Противогрибковые препараты на основе morinda citrifolia и способы
Изобретение относится к сельскому хозяйству. Препарат для ингибирования грибкового и микробного роста на растениях содержит экстракт или смесь экстрактов, выбранных из перечня, состоящего из плода, ствола, семян, околоплодника, листьев и корня Morinda citrifolia, разведенных в 1-10000 раз по массе водой. Препарат для ингибирования грибкового и микробного роста на растениях содержит от 0,1 до 10% по массе н-гексановой фракции Morinda citrifolia и материал-носитель. Способ ингибирования грибковой и микробной активности на растениях включает обработку указанного растения препаратом, содержащим переработанный продукт Morinda citrifolia, присутствующий в количестве примерно от 0,01 до 99,99 процентов по массе, где указанный продукт состоит из экстракта или смеси экстрактов, выбранных из перечня, состоящего из плода, ствола, семян, околоплодника, листьев и корня Morinda citrifolia. Изобретение позволяют реализовать указанные назначения. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 29 табл.
Описание
Настоящее изобретение относится к композиции на основе Morinda citrifolia, которая может быть применена в сельском хозяйстве для снижения грибковых инфекций, повышения урожайности и для сохранения свежести урожая после сбора.
Органическими (экологически чистыми) называют системы сельскохозяйственного производства, используемые для создания продуктов питания и волокон. Различные сельскохозяйственные продукты производятся органически, включая такие, как овощи и фрукты, зерно, мясо, молочные продукты, яйца, и волокна, такие как хлопок, цветы и технологически переработанные пищевые продукты. Организация органического (экологически чистого) сельскохозяйственного производства основана на использовании естественного механизма разрушения среды обитания сельскохозяйственных вредителей, а также целенаправленном поддержании и восстановлении плодородности почвы. Фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, не применяют синтетических пестицидов или удобрений. Животноводы не применяют синтетические агрохимикаты, облучение и генетически модифицированные корма или компоненты. Для поддержания сохранности пищевых продуктов без искусственных компонентов или консервантов органические пищевые продукты подвергаются минимальной обработке. Поскольку фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, твердо придерживаются подобных правил, органические продукты питания с гораздо меньшей вероятностью содержат остатки пестицидов, чем обычные продукты. Baker, B.P., et al., Pesticide residues in conventional, integrated pest management (IPM)-grown and organic food: insights from three US data sets, 19 FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS 427-446 (2002) (13% образцов органических продуктов против 71% образцов обычных продуктов содержали остатки пестицидов, при том, что давно запрещенные стабильные пестициды были исключены).
Рынок экологически чистых (органических) пищевых продуктов велик и продолжает расти. Приблизительно 2% пищевых ресурсов США выращивают с применением экологически чистых (органических) способов. За прошедшее десятилетие продажи органических продуктов показали годовой прирост по меньшей мере 20%, наиболее быстро растущий сектор в сельском хозяйстве. В 2001 году розничные продажи экологически чистых (органических) пищевых продуктов планировались на уровне 9,3 миллиардов долларов США (Organic Consumer Trends 2001. Published by the Natural Marketing Institute, in partnership with the Organic Trade Association, http://www.ota.com/consumer_trends-2001.htm). Международный рынок экологически чистых (органических) пищевых продуктов также растет. В частности, Япония и Германия становятся важными международными рынками экологически чистых (органических) пищевых продуктов.
Стоимость экологически чистых (органических) пищевых продуктов выше, чем обычных, так как фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, заменяют химикаты трудом и интенсивными агротехническими приемами. Делая это, фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, принимают на себя некоторые расходы, которые ранее оплачивались внешними источниками для фермерских хозяйств обычной практики (например, расходы на здравоохранение и охрану окружающей среды). Некоторые расходы, связанные с ведением экологически чистого (органического) фермерского хозяйства, включают очистку загрязненной воды и рекультивацию почвы, загрязненной пестицидами. Кроме того, цены на экологически чистые (органические) пищевые продукты включают затраты на выращивание, уборку урожая, транспортировку и хранение. В случае переработанных пищевых продуктов также включаются затраты на переработку и упаковку.
Кроме более высокой стоимости при экологически чистом (органическом) ведении фермерского хозяйства обычно урожайность бывает ниже, чем при использовании обычных сельскохозяйственных методов. Исходя из данных по различным сельскохозяйственным культурам, соответствующих 154 сезонам, урожаи экологически чистых (органических) культур составляли 95% от урожаев культур, выращенных в обычных высокозатратных условиях.
Фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, создают здоровые почвы путем подкормки живого компонента почвы, обитающих в ней микроорганизмов, которые высвобождают, преобразуют и переносят питательные вещества. Почвенные органические вещества вносят вклад в хорошую почвенную структуру и водоудерживающую способность. Фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, подпитывают почвенную биоту и восстанавливают структуру почвы и ее водоудерживающую способность. Фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, подпитывают почвенную биоту и восстанавливают органические вещества почвы с помощью запашных культур, компоста и биологических почвоулучшителей. В результате этого получают здоровые растения, которые могут лучше противостоять болезням. В качестве последнего спасительного средства можно использовать определенные растительные или другие несинтетические пестициды.
Обычный и фермер, выращивающий экологически чистые продукты, сталкиваются с трудной задачей мелиорации нежелательных микроорганизмов, которые снижают урожайность и качество продуктов питания. Для того чтобы избежать применения синтетических почвоулучшителей в процессе выращивания урожая, фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, особенно должны рассчитывать на биологические методы обработки. Несмотря на наличие десятков тысяч противомикробных соединений, микроорганизмы способны быстро развивать устойчивость даже к самым новым и сильным противомикробным соединениям или методам обработки. Для того чтобы не отставать от возрастающей потребности в новых противомикробных средствах, важно открывать новые соединения. Некоторые из них могут даже происходить из неожиданных источников (см., например, создание пенициллина).
Известно, что сок Morinda citrifolia обладает многими полезными свойствами и содержит много питательных элементов. Ароматические травы, здоровая пища, корма для домашних питомцев, косметика и другие продукты были созданы с использованием некоторых элементов данного плода. Однако до настоящего времени неизвестны сельскохозяйственные композиции с применением различных продуктов Morinda citrifolia.
Следовательно, органическую (экологически чистую) и обычную фермерскую практику можно усовершенствовать путем повышения урожайности, улучшения качества производимых пищевых продуктов и снижения стоимости органического фермерства. Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые могут использовать как обычные фермеры, так и фермеры, выращивающие экологически чистые продукты, для повышения урожайности и качества производимых пищевых продуктов.
Настоящее изобретение относится к композициям на основе Morinda citrifolia для применения в сельском хозяйстве, которые являются эффективными, но не оказывают вредного воздействия на экологические системы и пригодны для фермерства при выращивании экологически чистых (органических) продуктов. Осуществление настоящего изобретения связано с использованием сока, пюре и других экстрактов или частей растения, известного как Morinda citrifolia L. Варианты осуществления изобретения включают композиции, разработанные для применения в сельском хозяйстве, где конкретная композиция включает удобрение, стимулятор роста сельскохозяйственных культур, почвоулучшитель, антибактериальное и инсектицидное средство, противомикробное средство, а также средство от болезней и вредных насекомых. Кроме того, сельскохозяйственная композиция содержит природные материалы, обладающие такими свойствами, как стимуляция роста сельскохозяйственных культур, повышение качества урожая, повышение устойчивости к болезням и вредным насекомым, увеличение урожайности, усиление сахаристости и вкуса и сохранения свежести урожая после сбора.
Настоящее изобретение относится к композициям для применения в сельском хозяйстве, содержащим различные элементы из Morinda citrifolia в отдельности или в сочетании с другими ингредиентами. Настоящее изобретение относится к различным композициям на основе Morinda citrifolia, которые могут содержать экстракты или переработанные продукты, полученные из плодов, листьев, ствола, оболочки семян и/или корня Morinda citrifolia. Изобретение также относится к сочетанию различных элементов из Morinda citrifolia с дополнительными ингредиентами для усиления полезности описанных композиций для сельского хозяйства. Например, один из вариантов осуществления настоящего изобретения описывает использование экстрактов из плодов, листьев, ствола, семян и/или корня Morinda citrifolia, которые разводили в 1-10000 раз (по массе) водой. Композиции по настоящему изобретению обладают способностью повышать урожайность сельскохозяйственных культур и сохранять свежесть собранного урожая.
Кроме того, настоящее изобретение относится к противогрибковой и антибактериальной активности экстрактов из Morinda citrifolia L. и соответствующим способам определения средних ингибирующих концентраций. В частности, настоящее изобретение относится к этанольным, метанольным и этилацетатным экстрактам из Morinda citrifolia L. и их способности ингибировать обыкновенные грибки и бактерии, а также установлению средних ингибирующих концентраций.
В соответствии с изобретением, как осуществлено и широко описано в данном описании, настоящее изобретение описывает различные способы ингибирования, профилактики и уничтожения существующей активности и роста вредных грибков и микробов с использованием активных соединений и/или компонентов, экстрагированных из и присутствующих в одном или нескольких переработанных продуктах Morinda citrifolia. Продукты Morinda citrifolia предпочтительно входят в состав препарата, разработанного для ингибирования нежелательной микробной активности.
Переработанный продукт Morinda citrifolia может охватывать различные типы, включая, но, не ограничиваясь ими: переработанный плодовый сок Morinda citrifolia, переработанный сок-пюре Morinda citrifolia, переработанную пищевую клетчатку Morinda citrifolia, переработанное масло Morinda citrifolia, переработанный концентрат плодового сока Morinda citrifolia, переработанный концентрат сока-пюре Morinda citrifolia и переработанный масляный экстракт Morinda citrifolia.
Настоящее изобретение также описывает препарат для ингибирования и лечения грибковой и микробной активности и роста, где препарат содержит по меньшей мере один или несколько переработанных продуктов Morinda citrifolia. К переработанным продуктам Morinda citrifolia относятся фракции или экстракты Morinda citrifolia, которые обладают специфическими противогрибковой и противомикробной активностями. Препарат может также содержать другие природные компоненты.
Сельскохозяйственные препараты и способы по настоящему изобретению можно получить экстракцией эффективных компонентов из плодов, листьев, ствола, семян и/или корня Morinda citrifolia. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам определения активности и средней ингибирующей концентрации экстрактов Morinda citrifolia L. в отношении обыкновенных грибков и бактерий. В частности, настоящее изобретение относится к этанольным, метанольным и этилацетатным экстрактам и различным фракциям из Morinda citrifolia L., а также их противогрибковому и антибактериальному действию с учетом их определенных средних ингибирующих концентраций и средних летальных концентраций в составе препарата, причем концентрации основаны на различных экспериментальных исследованиях.
