Способ одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека

Предположенное изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, используемого для выявления гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов. Способ включает экстракцию коньюгатов стероидов, выделение сухого остатка и их последующее расщепление с одновременной защитой функциональных групп. Экстракцию коньюгатов стероидов проводят по типу «жидкость-жидкость» в среде этилацетата. Расщепление коньюгатов стероидов проводят комбинированным кислотным гидролизом при температуре 80°С путем взаимодействия бензола, коньюгатов стероидов и соляной кислоты, разбавленной до соотношения 1:2, в присутствии металлического шарика. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, используемого для выявления целого ряда гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов, причем многие из них могут быть диагностированы только по стероидному профилю (СП). Кроме того, СП дает информацию о ряде стероидов одновременно, что особенно важно для диагностических целей.

Исследования гормонов в крови иммунными методами можно использовать только для приблизительных оценок, так как результаты зависят от сиюминутного состояния организма человека и, как следствие, колеблются от 200 до 500%. Исследования мочи представляют собой более точный, а, главное, неинвазивный метод диагностики, предотвращающий опасность заражения пациента СПИДом, гепатитом В и т.д.

Суточная моча, как объект исследования, имеет существенные преимущества перед иммунными методами определения гормонов в крови, распространенными в настоящее время в клинической медицине, так как позволяет исключить влияние на результаты циркадных ритмов и мгновенных колебаний гормонов в крови, которые часто бывают значительными.

Известен способ определения СП в суточной моче, который описан в статье Leunissen W.J.J., Thijssen J.H.H., J. Chromat, Biomed Appl., 1978, v.146, p.365.

Недостатком этого способа является ферментативный гидролиз, с использованием дорогостоящих ферментов, активность которых меняется со временем; присутствие дополнительной стадии очистки образца перед вводом в испаритель хроматографа с использованием колонки Lipidex-5000, с последующим элюированием дериватов смесью дериватов, что значительно усложняет процесс и делает его крайне громоздким. Для реализации способа применяют смеси легкокипящих растворителей, что повышает опасность возгорания.

Наиболее близкий способ определения стероидного профиля мочи (СПМ) (прототип) изложен в обзоре «Profiling steroid hormones and urinary steroids» журнала "Journal of chromatography biomedical applications", vol.379, June 20, 1986 г. крупным исследователем в данной области C.H.L. Shakelton, стр.91-156.

В этом способе для извлечения конъюгатов стероидов используют различные вариации твердофазной экстракции, например с использованием С24-картриджей, стоимость которых относительно велика, вследствие чего для исследования в России они неприемлемы, кроме того, для работы с ними необходим высокотоксичный метанол (на работу с которым требуется специальное разрешение).

С другой стороны, в прототипе для гидролиза конъюгатов стероидов используют очень дорогостоящий фермент, полученный извлечением из виноградной улитки, активность которого меняется со временем, что сказывается на качестве гидролиза и требует дополнительного тестирования указанного фермента. Кроме того, при помощи этого фермента не удается достигнуть количественного гидролиза, для чего вводится еще одна дополнительная стадия - сольволиз, что увеличивает трудоемкость процедуры и занимает много дополнительного времени.

Недостатком способа также является двухступенчатая защита функциональных групп: силирование и получение метокси - производных, что еще более усложняет и без того сложный и многоступенчатый процесс.

Задачей предлагаемого изобретения является определение СП по суточной моче человека более простым и дешевым способом.

Решение поставленной задачи заключается в том, что в способе одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, включающем экстракцию конъюгатов стероидов, выделение сухого остатка конъюгатов стероидов и их последующее расщепление с одновременной защитой функциональных групп, используют экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» в среде этилацетата, расщепление конъюгатов стероидов проводят комбинированным кислотным гидролизом при температуре 80°С путем взаимодействия бензола, конъюгатов стероидов и соляной кислоты, разбавленной до соотношения 1:2, в присутствии металлического шарика, причем используют металлический шарик из стали ШХ15 диаметром 3,175 мм.

Защиту функциональных ОН-групп проводят в одну стадию путем силилирования.

