26-27).

Задачей настоящего изобретения является сокращение продолжительности анализа, повышение точности и чувствительности определения, увеличение степени извлечения анализируемого вещества из биологического материала.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, двукратно обрабатывают ацетонитрилом (каждый раз в течение 45 минут), ацетонитрильные извлечения объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей гексан - ацетон (8,5:1,5), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100μ (минимальный и максимальный размер частиц сорбента) с использованием подвижной фазы гексан - ацетон (8,5:1,5), фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил - вода (4:6) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack C-18» (насадка в виде двуокиси кремния, обработанной C₁₈, с размером пор 60 А° и содержанием углерода 7%), используя подвижную фазу ацетонитрил - вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин.

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую 2,4,6-тринитрометилбензол, измельчают, дважды настаивают с ацетонитрилом (каждый раз в течение 45 минут), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, полученный раствор вводят в сорбент, растворитель испаряют, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100μ с использованием подвижной фазы гексан - ацетон (8,5:1,5), фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил - вода (4:6) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack C-18», используя подвижную фазу ацетонитрил - вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин.

Пример 1

Качественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной свежей трупной ткани печени человека прибавляют 10 мг 2,4,6-тринитрометилбензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом, оставляют на 2 часа при температуре 16-18°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г ацетонитрила, выдерживают 45 минут, периодически перемешивая.

Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл ацетона. 1 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100μ и испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха.

В колонку размером 490×10 мм вносят вначале 9 г силикагеля типа L 40/100μ, а затем, поверх образующегося слоя, - 1 г силикагеля L 40/100μ, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде ацетонового раствора. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей гексан - ацетон (8,5:1,5). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 6 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22°С. Остаток растворяют в 50 мл смеси растворителей ацетонитрил - вода (4:6). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» (США), снабженный диодно-матричным детектором. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной сорбентом с привитой поверхностью «Nova Pack C-18», используя подвижную фазу ацетонитрил - вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм. Качественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола осуществляют по величинам характерных значений объема и времени удерживания, которые равны соответственно 7650 мкл и 7,65 мин.

Пример 2

Количественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной свежей трупной ткани печени человека прибавляют 10 мг 2,4,6-тринитрометилбензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 2 часа при температуре 16-18°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г ацетонитрила, выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл ацетона. 1 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100μ и испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха. В колонку размером 490х10 мм вносят вначале 9 г силикагеля L 40/100μ, а затем, поверх образующегося слоя сорбента, - 1 г силикагеля L 40/100μ, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде ацетонового раствора. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей гексан - ацетон (8,5:1,5). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 6 включительно объединяют, испаряют в токе воздуха при температуре 16-22°С. Остаток растворяют в 50 мл смеси растворителей ацетонитрил - вода (4:6). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» (США), снабженный диодно-матричным детектором. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной сорбентом с привитой поверхностью «Nova Pack С-18», используя в качестве подвижной фазы систему растворителей ацетонитрил - вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм.

Пик на хроматограмме со временем удерживания 7,65 мин (объемом удерживания 7650 мкл) соответствует 2,4,6-тринитрометилбензолу.

Количественное содержание 2,4,6-тринитрометилбензола определяют, исходя из площади хроматографического пика, и пересчитывают на навеску данного вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 1,25, 2,54, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 мл 0,0025% раствора, 5,0, 10,0, 20,0 мл 0,02% раствора 2,4,6-тринитрометилбензола в ацетонитриле, соответственно 18,75, 17,5, 15,0, 10,0, 5,0, 0,0, 15,0, 10,0, 0,0 мл ацетонитрила и доводят объем раствора в каждой колбе до метки водой. 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм с сорбентом «Nova Pack C-18», используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил - вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С.Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 5·10^-9-6,4·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=4938107·C-1575,55,

где S - площадь хроматографического пика;

С - концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 3

Количественное определение 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани легких

