Тест-система с использованием элементов неэнзиматического распознавания анализируемого вещества

Группа изобретений относится к медицинской диагностике. Тест-элемент имеет поверхности, расположенные на заданном расстоянии друг напротив друга и содержащие две одинаковые структуры, образующие участки с высокой и низкой поверхностной энергией. По меньшей мере один из чувствительных участков первой и второй поверхностей снабжен по меньшей мере одним элементом неэнзиматического распознавания, способным обеспечивать реакцию сродства с анализируемым веществом. Способ изготовления тест-элемента включает формирование участков с высокой и низкой поверхностной энергией на нижнем слое с первой поверхностью. Участки с высокой поверхностной энергией образуют гидрофильную систему распределения пробы, формирование структуры участков с высокой и низкой поверхностной энергией на верхнем слое со второй поверхностью, покрытие заданных чувствительных участков первой поверхности калибровочными составами, покрытие заданных чувствительных участков второй поверхности составом распознавания, содержащим элемент распознавания, и наложение слоев первой и второй поверхностей на противоположные стороны центрального слоя с вырезом. Раскрыта тест-система, включающая тест-элемент по п.п.1-15, и способ качественного и(или) количественного определения по меньшей мере одного анализируемого вещества в пробе физиологической или водной жидкости, использующий нанесение жидкости физиологической пробы на тест-элемент по п.п.1-15. Технический результат заключается в повышении точности анализа. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 21 ил., 2 табл.

 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к тест-системе для количественного и качественного определения анализируемого вещества в жидкой среде, такой как проба водной или физиологической жидкости. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к тест-системе для количественной и качественной оценки реакции между молекулой-хозяином и молекулой-гостем, в частности для исследований сродства и иммуноисследований.

Предпосылки создания изобретения

Диагностика и подтверждение различных заболеваний и состояния здоровья с самого начала являлась основной задачей для специалистов в медицине. В настоящее время в распоряжении врачей имеется множество способов диагностики, которые позволяют точно поставить диагноз и подтвердить различные заболевания и состояния пациентов в жидкостях организма. Определение различных состояний пациента, в частности, особенно важны для врачей, поскольку необходимо соответствовать различным потребностям и требованиям. Определение различных анализируемых веществ в жидкостях организма, таких как кровь, сыворотка и моча, играет значимую роль при борьбе с различными заболеваниями.

Кроме того, врачи и пациенты требуют точных систем результатов тестов и изделий, которые легко использовать, и которые удобны, особенно для мониторинга и ухода на дому. Такое удобство тесно связано с числом выполняемых врачом или пациентом операций для получения окончательных результатов теста и требуемым объемом пробы в случае, когда в тест-системе требуется кровь или сыворотка в качестве жидкости пробы и неинвазивная процедура взятия пробы.

Типичными примерами является регистрация хорионического гонадотропина человека при тестах на беременность или определение сердечного тропонина I, сердечного тропонина Т, СКМВ, миоглобина и натрийуретического пептида головного мозга (BNP), как сердечных маркеров для определения фактического инфаркта.

Дополнительными примерами анализируемых веществ, значение которых возрастает, являются маркеры опухолей, используемые и крайне важные для мониторинга пациентов после терапии для описания хода болезни до того, как какая-либо канцерогенная ткань может быть обнаружена клинически или путем визуализации. Примерами этих маркеров являются СЕА, PSA, CA19-9, СА125. СЕА или карциноэмбриональный антиген, переносимый кровью белок, упомянутый впервые, как вырабатываемый опухолями желудочно-кишечного тракта.

Аналогично другим примером возрастающей важности при лечении и(или) контроле заболевания, синонимичным с осложнениями, относящимися к сахарному диабету, является диабетическая ретинопатия. Такое состояние представляет собой заболевание сетчатки и в соответствии с множеством сообщений возникает приблизительно у трети пациентов, страдающих диабетом.

PSA или специфический антиген простаты, вырабатывается нормальной простатой. Это энзим, называемый серин-протеаза, который обычно действует как антикоагулянт для сохранения семенной жидкости. Обычно только малые количества попадают в систему кровообращения. Увеличенная простата и злокачественная простата выделяют значительные количества в систему кровообращения и мочу, которые можно обнаружить методами диагностики и скрининга.

Во всех перечисленных выше тестах и многих других используются реакции сродства интересующего анализируемого вещества (молекула-гость) и специфический для данного анализируемого вещества элемент распознавания (молекула-хозяин) для количественной оценки наличия или отсутствия соответственно количественной оценки концентрации молекул анализируемого вещества.

Специалисты в этой области классифицируют выполненный анализ как иммунологический анализ. В случае реакции сродства, описанной выше в примерах, осуществляемой между антителом или фрагментом антитела в качестве элемента распознавания, интересующий анализируемое вещество затем обычно называют антигеном. Этот тип исследования сродства наиболее широко известен и используется в области клинической и терапевтической диагностики.

В 2003 году 9,6 миллиона граждан США были признаны заболевшими раком. Исследование Американского общества по борьбе с раком указывает, что раннее распознавание и скрининг могут снизить смертность от рака, например, колоректального рака на 30%, рака шейки матки на 60%. Кроме того, другие типы заболеваний, которые все шире распространяются на западе, включают, среди прочих, ожирение, диабет и артрит. Кроме того, диагностика заболеваний с использованием иммунологических анализов даст врачам возможность раннего применения лекарственных средств и терапии для снижения вероятности выполнения сложной и часто инвазивной терапии. Такая терапия может быть опасной из-за риска бактериальной инфекции, дорогостоящей, и вероятность полного восстановления пациента за определенное время после проявления заболевания в организме пациента снижена.

В частности, в то время как распространение некоторых вирусов во всем мире сократилось, распространение других вирусов возросло, и Всемирная организация здравоохранения сообщает, что к 2005 году оцененное число людей с вирусом иммунодефицита (ВИЧ) во всем мире достигнет 40 миллионов - увеличение на 8% относительно 2000 года. Дополнительные данные предполагают, что у стран третьего мира или развивающихся стран отмечено значительное увеличение числа лиц, у которых диагностировано это заболевание, и для некоторых стран нередко возрастание 15% по отношению к предыдущим датам сравнения.

Следовательно, насущной проблемой для врачей является их неспособность быстро и точно получить результаты тестов для определения того, страдает ли пациент каким-либо заболеванием. Один из протоколов тестирования таких заболеваний, как ВИЧ, туберкулез, рак, является взятие пробы крови у пациента и передача ее в лабораторию для анализа. Действительно, такой протокол может оказаться проблематичным для пациента, поскольку временная задержка между первоначальной консультацией и получением результата теста вызывает взаимный стресс и ненужную задержку лечения и, следовательно, повышенный риск для пациентов. Однако диагностика на месте и клиники, принимающие больных без предварительной записи, становятся наиболее распространенными в некоторых странах, уравновешивая явную неэффективность отделов здравоохранения, но цены в них привлекательны только для наиболее обеспеченных членов общества.

Кроме того, оборудование для тестов в кабинете у врача может оказаться дорогостоящим для некоторых практикующих врачей, и часть из них может предпочесть пересылку проб жидкости в лабораторию для анализа. Дополнительно стоимость обращения за медицинской помощью в ряде стран при посещении врача может быть чрезмерно высокой для некоторых людей, поскольку не все случаи страхования являются бесплатными при диагностике на месте. Кроме того, диагностика и мониторинг заболевания в некоторых случаях могут проводиться два раза, т.е. врачи требуют подтверждения присутствия или отсутствия заболевания в жидкости организма, и, во-вторых, степени развития заболевания путем анализа уровня концентрации анализируемого вещества в жидкости организма.

Таким образом, люди, которые чувствуют, что они подвергаются риску заболевания, выигрывают при тестах диагностики на месте (PoC) или тестах диагностики на дому, поскольку последняя позволяет проводить тест в удобном для них окружении. Кроме того, врачи добиваются эффективной ежедневной работы, если они могут выполнять диагностический тест на рабочем месте, не обращаясь к дорогостоящим услугам лаборатории. Во многих случаях обеспечение таких диагностических комплектов дает пациенту элемент контроля его заболевания.

Существуют различные тест-элементы либо для тестирования на дому таких физиологических состояний, как диабет, беременность и фертильность, но имеется минимальное оборудование для тестов, которое может обеспечить простой диагностический инструмент для получения сведений о состоянии и ходе заболевания с быстрым и точным результатом при диагностике на месте или на дому.

Возможны различные принципы регистрации (детекции), применимые в оборудовании для лабораторных тестов и(или) терапевтических тест-элементов, которые определяют наличие и уровень анализируемого вещества в пробе теста, например иммунологический анализ агглютинации, иммунологический анализ диффузии, анализ модулятора энзима, иммунологические анализы на основе флуоресценции и анализ коэнзима-апоэнзима.

Соответственно многие современные отрасли и, в частности, область мониторинга метаболизма, сталкиваются с проблемой обеспечения тест-элемента со следующими характеристиками и свойствами:

- тест-элемент должен обеспечивать либо точные качественные либо точные количественные результаты теста в водной жидкости или жидкостях организма при возможно малом числе этапов применения для пользователя;

- для тест-элемента должно быть необходимо лишь малое количество пробы, таким образом врач или пациент может использовать минимально инвазивные способы взятия пробы;

- тест-элемент должен предусматривать лишь малое число технологических операций при производстве и, следовательно, недорогое изготовление, и использоваться для изделий, помогающих пациентам при самоконтроле физиологических параметров, и(или) врачом на месте работы.

В предшествующем уровне техники описаны системы и примеры решения или частичного решения вышеперечисленных проблем, в частности упомянутые ниже публикации особенно интересны для описываемого изобретения.

В патенте US 4213893 описан флавин-аденин-динуклеотид (ФАД), меченый конъюгат, используемый в качестве меченого конъюгата при специфических анализах связывания для определения лиганда или специфического члена пары связывания в жидкой среде, такой как сыворотка. ФАД меченые конъюгаты, используемые при анализе связывания для лигандов, мониторируют для анализа путем измерения активности ФАД, т.е. активности коэнзима или простстической группы меченого конъюгата.

В патенте US 4708933 описан анализ однородной твердотельной иммунолипосомы, в котором используется отделение боковой фазы антигенной липосомы, приводящее к нарушению устойчивости и лизису липосомы, которые можно оценить количественно и использовать для определения наличия и(или) концентрации антигенов, антител и подобных реагентов в биологических жидкостях.

В статье RJ Tyhach и др. в журнале Clinical Chemistry 27: 1499-1504; "Adaptation of Prostatic-Group-Label Homogeneous Immunoassay to reagent - strip format", опубликованной в 1981 г., описан способ иммунологического анализа метки простстической группы (PGLIA), осуществленный в формате полоски с реагентом, с использованием флавин N6-(N′-2,4-динитрофенил-6-аминогексил)аденин динуклсотида (DNP-FAD) в качестве производной простетической группы и 6-N-(2,4-динитрофенил)аминокапроновой кислоты (DNP-капроат) в качестве конкурентного лиганда. DNP-FAD, не связанные антителом, объединяется с апоэнзимом глюкозооксидазы, который вступает в реакцию с глюкозой и кислородом, создавая цвет посредством системы, связанной пероксидазой. Скорость возникновения цвета, таким образом, зависит от концентрации DNP-капроата.

В статье Butler и др. в журнале Journal of Clinical Investigation 115:86-93 (2005); "SDF-1 is both necessary and sufficient to promote proliferative retinopathy", опубликованной в 2005 году, описана связь между белком, известным как SDF-1, и ретинопатией.

В ЕР 163393 описан способ иммунологического анализа латекса для определения присутствия интересующего лиганда в невыделяемой жидкости организма и наличия химической добавки, содержащей галогензамещенную карбоновую кислоту или соль этой кислоты в реагирующей смеси для снижения неспецифического влияния на иммунологический анализ латекса. Добавление такой добавки позволяет использовать иммунологические анализы агглютинации для количественного определения уровней эндогенных метаболитов и контролировать специфические интересующие лиганды, такие как лекарственные препараты, терапевтические реагенты и специфические связывающие белки в пробах.

В WO 2002/086472 описано использование флуоресцентных молекулярных роторов, у которых меняется интенсивность флуоресценции на основе вязкости среды. Молекулярные роторы модифицированы углеводородными цепями или гидрофильными группами, чтобы обеспечить измерение мембраны или вязкости жидкости.

В заявке РСТ/ЕР 2004002284 описана тест-система для фотометрического обнаружения и количественного определения анализируемого вещества, например глюкозы, в физиологической жидкости, например крови, которая снабжена встроенной калибровочной системой с использованием метода добавления стандарта. Этот элемент содержит первую и вторую поверхности, образующие систему распределения пробы, чувствительные участки которой покрыты каталитическим и калибровочным составом соответственно, который позволяет выполнить обнаружение/определение анализируемого вещества по энзиматической реакции.

Однако до настоящего времени нет тест-системы, пригодной для диагностики на месте или на дому, которая позволяла бы оценить неэнзиматическую реакцию между интересующим анализируемым веществом и специфическим для этого анализируемого вещества элементом распознавания при выполнении встроенной калибровки и(или) измерения контроля качества для интересующего анализируемого вещества в данной пробе физиологической или водной жидкости.

