Способ получения биомассы микроорганизмов при биологической утилизации органических соединений в очищаемой среде

Изобретение может быть использовано при биологической очистке воды, почвы и подобных сред от загрязняющих органических соединений произвольного состава и концентраций, а также при утилизации органических отходов производства. Способ включает определение содержания органических соединений в очищаемой среде, селекцию аборигенных микроорганизмов, выделенных из очищаемой среды, внесение полученного консорциума в очищаемую среду с добавлением макроэлементов: азота, фосфора, калия, магния, серы, и микроэлементов: железа, цинка, марганца, молибдена, кобальта, бора, и регулирование физико-химических характеристик перерабатываемой среды. Селекцию микроорганизмов проводят по признаку наибольшей скорости прироста биомассы, содержание кислорода в очищаемой среде поддерживают от 2·10^-3 до 1,4 кг/м³, а рН очищаемой среды поддерживают от 5 до 7,5, причем макро- и микроэлементы вносят с учетом их наличия в очищаемой среде в суммарном количестве (1-8)·10^-3 кг для макроэлементов и 1,1·10^-7-1·10^-5 кг для микроэлементов на 1 МДж полной энергии окисления утилизируемых органических соединений в среде кислорода. Способ обеспечивает детоксикацию загрязняющих органических соединений до уровня ПДК и перевод их в форму, пригодную для полезного использования. 4 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к способам получения полезных веществ из загрязнителей природной среды и химических отходов и может быть использовано при биологической очистке воды, грунта и подобных сред, а также при утилизации отходов производства, например отработанных автомобильных масел.

Из уровня техники известно много способов биологической очистки среды от загрязнителей, например способ биологической утилизации нефтяных загрязнений по пат. РФ №2076150, опубл. 27.03.1997, в котором в качестве культур используют индивидуальные сапрофитные штаммы, способ биологической очистки почвы от загрязнений нефтью и нефтепродуктами по пат. РФ №2191643, опубл. 27.10.2002, пригодный для очистки от ароматических углеводородов высокой концентрации, например, от нефти и нефтепродуктов, при наличии солей тяжелых металлов.

В то же время известно использование органических веществ в биотехнологических процессах в качестве субстратов для выращивания микроорганизмов с целью получения продуктов их жизнедеятельности. К числу используемых веществ относятся углеводы, углеводороды, спирты, белки и другие. В качестве примеров может служить синтез уксусной кислоты штаммами Acetebacter и Gluconobacter с использованием в роли источника углерода и энергии этилового спирта, получение лимонной кислоты с использованием сахарозы или крахмала. Известные белковые препараты паприн и гаприн получают с применением штаммов рода Candida из н-парафинов C₁-С₃₀. Многие другие биотехнологические продукты (антибиотики, витамины, аминокислоты, пищевые добавки и др.) получают, перерабатывая биогенные углеводы: моно-, олиго и полисахариды. Иногда используют техногенные органические отходы, например циклогексин при производстве лизина, индол при биосинтезе триптофана [Биотехнология под ред. А.А.Балева. М. 1988; Елина Н.П. Основы биотехнологии. СПб., 1995; Кефели В.И., Дмитриева Г.А. Биотехнология. Пущино, 1989; Егорова Т.А., Клунова С.Н. Живухина Е.А. Основы биотехнологии. М. 2003].

Известен способ утилизации отходов жизнедеятельности животных и птицы по патенту РФ №2067570, опубл. 09.05.1999. На упомянутых отходах выращивают первичную биомассу, которая, в свою очередь, служит субстратом для выращивания вторичной группы микроорганизмов, которые используют как белково-витаминный корм для животных и птицы. Состав субстрата корректируют по соотношению углерод-азот добавкой гидролизатора лигнина.