Композиции и препараты по настоящему изобретению, как в основном описано в данном описании, можно разработать с охватом вариантов. Таким образом, следующее далее более подробное описание вариантов осуществления препаратов и способов по настоящему изобретению не имеет целью ограничить объем настоящего изобретения, как заявлено, но является только примером предпочтительных в настоящее время вариантов осуществления изобретения.
В описании и в формуле изобретения существительные в единственном числе включают такие же существительные во множественном числе, если из контекста с очевидностью не следует обратного.
В описании и формуле настоящего изобретения будет использована следующая терминология в соответствии с определениями, представленными ниже. Как использовано в данном описании, термины «заключающий в себе», «включающий», «содержащий», «характеризующийся» и их грамматические эквиваленты являются охватывающими или допускающими поправки терминами, которые не исключают дополнительные неперечисленные элементы или стадии способа. Как использовано в данном описании, словосочетание «состоящий из» и его грамматические эквиваленты исключает любой элемент, стадию или компонент, не оговоренный в пункте формулы. Как использовано в данном описании, «эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для осуществления целебных или желаемых результатов. Эффективное количество можно применять одним или большим количеством применений, нанесений или обработок. Например, эффективное количество композиции на основе Morinda citrifolia представляет собой количество, достаточное для обеспечения противомикробной активности и улучшения соответствующих состояний. Подобные эффективные количества могут определить без чрезмерного экспериментирования специалисты в данной области.
Последующее описание настоящего изобретения сгруппировано в три подрубрики, а именно «Общее обсуждение Morinda citrifolia и способы, применяемые для получения переработанных продуктов Morinda citrifolia», «Сельскохозяйственные препараты и способы применения» и «Противомикробная активность». Подрубрики использованы исключительно для удобства читателя и не должны быть истолкованы как ограничения в любом смысле.
1. Общее обсуждение Morinda citrifolia и способы, применяемые для получения переработанных продуктов Morinda citrifolia
Индийская шелковица или растение Noni, известное науке как Morinda citrifolia L. (Morinda citrifolia), представляет собой кустарник или небольшое дерево. Листья эллиптической или овальной формы расположены на одинаковой высоте друг против друга. Мелкие белые цветки собраны в мясистые шарообразные соцветия. Плоды крупные, мясистые, яйцевидной формы. Спелые плоды кремово-белого цвета, съедобны, но обладают неприятным вкусом и запахом. Растение эндемично для Юго-восточной Азии и в древние времена распространилось на обширной территории от Индии до восточной Полинезии. В диком состоянии оно растет беспорядочно, и его также выращивают на плантациях и небольших индивидуальных делянках. Цветки Morinda citrifolia небольшие, белые, с тремя-пятью лепестками, трубчатые, душистые, длиной примерно 1,25 см. Цветки развиваются в сложные плоды, состоящие из множества мелких костянок слитых в яйцевидное, эллипсоидное или округлое бугорчатое плодовое тело с восковидной белой или зеленовато-белой или желтоватой полупрозрачной кожицей. Плод имеет глазки на поверхности, подобно картофелю. Плод сочный, горький, бледно-желтого или желтовато-белого цвета и содержит множество буро-красных твердых, продолговато-трехгранных крылатых 2-ячеистых косточек, каждая из которых содержит по четыре семечка.
Полностью созревший плод обладает выраженным запахом протухшего сыра. Хотя некоторые народы употребляют плод в пищу, наиболее обычным является использование растения Morinda citrifolia в качестве источника получения красного и желтого красителей. С недавних пор вызывают интерес полезные питательные и оздоровительные свойства растения Morinda citrifolia, которые обсуждаются ниже.
Переработанный плодовый сок Morinda citrifolia можно получать, отделяя семена и кожицу от сока и мякоти зрелых плодов Morinda citrifolia, отфильтровывая мякоть от сока и упаковывая сок. Альтернативно, вместо упаковки сок можно сразу включать в качестве компонента в другие продукты. В некоторых вариантах осуществления изобретения сок и мякоть можно взбивать в пюре до гомогенной смеси, чтобы затем смешивать с другими компонентами. Другой способ включает замораживание и высушивание плодов и сока. Плоды и сок можно восстанавливать во время производства конечного сокового продукта. Еще другие способы включают воздушную сушку плодов и соков перед измельчением.
Настоящее изобретение также предполагает использование плодового сока и/или плодового сока-пюре, выжатого из растения Morinda citrifolia. При предпочтительном в настоящее время способе получения плодового сока Morinda citrifolia плоды собирают либо вручную, либо с помощью механического оборудования. Плод можно собирать, когда он достигнет в диаметре по меньшей мере от одного дюйма (2-3 см) до 12 дюймов (24-36 см). Предпочтительно плод имеет цвет от темно-зеленого, через желто-зеленый, вплоть до белого, с градациями промежуточных цветов. Плоды тщательно очищают после сбора и перед любой последующей переработкой.
Плодам дают возможность дозревать или вылежаться от 0 до 14 дней, притом что большинство плодов выдерживают от 2 до 3 дней. Плод дозревает или вылеживается, будучи помещенным в специальное приспособление таким образом, что он не соприкасается с землей. Желательно прикрыть его тканью или сетчатым материалом во время вылеживания, но он может вылеживаться и не будучи прикрытым. Плод, пригодный к дальнейшей переработке, светлого цвета, от светло-зеленого, светло-желтого, белого или полупрозрачного цвета. Плоды проверяют на признаки гниения либо чрезмерно зеленый цвет и излишнюю твердость. Гнилые и твердые зеленые плоды отделяют от пригодных.
Дозревшие и вылежавшие плоды предпочтительно помещают в ламинированные пластиком контейнеры для последующей переработки и транспортировки. Контейнеры с вылежавшими плодами можно хранить от 0 до 120 дней. Большинство плодовых контейнеров хранят от 7 до 14 дней до переработки. Контейнеры можно хранить либо в условиях охлаждения, либо при температуре окружающей среды/комнатной перед последующей переработкой. Плоды распаковывают из контейнеров-хранилищ и перерабатывают с помощью ручного или механического сепаратора. Семена и кожицу отделяют от сока и мякоти.
Сок и мякоть можно упаковывать в контейнеры для хранения и транспортировки. Альтернативно, сок и мякоть можно сразу перерабатывать в конечный соковый продукт. Контейнеры можно хранить в условиях охлаждения, заморозки или комнатной температуры.
Сок и мякоть Morinda citrifolia предпочтительно взбивают в гомогенную смесь, затем их можно смешивать с другими компонентами. Конечный соковый продукт предпочтительно нагревают и пастеризуют при минимальной температуре 181°F (83°C) или выше, вплоть до 212°F (100°C).
Другим производимым продуктом является пюре Morinda citrifolia и сок-пюре в концентрированной или разбавленной форме. Пюре, обычно, представляет собой мякоть, отделенную от семян, и отличается от плодового сокового продукта, описанного в данном описании.
Каждый продукт разливают и запечатывают в конечные контейнеры из пластмассы, стекла или иного походящего материала, который выдерживает температуры переработки. Контейнеры сохраняют при температуре разлива или могут быть быстро охлаждены, и затем помещены в транспортный контейнер. Транспортные контейнеры предпочтительно оборачивают в материал таким образом, чтобы поддерживать или контролировать температуру продукта в конечных контейнерах.
Сок и мякоть можно в дальнейшем перерабатывать путем отделения мякоти от сока с помощью фильтровального оборудования. Фильтровальное оборудование предпочтительно состоит из, но не ограничивается ими: декантатор-центрифуги, сетчатого фильтра с размерами от 0,01 микрон вплоть до 2000 микрон, более предпочтительно менее 500 микрон, фильтровального пресса, установки для обратноосмотической фильтрации и любых других стандартных коммерческих фильтрационных устройств. Рабочее давление на фильтре предпочтительно находится в пределах от 0,1 фунта на квадратный дюйм до примерно 1000 фунтов на квадратный дюйм. Скорость потока предпочтительно находится в пределах от 0,1 гал/мин до 1000 гал/мин и более предпочтительно от 5 до 50 гал/мин. Влажную мякоть промывают и фильтруют по меньшей мере один раз и вплоть до 10 раз для полного удаления сока из мякоти. Влажная мякоть обычно имеет содержание клетчатки от 10 до 40 процентов по массе. Влажную мякоть предпочтительно пастеризуют при температуре по меньшей мере 181°F (83°C) и затем упаковывают в бочки для дальнейшей переработки либо превращают в продукт с высоким содержанием клетчатки.
Переработанный продукт Morinda citrifolia может также существовать в виде клетчатки. Более того, переработанный продукт Morinda citrifolia может также существовать в форме масла. Масло Morinda citrifolia обычно содержит смесь нескольких различных жирных кислот в виде триглицеридов, таких как пальмитиновая, стеариновая, олеиновая и линолевая жирные кислоты, и других жирных кислот, присутствующих в меньших количествах. Кроме того, масло предпочтительно включает антиоксидант, чтобы препятствовать порче масла. Предпочтительно используют антиоксиданты, применяемые в производстве обычных пищевых продуктов.