По сравнению с другими полярными растворителями, этилацетат имеет следующие преимущества: является хорошим растворителем как для сульфатов, так и для глюкуронидов стероидов; имеет относительно невысокую температуру кипения при нормальных условиях (77,1°С); обладает незначительной токсичностью, а также низкую стоимость.

Задача комбинированного кислотного гидролиза (ККГ) коньюгатов состоит в том, чтобы как можно быстрее осуществить переход образующихся в процессе гидролиза в водной среде свободных стероидов в органическую гидрофобную фазу и тем самым защитить стероиды от деструктивного влияния сильной ионизирующей протонной среды.

Сравнительный анализ соответствующих характеристик ряда растворителей, апробированных в работе, позволяет остановиться на таком недорогом и доступном растворителе, как бензол, обладающий температурой кипения 80°, высокой способностью растворять необходимые стероиды, менее токсичным по сравнению, например, с галогенпроизводными углеводородами, а главное, из-за отсутствия ионов бензола вообще не разрушает стероиды. Именно поэтому сразу же после гидролиза гидрофильной молекулы конъюгата образовавшаяся гидрофобная молекула стероида быстро переходит в объем растворителя и, тем самым, надежно защищается в дальнейшем от деструктивного влияния кислой среды.

Главными критериями, по которым осуществляют выбор кислоты для проведения ККГ, являются следующие: во-первых, способность не растворяться в органическом растворителе, во-вторых - образовывать плохо разделяемые взвеси и эмульсии с растворителем, в-третьих, химическая инертность реагента по отношению к растворителю, а также доступность в России и низкая стоимость реактива. С учетом всего нами была выбрана соляная кислота. Сравнительная экспериментальная проверка ряда реагентов показала, что в случае использования соляной кислоты после выдувания органического растворителя током азота в осадке не обнаруживалось даже следов хлористого водорода. Изучение кинетики и механизма реакции гидролиза с использованием соляной кислоты проводят на примере расщепления PdGl.

После процедуры экстракции и удаления растворителя стероиды находятся на дне конусообразной колбы в виде сульфатов и глюкуронидов, что удобно при проведении последующих стадий анализа.

Как правило, в процессе проводимого гидролиза образуется система, состоящая из двух фаз: нижняя - это разбавленная соляная кислота, верхняя - бензол, причем при температуре проведения реакции 80°С нижняя фаза является неподвижной, тогда как верхняя - интенсивно кипит. Существование неподвижной нижней фазы является отрицательным фактором, поскольку гидролизующиеся стероиды длительное время находятся в агрессивной среде и поэтому подвержены относительно большему разрушению.

Для устранения данного недостатка комбинированный кислотный гидролиз проводят в присутствии металлического шарика, изготовленный из стали ШХ15

(03,175 мм). Металл взаимодействует с разбавленной соляной кислотой (при температуре 80°С), в результате чего в системе образуются мельчайшие пузыри водорода, являющиеся в то же время центрами кипения.

В этом случае вся смесь интенсивно кипит, хорошо перемешиваясь, что в свою очередь приводит к увеличению числа переноса стероидов в процессе гидролиза. Таким образом, образующиеся свободные стероиды гораздо быстрее переносятся в углеводородную фазу, где они надежно защищены от разрушительно влияния соляной кислоты.

В серии контрольных опытов показано, что присутствие металла не сказывается на качестве проводимого гидролиза.

Пример

Определяют клинически важные стероиды в биологической жидкости человека (беременной женщины).

С этой целью 4 мл, взятые из суточной мочи беременной женщины, помещают в конусообразную колбу, приливают этилацетат в количестве 10 мл и проводят экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» при постоянном встряхивании в течении 5-10 мин, после чего этилацетат упаривают и на дне конусообразной колбы остаются конъюгаты стероидов в виде сухого налета (фиг.1).

Затем для расщепления конъюгатов стероидов проводят комбинированный с экстракцией кислотный гидролиз, для чего добавляют 10 мл бензола и 2 мл хлористоводородной кислоты, разбавленной в соотношении 1:2.