Общим недостатком известных способов является ограниченный перечень перерабатываемых сред, представленный нефтью и биогенными продуктами, в то время как загрязнители природной среды, а особенно токсичные техногенные отходы, могут иметь произвольный состав как по природе входящих в них веществ, так и по их количественному соотношению. Способы не предусматривают получение полезных продуктов, либо их перечень ограничен. Эффективность известных способов утилизации мала, так как микроорганизмы-утилизаторы не проходят стадии селекции, из компонентов перерабатываемой среды учитывается только углерод и азот, в то время как другие жизненно важные для деятельности микроорганизмов макро- и микроэлементы не учитываются.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ биологической очистки различных сред от органических веществ и их смесей (Способ биологической очистки грунта и воды от органических соединений алифатического, карбоциклического и гетероциклического рядов и их смесей произвольного состава. Патент РФ №2315670, опубл. 27.01.2008, принят за прототип). В известном способе загрязняющие органические соединения (загрязнители) подвергают биологической утилизации до уровня предельно допустимой концентрации ПДК, обеспечивая благоприятные для жизнедеятельности микрофлоры физико-химические характеристики перерабатываемой среды. Органические соединения превращаются в клеточные вещества микроорганизмов-утилизаторов, воду и углекислый газ, которые включаются в общий цикл круговорота веществ в биосфере. Остатки микроорганизмов под воздействием регуляторных трофических механизмов включается в цикл естественных микробиоценозов, часть их под воздействием сапрофитной микрофлоры превращается в безопасные гумусовые вещества.

Недостатки прототипа.

Вещественный и энергетический потенциал утилизируемых органических соединений в способе-прототипе используется не рационально. Под вещественным потенциалом понимается масса химических элементов, переходящая в состав биомассы микроорганизмов, а под энергетическим потенциалом - количество энергии, которая может быть выделена при полном окислении органических соединений кислородом. Процесс утилизации экспоненциально затухает по мере расходования источников питания, а конечная биомасса микроорганизмов-утилизаторов стремится к минимуму, чтобы не нарушить экологический баланс природной среды.

При реализации способа-прототипа компоненты загрязнителей и компоненты добавок безвозвратно утрачиваются и не могут быть использованы для получения полезных продуктов. Загрязняющие органические соединения утилизируются до углекислого газа и воды, прочие химические элементы образуют формы, имеющие низкую коммерческую ценность: углерод, входящий в состав органических веществ, превращается в углекислый газ, водород в воду, сера в сульфаты, связанный азот в газообразный элементарный азот.

Согласно известному способу в процессе биологической утилизации загрязняющих органических соединений микроорганизмы-утилизаторы проходят стадию размножения, однако при исчезновении источников питания погибают, их концентрация постепенно стремится к фоновому (природному). В способе-прототипе упомянута возможность регулирования конечного содержания биомассы микроорганизмов, однако приведены признаки, обеспечивающие сведение их конечного содержания к минимуму, чтобы предотвратить вторичное (биологическое) загрязнение. По способу-прототипу вещественный и энергетический потенциал смеси органических веществ доступен для ограниченного перечня биологических культур (несколько сотен видов микроорганизмов-утилизаторов), но недоступен для большинства штаммов микроорганизмов-продуцентов, а также для других форм жизни (зоопланктон, насекомые, рыбы, птицы). Состав образующейся биомассы микроорганизмов-утилизаторов не контролируется, и эта биомасса не может быть использована в качестве питательного субстрата для микроорганизмов-продуцентов полезных продуктов.

Вместе с тем, биомасса микроорганизмов-утилизаторов (на пике ее содержания) представляет большую ценность в роли объекта биологической или технической трансформации или иного использования. Перерабатываемые микроорганизмами органические соединения обычно присутствуют в почве, воде и подобных средах в форме химических загрязнителей, но сюда же следует отнести и химические отходы производства. При постановке задачи изобретения к числу загрязнителей отнесены органические вещества, проникшие в окружающею среду и находящиеся в ней в концентрациях, превышающих ПДК, а к числу отходов - органические вещества, исключенные или недоступные более для технологического процесса. Обычно такие отходы накапливают в отстойниках или на токсичных полигонах и хранят в изолированных от природной среды условиях при концентрациях, на несколько порядков выше ПДК. В обоих случаях в целях заявленного изобретения почва, вода и подобные им среды, содержащие органические загрязнители, а также непосредственно отходы или их смеси выступают в качестве объекта переработки и обобщенно именуются перерабатываемой средой, а качественный состав этой среды и концентрация органических соединений не лимитируется.