Растение Morinda citrifolia богато природными компонентами. Компоненты, которые были обнаружены, включают: (из листьев): аланин, антрахиноны, аргинин, аскорбиновую кислоту, аспарагиновую кислоту, кальций, бета-каротин, цистеин, цистин, глицин, глютаминовую кислоту, гликозиды, гистидин, железо, лейцин, изолейцин, метионин, ниацин, фенилаланин, фосфор, пролин, смолы, рибофлавин, серин, бета-цитостерол, тиамин, треонин, триптофан, тирозин, урсоловую кислоту и валин; (из цветков): акацетин-7-о-бета-d(+)-глюкопиранозид, 5,7-диметил-апигенин-4'-о-бета-d(+)-галактопиранозид и 6,8-диметокси-3-метилантрахинон-1-o-бета-рамнозилглюкопиранозид; (из плодов): уксусную кислоту, асперулозид, бутановую кислоту, бензойную кислоту, бензиловый спирт, 1-бутанол, каприловую кислоту, декановую кислоту, (E)-6-додецено-гамма-лактон, (Z,Z,Z,)-8,11,14-эйкозатриеновую кислоту, элаидиновую кислоту, этилдеканоат, этилгексаноат, этилоктаноат, этилпальмитат, (Z)-6-(этилтиометил)бензол, эвгенол, глюкозу, гептановую кислоту, 2-гептанон, гексанал, гексанамид, гександиоевую кислоту, капроновую кислоту (гексановую кислоту), 1-гексанол, 3-гидрокси-2-бутанон, лауриновую кислоту, лимонен, линолевую кислоту, 2-метилбутановую кислоту, 3-метил-2-бутен-1-ол, 3-метил-3-бутен-1-ол, метилдеканоат, метилэлаидат, метилгексаноат, метил-3-метилтиопропанат, метилоктанат, метилолеат, метилпальмитат, 2-метилпропановую кислоту, 3-метилтиопропановую кислоту, миристиновую кислоту, нонановую кислоту, октановую кислоту (каприловую кислоту), масляную кислоту, пальмитиновую кислоту, калий, скополетин, ундекановую кислоту, (Z,Z)-2,5-ундекадиен-1-ол и вомифол; (из корней): антрахиноны, асперулозид (рубихлорноватую кислоту), дамнакантал, гликозиды, мориндадиол, мориндин, мориндон, слизистые вещества, нордамнакантал, рубиадин, монометиловый эфир рубиадина, смолы, соранжидиол, стеролы и монометиловый эфир тригидроксиметилантрахинона; (из корневой коры): ализарин, хлорорубин, гликозиды (пентоза, гексоза), мориндадиол, моринданигрин, мориндин, мориндон, смолистые вещества, монометиловый эфир рубиадина и соранжидиол; (из древесины): антрагаллол -2,3-диметилэфир; (из тканевой культуры): дамнакантал, люцидин, люцидин-3-примеверозид и мориндон-6-бета-примеверозид; (из растения): ализарин, ализарин-альфа-метилэфир, антрахиноны, асперулозид, капроновую кислоту, мориндадиол, мориндон, мориндогенин, октановую кислоту и урсоловую кислоту. По настоящему изобретению предполагают использование всех частей растения M. citrifolia в отдельности, в сочетании друг с другом или в сочетании с другими компонентами. Список перечисленных выше частей растения M. сitrifolia не является исчерпывающим списком частей растения, годных к использованию, но является скорее иллюстративным. Таким образом, хотя некоторые из частей растения M. сitrifolia не приведены выше (например, семена из плодов, околоплодник, кора растения), по настоящему изобретению предполагают использование всех частей растения.
Для получения экстракта из листьев, ствола, семян и/или корней Morinda citrifolia сначала указанные сырьевые материалы измельчают. Затем применяют способ экстракции для выделения интересующих компонентов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения применяют метод экстракции горячей водой, где воду добавляют в пяти-десятикратном избытке по количеству и нагревают до температуры 95°C, или можно применять метод экстракции, где используют органический растворитель, такой как этанол, метанол, гексан и тому подобное, или смесь воды и органического растворителя. Более того, можно применять метод влажного прессования с нагреванием, используя обычное автоклавное оборудование. Кроме того, к вышеуказанным способам можно добавить способы обработки с применением фермента, гидролизующего целлюлозу. После удаления нерастворимых компонентов фильтрованием, при необходимости, из экстракта, полученного из листьев, стволов, семян и/или корней, удаляют органический растворитель и получают экстракт по настоящему изобретению. Данный экстракт можно пастеризовать, если необходимо, или концентрировать, или сушить. Высушивания можно достичь с помощью обычной сушки распылением или сушки сублимацией. Экстракт можно хранить в условиях охлаждения или заморозки.
Кроме того, из семян можно экстрагировать масло. Масло можно получить путем высушивания, дробления и сжатия семян прессом. Дополнительное масло можно получить из брикета остатков семян добавлением раствора гексана и тому подобное. Масло содержит жирные кислоты, такие как линолевая кислота, олеиновая кислота, пальмитиновая кислота и стеариновая кислота в форме триглицеридов.
Недавно, как отмечалось, было открыто множество проявлений пользы для здоровья в результате употребления продуктов, содержащих Morinda citrifolia. Одним из обнаруженных полезных свойств Morinda citrifolia была его способность выделять и производить ксеронин. Ксеронин присутствует практически во всех здоровых клетках растений, животных и микроорганизмов. Хотя Morinda citrifolia содержит незначительное количество свободного ксеронина, оно содержит существенные количества предшественника ксеронина, называемого проксеронином. Кроме того, Morinda citrifolia содержит неактивную форму фермента проксероназы, которая высвобождает ксеронин из проксеронина. Статья R.M. Heinicke из Гавайского Университета, озаглавленная «The Pharmacologically Active Ingredient of Noni», свидетельствует о том, что Morinda citrifolia является «наилучшим сырьем для выделения ксеронина» из-за строительных блоков проксеронина и проксероназы.
Ксеронин защищает и поддерживает форму и гибкость белковых молекул таким образом, что они могут быть способны проникать через клеточные стенки и использоваться для образования здоровых тканей. Без этих питательных веществ, поступающих в клетку, клетка не может эффективно выполнять свои функции. Ксеронин помогает расширять поры в клеточных мембранах. Такое расширение дает возможность более длинным пептидным цепям (аминокислотам или белкам) проникать внутрь клетки. Если такие цепи не утилизируются, они становятся мусором. Кроме того, ксеронин, который получен из проксеронина, помогает в расширении пор, способствуя лучшему поглощению питательных веществ. Благодаря множеству своих полезных свойств Morinda citrifolia стала известна тем, что обладает множественными примечательными эффектами.
Преимущественно данное изобретение относится к способу лечения и ингибирования грибковой и другой микробной активности или роста с помощью препарата, основанного на Morinda citrifolia, без какой-либо значительной тенденции вызывать разрушительные для окружающей среды эффекты.
Как использовано в данном описании, термин «сок Morinda citrifolia» относится к продукту, который включает сок, переработанный из плодов индийской шелковицы или растения Morinda citrifolia L. В одном варианте осуществления изобретения сок Morinda citrifolia включает восстановленный плодовый сок из чистого сока-пюре из французской Полинезии. Композиция или препарат, содержащий по меньшей мере один переработанный продукт Morinda citrifolia, также может содержать другие компоненты. В следующем варианте осуществления изобретения сок Morinda citrifolia не перерабатывают из высушенной или молотой Morinda citrifolia.
2. Препараты и способы введения
Следующий раздел детализирует некоторые предпочтительные варианты осуществления препаратов на основе Morinda citrifolia и способов применения указанных препаратов в сельскохозяйственных посадках для увеличения урожайности и качества произведенных пищевых продуктов, в частности, путем ингибирования и профилактики болезнетворного роста микробов и путем обеспечения дополнительными питательными веществами развивающиеся растения.
Настоящее изобретение способствует прогрессу в области грибковых и прочих противомикробных ингибиторов, так как относится к композиции, составленной с одним или несколькими переработанными продуктами Morinda citrifolia, полученными из растения индийской шелковицы. Morinda citrifolia входит в состав различных носителей или композиций, пригодных для применения в сельском хозяйстве.
Сельскохозяйственные препараты по настоящему изобретению можно получать, создавая экстракт или смесь экстрактов из плодов, стволов, семян и/или корней Morinda citrifolia, полученных с использованием указанных выше способов, выполненных в виде жидкого, гранулированного, порошкообразного или пастообразного средства с помощью соответствующих материалов-носителей. Сельскохозяйственные препараты по настоящему изобретению можно применять путем растворения или диспергирования в воде. Кроме того, препараты по настоящему изобретению можно смешивать с удобрением в качестве компонента, таким как сульфат аммония, мочевина, калий, азот и хлорид аммония, различные компосты, различные навозы, куриный помет, коровий навоз, гуано, вермикомпост, помет насекомых, древесные опилки, рисовые отруби, чесночное масло, рыбий жир, вермикулит, монтмориллонит, активированный уголь, древесный уголь, диатомит, тальк, люцерновая мука и гранулы, азот, фосфор, калий, высушенные измельченные остатки сахарной свеклы, кукурузный глютен, муку из жмыха семян хлопчатника, экстракты или растертые в порошок части келпа или водорослей, соевый шрот, отходы от переработки туш животных, кровяную муку, костную муку и рыбные отходы.
Сельскохозяйственное стимулирующее средство по настоящему изобретению можно применять для плодовых овощных культур, листовых овощных культур, корнеплодов, зерновых, а также цветов и луковичных. В сущности, можно предложить следующий способ применения: препаратом можно опрыскивать или поливать почву перед посадкой или во время роста растений; наносить или распылять на растение во время обрезки, разделения или пересадки растения; наносить или распылять на семена или луковицы во время посадки; наносить или распылять на поникшие цветы и кустарники; распылять на водные растения; наносить или распылять на растения, инфицированные бактериями или вирусами; наносить или распылять на срезанные цветы после уборки; наносить или распылять на зерновые и цветковые после уборки.
В одном иллюстративном варианте осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению содержит один или несколько переработанных продуктов Morinda citrifolia (например, сок плодов Morinda citrifolia, или плодовый сок, или сок-пюре), присутствующих в массовых количествах примерно от 0,01 до 100 процентов по массе и предпочтительно от 0,01 до 95 процентов по массе. Некоторые варианты осуществления препаратов представлены ниже. Однако варианты приводятся только с иллюстративной целью, поскольку для специалиста в данной области будут очевидны другие препараты или композиции, содержащие переработанный продукт Morinda citrifolia.
Переработанный продукт Morinda citrifolia содержит по меньшей мере один из активных ингредиентов, таких как кверцитин и рутин и другие, для повышения эффективности ингибирования грибковой активности.
Активные ингредиенты из переработанного продукта Morinda citrifolia можно экстрагировать различными спиртами или спиртовыми растворами, такими как метанол, этанол и этилацетат, а также другими спиртовыми производными с помощью методов и способов, общепринятых в данной области. Активные ингредиенты кверцитин и рутин присутствуют в массовых количествах от 0,01 до 10 процентов от всего препарата или композиции. При необходимости, данные количества можно сконцентрировать до более эффективной концентрации, когда они присутствуют в количествах от 10 до 100 процентов.
В одном иллюстративном варианте осуществления изобретения, способ включает стадии: (a) составления композиции, состоящей частично из переработанного продукта Morinda citrifolia, присутствующего в количестве примерно от 0,01 до 95 процентов по массе, где композиция также содержит носитель, такой как вода или очищенная вода, а также может содержать другие природные и искусственные компоненты, включая избранные удобрения; (b) нанесения композиции на почву или растения таким образом, чтобы переработанный продукт Morinda citrifolia мог войти в состав или соприкоснуться с растением; (c) повторения предыдущих стадий так часто, как необходимо для обеспечения эффективного количества переработанного продукта Morinda citrifolia, необходимого для ингибирования и/или профилактики грибковой и прочей микробной активности или роста, при этом одновременно повышающего урожайность. Специалисту в данной области будет очевидно, что количество композиции и частота применения могут варьировать от одной агрономической ситуации к другой.