Сущность изобретения

Соответственно в настоящем изобретении предлагается тест-элемент для определения концентрации по меньшей мере одного анализируемого вещества в пробе физиологической или водной жидкости с первой поверхностью и второй поверхностью на заданном расстояние друг напротив друга, причем обе поверхности снабжены, по существу, одинаковыми структурами, образующими участки с высокой и с низкой поверхностной энергией, которые выровнены (совмещены), по существу, конгруэнтно, так что участки с высокой поверхностной энергией образуют систему распределения пробы по меньшей мере с двумя чувствительными участками, где по меньшей мере один из чувствительных участков первой и второй поверхностей снабжен по меньшей мере одним элементом неэнзиматического распознавания анализируемого вещества.

В предпочтительном варианте осуществления тест-элемент имеет n заданных чувствительных участков (6а) первой поверхности (2а), покрытых n калибровочными составами (18), изготовленными из m контрольных ("холостых") составов и n-m составов, содержащих различные уровни калибровочного соединения (33), при этом n - целое число больше 2, m - целое число равное или больше 1, и n>m, и

n заданных чувствительных участков (6′а) второй поверхности (4а), покрытых составом, содержащим специфический элемент (32) неэнзиматического распознавания анализируемого вещества.

В настоящем изобретении также предлагается тест-система, состоящая из измерительного устройства и тест-элемента, например, в форме полоски, для неэнзимативных реакций сродства между интересующим анализируемым веществом и специфическим элементом неэнзиматического распознавания анализируемого вещества. Для встроенных механизмов калибровки и контроля качества в тест-системе используются методы добавления стандарта, использующие систему распределения пробы тест-элемента, содержащую требуемые стандарты и(или) контроль качества. Система оптимизирована для выполнения иммунологических анализов, анализов рецепторов или других исследований сродства быстрым и простым способом с простым и одноразовым тест-элементом, предпочтительным для диагностики на месте и тестирования на дому.

Изготовление тест-элемента по настоящему изобретению не требует выполнения большого числа технологически сложных операций и обеспечивает производство недорогих элементов.

Для лучшего понимание особенностей и преимуществ настоящего изобретения ниже приводится подробное описание примеров и предпочтительных вариантов осуществления в сочетании с приложенными чертежами:

Краткое описание чертежей

на фиг.1 показан вид в перспективе одного варианта осуществления тест-элемента по настоящему изобретению в форме тест-полоски;

на фиг.2 показан вид в перспективе варианта осуществления по фиг.1, показывающий участок взятия пробы и систему распределения пробы в увеличенном масштабе;

на фиг.3 показан вид в перспективе по частям элемента по фиг.1, показывающий три отдельных слоя конструкции;

на фиг.4 показаны различные формы выреза центрального слоя, образующие полость для пробы совместно с первым и вторым слоем;

на фиг.5 показан вид в поперечном сечении чувствительного участка системы распределения пробы, сконструированного с гидрофобными направляющими элементами;

на фиг.6 показан вид в поперечном сечении другого варианта осуществления чувствительного участка системы распределения пробы с использованием гидрофильных каналов;

на фиг.7 показан схематический принцип реакции агглютинации: А) введение среды пробы жидкости, В) растворение состава распознавания и калибровки, С) заключительное образование агглютината между анализируемым веществом, элементом распознавания и калибровочным соединением;

на фиг.8 показан схематический принцип агглютинирующих микрочастиц: А) введение среды пробы жидкости, В) растворение состава распознавания и калибровки, С) заключительное образование агглютината между анализируемым веществом, элементом распознавания, иммобилизованным на микрочастицах и калибровочным соединением;

на фиг.9 показаны различные варианты осуществления системы распределения пробы с различными схемами каналов и чувствительными участками, пригодными для различных методов калибровки;

на фиг.10 показан чувствительный к пробе участок системы распределения пробы по фиг.6 в сочетании с излучателем света и регистрирующим (детектирующим устройством в поперечном сечении, конфигурированный для измерения поглощения;

на фиг.11 показано расположение регистрирующего (детекторного) устройства для тест-элемента, конфигурированного для оценки рассеяния света или флуоресценции;

на фиг.12 схематически показаны результаты и оценка для количественного анализа неконкурентного А) и конкурентного анализа В);

на фиг.13 приведены примеры определения концентрации анализируемого вещества с использованием метода линейного добавления стандарта;

на фиг.14 приведен график, показывающий метод проверки достоверности для рассчитанного результата и калибровочных данных;

на фиг.15 показаны примеры флуоресцентных красителей с неспецифическим сродством белков;

на фиг.16 показан схематический принцип реакции агглютинации посредством флуоресцентного молекулярного ротора: А) введение среды пробы жидкости, В) растворение состава распознавания и калибровки, С) заключительное образование агглютината между анализируемым веществом, элементом распознавания, калибровочным соединение и неспецифическим флуоресцентным молекулярным ротором в качестве репортерного элемента;

на фиг.17 показаны примеры неспецифических флуоресцентных молекулярных роторов;

на фиг.18 показан схематический принцип реакции сродства, использующей специфический флуоресцентный краситель в качестве репортерного элемента: А) введение среды пробы жидкости; В) растворение состава распознавания и калибровки, С) заключительное образование комплекса сродства между анализируемым веществом, элементом распознавания, калибровочным соединением и специфическим репортерным элементом;

на фиг.19 показан принцип реакции анализа распознавания при помощи апоэнзима (AARA от англ. "apo-enzyme assisted recognition assay");

на фиг.20 показано влияние сбоев регистрации во время ламинирования на объем пробы тест-элемента, а также верхняя часть относительно вида в поперечном сечении альтернативного варианта осуществления (с), который предусматривает большие допустимые пределы для фиксации нижнего и верхнего слоев без ущерба для качества тест-полоски;

на фиг.21 показан способ изготовления тест-элемента, используемый для анализов сродства и иммунологических анализов.

Подробное описание изобретения

Как показано на фиг.1 и фиг.2, тест-элемент 1 для анализа вещества по настоящему изобретению представляет собой многослойную компоновку, содержащую нижний слой 2, центральный слой 3, расположенный над нижним слоем 2, и верхний слой 4, расположенный над центральным слоем 3. Центральный слой 3 содержит вырез 5, который образует полость в сочетании с нижним слоем 2 и верхним слоем 4. Внутри полости расположена система 6 распределения пробы, которая сообщается с расположенным на краю тест-полоски участком 9 взятия пробы. Используемый пользователем участок 9 взятия пробы предпочтительно имеет форму скругленного выступа 10, расположенного на одной из главных сторон тест-полоски для анализируемого вещества для более простого взятия пробы. На другой главной стороне тест-полоски против участка 9, 10 взятия пробы расположено вентиляционное отверстие 11, через которое заполняющая систему распределения проба физиологической жидкости или жидкости на водной основе вытесняет воздух и поступает на заданные чувствительные участки 6а, 6′а (см. фиг.3). Следует отметить, что при этой конструкции необходимо только одно вентиляционное отверстие независимо от количества заданных чувствительных участков, используемых внутри тест-элемента. Описанные элементы системы распределения пробы с участками с высокой поверхностной энергией, участком взятия пробы, вентиляционным отверстием, центральным слоем и вырезом в центральном слое образуют собственно тест-элемент, который создает внутренний капиллярный эффект, обеспечивающий распределение взятой физиологической жидкости или жидкости на водной основе на заданные чувствительные участки.

Кроме того, тест-полоска 1 содержит регистрирующие (позиционирующие) элементы 7, 8, используемые для различения нескольких типов тест-элементов анализируемого вещества для определения различных анализируемых веществ. Посредством этого измерительное устройство для нескольких анализируемых веществ настроено на выполнение специальной программы или процедур с выбираемыми параметрами при введении полоски для определения конкретного анализируемого вещества.

Как показано на фиг.3, на которой представлена многослойная структура по фиг.1 и 2 в разобранном виде, нижний слой 2 обеспечивает первую поверхность 2а, и верхний слой 4 обеспечивает вторую поверхность 4а. Первая поверхность 2а и вторая поверхность 4а сконструированы с участками, которые создают систему 6 распределения пробы. Структура системы 6 распределения пробы содержит заданное число чувствительных к анализируемому веществу участков 6а и каналов пробы 6b, которые совмещены и зафиксированы в основном конгруэнтно при сборке многослойной структуры. Центральный слой 3 обеспечивает расстояние между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4 и содержит вырез 5 для создания внутренней полости совместно с первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4. Система 6 распределения пробы, которая образована между первой поверхностью 2а и второй поверхностью 4а, расположена внутри полости, созданной вырезом 5 центрального слоя 3 и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4. Предпочтительно внутренняя полость, по существу, конструктивно больше, чем система распределения пробы.

Поскольку назначение выреза 5 центрального слоя состоит только в создании полости для системы 6 распределения пробы, вырез 5 центрального слоя 3 может иметь различную форму; примеры показаны на фиг.4. На фиг.4а показана полость 12 тест-элемента в форме зонтика, на фиг.4b показана прямоугольная полость 13 тест-элемента, и на фиг.4с - полость 14 для пробы имеет круглую форму. Вырез 5 центрального слоя 3 не влияет на размер заданных чувствительных участков 6а и размер каналов 6b системы 6 распределения пробы и, следовательно, не влияет или не меняет требуемый объем пробы. По сравнению с системой 6 распределения пробы форма полости, показанная на фиг.4, довольно проста, таким образом обеспечивая использование простых пробивных штампов и быструю обработку с меньшими требованиями по точности установки.

Система 6 распределения пробы, расположенная в полости, образованной вырезом 5 центрального слоя 3 и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4, образована за счет создания участков с высокой и низкой поверхностной энергией на указанных поверхностях 2а и 4а. Участки с высокой и низкой поверхностной энергией на первой поверхности 2а нижнего слоя 2 и второй поверхности 4а верхнего слоя 4 совмещены и зафиксированы, по существу, конгруэнтно друг относительно друга. Поскольку нанесенная физиологическая жидкость или любая другая проба на водной основе смачивает только участки с высокой поверхностной энергией, таким образом, она ограничена в пределах заданных каналов 6b потока и чувствительных участков 6а системы 6 распределения пробы и между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4.

На фиг.5 показана конструкция системы распределения пробы с использованием гидрофобных "направляющих элементов". В этом варианте осуществления тест-элементы анализируемого вещества по настоящему изобретению - нижний слой 2 и верхний слой 4 покрыты гидрофобным слоем 16, за исключением участков, которые образуют каналы пробы, и чувствительных участков. Гидрофобный слой 16 создает участок с низкой поверхностной энергией, который проявляет силу отталкивания по отношению к нанесенной жидкости 15 пробы и, следовательно, ограничивает жидкость 15 пробы участками с высокой поверхностной энергией, которые образуют систему распределения пробы.

Предпочтительно гидрофобный слой 16 наносится на гидрофильную поверхность 2а, 4а, которая смачивается физиологической жидкостью или жидкостью 15 водной пробы. Описанная выше процедура требует наличия гидрофильной поверхности, которую можно изготовить из натурального гидрофильного полимера, такого как целлофан или стекло, а также на основе гидрофобных поверхностей общих полимеров (примеры приведены ниже), придав гидрофобной поверхности гидрофильные свойства с использованием покрытия или физического или химического плазменного осаждения гидрофильных мономеров, которые можно испарить в вакууме, например, диоксида кремния, оксида этилена, этилен гликоля, пиррола или акриловой кислоты. Следовательно, структура "направляющих элементов" может быть реализована печатью гидрофобной краски на гидрофильные поверхности нижнего и верхнего слоев.

Пригодная гидрофобная краска обладает углом смачивания с водой обычно больше 100° и поверхностной энергией обычно менее 25 мН/м и обычно содержит мономеры, олигомеры и полимеры с гидрофобными свойствами, придающие гидрофобные свойства добавки или гидрофобные пигменты и наполнители.

На фиг.6 показана другая конструкция системы распределения пробы с использованием гидрофильных каналов. В этом варианте осуществления тест-элемента натуральный гидрофобный нижний слой 2 и верхний слой 4 покрыты гидрофильными соединениями или лаком 17, за счет чего образованы участки с высокой поверхностной энергией.

Гидрофильный реагент 17, нанесенный печатью на гидрофобную поверхность 2а, 4а, сильно смачивается физиологической жидкостью или жидкостью водной пробы 15; таким образом, участки с высокой поверхностной энергией, создающие гидрофильные каналы системы распределения пробы, оказывают воздействие положительной капиллярной силы на нанесенную физиологическую жидкость или жидкость пробы на водной основе, чтобы передать жидкость пробы на отдельные чувствительные участки.

Гидрофильная структура может быть реализована путем печати гидрофильных или амфифильных реагентов на гидрофобную поверхность. Краски с гидрофильными свойствами могут быть выбраны из широкого ряда полимеров с высокой молекулярной массой и их смесей, растворимых в полярных растворителях, например воде или спиртах. В частности, пригодны производные альгината, целлюлозы и сложного эфира целлюлозы, гидроксиэтил целлюлозы, смол, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, оксида полиэтилена, поливинилпиролидона, полистирол сульфонат, поли(метилвинилового эфира/малеиновой кислоты), сополимеров винилпиролидона/триметиламмония и производных алкил-фосфохолина. Дополнительной оптимизации можно достичь за счет использования органомодифицированных добавок акрилатов кремния, которые являются перекрестно-сшитым видом органо-модифицированных поликсилоксанов и фторированных поверхностно-активных веществ. Пригодные покрытия обеспечивают угол смачивания с водой обычно менее 35° и поверхностную энергию обычно более 50 мН/м.

