Способ прогнозирования риска развития деструктивных изменений слизистой оболочки гастродуоденальной зоны

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и клинической иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития деструктивных изменений слизистой оболочки гастродуоденальной зоны. Способ предусматривает определение абсолютного количества позитивных по CD80-рецепторам нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, и при условии значения этого показателя выше 999 клеток/мл устанавливают наличие риска развития деструктивных изменений слизистой оболочки гастродуоденальной зоны. Данный способ может быть использован для скрининговой оценки выраженности и характера воспаления в слизистой оболочке при Helicobacter pylori-ассоциированных воспалительных заболеваниях гастродуоденальной зоны, позволяя быстро, без больших материальных и технических затрат с высокой вероятностью (75%) выявить среди пациентов с Н. pylori-ассоциированными воспалительными заболеваниями гастродуоденальной зоны группу риска по развитию деструктивного воспаления (эрозии, язвы) в слизистой оболочке. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и клинической иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития деструктивных изменений слизистой оболочки гастродуоденальной зоны.

С морфологической точки зрения, а также по характеру противоинфекционной иммунобиологической защиты организма нозологические формы воспалительных заболеваний гастродуоденальной зоны, таких как гастриты, дуодениты, гастродуодениты, язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки (ДПК), могут быть объединены в зависимости от степени поражения слизистой оболочки, когда определяется либо поверхностное (катаральное), либо деструктивное (эрозивно-язвенное) воспаление [Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. - М., 1998; Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. - М., 2003].

Поиск прогностических маркеров деструктивных изменений в слизистой оболочке при Helicobacter pylori (Hp)-ассоциированных воспалительных заболеваниях гастродуоденальной зоны является актуальной задачей, т.к. установлено, что деструктивный характер воспаления связан с типом патогенного штамма Hp [Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. - М., 2003; Figura N. Helicobacter pylori exotoxins and gastroduodenal diseases associated with cytotoxic strain infection // Aliment. Pharmacol. Ther. - 1996. - Vol.10, No 1. - P.79-96]. Именно при эрозивно-язвенных изменениях слизистой оболочки выявляется высокая частота (79,5%) ульцерогенных штаммов cagA⁺vacA⁺-H. Pylori [Мудров В.П., Нелюбин В.Н. Особенности провоспали-тельной цитокиновой регуляции иммунного ответа на Helicobacter pylori-инфекцию // Иммунология. - 2004. - №6. - С.364-367].

Аналогом предлагаемого способа является использование для оценки выраженности и характера воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка и ДПК эзофагогастродуоденоскопии (ЭФГДС) с биопсией [Назаров В.Е. и др. Эндоскопия пищеварительного тракта. - М: Триада-Фарм, 2002. - 176 с.]. Этот метод позволяет определить также локализацию, размер и выраженность очага воспаления и является единственным при установке нозологической формы воспалительного заболевания гастродуоденальной зоны.

Однако существуют медицинские ограничения в применении данного метода. Проведение ЭФГДС затруднено у пациентов с хроническими заболеваниями дыхательной, сердечно-сосудистой системы у пожилых пациентов и у детей. Кроме того, ЭФГДС - инвазивная процедура, - и значит, существует риск инфицирования (ВИЧ, гепатит, Hp) при ее проведении.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является применение тестовой панели "Гастропанель" для оценки состояния и функциональной активности слизистой оболочки желудка [P. Sipponen et al., Application of blood levels of gastrin-17, pepsinogen I and H.pylory antibody for nonendoscopic diagnosis of atrophic gastritis // DDW, 20-23 May, Atlannta, USA]. С помощью Гастропанели в плазме крови определяются 4 показателя: наличие антител к Hp, уровни пепсиногена I, пепсиногена II и гастрина-17. Исследования основаны на технологии иммуноферментного анализа (ИФА) и проводятся в соответствии с инструкцией, разработанной фирмой-производителем (Biochit, Финляндия). Этот метод исследования является неинвазивным, безопасным и удобным для пациента. В большинстве случаев с помощью Гастропанели получают результаты исследования состояния и функциональной активности слизистой оболочки желудка, аналогичные результатам эндоскопии с биопсийным исследованием. Несомненным достоинством этой тестовой системы является то, что она позволяет провести точную диагностику заболеваний желудка: гастрита, атрофического гастрита, хеликобактерной инфекции, а также дает долговременный прогноз по риску развития язвенной болезни.

Однако основное предназначение Гастропанели - это выявление степени и локализации атрофии слизистой оболочки желудка, установить же наличие уже имеющегося деструктивного воспалительного процесса (язвы, эрозии) в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны с помощью данной панели затруднительно. Кроме того, этот метод требует чрезвычайно дорогостоящих импортных реактивов, что делает практически невозможным его использование в качестве скрининга во многих лечебных учреждениях.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала способов, используемых для скрининговой оценки выраженности воспаления и прогнозирования развития деструктивных изменений в слизистой оболочке при Hp-ассоциированных воспалительных заболеваниях гастродуоденальной зоны.