Следующие таблицы иллюстрируют или представляют некоторые из предпочтительных препаратов или композиций, рассматриваемых в настоящем изобретении. Как было отмечено, указанные таблицы приводятся только для иллюстрации вариантов осуществления изобретения и никоем образом не могут быть истолкованы как ограничивающие.
Препарат один
| Ингредиенты | Процент по массе |
| сок-пюре или плодовый сок Morinda citrifolia | 100% |
Препарат два
| Ингредиенты | Процент по массе |
| плодовый сок Morinda citrifolia | 85-99,99% |
| вода | 0,01-15% |
Препарат три
| Ингредиенты | Процент по массе |
| плодовый сок Morinda citrifolia | 0,01-15% |
| вода | 85-99,99% |
Препарат четыре
| Ингредиенты | Процент по массе |
| плодовый сок Morinda citrifolia | 15-85% |
| вода | 15-85% |
Препарат пять
| Ингредиенты | Процент по массе |
| плодовый сок Morinda citrifolia | 20-90,8% |
| вода | 0,1-50% |
| удобрение | 0,1-30% |
Препарат шесть
| Ингредиенты | Процент по массе |
| плодовый сок Morinda citrifolia | 0,1-30% |
| вода | 0,1-50% |
| удобрение | 20-90,8% |
Препарат семь
| Ингредиенты | Процент по массе |
| экстрагированный компонент из плодов, околоплодника, стебля, семян и/или корня Morinda citrifolia | 100% |
Препарат восемь
| Ингредиенты | Процент по массе |
| экстрагированный компонент из плодов, околоплодника, стебля, семян и/или корня Morinda citrifolia | 85-99,99% |
| вода | 0,01-15% |
Препарат девять
| Ингредиенты | Процент по массе |
| экстрагированный компонент из плодов, околоплодника, стебля, семян и/или корня Morinda citrifolia | 0,01-15% |
| вода | 85-99,99% |
Препарат десять
| Ингредиенты | Процент по массе |
| экстрагированный компонент из плодов, околоплодника, стебля, семян и/или корня Morinda citrifolia | 50-90,98% |
| вода | 0,01-50% |
| удобрение | 0,01-30% |
Препарат одиннадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| экстрагированный компонент из плодов, околоплодника, стебля, семян и/или корня Morinda citrifolia | 0,1-30% |
| вода | 1-99,9% |
| удобрение | 1-99,9% |
Препарат двенадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| масло Morinda citrifolia | 0,1-30% |
| среда-носитель | 70-99,9% |
| Другие компоненты (например, удобрение) | 1-95% |
Препарат тринадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| продукт Morinda citrifolia | 10-80% |
| среда-носитель | 20-90% |
Препарат четырнадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| продукт Morinda citrifolia | 5-80% |
| среда-носитель | 20-95% |
Препарат пятнадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| масло или масляный экстракт Morinda citrifolia | 0,1-20% |
| среда-носитель | 20-90% |
Препарат шестнадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| сок-пюре или плодовый сок Morinda citrifolia | 0,1-80% |
| масло Morinda citrifolia | 0,1-20% |
| среда-носитель | 20-90% |
Препарат семнадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| концентрат сока-пюре или концентрат плодового сока Morinda citrifolia | 100% |
Препарат восемнадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| концентрат плодового сока или концентрат сока-пюре Morinda citrifolia | 85-99,99% |
| вода | 0,1-15% |
Препарат девятнадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| фракция сока-пюре или плодового сока Morinda citrifolia | 100% |
Препарат двадцать
| Ингредиенты | Процент по массе |
| фракция плодового сока Morinda citrifolia | 85-99,99% |
| вода | 0,1-15% |
Препарат двадцать один
| Ингредиенты | Процент по массе |
| фракция плодового сока Morinda citrifolia | 85-99,99% |
| удобрение | 0,1-15% |
Препарат двадцать два
| Ингредиенты | Процент по массе |
| фракция плодового сока Morinda citrifolia | 50-90% |
| вода | 0,1-50% |
| удобрение | 0,1-30% |
Препарат двадцать три
| Ингредиенты | Процент по массе |
| фракция сока-пюре Morinda citrifolia | 85-99,9% |
| вода | 0,1-15% |
Препарат двадцать четыре
| Ингредиенты | Процент по массе |
| сок Morinda citrifolia | 0,1-80% |
| экстрагированный компонент(ы) из Morinda citrifolia | 0,1-20% |
| удобрение | 20-90% |
В одном примере, который никоим образом не должен являться ограничивающим, полезная Morinda citrifolia переработана в сок TAHITIAN NONI®, производимый Morinda, Incorporated of Orem, Юта.
В примере варианта осуществления препарат содержит следующие ингредиенты: переработанный продукт Morinda citrifolia, присутствующий в количестве примерно 10-80 процентов по массе; и среда-носитель, присутствующая в количестве примерно 20-90 процентов по массе.
В данном варианте осуществления переработанный продукт Morinda citrifolia может включать один или несколько продуктов из переработанного плодового сока Morinda citrifolia, переработанного сока-пюре Morinda citrifolia, переработанного концентрата плодового сока или сока-пюре Morinda citrifolia, экстрагированного компонента(ов) из Morinda citrifolia и/или переработанного масляного экстракта Morinda citrifolia.
В другом примере варианта осуществления препарат содержит следующие ингредиенты: переработанный плодовый сок или сок-пюре Morinda citrifolia, присутствующий в количестве примерно 0,1-80 процентов по массе; переработанное масло Morinda citrifolia, присутствующее в количестве примерно 0,1-20 процентов по массе, и среда-носитель, присутствующая в количестве примерно 20-90 процентов по массе.
Среда-носитель, обозначенная в вышеуказанных препаратах, может включать любой ингредиент, который можно помещать в или на ткани растения и который способен обеспечить несущую среду для переработанного продукта Morinda citrifolia. Специальные составы сред-носителей хорошо известны специалистам в данной области и в данном описании подробно не описаны. Назначение среды-носителя, как отмечено, в том, чтобы в составе препарата обеспечить средство для включения переработанного продукта Morinda citrifolia, которое можно помещать в или на ткани растения.
3. Противомикробная активность
Следующие примеры излагают и представляют профилактическое и лечебное действие переработанных продуктов Morinda citrifolia на активность грибков. Данные примеры никоим образом не должны являться ограничивающими, но являются только иллюстрирующими полезность и преимущества, а также лечебное действие продуктов Morinda citrifolia.
Пример 1
Исследование проводили для определения средних ингибирующих концентраций определенных экстрактов из Morinda citrifolia в отношении активности обыкновенных грибков и бактерий. В данном исследовании пытались установить противомикробную активность в Morinda citrifolia, используя «нисходящий» подход. Был разработан воспроизводимый тест, и предварительные исследования указали на то, что противомикробный компонент из Morinda citrifolia можно экстрагировать. В результате исследования обнаружили, что этанольные, метанольные и этилацетатные экстракты Morinda citrifolia обладают противомикробной активностью в тестах с S. aureus, E. coli, C. albicans, T. mentagrophytes и A. niger.
За последние годы в попытке открыть новые противомикробные соединения было изучено множество различных источников. В данном исследовании был разработан протокол для определения средней ингибирующей концентрации (MIC) и затем использован для тестирования этанольных, метанольных и этилацетатных экстрактов Morinda citrifolia на противогрибковую и противомикробную активность в отношении Aspergillus niger (ATCC 6275); Candida albicans (ATCC 10231); Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9533); Staphlococcus aureus (ATCC 29213) и Escherichia coli (ATCC 25922).
Жидкие экстракты получали и тестировали в лунках микротитровального планшета в двух повторах. Экстракты в количестве от 6 мкл до 200 мкл помещали в лунки и сушили. Готовили раствор McFarland 0,5 каждого организма и получали суспензию 1/100 в соответствующей среде. Данную суспензию организмов добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение соответствующего периода времени при соответствующей температуре. Затем изучали рост в планшетах и определяли MIC. В пределах одного разведения все результаты для дублей совпадали. Этилацетатные экстракты обладали наименьшей противомикробной активностью, проявляя активность только при тестировании против T. mentagrophytes и S. aureus. Этанольные экстракты обладали противомикробной активностью в отношении всех тестируемых организмов. Диапазон данной активности простирался от значений за нижним пределом шкалы при тестировании против T. mentagrophytes до высоких значений шкалы для A. niger. Метанольные экстракты также обладали активностью против всех тестируемых микроорганизмов, в диапазоне от значений за нижним пределом шкалы при тестировании против T. mentagrophytes до высоких значений шкалы для A. niger. Данные результаты свидетельствуют о том, что по меньшей мере некоторые экстракты Morinda citrifolia обладают противомикробной активностью. Далее следует более подробное описание данного теста.
Материалы, используемые в данном тесте, включали некоторые культивируемые микроорганизмы, а именно S. aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922, C. albicans ATCC 10231, T. mentagrophytes ATCC 9533 и A. niger ATCC 6275. Исходные культуры выращивали в соответствии с инструкциями изготовителя. Перед тестированием S. aureus и E. coli высевали на чашки с трипсинизированным соевым агаром и инкубировали в течение 18-24 часов при 37°C. C. albicans, T. mentagrophytes и A. niger высевали на чашки с декстрозным агаром Saboraud и инкубировали в течение 48-72 часов при 25°C.
Для суспензии микроорганизмов использовали микроорганизмы с получением суспензии 0,5 McFarland в физиологическом растворе. 100 мкл суспензии бактерий добавляли к 9,9 мл трипсинизированного соевого бульона и 100 мкл суспензии грибков добавляли к 9,9 мл декстрозного бульона Saboraud.
В данном исследовании для подготовки планшетов использовали этанольные, метанольные и этилацетатные экстракты Morinda citrifolia. Экстракты плодового сока Morinda citrifolia поставлялись Morinda, Inc. Каждый экстракт использовали для подготовки ряда микротитровальных лунок. В лунки 1 и 6 вносили 200 мкл экстракта; в лунки 2 и 7 вносили 100 мкл экстракта; в лунки 3 и 8 вносили 50 мкл экстракта; в лунки 4 и 9 вносили 25 мкл экстракта; в лунки 5 и 10 вносили 12,5 мкл экстракта и в лунки 6 и 12 вносили 6,3 мкл экстракта. В результате каждый ряд содержал дублированные серии материала экстракта. Этанольные экстракты вносили в ряды A-B стандартного микротитровального планшета, метанольные экстракты вносили в ряды C-D стандартного микротитровального планшета и этилацетатные экстракты вносили в ряды E-F стандартного микротитровального планшета. В ряд G вносили 200 мкл 95% этилового спирта и в ряд H не вносили ничего. Затем планшеты инкубировали при 37°C в течение 48 часов и давали высохнуть.