Нижний слой 2 и верхний слой 4, пригодные в качестве подложки для печати, могут быть образованы из материала типа стекла, поливинил ацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, сложных полиэфиров и полиэфирных смол, содержащих кольца флюорена, полистиролы, поликарбонаты и привитые сополимеры поликарбоната-полистирола, концевые модифицированные поликарбонаты, полиолефины, циклоолефины и сополимеры циклоолефинов и(или) сополимеры олефин-малеинимида.

В случае, когда подложка относится к промежуточному гидрофобному типу, также возможно нанесение печатью гидрофильных каналов с окружающей гидрофобной структурой, т.е., комбинация конструкций по фиг.5 и фиг.6.

В альтернативном варианте осуществления либо первая либо вторая поверхность предусмотрена с гидрофильной/гидрофобной структурой (6, 16), поскольку соответствующая поверхность обеспечивает гомогенную структуру гидрофильных пикселей, окруженных гидрофобным участком, создавая тем самым поверхность с полугидрофильными, полугидрофобными свойствами (амфифильный характер поверхности), что устраняет необходимость совмещения гидрофильной и гидрофобной структур (6, 16) первой поверхности с эквивалентной гидрофильной и гидрофобной структурой (6′, 16′) второй поверхности. Свойства такой амфифильной поверхности можно легко спроектировать посредством геометрической структуры гидрофильных пикселей и общего соотношения между гидрофильным и гидрофобным участком. В описанном изобретении амфифильный характер, соответственно соотношение между гидрофильными пикселями и гидрофобными участками спроектировано таким, чтобы жидкость пробы проходила от гидрофильного пикселя к гидрофильному пикселю, только если противоположная поверхность обеспечивает гидрофильный характер. Если противоположная поверхность обеспечивает гидрофобный характер, движение жидкости внутри капиллярного зазора тест-элемента прекращается. Этот механизм позволяет создавать по вышеописанному способу функциональный тест-элемент без строгого требования точной регистрации соответствующей структуры системы распределения пробы, предусмотренной на первой и второй поверхностях.

Однако предпочтительно, чтобы и первая и вторая поверхности были предусмотрены с одинаковыми структурами с высокой и низкой поверхностной энергией для обеспечения быстрого распределения жидкости пробы внутри гидрофильных каналов системы распределения пробы.

Более того, можно физически поднять участки с высокой поверхностной энергией первой и второй поверхностей относительно участков с низкой поверхностной энергией за счет травления, тиснения или просто печати гидрофильного слоя 17 толщиной больше примерно в три - пять раз на первой и второй поверхности. Благодаря этому подъему капиллярный зазор гидрофильных каналов становится меньше относительно окружающего участка и оказывает более сильное воздействие капилляров на жидкость пробы.

Требование к объему для системы распределения пробы, содержащейся в тест-элементе анализируемого вещества по предпочтительному варианту осуществления, очень низкое и составляет примерно 0,5 мкл - 1,0 мкл, требуется примерно только 100 нл - 150 нл на чувствительный участок, в зависимости от того, созданы ли участки с высокой и низкой поверхностной энергией гидрофобными направляющими элементами или гидрофильными каналами или их комбинацией. Однако для специалистов очевидно, что объем системы распределения пробы различен для различных конструкций и в зависимости от числа использованных заданных чувствительных участков.

Как показано на фиг.5 и 6, участки с высокой поверхностной энергией первой и второй поверхностей 2а, 4а, образующие чувствительные участки, покрытые составами 18, 19, способствуют регистрации и позволяют определить анализируемое вещество в жидкости 15 пробы. В варианте осуществления, показанном на фиг.5 и 6, первая поверхность 2а чувствительного участка покрыта калибровочным составом 18. Калибровочный состав содержит калибровочное соединение, которое может быть анализируемым веществом или эквивалентной анализируемому веществу молекулой, которая обладает сродством к элементу распознавания. Вторая поверхность 4а чувствительного участка покрыта составом 19 распознавания, содержащим элемент распознавания, например рецептор, антитело или фрагмент антитела, такой как фрагмент Fab, который обладает сродством к анализируемому веществу и который может способствовать регистрации и определению анализируемого вещества в жидкости пробы. Конкретные примеры калибровочного соединения, а также элементов распознавания приведены ниже.

Как упомянуто выше, в зависимости от необходимости для врача в выполнении теста различные заболевания организма требуют различной чувствительности и различных динамических диапазонов, т.е. тест-системы для ВИЧ требуют высокочувствительного подхода для регистрации порога, но неширокого динамического диапазона, в то время как обнаружение гликозилированного гемоглобина HbAlc, 3-месячный маркер для развития диабета и податливости пациента, требует широкого динамического диапазона, но не очень чувствительного порога.

Далее, возникновение осложнений диабета, таких как диабетическая ретинопатия, требует очень чувствительного подхода с использованием регистрирующего средства на основе белка. Например, обнаружение такого осложнения может по меньшей мере двойным исследованием, т.е., обычно возникновение ретинопатии контролируется офтальмологами, и диагностику и состояние диабетической ретинопатии выполняют согласно подробному исследованию сетчатки с помощью офтальмоскопа. При втором способе обнаружения диабетической ретинопатии известно, что концентрация белка Фактор-1 на основе стромальных клеток (SDF-1) возрастает при развитии диабетической ретинопатии, коррелируя с тяжестью заболевания. Такой белок, следовательно, можно использовать как основу для анализа при регистрации и мониторинге осложнения заболевания, такого как ретинопатия.

Таким образом, методы регистрации и режимы должны быть адаптированы к требованиям диагностических потребностей соответственно требованиям терапии пациента. Описанные далее примеры предпочтительны не только как осуществление тест-элемента для выполнения требуемой диагностической задачи. Они содержат большинство случаев химических и(или) биохимических соединений, таких как флуоресцентные красители, микрочастицы, коэнзимы и апоэнзимы, обеспечивающие или усиливающие регистрацию нужной реакции сродства (реакция распознавания) между анализируемым веществом и соответствующим анализируемому веществу специфическим элементом распознавания, таким образом, можно обратиться в основном к этим соединениям в качестве репортерных элементов или к их множеству в качестве репортерной системы.

Тест-системы, использующие репортерные элементы для анализа сродства

Методы агглютинации

На фиг.7 показана схема и принцип первого варианта осуществления настоящего изобретения, применимого для анализа сродства и иммунологических анализов или в основном установленного для исследований распознавания. В этом варианте осуществления описана реакция агглютинации, которая указывает качественно относительно количественной реакции между интересующим анализируемым веществом 31 и специфическим для него элементом 32 распознавания. В этом конкретном случае анализируемым веществом 31 может быть белок, такой как белок вируса или хориогонадотропин hCG, и элемент 32 распознавания может быть антителом для этого белка.

На фиг.7 схематически показана эта реакция, если жидкая проба 15, содержащая интересующее анализируемое вещество 31, попадает на чувствительный к пробе участок, содержащий элемент 32 распознавания и калибровочное соединение 33 и присоединенный к первой и второй поверхностям 2а и 4а. Элемент 32 распознавания, а также калибровочное соединение 33 растворяются жидкостью пробы 15 и элементом 32 распознавания, вступающим в реакцию с калибровочным соединением 33, а также с анализируемым веществом 31, содержащимся в жидкости пробы. Для хода реакции элемент 32 распознавания способен и должен связываться с несколькими молекулами анализируемого вещества, таким образом, элементы 32 распознавания, следовательно, сшиваются или агглютинируют все молекулы анализируемого вещества в большие скопления 34. Размер этих скоплений или частиц приводит к рассеянию света лазера в зависимости от их физического размера. Если скопления меньше, чем длина волны света, скопление вызывает особый тип рассеяния, называемый специалистами в этой области рэлеевским, поскольку скопления больше, чем длина волны света, вызывают рассеяние, называемое рассеянием Ми. Для определения наличия, соответственно количества анализируемого вещества могут быть использованы различные типы рассеяния, и различна картина рассеяния в зависимости от длины волны лазера.

В случае, когда элемент или элементы 32 распознавания иммобилизированы на микрочастицах 35, например, из золота, латекса или полистирола, как показано на фиг.8, за реакцией агглютинации между множеством таких микрочастиц с повышенной чувствительностью и анализируемым веществом можно проследить с помощью простого фотоизмерительного устройства или даже глаза. Во время реакции агглютинации количество одиночных микрочастиц снижается за счет агглютинации, таким образом, число центров рассеяния в пробе сокращается, и свет рассеивается после описанной реакции, обеспечивая более высокое пропускание света через чувствительный к пробе участок.

Аналогично этому отсутствие реакции сродства между анализируемым веществом и элементом распознавания в жидкой среде пробы обнаруживается по отсутствию реакции агглютинации и, следовательно, характеризуется низким пропусканием света через чувствительный к пробе участок.

Тест-элемент обеспечен покрытием чувствительных участков 6′а первой поверхности 2а нижнего слоя 2 с пригодным элементом 32 распознавания относительно микрочастиц 35 с повышенной чувствительностью. Предпочтительно микрочастицы 35 могут быть из латекса, золота или желатина, но более предпочтительно из золота. Могут быть использованы другие известные частицы, такие как углерод, полистирол или т.п., что очевидно для специалистов в этой области. В альтернативном варианте микрочастицы 35 могут быть нанесены покрытием на чувствительные участки 6а второй поверхности 4а верхнего слоя 4. Кроме того, микрочастицы могут быть нанесены покрытием и на чувствительные участки первой поверхности 2а, и на чувствительные участки второй поверхности 4а, поскольку для анализа анализируемого вещества не требуется калибровочного состава 18 относительно калибровочного соединения 33.

В других и более предпочтительных вариантах осуществления чувствительные участки 6а первой поверхности 2а покрыты калибровочными составами 18, обеспечивающими выполнение анализа положительного и отрицательного контроля параллельно определению анализируемого вещества, таким образом создавая возможность гарантии для пользователя, что измерение выполнено правильно, и что тест-система, а также применяемый тест-элемент полностью функциональны. Такая подача через систему распределения обеспечивает высокую концентрацию калибровочного соединения (анализируемое вещество или эквивалентная анализируемому веществу молекула, которые обладают сродством к элементу распознавания) на одном чувствительном участке, например 6′а3, который позволяет полностью осуществить реакцию агглютинации. Таким образом, показания чувствительного участка 6′а3 соотносятся приблизительно со 100% или полной шкалой показаний измерительного устройства. Второй чувствительный участок, например 6′а2, содержит соединение-ингибитор, подавляющий реакцию сродства анализируемого вещества 31 с элементом распознавания или не вступающий в реакцию элемент распознавания, такой как нечувствительные микрочастицы, таким образом, соотношение показаний чувствительного участка 6′а2 составляет приблизительно 0% реакции агглютинации. В этом варианте осуществления концентрация элемента распознавания относительно микрочастиц с повышенной чувствительностью на всех заданных чувствительных участках 6а будет одинаково представлять оптимизированную концентрацию для конкретного анализа, оптимизированного в этой лаборатории.

В дополнительном и наиболее предпочтительном варианте осуществления два чувствительных участка первой поверхности 2а нижнего слоя 2 покрыты калибровочными составами 18, содержащими различные и заданные концентрации анализируемого вещества или соединений, вызывающих одну и ту же или эквивалентную некаталитическую реакцию сродства с элементом распознавания.

В наиболее упрощенной калибровочной модели оптический отклик, вызываемый реакцией сродства между анализируемым веществом и элементом распознавания, является линейным или легко может быть линеаризован посредством соответствующей математической функции, такой как f(log(x)) или f(1/x). После введения жидкой пробы с использованием участка 9 взятия пробы проба будет распределена на чувствительные к пробе участки. Здесь проба растворяет калибровочный состав 18, нанесенный покрытием на первую поверхность 2а, и состав распознавания 19, нанесенный покрытием на вторую поверхность 4а, инициирующий реакцию сродства между анализируемым веществом 31, калибровочным соединением 33 и элементом 32 распознавания. Благодаря различным концентрациям калибровочного состава на чувствительных участках 6′а2 и 6′а3, который добавлен к анализируемому веществу, содержащемуся в пробе, измерительное устройство и соответственно регистрирующее устройство могут соотнести оптические показания всех чувствительных участков 6а с концентрацией анализируемого вещества в жидкости пробы. Необязательно чувствительный к пробе участок 6с не содержит элемента распознавания или неспецифического связывающего реагента, такого как микрочастицы без повышения чувствительности, таким образом, нанесение жидкости пробы на чувствительный участок 6с не запускает агглютинацию и используется для оценки фоновых сигналов жидкости пробы 15 в тест-элементе анализируемого вещества. Описанный способ калибровки известен специалистам в этой области как "метод добавления стандарта" и используется в лабораториях для проб со "сложной" матрицей пробы.