Целью изобретения является более рациональное использование органических веществ, входящих в состав перерабатываемой среды, обеспечивающее получение полезных продуктов.

Технической задачей изобретения является биологическая детоксикация загрязняющих органических соединений и их смесей до уровня ПДК с переводом этих веществ в форму, пригодную для полезного использования. Другими словами, поставлена задача трансформировать физическую массу загрязнений в биомассу микроорганизмов, которая может быть выделена и использована либо непосредственно как продукт или сырье, либо в качестве питательного субстрата для широкого круга биосистем.

Поставленная задача решается тем, что в способе биологической утилизации органических соединений и их произвольных смесей, включающем определение содержания органических соединений в перерабатываемой среде, селекцию аборигенных микроорганизмов, внесение их в перерабатываемую среду с добавлением макро- и микроэлементов и регулирование физико-химических характеристик перерабатываемой среды упомянутые микроорганизмы дополнительно селектируют по признаку наибольшей скорости прироста биомассы, количество вносимых активирующих макро- и микроэлементов регулируют относительно энергии загрязняющих органических соединений, а процесс биологической утилизации проводят в режиме наращивания конечной биомассы упомянутых микроорганизмов. Для этого обеспечивают суммарное содержание в перерабатываемой среде азота, фосфора, калия, магния, серы в пределах (1-8)·10^-3 кг на 1 МДж энергии органических соединений с учетом их наличия в среде, суммарное количественное содержание железа, цинка, марганца, молибдена, кобальта, бора - в пределах 1,1-10^-7-1·10^-5 кг на 1 МДж энергии органических соединений с учетом их наличия в среде. Контролируя процесс, снижают концентрацию загрязняющих органических соединений до уровня ПДК, после чего накопленную биомассу используют как ценный биологический продукт, а именно либо оставляют в перерабатываемой среде и используют в качестве удобрения, либо выделяют и используют в качестве биотехнологического сырья или в качестве многоцелевого субстрата для выращивания микроорганизмов-продуцентов полезных продуктов.

Как указано выше, под упомянутым энергетическим потенциалом загрязнителей понимается количество энергии, выделяемой при их полном окислении в атмосфере кислорода, т.е. при переводе углерода в СО₂, водорода в H₂O, серы в SO₄ и т.д.

Способ по изобретению состоит из следующих этапов: а) селектирование микроорганизмов; b) внесение их в перерабатываемую среду; с) внесение веществ-активаторов; d) создание условий, оптимальных для выращивания биомассы микроорганизмов; е) использование полученной биомассы.

Признаки изобретения, общие с прототипом:

- для селекции используют аборигенные микроорганизмы;

- при селекции микроорганизмов выделяют консорциум, способный интенсивно утилизировать целевые (имеющиеся в наличии) органические соединения;

- микроорганизмы вносят в перерабатываемую среду в количестве 0,001 до 30 кг/м³;

- в качестве активирующих добавок используют азот, фосфор, калий, магний и серу;

- корректируют физико-химические показатели среды, в которой работают микроорганизмы.

При решении технической задачи обеспечивают режим прироста биомассы вплоть до момента окончания процесса утилизации. Для этого используют существенные признаки, отличающие заявленное изобретение от прототипа:

- микроорганизмы дополнительно селектируют по признаку скорости синтеза биомассы и выделяют наиболее продуктивный консорциум;

- количественное содержание макро- и микроэлементов увязывают с энергетическим потенциалом перерабатываемых органических соединений;

- макроэлементы добавляют из расчета (1-8)·10^-3 кг на 1 МДж энергии загрязняющих органических соединений;

- микроэлементы добавляют из расчета 1,1·10^-7-1·10^-5 кг на 1 МДж энергии загрязняющих органических соединений;

- накопленную биомассу микроорганизмов-утилизаторов используют в качестве биотехнологического продукта.