Каждый микроорганизм вносили в отдельный планшет, используя 1/100 суспензию микроорганизмов в среде. 100 мкл вносили в каждую лунку. После внесения бактериальные культуры инкубировали в течение 24-48 часов при 37°C. Грибковые культуры инкубировали в течение 72 часов при 25°C. После инкубации анализировали рост в лунках. Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) определяли, отмечая наименьшую концентрацию экстракта, которая ингибировала рост. Результаты представляли как количество экстракта в микролитрах в лунке, где обнаруживали MIC. Ряды G и H служили в качестве контроля для экстракта и неингибированного роста.
При разработке данного теста потребовалось преодолеть несколько проблем. Вероятно, наиболее сложно было усовершенствовать способ высушивания соединений таким образом, чтобы их можно было ре-солюбилизировать после внесения. Исторический обзор в области разработки противомикробных средств свидетельствует о том, что в ранних экспериментах, в которых экстракты пенициллина сушили, активность полностью исчезала. Данную проблему решили путем использования слабого нагрева в течение длительного периода времени.
Следующие таблицы 1-8 иллюстрируют обнаруженную активность. Активность указана как наименьший объем сухого экстракта, способный ингибировать рост.
|
Таблица 1
Активность этанольных экстрактов |
|
| E. coli | 50 мкл |
| S. aureus | 12,5 мкл |
| T. mentagrophytes | ≤6,3-25 мкл |
| A. niger | 100-200 мкл |
| C. albicans | 100 мкл |
|
Таблица 2
Активность метанольных экстрактов |
|
| E. coli | 25-50 мкл |
| S. aureus | ≤6,3 мкл |
| T. mentagrophytes | ≤6,3-12,5 мкл |
| A. niger | 200 мкл |
| C. albicans | 50-100 мкл |
|
Таблица 3
Активность этилацетатных экстрактов |
|
| E. coli | 200->200 мкл |
| S. aureus | 50-200 мкл |
| T. mentagrophytes | 50-100 мкл |
| A. niger | >200 мкл |
| C. albicans | >200 мкл |
|
Таблица 4
Экстракты, тестированные с E. coli |
||||
| этанол | 50 | 50 | 50 | 50 |
| метанол | 25 | 50 | 25 | 25 |
| этилацетат | >200 | >200 | 200 | >200 |
|
Таблица 5
Экстракты, тестированные с S. aureus |
||||
| этанол | 12,5 | 12,5 | 12,5 | 12,5 |
| метанол | ≤6,3 | ≤6,3 | ≤6,3 | ≤6,3 |
| этилацетат | 50 | 50 | 200 | 200 |
|
Таблица 6
Экстракты, тестированные с T. mentagrophytes |
||||
| этанол | ≤6,3 | 25 | ≤6,3 | 25 |
| метанол | ≤6,3 | 12,5 | ≤6,3 | 12,5 |
| этилацетат | 50 | 50 | 100 | 100 |
|
Таблица 7
Экстракты, тестированные с A. niger |
||||
| этанол | 200 | 200 | 100 | 100 |
| метанол | 200 | 200 | 200 | 200 |
| этилацетат | >200 | >200 | >200 | >200 |
|
Таблица 8
Экстракты, тестированные с C. albicans |
||||
| этанол | 100 | 100 | 100 | 100 |
| метанол | 100 | 100 | 50 | 50 |
| этилацетат | >200 | >200 | >200 | >200 |
Результаты теста свидетельствовали о том, что активность этанольных экстрактов находилась в пределах от ≤6,3 мкл до 200 мкл; активность метанольных экстрактов находилась в пределах от ≤6,3 мкл до 200 мкл; активность этилацетатных экстрактов находилась в пределах от 50 мкл до 200 мкл; и что этанольные и метанольные экстракты являлись наиболее эффективными против всех тестируемых микроорганизмов.
В данном исследовании сделана попытка предпринять первые шаги для выделения новых противомикробных соединений из неочищенного материала. При данном «нисходящем» подходе использованы грубые экстракты Morinda citrifolia. Результаты свидетельствовали о том, что этанол и метанол обладали активностью в отношении всех тестируемых микроорганизмов, что, в свою очередь, свидетельствовало о противогрибковой активности Morinda citrifolia.
Учитывая проявление противомикробной активности, можно сказать, что существует по меньшей мере одно, а возможно несколько соединений в составе Morinda citrifolia, которые ответственны за проявляемую в данном случае противомикробную активность. Таким образом, потребуются другие тесты и эксперименты, чтобы точно определить и выделить их. Наиболее вероятно, что будущие исследования будут включать очистку экстрактов, описанных в данном описании, с использованием стандартных методов разделения, которые будут включать установление некоторых из мириад соединений, которые присутствуют в данных экстрактах. Будучи выделенным, каждое может быть протестировано на противомикробную активность
Пример 2
Целью данного эксперимента является определение средней ингибирующей концентрации (MIC) выбранных экстрактов плодового сока Morinda citrifolia в отношении трех обыкновенных патогенных грибков и двух обыкновенных бактерий.
Используемыми в данном примере организмами являлись Aspergillus niger (ATCC 6275); Candida albicans (ATCC 10231); Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9533); Staphlococcus aureus (ATCC 29213) и Escherichia coli (ATCC 9533).
Для экстрактов плодового сока Morinda citrifolia из него были получены этанольные, метанольные, этилацетатные и водные экстракты с использованием соответствующих растворителей.
Приготовление стерильных сред (1 литр) включало: для грибков, декстрозный бульон Sabouraud (SDB); для бактерий, бульон Mueller Hinton (MHB); выдерживание в автоклаве при 121°C в течение 20 минут.
Приготовление суспензий организмов включало посев каждого организма на соответствующую среду, инкубацию и подтверждение идентичности, приготовление суспензии 0,5 McFarland каждого организма и добавление 0,1 мл суспензии организма к 9,9 мл соответствующей среды (SDB или MHB).
Чтобы приготовить экстракты сока Morinda citrifolia, используя соответствующую среду, экстракты высушивали и затем растворяли до конечной концентрации 2 мг/мл. Затем экстракты хранили в морозильных камерах при -20°C до готовности к высеванию грибков. Данные растворы с концентрацией 2 мг/мл использовали как маточные растворы Morinda citrifolia.
Тринадцать пробирок были помечены, как указано в таблице 9.
|
Таблица 9
Метки пробирок |
||
| 1/1 | 1/32 | 1/512 |
| 1/2 | 1/64 | 1/1024 |
| 1/4 | 1/128 | ростовой контроль |
| 1/8 | 1/256 | пустой контроль |
| 1/16 |
100 мкл маточного раствора Morinda citrifolia добавляли в пробирку 1/1 и 100 мкл в пробирку 1/2. 100 мкл стерильных сред добавляли в пробирки: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, ростовой контроль и пустой контроль.
Пробирку 1/2 тщательно перемешивали и 100 мкл отбирали и добавляли в пробирку 1/4. Данную процедуру двукратного разведения повторяли для пробирок 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512 и 1/1024. Отбирали 100 мкл из пробирки 1/1024. В пробирки РК или ПК не добавляли разведенных растворов Morinda citrifolia. Данные пробирки являлись контрольными. На данном этапе все пробирки содержали по 100 мкл.
Поскольку известно, что исходная концентрация маточного раствора экстракта составляла 2 мг/мл (то есть 2000 мкг/мл), в результате серийных двукратных разведений были получены следующие концентрации экстракта плодового сока Morinda citrifolia, представленные в таблице 10.
|
Таблица 10
Серийные разведения |
||
| № пробирки | разведение | Концентрация экстракта |
| 1 | 1/1 | 2000 мкг/мл |
| 2 | 1/2 | 1000 мкг/мл |
| 3 | 1/4 | 500 мкг/мл |
| 4 | 1/8 | 250 мкг/мл |
| 5 | 1/16 | 125 мкг/мл |
| 6 | 1/32 | 62,50 мкг/мл |
| 7 | 1/64 | 31,25 мкг/мл |
| 8 | 1/128 | 15,13 мкг/мл |
| 9 | 1/256 | 7,56 мкг/мл |
| 10 | 1/512 | 3,78 мкг/мл |
| 11 | 1/1024 | 1,89 мкг/мл |
| 12 | РК | без экстракта |
| 13 | ПК | без организма |
При введении 100 мкл суспензии организмов добавляли ко всем пробиркам, за исключением пробирки пустой контроль (ПК). 100 мкл среды дополнительно добавляли в ПК. Все пробирки инкубировали при соответствующих температурах и во временных интервалах для грибков, 25°C в течение 5-7 дней; для бактерий, 37°C в течение 24-48 часов.
Результаты записывали, наблюдая помутнение. Наличие помутнения указывало на рост, тогда как отсутствие помутнения свидетельствовало об ингибировании роста. Для любого экстракта результат признавали действительным только, если в пробирке ростового контроля имелось помутнение (то есть происходил рост) и в пробирке пустого контроля помутнение отсутствовало (то есть отсутствовал рост). MIC определяли как последнюю пробирку в серии (то есть с наиболее разбавленным раствором), в которой отсутствовало помутнение.
В следующей таблице 11 представлены значения средней ингибирующей концентрации (мкг/мл).
|
Таблица 11
Средняя ингибирующая концентрация |
|||
| EtOH | MeOH | EtAc | |
| C. albicans | 1000 | 250-1000 | >2000 |
| A. niger | 1000-2000 | 1000-2000 | >2000 |
| T. mentagr. | ≤7,56 | ≤7,56 | 250-1000 |
| S. aureus | 31,25-62,50 | 31,25-62,50 | 1000-2000 |
| E. coli | 250 | 62,50-250 | >2000 |
Результаты свидетельствуют о том, что этанольные и метанольные экстракты Morinda citrifolia обладают выраженной активностью в отношении всех тестируемых микроорганизмов. Предварительные исследования по высушиванию свидетельствовали о том, что активность при использовании этанольных и метанольных экстрактов была в пределах 5-10 мг/мл. Этилацетатные экстракты содержали <10% от величины, обнаруженной в этанольных и метанольных экстрактах.
