Способ оценки содержания в плаценте белка р53 при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции
Владельцы патента RU 2390781:
Учреждение Российской академии медицинских наук Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам, и касается способа оценки повреждающего действия белка р53 на плаценту при обострении герпес-вирусной инфекции. Способ заключается в определении белка р53 и титра антител к вирусу герпеса методом ИФА в гомогенате плаценты. При титре антител к вирусу герпеса 1:12800 и содержании белка р53 4,52±0,16 Е/мл судят об увеличении риска повреждения морфофункционального состояния синцитиотрофобласта. Способ обладает высокой чувствительностью и позволяет прогнозировать повреждение синцитиотрофобласта плаценты при обострении у беременной герпес-вирусной инфекции.
Цель изобретения заключается в прогнозировании устойчивости плаценты во время беременности от увеличивающегося накопления белка р53 при обострении в третьем триместре герпес-вирусной инфекции.
Программа смерти клеток запускается «суицидными» генами и реализуется через внутриклеточные белки р53 (Баранцев Ю.И., 1997; Плеханов Л.А., 2006). При введении гена р53 в трансформированные клетки происходит блок деления в фазе клеточного цикла G, и через некоторое время клетка подвергалась апоптозу (Greenbatt M.S., 1996; Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007).
В случае поступления информации о повреждении ДНК ген р53 запускает реакцию, приводящую к остановке роста. Происходит быстрое накопление белка р53 с последующей индукцией регуляторных механизмов, блокирующих клеточный цикл. Ген р53 играет, таким образом, ключевую роль в процессе вступления в клеточный цикл с поврежденной и нерепаративной ДНК. Белки р53 активизируются при повреждении ДНК и являются транскрипционными факторами, регулирующими общую цепь генов, многие из которых участвуют в апоптозном пути (Levrevo M., De Lanrenzi V., Constanzo A., et. al., 2000; Balint E., Vousden K.H., 2001). Отмечено, что в культуральных условиях при проникновении цитомегаловируса в фибробласты человека р53 увеличивается в количестве в 10-20 раз уже через 6 часов (Maganda P., Mendoza О., Hernandez J., 1994; Speir E., Modali R., Huang E., 1994). В отличие от описанных прототипов, где приводятся в основном факты, полученные в экспериментальных условиях (влияние цитомегаловируса на фибробласты человека в условиях культуры, Maganda P., 1994) или при онкологических процессах, наши исследования касаются влияния вируса простого герпеса (G2) в прижизненных условиях и во время беременности, раскрывая изменение синтеза белка р53 в плаценте при обострении у беременной герпес-вирусной инфекции.
Заявленный способ имеет следующие приемы:
а) Исследовались плаценты после родов у 20 беременных, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции и 20 беременных, не болевших в течение всего периода гестации (контроль). Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266;
б) Для оценки содержания р53 в плаценте приготовляли гомогенат плаценты, взятой через 10-15 мин после родов. Плацента отмывалась физраствором (ФР). Кусочки плаценты помещались для просушивания на фильтровальную бумагу, взвешивались. Затем их растирали в ступке и к полученному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл ФР). Затем его размораживали и центрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения ИФА.
В размороженном супернатанте определяли на ридере «Stat-Fax-2100» (USA) с помощью набора «Bender Med Systems» (Austria) содержание белка р53. Титр антител к вирусу герпеса (1:1600; 1:6400; 1:12800) определяли на ридере «Stat-Fax-2100» (USA).
Полученные данные показали, что содержание белка р53 в гомогенате плаценты у беременных, перенесших герпес-вирусную инфекцию, резко нарастает по мере агрессивности инфекции. Содержание р53 в гомогенате плаценты при титре 1:1600 к вирусу герпеса увеличивается до 0,94±0,12 Е/мл; при титре 1:6400 - до 4,04±0,30 Е/мл, а при титре 1:12800 - до 4,52±0,16 Е/мл (контроль - 0,74±0,03 Е/мл).
Полученные данные позволяют считать, что обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности способствует нарастанию в плаценте синтеза белка р53, что становится угрозой морфофункциональной целостности синцитиотрофобласта плаценты.
Статистический анализ дискриминантной функции при титре антител к вирусу герпеса 1:12800 (+95,85) больше граничного значения (+64,16) позволяет прогнозировать, что при дискриминантной функции меньше 95,85 нарастает угроза повреждения морфофункционального состояния синцитиотрофобласта плаценты.
Литература
1. Барнашев Ю.И. Индикаторы париетальных повреждений головного мозга плода и новорожденного // Акушерство и гинекология. 1997. №2.28-33.
2. Князькин И.В., Цыган В.Н. Апоптоз в онкоурологии. Санкт-Петербург. Наука. 2007. 239.
3. Плеханов Л.А. Апоптоз в прогнозировании исходов перинатальной патологии центральной нервной системы и позвоночника у новорожденных // Известия Челябинского научного центра. 2006. 3(33).135-139.
4. Balint E., Vousden K.H. Activation and activities of the p53 tumor supressor protein // British. Journal of Cancer. 2001. 85. 1813-1823.
5. Erster S., Mihara M., Kim R., et. al. In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede p53 target gene activation // Mol. Cell Biol. 2004. 24.6728-6741.
6. Greenbatt M.S., et. al. Deletions and insertions in the p53 tumor suppressor gene in human cancers // Cancer. Res. 1996. 56.2130-2136.
7. Hickman E.S., Moroni M.C., Helin K. The role of p53 and pRB in apoptosis and cancer // Current Opinion in Genetics. Development. 2002. 12. 60-66.
8. Levrevo M., De Lanrcnzi V., Constanzo A., et. al. The p53 / p63 / p73 famaly of transcription factors: overlapping and distinct function // J. Cell Science. 2000. 113. 1661-1670.
9. Maganda P., Mendoza О., Hemandez J., et. al. Human cytomegalovirus elevates of the cellular protein p53 in infected fibroblasts // J. Virol. 1994. 68.8028-8034.
10. Speir E., Modali R., Huang E., et. al. Potential role of human cytomegalovirus and p53 interaction in coronary restenosis // Science. 1994. 265. 391-394.
Способ оценки повреждающего действия белка р53 на плаценту при обострении герпес-вирусной инфекции у родильниц, перенесших в третьем триместре беременности вспышку герпес-вирусной инфекции, включающий приготовление гомогената плаценты, определение методом ИФА содержания белка р53 и титра антител к вирусу герпеса, и при титре антител 1:12800 и содержании белка р53 4,52±0,03 Е/мл судят об увеличении риска повреждения морфофункционального состояния синцитиотрофобласта.