К 10 г мелкоизмельченной свежей трупной ткани легких человека прибавляют 10 мг 2,4,6-тринитрометилбензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 2 часа при температуре 16-18°С. По истечении указанного времени смесь заливают 20 г ацетонитрила, выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, упаривают в токе воздуха при температуре 18-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл ацетона. 1 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100μ и испаряют остатки ацетона из сорбента в токе воздуха. В колонку размером 490×10 мм вносят вначале 9 г силикагеля L 40/100μ, а затем, поверх образовавшегося слоя сорбента,- 1 г силикагеля L 40/100μ, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде ацетонового раствора. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил - вода (4:6). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 5 по 6 включительно объединяют, испаряют в токе воздуха при температуре 16-22°С. Остаток растворяют в 50 мл смеси растворителей ацетонитрил - вода (4:6). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф «Alliance» фирмы «Waters» (США), снабженный диодно-матричным детектором. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной сорбентом с привитой поверхностью «Nova Pack С-18», используя в качестве подвижной фазы систему растворителей ацетонитрил - вода (4:6). Скорость подачи подвижной фазы составляет 1 мл/мин, температура колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 229 нм.

Построение калибровочного графика

Процесс построения калибровочного графика и его уравнение приведены выше в примере 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 16 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2 раза в ткани печени, в 1,5 раза увеличивает степень извлечения 2,4,6-тринитрометилбензола из ткани печени (с 61,41% до 90,38%), снижает продолжительность одного анализа в 8 раз (с 25-26 часов до 3,5 часов), характеризуется более высокой точностью (относительная ошибка среднего результата уменьшается в 2 раза).

Таблица 1
Результаты определения 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани печени
№	Внесено 2,4,6-тринитрометилбензола, мг в 10 г печени	Найдено	Метрологические характеристики
мг	%
1.	10,00	9,368	93,68	=90,38
2.	10,00	9,143	91,43	S=2,27
3.	10,00	8,810	88,10	=1,02
4.	10,00	8,856	88,56	=2,84
5.	10,00	9,012	90,12
Таблица 2
Результаты определения 2,4,6-тринитрометилбензола в ткани легких
№	Внесено 2,4,6-тринитрометилбензола, мг в 10 г легких	Найдено	Метрологические характеристики
мг	%
1.	10,00	9,426	94,26	=93,75
2.	10,00	9,139	91,39	S=1,95
3.	10,00	9,264	92,64	=0,87
4.	10,00	9,385	93,85	=2,42
5.	10,00	9,659	96,59

Способ определения 2,4,6,-тринитрометилбензола в биологическом материале путем измельчения пробы, обработки органическим растворителем, отделения извлечения и последующего хроматографирования, отличающийся тем, что биологическую ткань обрабатывают ацетонитрилом двукратно - каждый раз в течение 45 мин, ацетонитрильные извлечения объединяют, упаривают при температуре воздуха 16-22°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-ацетон 8,5:1,5, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100μ с использованием подвижной фазы гексан-ацетон 8,5:1,5, фракции элюата, содержащие 2,4,6-тринитрометилбензол, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей ацетонитрил-вода 4:6 и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (4:6) и диодно-матричный детектор при температуре колонки 20°С и скорости подачи подвижной фазы 1 мл/мин.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для проведения технологического контроля углеводородного газа, чтобы предотвратить коррозию трубопроводов.

Способ фотометрического определения палладия (ii) // 2313088

Изобретение относится к аналитической химии платиновых металлов и может быть использовано при определении палладия в технологических нитритных растворах аффинажного производства.

Способ определения осмия // 2313087

Изобретение относится к области аналитической химии элементов, а именно к методам выделения и определения осмия, и может быть использовано при выделении и определении осмия в объектах различного вещественного состава.

Способ определения ртути в воде // 2313076

Изобретение относится к области аналитической химии объектов окружающей среды, а именно концентрированию микроэлемента из воды и водных растворов с целью количественного его определения на примере ртути.