Из данной предварительной фазы исследования можно с очевидностью установить, что плодовый сок Morinda citrifolia или его экстракты обладают существенным количеством противогрибковой активности. Однако каждый экстракт содержит сотни соединений. Действительно, при концентрации 1000 мкл/мл, там могут присутствовать 100 соединений, каждое в концентрации 10 мкл/мл. Таким образом, поскольку тестируемые экстракты не были очищенными противомикробными соединениями, даже очень высокие значения MIC могут быть весьма выразительными. Более поздние тесты, описанные ниже, представляют некоторые специфические соединения, которые были фракционированы или экстрагированы из концентрата плодового сока Morinda citrifolia.
Пример 3
Для следующего эксперимента, минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) антибактериального средства определяют как максимальное разведение продукта, при котором все еще будет ингибирован рост тестируемого микроорганизма. Минимальную летальную концентрацию (MLC) антибактериального средства определяют как максимальное разведение продукта, при котором погибает тестируемый микроорганизм. Значения MIC/MLC можно определить с помощью ряда стандартных методов тестирования. Наиболее часто применяемыми методами являются метод разведения в пробирке и методы разведения в агаре. Метод разведения в пробирке предлагался для данного продукта для определения MIC и посева аликвот из разведений, при которых наблюдали возможное ингибирование роста, для определения MLC. Продукты серийно разводили в бактериальной ростовой среде. Тестируемые организмы добавляли к разведенным продуктам, инкубировали и анализировали рост. Все тесты проводили в трех повторах.
Приведенная методика является стандартным тестом для противомикробных средств. Данная методика воплощает содержание и цель метода, рекомендованного Американским микробиологическим обществом (ASM). Метод разведения в пробирке включает разведение тестируемого продукта в бактериальной ростовой среде, смешивание с тестируемым организмом в заранее определенной концентрации и визуализацию роста после инкубации. Методы разведения в пробирке применяют только к продуктам, которые не образуют осадка или помутнения в ростовой среде в пределах ожидаемого диапазона конечных точек.
Для подготовки культур в качестве тестируемых организмов использовали Escherichia coli 0157H7 ATCC #43888; Staphylococcus aureus ATCC #6538; Bacillus subtilis ATCC #19659; Salmonella choleraesuis серотипа enteritidis ATCC #13706; Listeria monocytogenes ATCC #19111; Candida albicans ATCC #10231 и Streptococcus mutans ATCC #25175.
Из маточного раствора тестируемые микроорганизмы переносили в казеин-соевый питательный бульон (SCDB) и инкубировали при 37±2°C в течение 24-48 часов для бактерий и 20-25°C для дрожжей. При необходимости, суспензии доводили до концентрации примерно 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) (CFU) в мл по оптической мутности физиологическим солевым раствором (PHSS) и проводили подсчет стандартной чашки для определения начальных титров. Дрожжевую культуру высевали на декстрозный агар Sabouraud (SDEX) и инкубировали при 20-25°C в течение 2-4 дней, S. mutans инкубировали при 37±2°C в течение 3-5 дней, и все остальные бактерии инкубировали при 37±2°C в течение 18-24 часов.
Для способа определения средней ингибирующей концентрации (MIC) тестируемый продукт приводили к нейтральному pH для проведения данного теста. Значение pH записывали до и после того, как были проведены корректировки. Каждый тестируемый продукт серийно разводили 1:2 в стерильной воде. Разведения были выбраны таким образом, чтобы показать конечную точку MIC/MLC. Оценку каждого тестируемого продукта проводили в трех повторах для каждого организма. Продукт в разных разведениях добавляли к равному объему 2ХSCDS, чтобы получить дополнительное разведение 1:2. Три пробирки с положительным контролем готовили для каждого тестируемого организма, смешивая стерильную воду с равными объемами 2ХSCDB. Три пробирки с отрицательным контролем готовили, смешивая тестируемый продукт в наивысшем тестированном разведении с равными объемами 2ХSCDB. В данные пробирки тестируемые организмы не добавляли. Три контрольные пробирки со средами готовили, смешивая стерильную воду с равными объемами 2ХSCDB. В данные пробирки тестируемые организмы также не добавляли.
Примерно 0,05 мл суспензии каждого тестируемого организма добавляли в пробирки с образцами и с положительным контролем. Пробирки с бактериями инкубировали при 37±2°C в течение 18-24 часов и пробирки с дрожжами инкубировали при 20-25°C в течение 2-4 дней. После инкубации рост оценивали как отрицательный (0) или положительный (+) для каждой пробирки.
Для способа определения средней летальной концентрации (MLC) тестировали только пробирки, в которых предположительно отсутствовал всякий рост. Аликвоту 1,0 мл отбирали из каждой пробирки и делали серийные разведения 1/10 в нейтрализующем бульоне, вплоть до 1/1000. Аликвоту от каждого разведения высевали на нейтрализующий агар (NUAG). Для положительного контроля на NUAG высевали 10-100 КОЕ. Отрицательный контроль получали, высевая 2ХSCDB на NUAG. Чашки инкубировали при 20-25°C в течение 2-4 дней для дрожжей и при 37±2°C в течение 18-24 часов для всех бактерий, за исключением S. mutans.
Относительно того, что понимают под подтверждением нейтрализации, самое слабое разведение тестируемого продукта, который тестировали для MLC, тестировали на восстановление после нейтрализации для каждого тестируемого организма. Аликвоты 0,5 мл, в трех повторах, наиболее концентрированного тестируемого продукта помещали на NUAG. На чашки проколами наносили 10-100 КОЕ каждого тестируемого организма. Для сравнения на три чашки с NUAG без тестируемого продукта также проколами наносили такие же 10-100 КОЕ каждого тестируемого организма.
За исключением S. mutans, все организмы были ингибированы нейтрализованным концентратом Morinda citrifolia в концентрации 1:2. Ни одно из тестируемых разведений не обладало способностью вызывать гибель какого-либо из организмов. Нейтрализованный концентрат Morinda citrifolia не обладал ни ингибирующим, ни летальным действием при тестировании против S. mutans.
Результаты определения MIC для всех организмов представлены в таблицах 12-18. Результаты определения MLC для каждого организма представлены в таблицах 19-25. Так как для S. mutans ни в одном из разведений не было зафиксировано отсутствие роста в части теста по определению MIC, определение MLC для данного организма не проводили.
Восстановление после нейтрализации для всех тестируемых организмов составляло от 40 до 97%. Данные о восстановлении после нейтрализации для нейтрализующих сред, используемых в исследовании, представлены в таблице 25.
|
Таблица 12
Результаты определения средней ингибирующей концентрации для Escherichia coli 0157H7 ATCC #43885 |
|||
| Разведение | Рост +/0 | ||
| 1:2 | 0 | 0 | 0 |
| 1:4 | + | + | + |
| 1:8 | + | + | + |
| 1:16 | + | + | + |
| 1:32 | + | + | + |
| 1:64 | + | + | + |
| положительный | + | + | + |
| отрицательный | 0 | 0 | 0 |
| среда | 0 | 0 | 0 |
| Титр: 7,0×108 КОЕ/мл Объем внесения=0,05 мл |
|
Таблица 13
Результаты определения средней ингибирующей концентрации для Staphylococcus aureus ATCC #6538 |
|||
| Разведение | Рост +/0 | ||
| 1:2 | 0 | 0 | 0 |
| 1:4 | + | + | + |
| 1:8 | + | + | + |
| 1:16 | + | + | + |
| 1:32 | + | + | + |
| 1:64 | + | + | + |
| положительный | + | + | + |
| отрицательный | 0 | 0 | 0 |
| среда | 0 | 0 | 0 |
| Титр: 6,5×108 КОЕ/мл Объем внесения=0,05 мл |
|
Таблица 14
Результаты определения средней ингибирующей концентрации для Bacillus subtilis ATCC #19659 |
|||
| Разведение | РОСТ +/0 | ||
| 1:2 | 0 | 0 | 0 |
| 1:4 | + | + | + |
| 1:8 | + | + | + |
| 1:16 | + | + | + |
| 1:32 | + | + | + |
| 1:64 | + | + | + |
| положительный | + | + | + |
| отрицательный | 0 | 0 | 0 |
| среда | 0 | 0 | 0 |
| Титр: 8,5×107 КОЕ/мл Объем внесения=0,05 мл |
|
Таблица 15
Результаты определения средней ингибирующей концентрации для Salmonella choleraesuis серотип enteritidis ATCC #13706 |
|||
| Разведение | РОСТ +/0 | ||
| 1:2 | 0 | 0 | 0 |
| 1:4 | + | + | + |
| 1:8 | + | + | + |
| 1:16 | + | + | + |
| 1:32 | + | + | + |
| положительный | + | + | + |
| отрицательный | 0 | 0 | 0 |
| среда | 0 | 0 | 0 |
| Титр: 4,8×108 КОЕ/мл Объем внесения=0,05 мл |
|
Таблица 16
Результаты определения средней ингибирующей концентрации для Listeria monocytogenes ATCC #19111 |
|||
| Разведение | РОСТ +/0 | ||
| 1:2 | 0 | 0 | 0 |
| 1:4 | + | + | + |
| 1:8 | + | + | + |
| 1:16 | + | + | + |
| 1:32 | + | + | + |
| 1:64 | + | + | + |
| положительный | + | + | + |
| отрицательный | 0 | 0 | 0 |
| среда | 0 | 0 | 0 |
| Титр: 3,9×108 КОЕ/мл Объем внесения=0,05 мл |
|
Таблица 17
Результаты определения средней ингибирующей концентрации для Candida albicans ATCC #10231 |
|||
| Разведение | РОСТ +/0 | ||
| 1:2 | 0 | 0 | 0 |
| 1:4 | + | + | + |
| 1:8 | + | + | + |
| 1:16 | + | + | + |
| 1:32 | + | + | + |
| 1:64 | + | + | + |
| положительный | + | + | + |
| отрицательный | 0 | 0 | 0 |
| среда | 0 | 0 | 0 |
| Титр: 1,3×108 КОЕ/мл Объем внесения=0,05 мл |
|
Таблица 18
Результаты определения средней ингибирующей концентрации для Streptococcus mutans ATCC #25175 |
|||
| Разведение | РОСТ +/0 | ||
| 1:2 | + | + | + |
| 1:4 | + | + | + |
| 1:8 | + | + | + |
| положительный | + | + | + |
| отрицательный | 0 | 0 | 0 |
| среда | 0 | 0 | 0 |
| Титр: 1,0×107 КОЕ/мл Объем внесения=0,05 мл |
|
Таблица 19
Результаты определения средней летальной концентрации для Escherichia coli 0157H7 ATCC #43588 |
|||||
| Разведение | Реплика | Разведение | |||
| 100 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||