Сущностью изобретения является определение абсолютного количества позитивных по CD80-рецепторам нейтрофильных гранулоцитов (НГ) периферической крови, и при условии значения этого показателя выше 999 клеток/мл устанавливают наличие риска развития деструктивных изменений слизистой оболочки гастродуоденальной зоны.

Техническим результатом изобретения является разработка скринингового, малоинвазивного, не требующего больших материальных затрат способа выявления пациентов с высокой степенью риска (75%) развития деструктивного воспаления (эрозии, язвы) в слизистой оболочке при Нр-ассоциированных воспалительных заболеваниях гастродуоденальной зоны.

Способ апробирован на 31 пациенте с воспалительными заболеваниями гастродуоденальной зоны обоего пола в возрасте от 21 до 59 лет. В группу с поверхностным воспалением вошли 20 пациентов с катаральным гастритом. В группу с деструктивными воспалительными изменениями слизистой оболочки гастродуоденальной области вошли 11 пациентов с хроническим эрозивным гастритом, язвенной болезнью желудка и/или двенадцатиперстной кишки в стадии обострения заболевания.

Диагноз определяли на основании клинических данных, ЭФГДС и гистологического исследования. ЭФГДС проводили в утренние часы, натощак, со взятием биоптатов из зоны поражения слизистой оболочки. При морфологическом исследовании гистологических препаратов были выявлены высокие показатели лейкоцитарной инфильтрации (полиморфно-ядерными нейтрофилами и лимфоидными клетками). Степень обсемененности слизистой оболочки Hp оценивали полуколичественно по 4-х балльной шкале: отсутствие бактерий обозначали «-», до 20 микроорганизмов в поле зрения - «+», 20-50 - «2+», более 50 - «3+». Наличие Hp в слизистой желудка подтверждалось в 70,9% случаев, и составило в среднем 2,4±0,09 балла.

Кровь для исследования брали при первичном обращении до начала традиционного лечения. В качестве сравнения использовали показатели фенотипических характеристик НГ, полученные в группе здоровых добровольцев (n=17).

Способ осуществляют следующим образом: НГ выделяют из ЭДТА-стабилизированной (2,7%) периферической крови с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-верографина (1,077:1,093) [Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood // J.Clin. Lab. Invest. - 1968. - Vol.21. - Suppl. 97. - P.77-89]. Определение количества НГ, позитивных по костимулирующей молекуле CD80 проводят непрямым иммунофлюоресцентным методом [Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. Комплексное трехуровневое исследование системы нейтрофильных гранулоцитов с возможной диагностикой ИДС при различной патологии // Метод. реком. №96/11. - Краснодар, 1996. - 22 с.] с использованием соответствующих моноклональных антител: анти-СD80 (ООО "Сорбент", Москва). Для каждого образца крови производят подсчет общего количества лейкоцитов и определение морфологического состава крови по общепринятым методикам с целью дальнейшего определения абсолютного количества CD80⁺-НГ.

Известно, что НГ являются одним из ведущих патогенетических факторов при Hp-ассоциированных гастритах, язвенной болезни желудка и ДПК [Allen L.-A. Н. The role of the neutrophil and phagocytosis in infection caused by Helicobacter pylori II Curr. Opin. Infect. Dis. - 2001. - Vol.14. P.273-276; Danielsson D., Farmery S. M., Blomberg B. et al. Co-expression in Helicobacter pylori of cagA and non-opsonic neutrophil activation enhances the association with peptic ulcer disease // J.Clin. Pathol. - 2000. - Vol.53, No 4. - P.318-321; Rautelin H., Blomberg G., Jarnerot G., Danielsson D. Nonopsonic activation of neutrophils and cytotoxin production by Helicobacter pylori: ulcerogenic markers // Scand. J. Gastroenterol. - 1994. - Vol.29. - P.128-133]. В то же время НГ играют ключевую роль в иммунном ответе к хеликобактерной инфекции, действуя и как эффекторные клетки для элиминации бактерий, и как регуляторы адаптивного иммунного ответа [Ismail Н.F., Fick P., Zhang J., et al. Depletion of Neutrophils in IL-10"A Mice Delays Clearance of Gastric Helicobacter Infection and Decreases the Thl Immune Response to Helicobacter // The J. of Immunol. - 2003. - Vol.170. - P.3782-3789].

Определение количества CD80⁺-HГ у здоровых добровольцев позволило нам установить интервал нормы (Табл.1).

Анализ результатов, полученных при оценке аналогичных показателей НГ у пациентов с воспалительными заболеваниями гастродуоденальной зоны, выявил усиление экспрессии молекулы CD80, независимо от отсутствия или наличия деструктивных процессов в слизистой. Однако выраженность воспалительного процесса при эрозивных и язвенных поражениях слизистой оболочки, его деструктивный характер, обуславливает достоверное увеличение абсолютного количества НГ, экспрессирующих CD80-рецепторы в 3,2 по сравнению с контролем, превышая в 75% случаев верхние границы нормальных значений и в 1,8 раз (р<0,05), превышая аналогичные показатели в группе пациентов с поверхностным воспалением. При поверхностном гастрите этот показатель в большинстве случаев находится в пределах нормальных значений и достоверно не отличается от контроля (Табл. 1).