Кроме того, на дно помещают металлический шарик (сталь марки ШХ15, диаметр 3,175 мм) для обеспечения равномерного кипения.

Колбу, снабженную обратным холодильником, помещают в водяную баню с температурой 80-83°С. Гидролиз длится 20 мин, начиная с момента начала кипения. Затем смесь быстро охлаждают, переливают в делительную воронку и отбрасывают нижний слой.

Оставшийся экстракт последовательно промывают 2 мл 0,5 N раствора щелочи, 4 мл дистиллированной воды и центрифугируют. Остаток после центрифугирования (супернатант) переносят в коническую колбу и выпаривают досуха.

После проведения кислотного гидролиза, полученные в результате подобной процедуры свободные стероиды нельзя сразу вводить в хроматограф, так как экстракт содержит массу примесей. В предлагаемом изобретении в качестве основного метода очистки выбран способ промывки гидролизата раствором щелочи с целью удаления кислотных и других остатков. После щелочной обработки экстракт промывают дистиллированной водой, при этом удаляется остаток щелочи. С целью достижения наименьших потерь стероидов стадию очистки гидролизата также оптимизируют.

Для проведения анализа клинически важных стероидов проводят газохроматографический анализ.

Полученные количественные характеристики клинически важных стероидов и профиль концентрации клинически важных стероидов в суточной моче представлены в таблице и на фиг.2 соответственно.

При газохроматографическом анализе используют два вида колонок - традиционные насадочные и высокоэффективные капиллярные. Поскольку преимуществами капиллярных колонок являются высокая селективность и долговечность, именно их рекомендуется применять при анализе СП. Оптимальными условиями хроматографирования являются следующие: температура термостата 150°-300°С, испарителя 250°-300°С, детектора 250°-300°С.

Таблица.
Количественное определение стероидов в суточной моче беременной женщины
Нормы (мкМоль/24 часа)	Названия и аббревиатура стероидов	Результаты опред.
Абс. знач.	%
3.8-15.1	Андростерон (An)	15,4	43,7
3.0-14.8	Этиохоланолон (Et)	12,2	34,8
0-2.8	Дегидроэпиандростерон (DHEA)	2,4	7,0
0.3-2.7	11-Кетоандростерон (11-Keto-An)	1,0	2,7
0.4 -2.5	11-Кетоэтиохоланолон (11-Keto-Et)	1,3	3,6
2.0-7.5	11в-Гидроксиандростерон (11-OH-An)	2,2	6,4
0.5-3.1	11в-Гидроксиэтиохоланолон (11-OH-Et)	0,6	1,8
9.9-35.5	Сумма 17-КС	35,2	100,0
<3.0	Дискриминанта ван де Калсейде	2,8
32.2 - 220	Прегнандиол (Pd)	101,1
2.2-8.0	алло-Прегнандиол (allo-Pd)	17,4
1.3-21.7	Прегнанолон	32,1
дельта5-Прегнандиол (дельта5-Pd)	0,9
	Прегнантриол (Pt)	0,5
	16альфа-Гидрокси-Et	0,0
4.3-39.5	16альфа-Гидрокси-An	0,0
	16альфа-Гидрокси-DHEA	0,0
Только для беременных	Эстрадиол	37,0
Только для беременных	Эстрон	13,6
5.6-9.8	Холестерин (Ch)	8,5
0,5-1,8	Суточное количество мочи (литры)	2,05

1. Способ одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, включающий экстракцию коньюгатов стероидов, выделение сухого остатка конъюгатов стероидов и их последующее расщепление с одновременной защитой функциональных групп, отличающийся тем, что используют экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» в среде этилацетата, а расщепление конъюгатов стероидов проводят комбинированным кислотным гидролизом при температуре 80°С путем взаимодействия бензола, конъюгатов стероидов и соляной кислоты, разбавленной до соотношения 1:2, в присутствии металлического шарика.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что защиту функциональных OH-групп проводят в одну стадию путем силирования.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют металлический шарик из стали ШХ15 диаметром 3,175 мм.