Способ фотометрического определения алюминия (iii) в растворах чистых солей и искусственных смесей // 2312339

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к фотометрическому методу анализа, и может быть использовано для определения содержания алюминия (III) в растворах чистых солей и искусственных смесей, содержащих алюминий (III) в очень малой концентрации.

Способ фотометрического определения железа (ii) в растворах чистых солей и искусственных смесей // 2312338

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к фотометрическому методу анализа, и может быть использовано для определения содержания железа (II) в растворах чистых солей и искусственных смесей, содержащих железо (II) в очень малой концентрации.

Способ количественного определения n,n-диметиламидо-о-этилцианфосфата // 2312337

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно анализу N,N-диметиламидо-о-этилцианфосфата, его обнаружению и количественному определению. .

Способ измерения активности моющих средств при обработке кожи и/или шерсти животных, загрязненных радионуклидами // 2312336

Изобретение относится к области радиационной экологии и может найти применение в измерении активности моющих средств, предназначенных для обработки кожи или шерсти животных, загрязненных радиоактивными частицами, с помощью безопасных имитаторов радиоактивных загрязнений с целью получения из них экологически чистого сырья для легкой промышленности.

Способ определения автомобильного бензина в воздухе // 2312330

Изобретение относится к аналитической химии органических соединений и может быть применено для определения паров автомобильного бензина в воздухе. .

Способ определения иридия // 2311635

Изобретение относится к области аналитической химии, конкретно к способам электрохимического определения иридия. .

Способ газохроматографического определения микроконцентраций диметиламина в воде // 2318208

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к газохроматографическому определению микроконцентраций диметиламина в воде, и может быть использовано для санитарного контроля водных объектов.

Способ определения дигидроксибензолов в водных растворах // 2315994

Изобретение относится к аналитической химии органических соединений и может быть рекомендовано для аналитического контроля содержания химических соединений в очищенных сточных водах предприятий лакокрасочной и фотографической промышленности.

Способ и аппарат для газохроматографического анализа водородсодержащих газовых смесей // 2306555

Капиллярный газовый хроматограф для анализа органических и неорганических веществ // 2302630

Изобретение относится к газовой хроматографии и может быть использовано для количественного анализа сложных смесей веществ природного и техногенного происхождения в различных отраслях промышленности: химической, нефтяной, газовой, нефтехимической, энергетике, медицине, биологии, экологии и др.

Экспресс-хроматограф // 2300764

Изобретение относится к лабораторным хроматографическим приборам для проведения скоростного хроматографического анализа. .

Способ определения полимерных молекул хитозана в препаратах хитозана // 2295127

Изобретение относится к биотехнологии - получению хитозана, и может быть использовано для определения методом эксклюзионной хроматографии полимерных молекул хитозана, смешанных хитозан-хитиновых молекул и молекул хитозан-белкового комплекса в готовых формах препаратов хитозана.

Способ количественного определения тиотриазолина и пирацетама в комплексных лекарственных препаратах // 2293320

Изобретение относится к области аналитической химии. .

Способ определения метилового спирта в воде // 2273850

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способу количественного определения метилового спирта (метанола) в воде. .

Газовый анализатор // 2267123

Изобретение относится к устройствам аналитического приборостроения и может быть использовано в качестве хроматографического устройства в нефтеперерабатывающей, нефтехимической и других областях для измерения содержания микропримесей.

Способ разделения веществ с различными физико-химическими свойствами // 2264619

Изобретение относится к физико-химическим методам разделения веществ и позволяет выполнять разделение веществ с разными физико-химическими свойствами. .

Хроматографическая колонка и способ хроматографического анализа // 2315296

Изобретение относится к газовому анализу смесей, позволяющему проводить полное разделение компонентов газожидкостной смеси, состоящей из воздуха, диоксида углерода, насыщенных и ненасыщенных углеводородов, воды, ацетальдегида, акролеина, пропиленоксида, ацетона в условиях программирования температуры.