Таблица 1.
Характеристика рецепторной активности нейтрофильных гранулоцитов при воспалительных заболеваниях гастродуодельной области
Показатель	Контроль (n=17) (M±m)	Интервал нормы (5-й и 95-й процентили)	Поверхностное воспаление (n=20)	Деструктивное воспаление (n=11)
CD80-НГабс, кл/мл	413,3±58,5	211,7-998,9	745,4±92,7	1337±299,4 1,2)
Отклонение от нормы (в %)			15	75
Примечание: 1) - р<0,05 по сравнению с группой контроля; 2) - р<0,05 по сравнению с группой ПВ (критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони).

Таким образом, проведенное исследование позволило выявить различия в характере и уровне реагирования поверхностной мембраны НГ на патологический процесс в зависимости от степени выраженности воспалительной реакции, наличия повреждений слизистой оболочки (язвы и эрозии). При значительном увеличении абсолютного количества CD80⁺-НГ с превышением верхней границы нормальных значений (свыше 999 клеток/мл) можно прогнозировать высокую степень риска развития деструктивного воспаления (эрозии, язвы) в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны.

Увеличение количества НГ, экспрессирущих костимулирующую молекулу CD80 при Hp-ассоциированных воспалительных заболеваниях, может быть следствием ответа на инфекцию, направленным на элиминацию антигена, т.к. установлено, что НГ могут транспортировать бактерии в лимфатические узлы через афферентные лимфатические протоки при воспалении и, таким образом, участвовать в презентации антигенов Т-лимфоцитам в местах формирования иммунного ответа [Abadie V., Badell Е., Douillard P. et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes // Blood. - 2005. - Vol.106. - P.1843-1850; Bonneau M., Epardaud M., Payot F. et al. Migratory monocytes and granulocytes are major lymphatic carriers of Salmonella from tissue to draining lymph node // J. of Leukoc. Biol. - 2006. - Vol.79. - P.268-276]. Кроме того, показано что CD80⁺-гранулоциты могут негативно регулировать адаптивный иммунитет, супрессируя активацию Thl-лимфоцитов [Mencacci A., Montagnoli С, Bacci A. et al. CD80+Gr-1+myeloid cells inhibit development of antifungal Th1 immunity in mice with candidacies // J. Immunol. - 2002. - Vol.169. - P.3180-3190], и, таким образом, значительное увеличение количества CD80⁺-НГ при деструктивном воспалении может быть механизмом негативной ауторегуляции через супрессию Th1-иммунного ответа для ограничения иммунопатологических повреждений.

Пример. Больная Г., 31 лет, история болезни №347, находилась на обследовании в Российском центре функциональной хирургической гастроэнтерологии (РЦФХГ) 21.03.07 с жалобами на боли в эпигастрии, преимущественно натощаковые, эпизодическую тошноту. После проведенного обследования выставлен диагноз: Грыжа пищеводного отверстия диафрагмы. Нр-ассоциированный гастрит.

УЗИ от 21.03.07. Ультразвуковые признаки незначительных диффузных изменений поджелудочной железы, колоптоза.

ЭФГДС от 21.03.07. Признаки грыжи пищеводного отверстия диафрагмы, катаральный гастрит, бульбит.

Цитологическое исследование мазка-отпечатка слизистой оболочки желудка от 21.03.07: Hp ++; слизь ++++.

Иммунологическое исследование НГ от 21.03.07: количество CD80⁺-НГ - 682 кл/мл. Определен низкий риск развития деструктивных изменений слизистой оболочки, подтвержденный данными ЭФГДС.

Пример. Больной Ш., 24 лет, история болезни №1681, находился на обследовании в РЦФХГ 12.04.07 с жалобами на боли в эпигастрии натощак и после еды, изжогу. После проведенного обследования выставлен диагноз: Гастро-эзофагеальная рефлюксная болезнь. Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. Рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки в стадии рубца. Эрозивный Hp-ассоциированный гастрит.

УЗИ от 12.04.07. Ультразвуковые признаки диффузных изменений поджелудочной железы, паренхиматозной кисты слева.

ЭФГДС от 12.04.07. Рубцовая деформация луковицы двенадцатиперстной кишки, бульбит. Эрозивный гастрит. Недостаточность кардии. Признаки грыжи пищеводного отверстия диафрагмы.

Цитологическое исследование мазка-отпечатка СОЖ от 12.04.07: Hp ++; слизь +++, клетки покровно-ямочного эпителия без признаков атипии.

Иммунологическое исследование НГ от 21.03.07: количество CD80⁺-НГ - 4199 кл/мл. Определен высокий риск развития деструктивных изменений слизистой оболочки (язвы, эрозии), подтвержденный данными ЭФГДС.

Способ прогнозирования риска развития деструктивных изменений слизистой оболочки гастродуоденальной зоны, включающий определение клинических показателей и иммунологическое исследование факторов крови, отличающийся тем, что определяют абсолютное количество позитивных по CD80-рецепторам нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, и при условии значения этого показателя выше 999 клеток/мл устанавливают наличие риска развития деструктивных изменений.