| 1:2 | 1 | ПВС | ПВС | ПВС | 245 |
| 2 | ПВС | ПВС | ПВС | 239 | |
| 3 | ПВС | ПВС | ПВС | 215 | |
| Объем посева=0,5 мл ПВС=превышает возможности счета |
|
Таблица 20
Результаты определения средней летальной концентрации для Staphylococcus aureus ATCC #6538 |
|||||
| Разведение | Реплика | Разведение | |||
| 100 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||
| 1:2 | 1 | ПВС | ПВС | ПВС | 200 |
| 2 | ПВС | ПВС | ПВС | 134 | |
| 3 | ПВС | ПВС | ПВС | 114 | |
| Объем посева=0,5 мл ПВС=превышает возможности счета |
|
Таблица 21
Результаты определения средней летальной концентрации для Bacillus subtilis ATCC #19659 |
|||||
| Разведение | Реплика | Разведение | |||
| 100 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||
| 1:2 | 1 | 27 | 3 | 0 | 0 |
| 2 | 25 | 2 | 0 | 0 | |
| 3 | 18 | 2 | 0 | 0 | |
| Объем посева=0,5 мл |
|
Таблица 22
Результаты определения средней летальной концентрации для Salmonella choleraesuis серотип enteritidis ATCC #13706 |
|||||
| Разведение | Реплика | Разведение | |||
| 100 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||
| 1:2 | 1 | ПВС | ПВС | 41 | 7 |
| 2 | ПВС | ПВС | 75 | 5 | |
| 3 | ПВС | ПВС | 63 | 6 | |
| Объем посева=0,5 мл ПВС=превышает возможности счета |
|
Таблица 23
Результаты определения средней летальной концентрации для Listeria monocytogenes ATCC #19111 |
|||||
| Разведение | Реплика | Разведение | |||
| 100 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||
| 1:2 | 1 | ПВС | ПВС | ПВС | 109 |
| 2 | ПВС | ПВС | ПВС | 109 | |
| 3 | ПВС | ПВС | ПВС | 179 | |
| Объем посева=0,5 мл ПВС=превышает возможности счета |
|
Таблица 24
Результаты определения средней летальной концентрации для Candida albicans ATCC #10231 |
|||||
| Разведение | Реплика | Разведение | |||
| 100 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||
| 1:2 | 1 | ПВС | ПВС | ПВС | 168 |
| 2 | ПВС | ПВС | ПВС | 117 | |
| 3 | ПВС | ПВС | ПВС | 138 | |
| Объем посева=0,5 мл ПВС=превышает возможности счета |
|
Таблица 25
Нейтрализация |
|||||||||
| Организм | Положительный счет | Счет при нейтрализации | Процент восстановления | ||||||
| 1 | 2 | 3 | СР | 1 | 2 | 3 | СР | ||
| E. coli 0157H7 | 60 | 63 | 58 | 60 | 53 | 50 | 73 | 59 | 97% |
| S. aureus | 48 | 65 | 38 | 50 | 49 | 44 | 42 | 45 | 89% |
| B. subtilis | 53 | 61 | 53 | 56 | 25 | 20 | 22 | 22 | 40% |
| S. choleraesuis | 38 | 43 | 36 | 39 | 34 | 34 | 31 | 33 | 85% |
| L. monocytogenes | 43 | 38 | 22 | 34 | 26 | 31 | 34 | 30 | 88% |
| C. albicans | 36 | 25 | 21 | 27 | 20 | 12 | 27 | 20 | 72% |
| S. mutans | 11 | 19 | 13 | 14 | 9 | 16 | 14 | 13 | 91% |
Пример 4
Были выполнены эксперименты для установления одного или нескольких специфических соединений или фракций, присутствующих в отдельном продукте(тах) Morinda citrifolia, который отвечает(ют) за проявление противогрибковой активности в организме, будучи введенным в него.
Плодовый сок Morinda citrifolia фракционировали с получением н-гексановых фракций Morinda citrifolia, CL2CL2 фракций Morinda citrifolia, ETOAc фракций Morinda citrifolia и BuOH фракций Morinda citrifolia, каждую в определенной концентрации. Каждую из них изучали для определения их противомикробной активности с использованием организмов Aspergillus niger (ATCC 6275); Candida albicans (ATCC 10231); Staphlococcus aureus (ATCC 29213) и Escherichia coli(ATCC 9533). Другие продукты Morinda citrifolia также можно фракционировать аналогичным образом, как описано выше.
При получении каждый экстракт тестировали, делая серию концентраций в микротитровальном планшете. В первую лунку из каждой серии вносили 200 мкл, во вторую - 100 мкл, в третью - 50 мкл, в четвертую - 25 мкл, в пятую - 12,5 мкл и в шестую - 6,3 мкл. Планшеты инкубировали при 35-37°C в течение 72 часов. К этому времени все экстракты высыхали.
Для приготовления организмов культуры ATCC высевали на соответствующие среды и инкубировали. После инкубации готовили 0,5 McFarland суспензию организма в физиологическом растворе. 100 мкл данной суспензии добавляли к 9,9 мл соответствующей среды. 200 мкл суспензии организмов добавляли в каждую лунку из серии и использовали для суспендирования тестируемого материала. В пустую лунку вносили суспензию для получения ростового контроля и в одну лунку вносили среду для получения отрицательного контроля. Планшеты инкубировали при соответствующих температурах в течение определенных интервалов времени. (Для бактериальных культур это соответствовало 35±2°C в течение 24-48 часов. Для грибков это соответствовало 20-25°C в течение 5-7 дней).
Лунку ростового контроля проверяли на наличие помутнения и отрицательный контроль проверяли на отсутствие помутнения. Результат признавали действительным, только если в лунке ростового контроля наблюдали рост, и в лунке без добавления культуры рост отсутствовал. Затем каждую из прочих лунок проверяли на наличие помутнения. Результаты записывали. Планшеты помещали в планшет-ридер Multiskan. Регистрировали поглощение при 550 нм.
Минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) являлась последняя пробирка в серии, в которой не было мути. Результаты данного теста представлены в следующих таблицах 26-29, где активность выражена в мг/мл.
|
Таблица 26
Активность концентрата плодового сока Morinda citrifolia |
|
| E. Coli | 25 мг |
| S. aureus | 25 мг |
| A. niger | >50 мг |
| C. albicans | 50 мг |
|
Таблица 27
Активность гексановой фракции Morinda citrifolia |
|
| E. Coli | 25 мг |
| S. aureus | 25 мг |
| A. niger | 25 мг |
| C. albicans | 12,5 мг |
|
Таблица 28
Активность ETOAc фракции Morinda citrifolia |
|
| E. Coli | 6,3 мг |
| S. aureus | 3,1 мг |
| A. niger | 25 мг |
| C. albicans | 12,5 мг |
|
Таблица 29
Активность n-BuOH фракции Morinda citrifolia |
|
| E. Coli | >12,5 мг |
| S. aureus | 25 мг |
| A. niger | >50 мг |
| C. albicans | >50 мг |
Фракции и экстракты Morinda citrifolia обладали ингибирующей и профилактической активностью в отношении тестируемых микроорганизмов.
В данном исследовании возникли две проблемы. Первая проблема заключается в том, что было сложно перевести в раствор некоторые ETOAc фракции или экстракты в высокой концентрации. В результате при снятии показаний наблюдали осаждение. Данное осаждение не мешало зрительной оценке, но мешало измерению поглощения. Вторая проблема заключается в том, что н-гексановые фракции или экстракты, очевидно, разъедали пластик в микротитровальном планшете. Это также вызывало проблемы при измерении поглощения, но не при зрительной оценке. Кроме того, из-за недостатка поставляемых соединений для четвертого планшета не хватило n-BuOH для приготовления всех концентраций. В результате значение для E. coli указано как >12,5 мг/мл.
Пример 5
Проводили эксперименты для подтверждения того, что продукты Morinda citrifolia способны ингибировать рост грибков, и для подтверждения того, что продукты Morinda citrifolia можно применять для опрыскивания после сбора урожая. В одной серии качественных экспериментов переработанным продуктом Morinda citrifolia опрыскивали растения земляники. Опрысканные Morinda citrifolia ягоды земляники дольше сохраняли свежесть, чем контрольная группа. Кроме того, урожай при опрыскивании Morinda citrifolia был выше, чем в контроле. Опрысканные Morinda citrifolia ягоды земляники были слаще (выше брикс), чем контрольные. Растения обладают системой, подобной иммунной, которую называют внутриклеточный патогенез (IP). IP обеспечивает основу для того, чтобы здоровые растения сопротивлялись патогенам. Была рассмотрена возможность того, что химические вещества, присутствующие в переработанной Morinda citrifolia, активируют путь IP.
Пример 6
В другом эксперименте собранную землянику опрыскивали продуктами Morinda citrifolia. Обрабатывали четыре группы ягод земляники. Группы с первой по третью опрыскивали переработанной Morinda citrifolia в серийных разведениях (группа 1=неразбавленная, группа 2=разведение 1:200 и группа 3=разведение 1:1000). Группу 4 опрыскивали бенлейтом при разведении 1:500. Бенлейт представляет собой искусственный пестицид, сертифицированный Департаментом сельского хозяйства в Японии. Ягоды осматривали в течение четырех дней. Качественный анализ показал, что плесневую инфекцию удалось предотвратить у земляники, опрысканной переработанной Morinda citrifolia.
Пример 7
В другом эксперименте фермер, выращивающий землянику, у которого земляника была поражена мучнистой росой, вызываемой Sphaerotheca spp., опрыскивал землянику переработанной Morinda citrifolia (разведенной 1:400 водой). Грибковая инфекция снижалась. Земляника стала более мясистой и сладкой, чем обычно. Была рассмотрена возможность того, что переработанная Morinda citrifolia убивает бактерии и грибки непосредственно и/или укрепляет иммунную систему растений. Далее, была рассмотрена возможность того, что укрепленная иммунная система растений подвергается воздействию нанесением переработанной Morinda citrifolia так, что данное нанесение снабжает питательными веществами и приводит в равновесие нормальную микрофлору почвы.
Пример 8
В следующем эксперименте в теплице были установлены четыре сеялки. По десять саженцев земляники (Fragaria ananassa: разновидность Tochiotome) сажали в каждую сеялку. Верхнюю левую сеялку опрыскивали переработанной Morinda citrifolia (группа 1). Верхняя правая сеялка соответствовала контрольной группе (группа 2). Нижняя левая сеялка соответствовала контрольной группе (группа 3). Нижнюю правую сеялку опрыскивали переработанной Morinda citrifolia (группа 4). В течение шести месяцев растения только поливали, не опрыскивали ни переработанной Morinda citrifolia, ни грибком. Каждую сеялку поливали 500 мл воды каждые 4 дня. Цветки удаляли, как только они показывались.