На фиг.9 показаны различные структуры системы распределения пробы, которые могут быть осуществлены посредством гидрофильных каналов, как показано на фиг.6, или посредством гидрофобных "направляющих элементов", как показано на фиг.5, или посредством комбинации гидрофильных каналов и гидрофобных направляющих элементов. Ячейка А1 на фиг.9 показывает случаи для простейшей системы распределения пробы. Столбец А фиг.9 показывает формальную конструкцию систем распределения пробы без корректировки фона, в то время как столбец В обеспечивает конструкции для систем распределения пробы с корректировкой фона, столбец С указывает наивысший порядок полиномиального уравнения калибровки, достижимый с соседними конструкциями, и столбец n указывает требуемое число заданных чувствительных участков каждой поверхности и соответственно число требуемых измерений. Буквы в каждой конструкции указывают положение корректировки фона (с), пробу (1), и все связанные калибровочные участки (2, 3, 4, 5, 6) с возрастанием количества калибровочного соединения. Самая простая калибровка представлена линейным уравнением, где взаимосвязь между измерением и концентрацией анализируемого вещества строго пропорциональна. Калибровка тест-элемента в основном выполняется с использованием метода добавления стандарта путем добавления калибровочного соединения различных калибровочных участков к пробе и последующего расчета линейного или монотонного нелинейного уравнения калибровки. На фиг.13 приведено более подробное пояснение случая I. Калибровочная модель или порядок (столбец С) должен соответствовать выбранному анализируемому веществу и используемому химическому способу регистрации, следовательно, нельзя применять линейную калибровочную модель к химической реакции, которая подчиняется модели четвертого порядка и наоборот. Однако еще можно использовать тест-элемент, предназначенный для пяти стандартных добавок для линейной калибровки, большее количество стандартов обеспечивает даже более точное измерение и статистическую достоверность с более высокой значимостью с точки зрения коэффициента корреляции, стандартного отклонения и стандартной погрешности теста по сравнению с линейной калибровкой, основанной на двух стандартах.

Более того, также возможен повтор измерений пробы и стандарта, таким образом, можно выполнить две независимые линейные калибровки для одной конкретной пробы пробе физиологической или водной жидкости с вариантами осуществления, показанными в ряду IV. Аналогично этому можно использовать тот же самый тест-элемент для определения двух анализируемых веществ. Дополнительно система для нескольких анализируемых веществ может быть осуществлена в пределах того же набора заданных чувствительных участков, если выбранная химическая реакция регистрации не создает проблем помех, таким образом, продукты извлечения и продукты одной реакции не участвуют в других реакциях, и полученный индикатор в виде красителя поглощает свет, по существу, в другом диапазоне длин волн.

В дополнительном и альтернативном вариантах осуществления тест-элемента калибровка носит более качественный характер. Здесь результат чувствительного участка 6а1 сравнивается с зафиксированными пределами положительного стандарта 25с и отрицательного стандарта 26с, предусмотренными на дополнительных чувствительных участках, например 6а2 и 6а3 (см.подробно на фиг.12). Такой способ удобен для анализируемых веществ, требующих только качественной индикации, в основном известных по тест-системам на беременность.

В случае нелинейного оптического отклика реакции между анализируемым веществом и элементом распознавания могут быть использованы другие калибровочные модели, если система распределения пробы принята в соответствии с фиг.9 для нелинейного характера путем введения большего числа заданных чувствительных к пробе участков в системе распределения пробы тест-элемента. Специалисты в этой области отметят, что фиг.9 дает примеры для систем распределения пробы для целей иллюстрации. Другие геометрические решения также возможны и используются для выполнения аналогичных или связанных задач.

Оптический отклик реакции между анализируемым веществом и элементом 32 распознавания, содержащимся в составе 19 распознавания, измеряется измерительным устройством или регистрирующим (детекторным) устройством. Измерительное устройство или регистрирующее устройство обеспечивает держатель полоски по меньшей мере с одной, но предпочтительно с множеством компоновок, содержащих источник 20 света для испускания длины 24 волны через заданный чувствительный к пробе участок 6, как показано на фиг.10. Длина 24 волны света 20 может быть в диапазоне 300-800 нм, но предпочтительно между 400 и 650 нм и наиболее предпочтительно 635 нм. Свет, испускаемый источником света, проходит через оптическую схему 21, 22, такую как линза и апертура, нижний слой 2, жидкую среду 15, верхний слой 4 чувствительного участка и регистрируется на противоположной стороне тест-элемента регистрирующим устройством 23. Предпочтительно устройство регистрации света содержит оптическую схему 21 а и 22а, такую как апертура, линза и(или) оптический фильтр, и по меньшей мере одно из следующего: фотодиод, фототранзистор, фотоэлемент, фотоумножитель или группа устройств с зарядовой связью. Более предпочтительно устройство регистрации света содержит фотодиод. Источник света может быть светоизлучающим диодом или лазерным диодом с соответствующей длиной волны.

В случае реакции агглютинации, контролируемой непосредственно по рассеянию света и без помощи микрочастиц, наиболее удобно расположить источник света и регистрирующее устройство не друг напротив друга, а под углом приблизительно 90 градусов для достижения максимальной чувствительности. Предпочтительный угол между источником света и регистрирующим устройством составляет между 80 и 120 градусами, но наиболее предпочтителен угол приблизительно 109 градусов, и тест-элемент расположен в оптической регистрирующей схеме таким образом, что угол между нижним слоем и источником света и угол между верхним слоем и регистрирующим устройством составляет приблизительно 54 градуса для снижения фонового шума из-за внутреннего отражения на различных поверхностях чувствительного участка (или более в основном тест-элемента), как показано на фиг.11. Таким образом, регистрирующее устройство видит только волну 24 света, отклоненную рассеянием на агглютинированных частицах, и не видит волну 24а света, испускаемого источником света. Тем не менее, специалисты в этой области отметят, что фактический угол должен быть оптимизирован для конкретного применения, требуемой чувствительности и требований к измерительному устройству относительно регистрирующего устройства. Кроме того, схема, показанная на фиг.11, может быть использована для регистрации флуоресценции, если источник 20 света и фотодетектор 23 конфигурированы с дополнительными фильтрами, обеспечивающими дискриминацию между длиной волны возбуждения и испускания.

Кроме того, падение световых волн на каждый чувствительный к пробе участок 6 при возникновении реакции сродства вызывает рассеяние световых волн. Поскольку концентрация анализируемого вещества на каждом чувствительном участке различна из-за добавления анализируемого вещества или добавления эквивалентного анализируемому веществу соединения в качестве калибровочного соединения 33, оптическая плотность каждого результирующего светового пучка также различна. В случае наличия по меньшей мере трех чувствительных участков, расположенных в пределах системы распределения пробы, тем самым по меньшей мере два чувствительных участка содержат различные уровни калибровочного соединения, можно рассчитать неизвестную концентрацию анализируемого вещества 31 в жидкой среде пробы 15 на заданном чувствительном участке без калибровочного соединения (6′а1), поскольку соотношение между агглютинацией и концентрацией анализируемого вещества следует линейной или монотонно возрастающей, соответственно убывающей, модели. Потенциальные системы распределения пробы, соответствующие калибровочным моделям, основанным на полиномиальном соотношении, показаны на фиг.9, как описано выше.

В случае, когда реакция агглютинации не возникает, т.е. нет реакции между анализируемым веществом 31 и элементом распознавания 32 на чувствительном участке, свет рассеивается, что приводит к псевдовысокой оптической плотности (поглощение). И, напротив, в случае ~ 100% агглютинации в соответствии с сильной реакцией между анализируемым веществом, соответственно калибровочным соединением и элементом распознавания на первой поверхности нижнего слоя и второй поверхности верхнего слоя свет рассеивается минимально, что приводит к низкой оптической плотности.

На фиг.12 показаны примеры графиков поглощения в зависимости от концентрации с режимом качественной регистрации. Здесь заданные чувствительные участки 6а2 и 6а3 конфигурированы для обеспечения информации по динамическому диапазону реакции агглютинации, указанный участок 6а2 обеспечивает сравнение с ~ 0% агглютинацией, представляющей отрицательный стандарт 26с, соответственно участок 6а3 обеспечивает сравнение со ~ 100% агглютинацией, представляющей положительный стандарт 25с, таким образом, показания этих чувствительных участков можно использовать для подтверждения измерения, выполненного на чувствительном участке 6а1.

На фиг.13 показаны примеры графиков и оценки поглощения в зависимости от концентрации реакции агглютинации между анализируемым веществом и элементом распознавания в жидкой среде, пригодные для количественного анализа. Концентрация элемента распознавания, который может быть, например, заданным количеством антитела или антитела, иммобилизованного на микрочастицах, на чувствительных участках с 6а1 по 6а3, оптимизированным для достижения соответствующей чувствительности и динамического диапазона для интересующего анализируемого вещества. Кроме того, на четвертом и необязательно чувствительном участке измеряется рассеяние света или оптическое поглощение пробы, расположенной на чувствительном участке 6с. Показания этого чувствительного участка представляют количественную оценку для фона пробы, обеспечивающую полную информацию неспецифической части реакции, вызванной материалами тест-элемента, такими как пленки, неактивные соединения покрытий, неспецифические белки или микрочастицы без повышения их чувствительности или сама матрица пробы, которые особенно нужны для количественной оценки проб.

Как упомянуто выше, нанесение покрытия калибровочным составом 18, содержащим калибровочное соединение 33 и состав 19 распознавания, содержащий элемент 32 распознавания, соответственно элемент распознавания, иммобилизованный на соответствующих микрочастицах 35, может быть выполнено несколькими известными способами, такими как микроконтактная печать, печать с дозированием краски или способы осаждения, или другие способы осаждения с капиллярным контактом. Концентрация активных компонентов в покрытиях или красителях, таких как калибровочное соединение и элемент распознавания в пределах тест-элемента, может быть оптимизирована лабораторными методами для определения приемлемого динамического диапазона и чувствительности тест-системы для конкретного интересующего анализируемого вещества.

Если динамический диапазон конкретного теста оценен в лаборатории, определенные характеристики можно запрограммировать в измерительном устройстве или устройстве регистрации в качестве окна 29 достоверности, как показано на фиг.14, для выполнения подтверждения результатов после измерений и, кроме того, для оценки статистических параметров выполненного калибровочного расчета 30, такого как стандартное отклонение, стандартная погрешность и коэффициент регрессии.

Способы регистрации на основе флуоресценции

Характеристики описанных выше способов для анализа агглютинации зависят от скорости анализа и структуры измерительного устройства, причем эти параметры взаимосвязаны. По молекулярной шкале микрочастицы огромны и приблизительно больше, чем антитело IgG (иммуноглобулин G), от 1000 до 10000 раз, что является обычным примером для элемента распознавания. В случае элемента(ов) 32 распознавания, иммобилизованных на микрочастицах 35, диффузия микрочастиц гораздо медленнее, чем диффузия только одного элемента распознавания, влияющая на время анализа и, следовательно, характеристики потенциального продукта, но реакцию агглютинации можно контролировать очень простым и затратоэффективным устройством регистрации или даже глазом, если выбраны соответствующие микрочастицы, что обусловлено тем фактом, что интенсивность рассеяния возрастает примерно в 1020, если размер частиц увеличен с коэффициентом 5.

С другой стороны, реакцию агглютинации между анализируемым веществом и неиммобилизованным элементом 32 распознавания можно успешно контролировать на молекулярном уровне правильными устройствами мониторинга на основе лазера, как описано выше. Можно даже количественно оценить молекулярную массу элемента распознавания и результирующий агглютинат после реакции с анализируемым веществом. Однако стоимость необходимого оборудования, главным образом, за счет использованной лазерной технологии мешает использованию при диагностике на месте или мониторинге на дому.

Дополнительный вариант осуществления изобретения обеспечивает решение, которое является средним между двумя описанными методами агглютинации. На молекулярном уровне агглютинация элемента распознавания и анализируемого вещества создает сетку малых частиц белка, меняющую отдельную молярность воды и белков, даже хотя это не влияет на общий баланс массы между белками и водой. После реакции агглютинации некоторые области в жидкости пробы имеют более высокую концентрацию, а некоторые более низкую концентрацию белков по сравнению с моментов времени перед реакцией агглютинации. Это изменение физических свойств может быть зафиксировано и сообщено либо посредством флуоресцентного закаливания молекул красителя, которые обладают высоким сродством к белкам, или посредством флуоресцентных молекулярных роторов.

Флуоресцентные красители с неспецифическим сродством к белкам в качестве репортерного элемента

Основополагающий принцип этого способа регистрации состоит во влиянии зависящего от концентрации флуоресцентного закаливания. Выше некоторой концентрации молекулы флуоресцентного красителя становятся поглотителями флуоресценции, испускаемой молекулами другого флуоресцентного красителя, таким образом, общее регистрируемое испускание пробы снижается с увеличением концентрации. Это снижение зависит от природы флуоресцентного красителя и непосредственного расстояния между двумя молекулами флуоресцентного красителя, другими словами, чем ближе молекулы красителя и короче расстояние, тем сильнее будет флуоресцентное закаливание. В однородном растворе описанный и хорошо известный эффект флуоресцентного закаливания просто зависит от концентрации флуоресцентного красителя, поскольку порог закаливания зависит от используемого флуоресцентного красителя или смеси флуоресцентных красителей. Эффект закаливания становится интересным для анализа распознавания, только если красители неравномерно распределены в жидкости пробы и некоторым образом отражают агглютинацию анализируемого вещества и элемента распознавания, приводящую к неравномерному распределению анализируемого вещества и элементов распознавания в жидкости пробы. Дополнительно полезно выбирать флуоресцентные красители, которые обнаруживают возросший квантовый выход флуоресценции только после поглощения красителей на поверхности белков для минимизации фонового сигнала. Пригодные варианты для этого принципа анализа можно найти в классе амфифильных цвиттер-ионных красителей на основе анилин-пиридиния с двумя гомологичными сериями, полученными из дибутиланилино-пиридиний-бутилсульфоната, и красителей на основе стрирола (так же известных, как гемицианиновые красители), таких как RH364, RH160, RH237, RH421, di-4-ANEPBS, BNBIQ, ANNINE-5 и ANNINE-6. Структурные формулы примеров этих красителей приведены на фиг.15. Однако более известные красители, такие как "нильский голубой" А, флоксин В, 1-анилино-8-нафталин сульфонат (ANS) или их производные также могут использоваться для описанного способа.