Данные об энергетическом потенциале загрязнителей, необходимые для расчета количества добавок в заявленных пределах, содержатся в химических справочниках (см., например, «Краткий химический справочник» под ред. В.А.Рабиновича. Изд-во «Химия». Л., 1977).

Перечисленные условия необходимы и достаточны для непрерывного увеличения биомассы микроорганизмов-утилизаторов от момента внесения до момента утилизации загрязняющих органических соединений. Однако применительно к конкретным техническим задачам некоторые признаки могут быть конкретизированы.

В частности, при утилизации загрязнений до уровня ПДК наращивание биомассы более эффективно при выполнении следующих условий:

- при соотношении макроэлементов в пределах N:Р:К:Mg:S=(6-14):(1-3):(1-3):(0,01-0,1):(0,05-0,2);

- при соотношении микроэлементов в пределах Fe:Zn:Mn:Mo:Co:В=(1-5):(0,1-2,2):(0,1-2,4):(0,1-0,6):(0,01-0,4):(0,01-0,3);

- при содержании кислорода в среде в пределах от 2·10^-3 до 1,4 кг/м³;

- при концентрации солей щелочных и щелочноземельных металлов в перерабатываемой среде не выше 380 кг/м³;

- при концентрации солей тяжелых металлов в перерабатываемой среде не выше 180 кг/м³;

- в ряде случаев концентрацию солей тяжелых металлов до требуемого уровня можно понизить методом электролиза;

- если продукты электролиза ингибируют процесс размножения микроорганизмов, электроды можно изолировать мембранами;

- если концентрация органических соединений слишком велика (например, отходы химпроизводства), для удобства можно добавить нейтральный наполнитель (например, песок).

Полученная биомасса микроорганизмов-утилизаторов может быть использована, в частности, для выделения тяжелых металлов, получения биогаза, рибофлавина, лизина, связанного азота, средств защиты растений. Кроме того, биомасса может быть оставлена в почве в качестве азотного или иного удобрения и микроэлементов, а также выделена и использована в качестве источника питания для многоклеточных организмов и животных или сожжена в целях консервации углерода.

Селекцию аборигенных микроорганизмов после взятия проб проводят в три этапа следующим образом. На первом этапе на твердых средах выделяют микроорганизмы, способные усваивать перерабатываемые органические соединения. Такие виды всегда присутствуют в загрязненной среде. На втором этапе из выделенной колонии микроорганизмов на твердых средах проводят засев для периодического культивирования. Питательную среду готовят в лабораторных условиях, используя утилизируемые органические соединения и активирующие минеральные компоненты. Для дальнейшей работы оставляют только те виды, которые дают наибольший прирост биомассы в пересчете на 1 МДж энергии органических соединений, для чего проводят селекцию по двум показателям: по скорости размножения и по продуктивности биомассы. Последний показатель зависит от жизнестойкости вида и условий среды обитания. Селекцию проводят с применением проточной системы культивирования, работающей в режиме хемостата. Ферментёр хемостата засевают культурами, выделенными на втором этапе. Ступенчато повышая скорость протока питательной среды и контролируя концентрацию организмов, выделяют культуры, совмещающие высокую скорость размножения с высокой биопродуктивностью. Непригодные для решения поставленной задачи микроорганизмы вымываются их системы. В результате селекции получают уникальный для решаемой задачи консорциум, который размножают в требуемом количестве.