Через месяц после шестимесячного периода полива растения опрыскивали грибком в дополнение к предписанному выше режиму полива. Листья земляники были инфицированы грибком, Sphaerotheca humuli burrill. Грибок измельчали и разводили в 450 мл дистиллированной воды и 100 мл воды опрыскивали все группы. Опрыскивание грибком проводили каждые четыре дня.
Начиная с девятого месяца эксперимента, 1 мл переработанного сока Morinda citrifolia разводили в 199 мл дистиллированной воды и раствором опрыскивали группы 1 и 4. 200 мл дистиллированной воды без переработанной Morinda citrifolia опрыскивали каждую из контрольных групп (группы 2 и 3). Опрыскивание спреем переработанной Morinda citrifolia проводили каждые четыре дня. Эксперимент еще не завершен, но ожидают результатов, аналогичных тем, которые описаны выше.
Пример 9
В эксперименте, проведенном в земляничной теплице, использовали сок Morinda citrifolia. Задействовали шесть рядов длиной 30 м с 80 растениями земляники Tochiotome, посаженными в каждом ряду. Каждый ряд делили на две равные секции, на одной стороне распыляли разведенный сок Morinda citrifolia, тогда как такое же количество воды распыляли на другую секцию, которую использовали как контроль.
Сок Morinda citrifolia разводили водой и каждый раз распыляли три литра раствора на кв.м посадок земляники. Распыление начинали за 12 дней до образования ягод земляники, раз в два дня, всего пять распылений. В первые три распыления сок Morinda citrifolia разводили в 200 раз по массе водой и для двух последних распылений разводили в 300 раз по массе. После сбора ягод изучали урожайность, содержание сахара и сохранение свежести в контрольной группе и в группе, где проводили распыление сока Morinda citrifolia.
Только ягоды земляники, превышающие в длину 3,0 см от чашечки до кончика ягоды, учитывали для определения, используя шкалу, массы урожая. Урожай составил 600 грамм (38 ягод) в контрольной группе, тогда как в группе, где распыляли сок Morinda citrifolia, он составил 1400 грамм (96 ягод). Из этого сравнения можно сделать вывод, что покрытие и распыление сока Morinda citrifolia ускоряет рост ягод земляники и критерий 3 см длины для сбора урожая достигается быстрее. Более того, во время эксперимента на некоторых растениях наблюдали мучнистую болезнь, но распыление Morinda citrifolia предотвратило распространение болезни.
Содержание сахара определяли цифровым сахарометром (точность измерения ±0,2 брикс) производства Kyoto Denshi Kogyo KK. После удаления чашечки 10 ягод земляники помещали в блендер и тщательно перемешивали. Полученный земляничный сок наливали в сахарометр и в общей сложности проводили пять измерений, из которых определяли среднее значение. Среднее значение содержания сахара для группы, где распыляли Morinda citrifolia, составило 8,0 брикс, тогда как для контрольной группы оно составило 7,1 брикс. Из данного эксперимента было установлено, что содержание сахара в землянике возрастает на 13% при распылении сока Morinda citrifolia.
Далее, для того чтобы проверить сохранение свежести собранного урожая, собранную землянику держали в холодильнике и осматривали в течение десяти дней. Через 10 дней после сбора некоторые ягоды из контрольной группы оказались испорченными белой плесенью, тогда как плесень отсутствовала и поверхность была плотной у земляники из группы Morinda citrifolia. Исходя из этого, был сделан вывод, что распыление сока Morinda citrifolia на растение продлевает период свежести земляники и предотвращает рост плесени.
Настоящее изобретение может быть осуществлено в других особых вариантах, не отходя от существа и основных характеристик. Описанные варианты осуществления следует считать во всех отношениях только иллюстративными, а неограничивающими. Поэтому объем настоящего изобретения указан скорее в прилагаемой формуле изобретения, чем в вышеприведенном описании. Все изменения, которые относятся к существу или степени эквивалентности пунктов формулы изобретения, должны быть охвачены их объемом.
Пример 10
Продукты Morinda citrifolia, переработанные по данному изобретению, применяли для ухода за газоном. В разных случаях переработанные продукты Morinda citrifolia применяли для обработки газонов. Применение переработанной Morinda citrifolia уменьшало грибковую инфекцию на газонах. Фенотипически грибковая инфекция вызывала изменение цвета газона на коричневый. Далее, применение Morinda citrifolia предотвращало рецидив грибковой инфекции на газонах, обработанных ею.
1. Препарат для ингибирования грибкового и микробного роста на растениях, содержащий: экстракт или смесь экстрактов, выбранных из перечня, состоящего из плода, ствола, семян, околоплодника, листьев и корня Morinda citrifolia, разведенные в 1-10000 раз (по массе) водой.
2. Препарат по п.2, где препарат дополнительно содержит по меньшей мере один компонент-удобрение.
3. Препарат по п.1, где указанный компонент-удобрение выбирают из перечня, включающего сульфат аммония, мочевину, калий, азот и хлорид аммония, куриный помет, коровий навоз, гуано, вермикомпост, помет насекомых, древесные опилки, рисовые отруби, чесночное масло, рыбий жир, вермикулит, монтмориллонит, активированный уголь, древесный уголь, диатомит, тальк, люцерновую муку и гранулы, азот, фосфор, калий, высушенные измельченные остатки сахарной свеклы, кукурузный глютен, муку из жмыха семян хлопчатника, экстракты или растертые в порошок части келпа или водорослей, соевый шрот, отходы от переработки туш животных, кровяную муку, костную муку, компост или рыбные отходы.
4. Препарат по п.1, где указанный переработанный препарат дополнительно содержит кверцетин.
5. Препарат по п.4, дополнительно содержащий рутин в качестве добавочного активного ингредиента, который действует синергично с указанным кверцетином для ингибирования указанного грибкового и микробного роста.
6. Препарат по п.5, где указанный рутин присутствует в количестве примерно от 0,1 до 10 мас.%.
7. Препарат для ингибирования грибкового и микробного роста на растениях, где указанный препарат содержит от 0,1 до 10 мас.% н-гексановой фракции Morinda citrifolia и материал-носитель.
8. Препарат по п.7, где указанная фракция Morinda citrifolia включает фракцию Morinda citrifolia, выбранную из перечня, состоящего из CL2CL2 фракции; ЕТОАс фракции и n-BuOH фракции.
9. Препарат по п.7, где указанный препарат состоит из экстракта или смеси экстрактов, выбранных из перечня, состоящего из плода, ствола, семян, околоплодника, листьев и корня Morinda citrifolia.
10. Препарат по п.7, где препарат разводят в 1-10000 раз по массе до или во время применения.
11. Препарат по п.7, где указанный препарат выполняют в виде жидкого, гранулированного, порошкообразного или пастообразного средства с помощью соответствующих материалов-носителей.
12. Препарат по п.7, где препарат растворяют или диспергируют в воде.
13. Препарат по п.7, где препарат дополнительно содержит по меньшей мере один компонент-удобрение, выбранное из перечня, включающего сульфат аммония, мочевину, калий, азот и хлорид аммония, куриный помет, коровий навоз, гуано, вермикомпост, помет насекомых, древесные опилки, рисовые отруби, чесночное масло, рыбий жир, вермикулит, монтмориллонит, активированный уголь, древесный уголь, диатомит, тальк, люцерновую муку и гранулы, азот, фосфор, калий, высушенные измельченные остатки сахарной свеклы, кукурузный глютен, муку из жмыха семян хлопчатника, экстракты или растертые в порошок части келпа или водорослей, соевый шрот, отходы от переработки туш животных, кровяную муку, костную муку, компост или рыбные отходы.
14. Препарат по п.7, где указанный переработанный препарат дополнительно содержит кверцетин.
15. Препарат по п.14, дополнительно содержащий рутин в качестве дополнительного активного ингредиента, который действует синергично с указанным кверцетином для ингибирования указанного грибкового и микробного роста.
16. Препарат по п.15, где указанный рутин присутствует в количестве примерно от 0,1 до 10 мас.%.
17. Способ ингибирования грибковой и микробной активности на растениях, где указанный способ включает
обработку указанного растения препаратом, где указанный препарат содержит:
переработанный продукт Morinda citrifolia, присутствующий в количестве примерно от 0,01 до 99,99 мас.%, где указанный продукт состоит из экстракта или смеси экстрактов, выбранных из перечня, состоящего из плода, ствола, семян, околоплодника, листьев и корня Morinda citrifolia.
18. Способ по п.17, дополнительно включающий ингредиент, выбранный из перечня, состоящего из кверцетина, рутина, н-гексанового экстракта, CL2CL2 экстракта, ЕТОАс экстракта и n-BuOH экстракта.
19. Способ по п.17, дополнительно включающий обработку растения препаратом по меньшей мере одним из следующих способов: путем опрыскивания или полива почвы перед посадкой; путем опрыскивания или полива почвы во время роста растения; путем нанесения на растение во время обрезания, разделения или пересаживания; путем нанесения на семена или луковицы при посадке; путем нанесения на поникшие цветы и кустарники; путем распыления на водные растения; путем нанесения на растения, инфицированные бактериями или вирусом; путем нанесения на срезанные цветы после сбора или путем нанесения на урожай и цветы после сбора.
20. Способ по п.17, где указанный препарат выполняют в виде жидкого, гранулированного, порошкообразного или пастообразного средства с помощью соответствующих материалов-носителей.
21. Способ по п.17, где продукт Morinda citrifolia разводят в 1-10000 раз по массе водой.
22. Способ по п.17, где препарат дополнительно содержит по меньшей мере один компонент-удобрение, выбранный из перечня, включающего сульфат аммония, мочевину, калий, азот и хлорид аммония, куриный помет, коровий навоз, гуано, вермикомпост, помет насекомых, древесные опилки, рисовые отруби, чесночное масло, рыбий жир, вермикулит, монтмориллонит, активированный уголь, древесный уголь, диатомит, тальк, люцерновую муку и гранулы, азот, фосфор, калий, высушенные измельченные остатки сахарной свеклы, кукурузный глютен, муку из жмыха семян хлопчатника, экстракты или растертые в порошок части келпа или водорослей, соевый шрот, отходы от переработки туш животных, кровяную муку, костную муку, компост или рыбные отходы.