Ключевой реакций этого способа является покрытие in-situ элемента распознавания и анализируемого вещества внутри жидкой среды пробы выбранным красителем, таким образом, реакция ограничена элементами распознавания и анализируемого веществами, которые в основном относятся к семейству белков. Однако последовательность событий, реакция агглютинации и поглощение красителя, не важны, поскольку поглощение красителя не препятствует агглютинации. Во время агглютинации молярность отдельного красителя возрастает внутри агглютината и вызывает эффект закаливания. Концентрация красителя, предусмотренного в тест-элементе анализируемого вещества, должна быть оценена для каждой комбинации красителя, элемента распознавания и анализируемого вещества, а также для других условий эксперимента, но в основном зависит от охвата белка красителя, постоянной связывания белка красителя, компактности агглютината и наложение интеграла возбуждения и испускания, который является функцией стоксова сдвига частоты и полуширины полосы пропускания спектра флуоресценции красителя.

После нанесение жидкой среды пробы на участок 9 взятия пробы проба будет распределена системой 6 распределения пробы на чувствительные к пробе участки 6а. Здесь проба растворяет калибровочный состав 19, содержащий флуоресцентный краситель и калибровочное соединение 32 на поверхности 2а первого слоя 2, и состав распознавания 18, содержащий элемент распознавания 32 на поверхности 4а второго слоя 4. После смешивания предусмотренных на первой и второй поверхностях соединений начинается реакция, тем самым элемент распознавания и анализируемое вещество, при условии что анализируемым веществом является белок, становится покрытым красителем, и популяция молекул элемента распознавания, соответственно частиц претерпевает сшивку с анализируемым веществом. Таким образом, степень флуоресцентного закаливания можно измерить регистрирующим устройством тест-элемента. Для качественных режимов регистрации два чувствительных к пробе участка конфигурированы как отрицательный контроль 6′а2 и положительный контроль 6′а3. Измерение отрицательного контроля относится к флуоресценции всего содержимого белков пробы плюс добавленные компоненты, предусмотренные на соответствующих чувствительных к пробе участках, без агглютинации. Во избежание реакции агглютинации чувствительный участок 6′а2 покрыт неспецифическим элементом распознавания без сродства к анализируемому веществу. Следовательно, показания флуоресценции этого чувствительного участка приводят к 100% сигналу, характеризующему верхний предел динамического диапазона.

И наоборот, измерение положительного контроля, расположенного на чувствительном к пробе участке 6′а3, относится к флуоресценции полностью образованного и агглютинировавшего скопления красителя, обеспечивающего максимальное возможное флуоресцентное закаливание. Такое положительный контроль может быть обеспечен за счет избытка калибровочного соединения, соответственно анализируемого вещества или эквивалента анализируемого вещества с калибровочным составом, нанесенным покрытием на чувствительный к пробе участок 6′а3. Эта конфигурация не только позволяет сообщить о наличии или отсутствии анализируемого вещества, но также дает возможность сообщения полуколичественной информации о концентрации анализируемого вещества в относительных единицах по сравнению с измерениями отрицательного и положительного контроля, такой как низкая, средняя и высокая концентрация.

Если соотношение между концентрацией анализируемого вещества и флуоресцентным закаливанием линейное в нужном диапазоне концентрации анализируемого вещества или может быть линеаризовано с помощью соответствующей математической формулы, количественные результаты для анализируемого вещества могут быть получены, если известное количество калибровочного соединения осаждено на чувствительные участки 6′а2 и 6′а3, тем самым концентрация калибровочного соединения на чувствительном участке 6′а3 выше, чем концентрация калибровочного соединения на участке 6′а2. В случае, когда это соотношение нелинейно, количественная информация для анализируемого вещества может быть получена с использованием тест-элементов анализируемого вещества, обеспечивающих более высокое число чувствительных к пробе участков и больше двух различных уровней концентрации калибровочного соединения (фиг.9). Используемый устройством обработки способ расчета концентрации анализируемого вещества по линейному методу добавления стандарта одинаков для обоих примеров помимо предварительной обработки сигнала и шкалы, как указано на фиг.13А и 13В. Таким образом, более подробное исследование методов добавления стандарта в этом примере опущено.

Неспецифические флуоресцентные молекулярные роторы в качестве репортерных элементов для анализа агглютинации

Ход реакции агглютинации, приводящей к агглютинату 34 со связанными флуоресцентными молекулярными роторами, показан на фиг. с 16 А по 16 С. В этом случае в тест-системе используется тот эффект, что флуоресцентные молекулярные роторы 36 увеличивают их флуоресценцию, если вращение специальных групп в молекулярной структуре затруднено либо повышением вязкости либо за счет пространственного затруднения. Соответственно квантовый выход флуоресценции использованного красителя возрастает с увеличением размера агглютината и уровня перекрестной сшивки, поскольку оба параметра зависят от концентрации анализируемого вещества.

Типичные флуоресцентные молекулярные роторы основаны на главной структуре ксантиновых красителей. Ксантиновые красители получены конденсацией фталевого ангидрида с резорцином (и производными) или m-аминофенолом (и производными), из которых флуоресцеин является прототипом (все такие красители содержат ядра ксантина). Однако не все ксантиновые красители являются флуоресцентными молекулярными роторами. Хотя флуоресцеин обеспечивает базовую структуру для молекулярного ротора, он не обеспечивает нужной зависимости и соотношения между флуоресценцией и межмолекулярным вращением боковых групп. Этот эффект не превалирует во флуоресцеине из-за боковых гидроксильных групп в положении 3′ и 6′ молекулы, на который влияет только рН среды пробы и не влияет микровязкость жидкости пробы.

Эффективные флуоресцентные молекулярные роторы основаны на лежащей в основе структуре ксантина, превалирующей в родаминовых красителях. Эти красители получены путем конденсации фталевого ангидрида с m-диалкиламинофенолами. Гидроксильные группы (НО-) флуоресцеина заменены в родаминовых красителях вторичными аминогруппами (R2N-) в качестве эффективных роторов в молекулярной структуре. Родамин В, иногда называемый кислотный красный 52, содержит две группы этила в качестве остатков R в молекулярной структуре роторов и обеспечивает требуемые характеристики флуоресценции и молекулярной подвижности, используемых в тест-системе.

Родамин В или сульфородамин В с повышенной растворимостью в воде является просто примером флуоресцентного молекулярного ротора для описанного применения. Красители на основе аурамина О, кристаллического фиолетового, p-N,N-диметиламинобензонитрила, p-N,N-диметиламинобензилиденмалононитрила, юлолидинбензилиденмалононитрила, Родамина 19, Родамина 6G, оксазина 1, оксазина 4, оксазина 170, розамина, красители на основе карбопиронина, красители на основе пиронина и тиазина являются дополнительными примерами эффективных флуоресцентных молекулярных роторов. Типичные молекулярные структуры показаны на фиг.17.

Для достижения нужного динамического диапазона и чувствительности с тест-системой, соответственно оптимального слежения за реакцией между интересующим анализируемым веществом и соответствующим элементом распознавания, наиболее подходящий флуоресцентный молекулярный ротор необходимо отобрать или даже модифицировать в отношении размера роторов. Однако модификация флуоресцентных молекулярных роторов входит в объем настоящего изобретения.

Специфический репортерный элемент флуоресценции с использованием общего вращения молекулы для конкурентных и неконкурентных анализов распознавания

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения флуоресцентный краситель участвует в реакции сродства между анализируемым веществом и элементом распознавания, поскольку специфический остаток R красителя обладает сродством к элементу распознавания. В соответствии с этим способом все функциональные группы, некоторые из функциональных групп или часть функциональных групп молекул красителя заменены специфическим остатком R, представляющим структуру реагента, участвующего в реакции, например, анализируемого вещества, пептида, гормона, лекарственного средства или нуклеиновой кислоты, такой как олигонуклеотид или короткого аптамера. Три примера внизу показывают возможные модификации флуоресцентных красителей флуоресцеина. Родамина 6G и оксазина 4:

В противоположность примеру флуоресцентного молекулярного ротора, приведенному выше, где изменение внутримолекулярной гибкости меняет их квантовый выход флуоресценции, введенная в настоящее время схема регистрации для тест-элемента сосредоточена на общем вращении молекул флуоресцентного красителя со специфическим сродством к элементу распознавания. Для специалистов очевидно, что общее вращение молекул в данной жидкой среде пробы зависит от гидродинамического диаметра молекулы, который связан с молекулярной массой флуоресцентного красителя. Общее вращение молекул флуоресцентного красителя можно напрямую контролировать посредством поляризации флуоресценции, впервые открытой Перрином в 1926 г.

Поляризация флуоресценции в основном обратно пропорциональна скорости вращения молекулы, таким образом, чем быстрее краситель вращается, тем ниже наблюдаемый сигнал поляризации флуоресценции, и, следовательно, он пропорционален молекулярной массе, соответственно явному гидродинамическому размеру молекулы. Другими словами, чем больше молекула, тем сильнее сигнал поляризации флуоресценции.

Для регистрации поляризации флуоресценции линейный поляризованный свет используется для возбуждения нужного флуоресцентного красителя, и результирующее испускание флуоресценции измеряется после второго поляризационного фильтра, плоскость поляризации которого ориентирована либо параллельно (I_||), либо перпендикулярно (I_⊥) плоскости устройства возбуждения. Когда такой линейный поляризованный свет поглощается флуорофором, он может стать деполяризованным, при условии, что молекула поворачивается в растворе на значительный угол за период ее срока флуоресценции.

Например флуоресцеин, флуоресцентный краситель с молекулярной массой ~ 332 D, присоединенный к лигандам с молекулярной массой ниже 5000 D, возвращает только слабый сигнал поляризации флуоресценции, что обусловлено значительно деполяризацией, присущей быстрому вращению молекул - более 4 нс времени флуоресценции флуорофора. Это означает, что во время второго измерения с фильтрами, ориентированными перпендикулярно друг другу, значительная интенсивность испускания проходит через регистрирующее устройство, так что I_⊥ значителен и по величине аналогичен I_||. Это приводит к относительно низкому сигналу поляризации.

В случае, когда флуоресцентный краситель связывает большой элемент распознавания, степень вращения молекул за время флуоресценции сильно снижается, и деполяризация сигнала незначительна. Следовательно, малая интенсивность испускания измеряется с поляризационными фильтрами, ориентированными перпендикулярно друг другу, при этом I_⊥ мал, что создает относительно высокие результирующие сигналы поляризации.

Для наблюдения поляризации флуоресценции измерительное устройство должно быть конфигурировано с двумя поляризационными фильтрами, причем один - в оптической схеме 21, 22 источника света 20, а другой - в оптической схеме 21а, 22а оптического регистрирующего устройства 23. Измерительное устройство должно измерять интенсивность флуоресценции дважды. Для одного измерения поляризационные фильтры ориентированы параллельно друг другу (I_||); второе измерение выполняют с фильтрами, ориентированными перпендикулярно друг другу (I_⊥). Устройства предыдущего уровня техники позволяют выбрать различные плоскости поляризации с поляризационными фильтрами, смонтированными в колесе или других механических фиксаторах, позволяющих изменить вращение или физическое перемещение. Механический выбор фильтров обеспечивает высокую универсальность и некоторые преимущества для лабораторного оборудования. Однако это не подходит для малых и переносных устройств или даже ручных устройств.

Немеханическим решением этой проблемы является выбор параллельной или перпендикулярной плоскости поляризации посредством жидкокристаллического фильтра или жидкокристаллического устройства выбора плоскости поляризации. Жидкокристаллический фильтр или жидкокристаллическое устройство выбора плоскости поляризации можно считать конструкцией типа "сэндвича" из трех несущих слоев, параллельных друг другу, между которыми расположены два слоя жидких кристаллов, которые можно ориентировать в одной плоскости поляризации, приложив потенциал к двум прилегающим несущим слоям, охватывающим жидкие кристаллы. Потенциал, приложенный к двум прилегающим несущим слоям, можно регулировать посредством блока обработки измерительного устройства. Специалисты в этой области знакомы с соотношением жидкокристаллического устройства выбора плоскости поляризации с модифицированным жидкокристаллическим блоком отображения.

Блок обработки измерительного устройства в настоящее время позволяет рассчитать по двум измеренным интенсивностям флуоресценции обеих плоскостей поляризации поляризацию флуоресценции Р по следующей формуле:

Из формулы очевидно, что поляризация Р является безразмерной величиной и, следовательно, не зависит от концентрации использованного флуоресцентного красителя, интенсивности источника света и, что наиболее важно, от ослабления интенсивности флуоресценции из-за свойств самой пробы. Этот принцип регистрации одинаково действенен для конкурентного и неконкурентного анализа распознавания, как описано ниже.

Конкурентные анализы обнаруживают обратно пропорциональную зависимость между количеством анализируемого вещества и поляризацией флуоресценции, таким образом, низкая концентрация анализируемого вещества дает сильную поляризацию флуоресценции, а высокая концентрация анализируемого вещества дает малую поляризацию флуоресценции (как показано на фиг.12В). Дополнительно элемент распознавания считается активным связывающим элементом или молекулой-хозяином, такой как антитело, и анализируемое вещество считается пассивным связывающим элементом или молекулой-гостем.

И наоборот, высокая концентрация анализируемого вещества обязательно даст высокий выход флуоресценции при использовании вышеописанного способа агглютинации с неспецифическими флуоресцентными молекулярными роторами, когда флуоресцентный молекулярный ротор не участвует непосредственно, но вынужден и препятствует вращению посредством реакции распознавания (как показано на фиг.12А).

Схема хода реакции между анализируемым веществом 31 и элементом распознавания и специфическим репортерным элементом 37 показана на фиг.18. После введения пробы А) и растворения состава распознавания и калибровочного состава, содержащего специфический флуоресцентный краситель в качестве репортерного элемента В), происходит реакция распознавания С). Теперь анализируемое вещество 31, содержащееся в среде пробы 15, конкурирует со специфическими остатками флуоресцентного красителя 37 для имеющихся элементов распознавания, предусмотренных на второй поверхности 4а чувствительного к пробе участка, образуя сложную сетку 38 между всеми элементами реакции. Если концентрация молекул анализируемого вещества высока, почти все места связывания предусмотренного элемента распознавания 32 будут заняты, что приводит к неограниченному свободно вращающемуся специфическому флуоресцентному красителю 37 с низкой поляризацией флуоресценции. И наоборот, если концентрация молекул анализируемого вещества в среде пробы низкая, участки связывания элемента распознавания 32 в основном заняты специфическими остатками флуоресцентного красителя 37, таким образом приводя к ограниченным молекулам красителя и высокой поляризации флуоресценции. Это основное соотношение концепции конкурентного анализа показано на фиг.12В.

Однако специалисты в этой области могут рассмотреть дополнительную конфигурацию, в которой сам анализируемое вещество действует как активный связывающий элемент, соответственно как молекула-хозяин. Это происходит в случае, когда интересующим анализируемым веществом является антитело, т.е. если пациента тестируют на его отклик на вакцинацию. В этом случае специфический флуоресцентный краситель реагирует непосредственно с анализируемым веществом без участия другого элемента реакции, таким образом, реакция является неконкурентной, и поляризация флуоресценции будет пропорциональна концентрации анализируемого вещества в динамическом диапазоне реакции. Этот случай показан на фиг.12А.

Базовая конструкция тест-элемента основана на приведенном выше описании. Кроме того, тест-элемент может быть сконфигурирован для получения качественных результатов или количественных результатов. Качественные результаты дают информацию о наличии или отсутствии анализируемого вещества, или информацию, присутствует ли анализируемое вещество в низкой или высокой концентрации, чего можно достигнуть измерением с положительным и отрицательным контролем для определения динамического диапазона тест-системы. Соответственно чувствительный участок 6′а2 сконфигурирован на отрицательный контроль, когда флуоресцентный краситель не ограничен реакцией сродства, таким образом, регистрирующее устройство может оценить фоновую флуоресценцию (в случае конкурентного способа это будет положительный контроль). Это состояние может быть достигнуто путем использования неспецифического элемента распознавания на чувствительном участке 6а2.

Чувствительный участок 6а3 сконфигурирован на положительный контроль, когда флуоресцентный краситель становится полностью ограниченным либо полностью оформившимся агглютинатом, либо если флуоресцентный краситель полностью захвачен элементом распознавания, таким образом, устройство регистрации тест-системы может регистрировать максимальную флуоресценцию (в случае конкурентного способа это будет отрицательный контроль). Таким образом, калибровочный состав содержит достаточно анализируемого вещества или калибровочного соединения для запуска полностью завершенной реакции сродства.

Количественные результаты достигаются с тест-элементом анализируемого вещества, если по меньшей мере два чувствительных к пробе участка сконфигурированы по меньшей мере с двумя различными концентрациями калибровочного соединения в калибровочном составе. Минимальное количество из двух различных уровней калибровочных соединений должно быть достаточно для оценки анализируемых веществ с линейными характеристиками отклика. Если такая характеристика является более сложной, число чувствительных к пробе участков, соответственно число различных калибровочных составов должно быть увеличено, чтобы удовлетворить требованиям подходящих калибровочных моделей, таких как уравнение полиномов более высокого порядка.

При выполнении этих требований для конкурентной линейной модели калибровочный состав, содержащий специфический флуоресцентный краситель и калибровочное соединение, такое как анализируемое вещество или эквивалентная анализируемому веществу молекула, нанесен покрытием на чувствительные участки 6′а2 и 6′а3 поверхности 2а первого слоя 2. Калибровочный состав, нанесенный покрытием на чувствительный к пробе участок 6′а1, содержит только специфический флуоресцентный краситель в качестве репортерного элемента, но не содержит добавочного калибровочного соединения. Чувствительные участки с 6а1 по 6а3 на поверхности 4а второго слоя 4 покрыты составом распознавания, содержащим элемент распознавания в нужной концентрации.

В случае неконкурентного способа специфический флуоресцентный краситель становится элементом распознавания и нанесен покрытием на чувствительный участок на противоположной стороне калибровочного соединения. Для пояснения конфигурации для линейной конкурентной и линейной неконкурентной тест-систем приведены в Табл.1.

Таблица 1
Составы различных покрытий, требуемых для различных чувствительных к пробе участков при конкурентном и неконкурентном анализе
Положение в системе распределения пробы	Конкурентный анализ	Неконкурентный анализ
6а1 (1-я поверхность)	Уровень 0 калибровочный состав: только специфический флуоресцентный краситель	Уровень 0 калибровочный состав = Контрольной состав
6′а1 (2-я поверхность)	Состав распознавания: активно связывающий компонент, т.е.антитело в качестве элемента распознавания	Состав распознавания: специфический флуоресцентный краситель
Положение в системе распределения пробы	Конкурентный анализ	Неконкурентный анализ
6а2 (1-я поверхность)	Уровень 1 калибровочный состав: анализируемое вещество или эквивалент с первой концентрацией в качестве калибровочного соединения, специфический флуоресцентный краситель	Уровень 1 калибровочный состав: анализируемое вещество или эквивалент с первой концентрацией в качестве калибровочного соединения
6′а2 (2-я поверхность)	Состав распознавания: активно связывающий компонент, т.е. антитело в качестве элемента распознавания	Состав распознавания: специфический флуоресцентный краситель
6а3 (1-я поверхность)	Уровень 2 Калибровочный состав: анализируемое вещество или эквивалент со второй концентрацией в качестве калибровочного соединения, специфический флуоресцентный краситель	Уровень 2 Калибровочный состав: анализируемое вещество или эквивалент со второй концентрацией в качестве калибровочного соединения
6′а3 (2-я поверхность)	Состав распознавания: активно связывающий компонент, т.е. антитело в качестве элемента распознавания	Состав распознавания: специфический флуоресцентный краситель
6с (1-я поверхность)	Контрольной состав не содержит флуоресцентный краситель или элемент распознавания для анализируемого вещества	Контрольной состав не содержит флуоресцентный краситель или калибровочное соединение
6′с (2-я поверхность)	Контрольной состав не содержит флуоресцентный краситель или элемент распознавания для анализируемого вещества	Контрольной состав не содержит флуоресцентный краситель или калибровочное соединение

Средство для анализа распознавания с помощью апоэнзима (AARA) в качестве репортерного элемента

Метод анализа распознавания с помощью апоэнзима (AARA) можно использовать для регистрации присутствия анализируемого вещества в жидкой среде без физического разделения свободных и связанных видов промыванием, которое является общим недостатком иммунологических анализов, например анализа иммунособентов, связанных энзимом (ELISA), препятствующим введение этой концепции в универсальную тест-систему. Однако способ AARA может быть ограничен малыми анализируемого веществами, такими как гормоны, стероиды, пептиды (например, натрийуретический пептид В-типа (BNP)), сердечные маркеры типа тропонина I (TnI), тропонина Т (TnT) и тропонина С (TnC), гаптены, органические молекулы типа пестицидов, лекарственные средства (особенно при неправильном применении: амфетамины, барбитураты, бензодиазепины, кокаин, метамфетамины, опиаты, фенциклидин, ТНС) или взрывчатые вещества. Некоторые из известных и используемых маркеров опухолей в диагностической области, например карциноэмбриональный антиген (СЕА) приблизительно с 180000 дальтонами может быть слишком крупным для этой концепции анализа.

На фиг.19 показан механизм принципа AARA, используемый в тест-системе по настоящему изобретению с элементом 32 распознавания (например, антитело), где анализируемое вещество 39, меченное коэнзимом, способно вступать в реакцию с соответствующим апоэнзимом 40 для образования энзиматического активного голоэнзима 41. В количественном определении анализируемого вещества посредством AARA используется тот факт, что концентрация анализируемого вещества 31 пропорциональна восстановленной концентрации голоэнзима, соответственно модулированной активности энзима для голоэнзима, полученного восстановлением меченого анализируемых веществ коэнзима и апоэнзима.

В конкретном примере коэнзимом может быть флавин-аденин-динуклеотид (FAD), соединенный с производной интересующего анализируемого вещества, например BNP, поскольку апоэнзим глюкозооксидазы используется как часть репортерного элемента. При отсутствии свободного анализируемого вещества меченый коэнзим вступает в реакцию с элементом распознавания, в этом случае BNP специфическим антителом, таким образом подавляя восстановление голоэнзима. Чем больше свободного анализируемого вещества (например, BNP) содержится в жидкой среде пробы, тем больше в пропорциональном соотношении элемент распознавания становится захваченным анализируемым веществом, и тем пропорционально больше меченый коэнзим становится доступен для восстановления голоэнзима. Для описанного механизма важно, чтобы меченый коэнзим 39 становился пространственно защищенным элементом 32 распознавания, предотвращая восстановление с апоэнзимом 40. Как известно специалистам в этой области, активированный GOD начинает окислять глюкозу до глюконолактона и пероксида водорода, которые можно использовать для последующих и соответствующих хромогенных реакций. Тест-элемент сконструирован по меньшей мере с двумя, но предпочтительно с тремя чувствительными к пробе участками для выполнения AARA. Конструкция соответствует приведенному выше описанию, предусматривая нижний слой 2 и верхний слой 4 на заданном расстоянии друг напротив друга с системой 6 распределения пробы на поверхностях 2а и 4а. С некоторыми полимерными пленками может быть предпочтительно обеспечить систему 6 распределения пробы не только с гидрофильным покрытием 17, но также с гидрофобными направляющими элементами 16 для достижения оптимального распределения пробы.

Главным отличием описанных выше вариантов осуществления для агглютинации является покрытие активных компонентов и их комбинации на первой и второй поверхностях. Способ AARA требует более двух, в этом случае четырех активных компонентов плюс хромогенные репортерные элементы, содержащие энзимы, такие как пероксидаза хрена и подложки энзиматических красителей. Здесь важно сочетать только неактивные комбинации компонентов на одной и той же поверхности чувствительных участков. Эти неактивные комбинации представляют собой смесь из двух или более химических соединений, которые не вступают в реакцию друг с другом, таких как две энзиматические подложки, поскольку активная комбинация представляет собой смесь двух реактивных соединений, таких как энзим и соответствующая энзиматическая подложка или элемент распознавания (т.е. антитело) и соответствующее анализируемое вещество (например, антиген). Эти неактивные комбинации, предусмотренные на одной поверхности в виде состава или печатной краски, растворяются при контакте с жидкой средой пробы и, следовательно, образуют активную комбинацию с соединениями противоположной поверхности после смешивания, запускающего химическую или физическую реакцию.

В соответствии с этим способом каждый чувствительный к пробе участок первой поверхности покрыт калибровочными составами, которые содержат анализируемое вещество или эквивалентную молекулу, меченный анализируемым веществом коэнзим, плюс соединения, требуемые для фотометрической оценки, такие как хромоген и энзиматическая подложка, требуемая голоэнзимом. В зависимости от принципа калибровки концентрация калибровочного соединения в калибровочном составе меняется на n-1 или n-2 числе чувствительных к пробе участков, таким образом, по меньшей мере один чувствительный к пробе участок не несет калибровочного соединения. Чувствительные к пробе участки на второй поверхности покрыты составом распознавания, содержащим элемент распознавания для распознавания интересующего анализируемого вещества, апоэнзим, плюс дополнительные энзимы, если это требуется для хроматогенной реакции.

Метод добавления стандарта для AARA

Как упомянуто выше, роль определения того, существует ли анализируемое вещество в жидкой среде, важна для врачей. Также важно определение концентрации анализируемого вещества в жидкой среде. В одном варианте осуществления настоящего изобретения тест-элемент конфигурирован для количественного определения интересующего анализируемого вещества на основе метода линейного добавления стандарта. Для этого примера рассматривается линейное соотношение анализируемого вещества в нужном диапазоне мониторинга анализируемого вещества.

Аналогично вышеописанному способу AARA тест-элемент имеет четыре чувствительных участка на первой поверхности и второй поверхности, совмещенные, по существу, конгруэнтно, для создания системы распределения пробы. Три чувствительных к пробе участка (6′а1, 6′а2, 6′а3) покрыты калибровочным составом 18, поскольку калибровочный состав, нанесенный покрытием на чувствительные к пробе участки 6′а2, 6′а3, содержит две различные заданные и известные концентрации калибровочного соединения 33. В противоположность этому чувствительный к пробе участок 6′а1 покрыт калибровочным составом, не содержащим калибровочного соединения или анализируемого вещества. Чувствительный к пробе участок 6′с не покрыт калибровочным соединением и используется для оценки фона пробы. Чувствительные к пробе участки (6а1, 6а2, 6а3) на второй поверхности 4а покрыты составом 19 распознавания, предусмотренным с заданной концентрацией элемента 32 распознавания, апоэнзима и, если это необходимо, дополнительных энзимов. Чувствительный к пробе участок 6с, аналогично противоположно расположенному участку 6′с, обеспечивает отсутствие состава распознавания или состава без активных компонентов соответственно элемента распознавания. В Табл.2 приведен обзор вышеописанной конфигурации.

Таблица 2
Функциональные компоненты для калибровочных составов и составов распознавания, требуемые для анализа распознавания с помощью апоэнзима
Положение в системе распределения пробы	1-я поверхность Функциональные соединения калибровочных составов	2-я поверхность Функциональные соединения состава распознавания
6′а1/6а1	меченное коэнзимом анализируемое вещество, энзиматические подложки, хромогены	элемент распознавания (т.е. специфическое к анализируемому веществу антитело), апоэнзим, дополнительные энзимы, если требуется для оптической и фотометрической регистрации
6′а2/6а2	Заданные калибровочные соединения С=1 (т.е. анализируемое вещество или эквивалент), меченное коэнзимом анализируемое вещество, энзиматические подложки, хромогены	элемент распознавания (т.е. специфическое к анализируемому веществу антитело), апоэнзим, дополнительные энзимы, если требуется для оптической и фотометрической регистрации
Положение в системе распределения пробы	1-я поверхность Функциональные соединения калибровочных составов	2-я поверхность Функциональные соединения состава распознавания
6′а3/6а3	Заданные калибровочные соединения С=2 (т.е. анализируемое вещество или эквивалент), меченное коэнзимом анализируемое вещество, энзиматические подложки, хроматогены	элемент распознавания (т.е. специфическое к анализируемому веществу антитело), апоэнзим, дополнительные энзимы, если требуется для оптической и фотометрической регистрации
6′с/6с	без покрытия или инертное покрытие без активных компонентов	без покрытия или инертное покрытие без активных компонентов

После нанесения жидкой среды пробы на систему распределения пробы, обеспечивающее повторное растворение калибровочного состава и состава распознавания и последующие реакции между ними, источник 20 света и схема 23 регистрации измерительного устройства измеряют первое оптическое поглощение 25а жидкой среды, расположенной на чувствительном к пробе участке 6′а2 с первым уровнем калибровочного соединения, как показано на фиг.13А. Показания этого чувствительного участка 6а2 представляют собой сигнал, пропорциональный сочетанной концентрации калибровочного соединения на участке 6′а2 и концентрации анализируемого вещества в жидкой среде 15. Параллельно второе оптическое поглощение 26а измеряется для жидкой среды 15 пробы, расположенной на чувствительном участке 6а3 со вторым уровнем калибровочного соединения на участке 6′а3, представляющим сигнал, пропорциональный сочетанной концентрации калибровочного соединения и концентрации анализируемого вещества. Кроме того, третье оптическое поглощение 27а определяется чувствительным участком 6а1, не содержащим калибровочного соединения в калибровочном составе, нанесенном на чувствительный участок 6′а1. Таким образом, жидкая среда 15 пробы содержит только неизвестную концентрацию анализируемого вещества 28. Согласно теории метода линейного добавления стандарта, устройство обработки тест-системы может рассчитать по измеренному поглощению 25а, 26а, 27а и известным концентрациям калибровочного соединения на чувствительных к пробе участках 6′а2, 6′а3, неизвестную концентрацию анализируемого вещества, коэффициенты для уравнения калибровки у=с0+с1х, коэффициент корреляции и стандартное отклонение для выполнения анализа посредством линейного регрессионного анализа. Специфическая концентрация различных компонентов, содержащихся в составе распознавания и различных калибровочных составах согласно Табл.2, должна быть оптимизирована посредством стандартного лабораторного эксперимента для достижения оптимальных характеристик тест-системы. Кроме того, если соотношение между оптическим поглощением и концентрацией анализируемого вещества обнаруживает нелинейную характеристику, метод добавления стандарта можно модифицировать и применить к такому нелинейному поведению, обеспечив больше чувствительных к пробе участков, как показано на фиг.9.

Способ изготовления тест-элемента

Тест-элемент по настоящему изобретению, который предпочтительно изготовлен в виде полоски, можно легко изготовить обычными для специалиста в этой области способами печати, пробивной штамповки и ламинирования. Конструкцию тест-элемента можно изготовить просто и затратоэффективным способом, который предпочтительно, но необязательно, непрерывный.

На первом этапе изготовления структура системы распределения пробы образована созданием участка с высокой и низкой поверхностной энергией на подложке. В первом варианте осуществления участки с высокий поверхностной энергией, образующие каналы пробы и чувствительные участки на первой и второй поверхностях, созданы нанесением гидрофильного состава на гидрофобную поверхность подложки. Как подробно описано выше, также можно создать участки с высокой и низкой поверхностной энергией нанесением структуры гидрофобных "направляющих элементов" на гидрофильную поверхность. В предпочтительном случае подложка обладает промежуточными гидрофобными свойствами имеющейся в продаже прозрачной полимерной пленки, поскольку участки с низкой и высокой поверхностной энергией системы распределения пробы и чувствительные к пробе участки созданы печатью гидрофильных каналов под или окруженных гидрофобной структурой гидрофобных направляющих элементов.

Подложка может быть создана из материала типа стекла, поливинил ацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, полистиролов, сложных полиэфиров и полиэфирных смол, содержащих кольца флюорена, поликарбонаты и привитые сополимеры поликарбоната-полистирола, концевые модифицированные поликарбонаты, полиолефины, циклоолефины и сополимеры циклоолефинов и(или) сополимеры олефин-малеинимида.

Нанесение гидрофильной структуры на гидрофобную подложку и(или) нанесение гидрофобных "направляющих элементов" на гидрофильную подложку или любая их комбинация могут быть осуществлены методом контактной печати и неконтактной печати, распыления, погружения или плазменного осаждения, в частности, пригодными способами являются флексография, литография, глубокая печать, способы переноса на основу твердого красителя или струйная печать.

Однако предпочтительным способом изготовления является способ флексографии, который позволяет выполнить печать с высоким разрешением на ротационных печатных машинах и обеспечивает высокую производительность. Этот способ широко применяют для печати на полимерных пленках и повсеместно используют в упаковочной промышленности. Способ оптической регистрации, показанный на фиг.10 и 11, требует прозрачной и чистой краски с низкой вязкостью для гидрофильной структуры. Краски с низкой вязкостью предпочтительны для получения тонкого и ровного покрытия толщиной примерно 2-4 микрон. Оптическое окно спектра краски должно находиться в диапазоне длин волны, пригодном для оптической регистрации химической реакции. Требования к гидрофобной краске, помимо гидрофобных свойств, менее строгие, и ее можно использовать также для украшения тест-элемента нужным цветом, таким образом, для этого этапа предпочтительна непрозрачная краска. Использование четырехцветной машины для флексографической печати получило широкое распространение и ее использование, по существу, не создаст проблем. То же относится к литографическому устройству.

Наиболее пригодны для изготовления тест-элемента краски на базе растворителя, которые широко представлены различными изготовителями. Дополнительно все имеющиеся печатные краски можно подбирать с дополнительными добавками и пигментами для оптимизации требуемых параметров. Многие из этих красок основаны на смесях нитроцеллюлозного этанола или поливинил бутирал этанола и могут быть получены, например, в компании Sun Chemicals Inc. (35 Waterview Boulevard, Parsippany, Нью-Йорк, США) или Flint Ink Inc. (4600 Arrowhead Drive, Ann Arbor, Мичиган, США).

Хотя краски на основе растворителя или закрепляемые под действием ультрафиолетового излучения применимы для изготовления тест-элемента, некоторыми предпочтительными свойствами обладают краски, закрепляемые пучком электронов (ЭП). Эти краски обеспечивают самое высокое сопротивление механическим и химическим факторам и содержат 100% полимеров, необязательно с пигментами, но без летучих органических растворителей и фотоингибиторов, которые, как доказано, влияют на стабильность при использовании сенсоров. Эти положительные достижения в улучшении характеристик получены за счет способности электронов создавать сшитые полимерные пленки и проникать вглубь поверхности.

Печатные краски, которые закрепляются в потоке электронов, позволяют использовать способность акриловых мономеров и олигомеров к полимеризации. Использование акриловых соединений для приготовления печатных красок в настоящее время становится все более актуальным (см. J.T.Kunjappu. "The Emergence of Polyacrylatcs in Ink Chemistry," Ink World, февраль, 1999 г., стр.40). Простейшее акриловое соединение, а именно акриловая кислота имеет следующую формулу (I):

Двойная связь в акриловом фрагменте при взаимодействии с электронами (инициация) раскрывается и образует свободный радикал, в результате взаимодействия которого с другими образующими цепь (развитие цепи) мономерами образуются высокомолекулярные полимеры. Как уже было отмечено выше, радиационная полимеризация не требует никакого внешнего инициатора, поскольку излучение высокой энергии само генерирует свободные радикалы, благодаря чему в покрытии не остается никаких остатков инициаторов.

К акриловым мономерам, которые закрепляются в потоке электронов, относится большое количество акриловых мономеров, начиная от простых акрилатов типа 2-феноксиэтилакрилата и изооктилакрилата и заканчивая форполимерами типа эпоксиакрилата бисфенола А и акрилатов сложных/простых полиэфиров (R.Golden. J. Coatings Technol., 69, 1997, с.83). Подобный (электронно-лучевой) способ закрепления печатных красок позволяет создать "функциональные печатные краски" с определенными химическими и физическими свойствами без использования растворителя и необходимых при работе с другими печатными красками систем закрепления, которые заметно усложняют весь технологический процесс изготовления предлагаемых в изобретении тест-элементов.

К акриловым мономерам, которые закрепляются в потоке электронов, относится большое количество акриловых мономеров, начиная от простых акрилатов типа 2-феноксиэтилакрилата и изооктилакрилата и заканчивая форполимерами типа эпоксиакрилата бисфенола А и акрилатов сложных/простых полиэфиров (R.Golden. J. Coatings Technol., 69, 1997, с.83). Подобный (электронно-лучевой) способ закрепления печатных красок позволяет создать "функциональные печатные краски" с определенными химическими и физическими свойствами без использования растворителя и необходимых при работе с другими печатными красками систем закрепления, которые заметно усложняют весь технологический процесс изготовления предлагаемых в изобретении тест-элементов.

Печатные краски с гидрофильными свойствами могут быть получены путем выбора растворимых в этаноле и воде полимеров и смесей этих полимеров. Можно использовать полимеры и производные полимеров, сополимеры и соединения на основе альгината, целлюлозы и сложного эфира целлюлозы, гидроксиэтил целлюлозы, смол, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, оксида полиэтилена, винилпиролидона, полистирол сульфоната, поли(метилвинилового эфира/малеиновой кислоты), сополимеров винилпиролидона/триметиламмония и производных алкил-фосфохолина. Возможна дополнительная оптимизация за счет использования добавок органомодифицированных силиконакрилатов, которые являются сшиваемыми разновидностями органомодифицированных полисилоксанов, и фторированных поверхностно-активных веществ. Общее пригодное покрытие обычно обеспечивает угол смачивания с водой менее 35° и поверхностную энергию более 50 мН/м.

Второй этап изготовления включает нанесение составов распознавания, содержащих элемент распознавания и дополнительные реагенты для получения печатных и(или) дозируемых красок, образующих однородный слой в пределах чувствительных к пробе участков.

На всех соответствующих чувствительных к пробе участках противоположной поверхности осаждены калибровочные составы, содержащие нужное количество калибровочного соединения, требуемого для количественного или качественного режимов регистрации. В зависимости от механизма регистрации, например агглютинации, агглютинации с помощью флуоресценции или репортерных AARA дополнительные репортерные элементы могут быть добавлены либо к составу распознавания либо к калибровочному составу, если это необходимо, подробное описание дано выше и в Табл.1.

Поскольку уровень концентрации, соответствующий общему количеству элемента распознавания, нанесенного на заданные чувствительные к пробе участки с 6а1 по 6а3, ответственен за чувствительность и динамический диапазон различных описываемых тест-элементов для анализируемого вещества, а также уровень концентрации и точность примененного калибровочного соединения ответственны за точность результатов теста, для этого применения первостепенно важно обеспечить тест-элементы с точной дозировкой вышеперечисленных элементов, соединений и компонентов. Достичь точной дозировки можно, например, за счет использования системы микродозирующего устройства, предлагаемого компанией Vermes Technik GmbH & Со. KG, Palnkamer Str. 18-20, D-83624 Otterfing, Германия. Эта система также позволяет дозировать нано- и микрочастицы, как это необходимо для некоторых реакций агглютинации. Состав покрытия должен быть легкорастворимым в жидкой среде пробы, чтобы обеспечить быстрое восстановление без остатков после введения жидкости пробы.

Следующий этап включает процедуру ламинирования, при которой нижний и верхний слои, представляющие собой первую и вторую поверхности системы распределения пробы, наложены слоями на центральный слой, определяя тем самым расстояние между первой и второй поверхностями нижнего и верхнего слоев. Центральный слой обеспечивает вырез для создания полости для системы распределения пробы на участках, где система распределения пробы образована на первой и второй поверхностях нижнего и верхнего слоев. Структура с высокой и низкой поверхностной энергией, образованная на первой и второй поверхностях нижнего и верхнего слоев, должна быть совмещена практически конгруэнтно, чтобы обеспечивать образование функциональной системы распределения пробы между первой и второй поверхностями.

Точная ху-установка (фиксация) нижнего и верхнего слоев становится критичной для функционирования элемента, если это не достигается, система распределения пробы не будет функционировать правильно и(или) обладать большим отклонением по отношению к указанному объему пробы. Допустимые пределы отклонения должны составлять +/- 5% ширины гидрофильных каналов для достижения надежных характеристик.

На фиг.20 показан вид сверху (слева) и вид в поперечном сечении (справа) тест-элемента и влияние качества установки. В случае 20а система распределения пробы собрана правильно с надежным совмещением гидрофильных каналов первой 2а и второй 4а поверхностей. Результат неправильно совмещенного тест-элемента показан на фиг.20б. Хотя проставка между нижним (2) и верхним слоем (4) одинакова в случае 20а и 20б, объем пробы ошибочно увеличен в случае (б), поскольку жидкость пробы частично покрывает гидрофобные направляющие элементы системы распределения пробы. Это вызвано жидкостью пробы внутри тест-элемента, которая стремится обладать минимальной площадью поверхности, граничащей с атмосферой, чтобы достичь наиболее предпочтительного энергетического состояния и, следовательно, преодолеть влияние гидрофобных участков.

В альтернативном варианте осуществления, как показано на фиг.20в, система распределения пробы верхнего слоя 4 запланирована примерно на 10% меньше, чем система распределения пробы нижнего слоя 2, таким образом, общий объем пробы тест-элемента определен выступами системы распределения пробы нижнего слоя, обеспечивающими большие допустимые пределы для регистрации во время изготовления без ущерба для точности требуемого объема пробы. Для специалистов в этой области очевидно, что нижний и верхний слои взаимозаменяемы в описанном варианте осуществления без ущерба для сущности изобретения.

Нанесение центрального слоя, который может быть двухсторонней клейкой лентой предпочтительно толщиной 80 микрон или в альтернативном варианте в альтернативном варианте клеем-адгезивом, нанесенным с одинаковой толщиной, упрощено за счет относительно большого выреза в материале по сравнению с размером гидрофильных каналов. Правильная установка особенно важна на линиях непрерывного производства, где подложка поступает с несколькими измерительными устройствами до десятков измерительных устройств в минуту. Выступы подложки и натяжение полотна затрудняют установку в х-направлении (направление перемещения полотна) по сравнению с у-направлением, перпендикулярным перемещению полотна.

Способ изготовления гибких полимерных пленок, обеспечивающий точное размещение структур первой и второй поверхностей, показан на фиг.21, где указаны этапы непрерывного производства полотна. На первом этапе производства по фиг.21а структуры системы 6 распределения пробы нижнего и верхнего слоев нанесены печатью на одну подложку 49 полотна, которая представляет собой материал создаваемых тест-элементов анализируемого вещества. Как показано на фиг.21, напечатанные структуры системы 6 распределения пробы расположены на полотне подложек 49 таким образом, что две системы распределения пробы находятся друг напротив друга слева и справа от зеркальной линии. Необязательно система распределения пробы присоединена на участках, которые образуют участки нанесения пробы. Таким образом, положение заданных чувствительных участков 6а, 6′а фиксировано друг относительно друга и не зависит от выступов материала и натяжения полотна.

Штриховые линии 50 указывают линии будущего разреза для разделения тест-элементов на полоски, в то время как штриховые линии 51 указывают зеркальную линию заготовки полоски и будущую линию сгиба подложки полотна.

После печати траекторий потока тест-элемента чувствительные участки 6а, 6′а системы распределения пробы покрывают калибровочным составом и составом распознавания. Например, чувствительные участки 6′а нижнего ряда подложки 49 полотна, которые представляют первую поверхность тест-элемента, покрывают калибровочным составом, содержащим репортерный элемент и различные уровни калибровочного соединения; один из калибровочных составов (например, расположенный на участке 6′а1) не содержит калибровочного соединения и обеспечивает показания жидкой среды пробы, тогда как чувствительные участки 6а верхнего ряда подложки 49 полотна, которые представляет вторую поверхность тест-элемента, покрывают составами распознавания, содержащими элемент распознавания, и в особом случае анализа распознавания с помощью апоэнзима также дополнительные части репортерной системы.

Соответственно дополнительный слой накладывается на одну из поверхностей, например поверхность 2а нижнего слоя 2, представляющую центральный слой 52 тест-элемента, как показано на фиг.21б. Центральный слой 52 может быть изготовлен из двухсторонней клейкой ленты или клея-адгезива, который обеспечивает прорывы 5, раскрывающие систему 6 распределения пробы для создания полостей для систем распределения пробы в тест-элементах анализируемого вещества после заключительного этапа сборки.

Тест-элемент по настоящему изобретению затем собирают посредством сгибания двух боковых сторон вдоль зеркальной линии 51, например, с помощью отгибающего аппарата или другого соответствующего оборудования, как показано на фиг.21в, создающего согнутое и ламинированное полотно 53, как показано на фиг.21г. Соответственно можно прижимным валиком плотно соединить центральный слой, нижний и верхний слои.

Наконец, ламинированное полотно 53 вырезают или высекают в изделие нужной формы, тогда как линия 50 переносит примерную форму окончательной тест-полоски на полотно 53 перед разделением. При способе изготовления, показанном на фиг.21, верхняя часть подложки может быть отогнута на нижнюю часть без риска ухудшения фиксации в х-направлении полотна и обеспечивает более простой способ добиться правильной установки первой и второй поверхностей, образующих систему распределения пробы, по сравнению со способом с одним слоем.

Настоящее изобретение обеспечивает систему для определения концентрации клинически доступных и биохимических аналитов, которые имеются в лабораториях, поддерживающих иммунологические или аналогичные аналитические способы анализа сродства, такие как радио-, диффузионный- или иммунологические анализы бокового потока, соответственно анализы иммуносорбентов, связанных энзимом. Обычно анализируемое вещество регистрируют в жидкой среде пробы, такой как кровь, сыворотка, плазма, слюна, моча, интерстициальная и(или) внутриклеточная жидкость. Тест-элемент снабжен встроенной калибровочной системой и системой контроля качества, пригодной для формата тест-полоски с сухими реагентами с очень малым объемом пробы примерно 0,5 мкл. Изготовление тест-элемента по настоящему изобретению не требует выполнения множества технологически сложных операций и позволяет изготавливать недорогие тест-элементы.

1. Тест-элемент для качественного и(или) количественного определения по меньшей мере одного анализируемого вещества в пробе физиологической или водной жидкости, имеющий первую и вторую поверхности (2а и 4а), расположенные на заданном расстоянии друг напротив друга и обе содержащие две, по существу, одинаковые структуры, образующие участки с высокой и низкой поверхностной энергией, выровненные в основном конгруэнтно относительно друг друга, так что участки с высокой поверхностной энергией образуют систему (6) распределения пробы с по меньшей мере двумя чувствительными участками (6а, 6′а), причем по меньшей мере один из чувствительных участков (6а, 6′а) первой и второй поверхностей (2а, 4а) снабжен по меньшей мере одним элементом (32) неэнзиматического распознавания, способным обеспечивать реакцию сродства с упомянутым по меньшей мере одним анализируемым веществом.

2. Тест-элемент по п.1, в котором
n заданных чувствительных участков (6а) первой поверхности (2а) покрыты n калибровочными составами (18), изготовленными из m контрольных составов и n-m составов, содержащих различные уровни калибровочного соединения (33), где n - целое число больше 2, m - целое число равное или больше 1, и n>m, и
n заданных чувствительных участков (6′а) второй поверхности (4а) покрыты составом, содержащим элемент (32) неэнзиматического распознавания.

3. Тест-элемент по п.2, имеющий дополнительный чувствительный участок (6 с) с неспецифическими материалами, которые не содержат ни элемент (32) распознавания анализируемого вещества, ни калибровочное соединение (33), обеспечивая измерение фоновых сигналов.

4. Тест-элемент по п.2, в котором калибровочное соединение (33) идентично или, по существу, эквивалентно анализируемому веществу.

5. Тест-элемент по меньшей мере по п.1, в котором специфический элемент(ы) (32) распознавания иммобилизован(ы) на микрочастицах.

6. Тест-элемент по одному из предшествующих пунктов, в котором состав распознавания и(или) калибровочный состав содержит(ат) репортерный элемент(ы), которые способствуют оптической регистрации/определению анализируемого вещества.

7. Тест-элемент по п.6, в котором репортерным элементом является флуоресцентный краситель.

8. Тест-элемент по п.7, в котором флуоресцентный краситель обладает сродством к элементу распознавания.

9. Тест-элемент по п.7, в котором флуоресцентный краситель обладает сродством к анализируемому веществу.

10. Тест-элемент по п.6, в котором репортерным элементом является флуоресцентный молекулярный ротор.

11. Тест-элемент по п.6, в котором репортерные элементы содержат средство для анализа распознавания с помощью апоэнзима.

12. Тест-элемент по п.11, в котором средство для анализа распознавания с помощью апоэнзима содержит элемент распознавания, апоэнзим, меченый анализируемым веществом коэнзим, подложку, необходимые для голоэнзима и хромогена.

13. Тест-элемент по одному из пп.1-5 или 7-12, в котором элементом (32) распознавания является антитело или фрагменты антитела к анализируемому веществу.

14. Тест-элемент по одному из пп.1-5 или 7-12, в котором специфическим элементом (32) распознавания является нуклеиновая кислота.

15. Тест-элемент по одному из пп.1-5 или 7-12, в котором специфическим элементом (32) распознавания является рецептор анализируемого вещества.

16. Способ изготовления тест-элемента для анализа вещества, включающий следующие шаги:
формирование участков с высокой и низкой поверхностной энергией на нижнем слое (2) с первой поверхностью (2а), причем участки с высокой поверхностной энергией образуют гидрофильную систему (6) распределения пробы с n заданными чувствительными участками (6′а), где
n - целое число больше 2,
формирование соответствующей структуры участков с высокой и низкой поверхностной энергией на верхнем слое (4) со второй поверхностью (4а), покрытие n заданных чувствительных участков (6а) первой поверхности (2а) n калибровочными составами (18), изготовленными из m контрольных составов и n-m составов, содержащих различные уровни калибровочного соединения (33), где n - целое число больше 2, m - целое число равное или больше 1, и n>m,
покрытие n заданных чувствительных участков (6′а) второй поверхности (4а) составом (19) распознавания, содержащим элемент (32) распознавания, и
наложение слоев первой и второй поверхностей на противоположные стороны центрального слоя (3) с вырезом (5), обеспечивающим полость для системы распределения пробы, образованную участками с высокой поверхностной энергией (6, 6′) на первой и второй поверхностях (2а, 4а) нижнего и верхнего слоев (2, 4),
причем элемент (32) распознавания способен обеспечивать реакцию сродства с анализируемым веществом в пробе физиологической или водной жидкости, доставляемой к чувствительным участкам (6а, 6′а).

17. Способ по п.16, в котором участки с высокой поверхностной энергией (6, 6′) создают нанесением гидрофильного состава на первую и вторую поверхности (2а, 4а).

18. Способ по п.16, в котором участки с низкой поверхностной энергией создают нанесением гидрофобного состава на первую и вторую поверхности (2а, 4а).

19. Способ по п.17 или 18, в котором гидрофильный и(или) гидрофобный состав(ы) наносят на первую и вторую поверхности посредством контактной и неконтактной печати, распыления, погружения или плазменного осаждения, в частности, флексографии, литографии, глубокой печати, методов переноса на основу твердого красителя или струйной печати.

20. Способ по одному из пп.16-18, в котором состав распознавания и(или) калибровочный состав(ы) (18, 19) наносят в виде покрытия на чувствительные участки (6а, 6′а) первой и второй поверхности посредством микроконтактной печати, микрораспыления или струйной печати.

21. Способ по одному из пп.16-18, в котором нижний слой (2) и верхний слой (4) формируют из одной гибкой подложки и сгибают вдоль продольной зеркальной линии (45) с охватом центрального слоя (3) таким образом, что гидрофильные структуры (6, 6′), образующие систему распределения пробы с заданными чувствительными участками (6′а, 6а), совмещены и зафиксированы, по существу, конгруэнтно.

22. Тест-система для качественного и(или) количественного определения анализируемого вещества в пробе физиологической или водной жидкости, содержащая
тест-элемент по одному из пп.1-15, в котором
n заданных чувствительных участков (6а) первой поверхности (2а) покрыты n калибровочными составами (18), изготовленными из m контрольных составов и n-m составов, содержащих различные уровни калибровочного соединения (33), и n заданных чувствительных участков (6′а) второй поверхности (4а) покрыты составом, содержащим элемент (32) неэнзиматического распознавания, и где n - целое число больше 2, m - целое число равное или больше 1, и n>m,
устройство регистрации для регистрации изменений оптических свойств физиологической пробы, расположенное на 2n заданных чувствительных участках и обеспечивающее n результатов от 2n заданных чувствительных участков, и
устройство обработки для расчета всех калибровочных коэффициентов полиномиального уравнения калибровки, полученных по п измерениям, и одного коэффициента регрессии для подтверждения качества расчетных калибровочных коэффициентов уравнения калибровки.

23. Тест-система по п.22, содержащая устройство выбора плоскости поляризации.

24. Тест-система по п.23, в котором управление устройством выбора плоскости поляризации осуществляется устройством обработки.

25. Тест-система по п.23 или 24, в котором устройство выбора плоскости поляризации изготовлено по меньшей мере из одного жидкокристаллического блока.

26. Способ качественного и(или) количественного определения по меньшей мере одного анализируемого вещества в пробе физиологической или водной жидкости, включающий:
нанесение жидкости физиологической пробы на тест-элемент по любому из пп.1-15,
присоединение тест-элемента к устройствам регистрации и обработки, регистрацию и соотнесение сигналов, полученных на различных чувствительных участках.