На практике по мере включения микро- и макроэлементов в биомассу за время t происходит неуклонное снижение концентрации активирующих добавок как обязательных строительных компонентов для прироста биологической массы m. В силу этого показатель dm/dt может стремиться к нулю или принимать отрицательное значение, как это происходит в способе-прототипе. На основе закономерностей процессов метаболизма и микробиологических экспериментов нами определены и введены в формулу изобретения диапазоны общего количества добавок и интервалы их относительного содержания, обеспечивающие dm/dt>0 и наибольший выход биомассы. Теоретически на 1 МДж энергии, заключенной в утилизируемом органическом соединении, можно получить на выходе не более 3,4·10^-2 кг сухой биомассы. Опытным путем установлено, что при найденных диапазонах кислотности, содержания кислорода и активирующих добавок обеспечивается стабильный выход биомассы микроорганизмов в количестве (1,1-3,4)·10^-2 кг/МДж, или 30-100% от возможного в пересчете на абсолютно сухой вес. Часть энергетического потенциала органики в процессе биосинтеза переходит в тепло, часть вещественного потенциала в формы, которые невозможно использовать, а указанный диапазон характеризует эффективность и КПД процесса.

В силу физико-химических особенностей некоторых органических соединений их утилизация протекает при малой скорости размножения микроорганизмов. При низких значениях удельной скорости прироста биомассы, а именно при времени удвоения числа клеток примерно 70 часов, вещественный и энергетический потенциал веществ расходуется не на накопление биомассы, а на поддержание жизни клеточных организмов, что снижает общий экономический коэффициент по источникам углерода и энергии. Кроме того, в перерабатываемой среде всегда имеются какие-либо ингибирующие факторы, которые следует устранить или скорректировать, поэтому для грамотного использования способа необходимо учитывать общие сведения по микробиологии. Для повышения конечного выхода биомассы среду оптимизируют по таким показателям, как содержание макро- и микроэлементов на единицу энергетического потенциала органики, концентрация солей щелочных, щелочноземельных и тяжелых металлов, массовое содержание кислорода, кислотность. Опытным путем нами установлено, что для быстрого и стабильного прироста биомассы необходимо поддерживать содержание кислорода в реакционной зоне от 2-10^-3 до 1,4 кг/м³ при кислотности рН 5-7,5. Источники макро- имикроэлементов могут быть не только внешние, но и внутренние. При внесении активирующих добавок в указанных выше количествах и соотношениях обязателен учет их содержания в перерабатываемой среде. Температуру выбирают выше нуля, преимущественно 15-35°С. При отклонении от указанных параметров биохимический состав произведенной биомассы становится обедненным, несбалансированным, и для использования ее в качестве универсального субстрата требуется дополнительная коррекция, что снижает экономический эффект от применения способа.

Способ осуществляют следующим образом:

а) культивируют требуемый консорциум микроорганизмов-утилизаторов; b) вносят его в перерабатываемую среду; с) вносят активирующие добавки в количестве, обусловленном энергетическим потенциалом перерабатываемой органики; d) корректируют физико-химические характеристики среды; е) выращивают микроорганизмы в режиме накопления биомассы. Процесс завершают при снижении концентрации органических соединений до уровня ПДК. Дальнейший прирост биомассы незначителен, и через определенное время биомасса начинает уменьшаться. В этот момент микроорганизмы-утилизаторы могут быть выделены из очищаемой среды. Использование такого показателя, как удельный энергетический потенциал органических соединений в МДж/кг позволяет дозировать требуемое количество активирующих добавок и рассчитать валовый выход биомассы. Для выделения биомассы микроорганизмов из жидкой среды используют следующие способы. а) Выделение методом центрифугирования. Очищенный объем жидкости подвергается центрифугированию при 5000-6000g в течение 10-15 минут. Выделяется 90-95% биомассы. б) Выделение методом флотации. Подбирается флотирующий агент, смачивающий поверхность клеток. После продувки воздухом биомасса концентрируется в образовавшейся пене. в) Выделение методом электрофореза. Если клетки микроорганизмов имеют электрический заряд, то при создании электрического потенциала, достаточного для перемещения микроорганизмов, биомасса концентрируется у электрода соответствующей полярности. г) Выделение методом осаждения с использованием гелеобразующих веществ. Способ применяется, в частности, для очистки питьевой воды от взвешенных частиц. В среду, содержащую микроорганизмы, добавляют Al₂(SO₄)₃ в дозах 10^-2 - 1 кг на 1 м³. Образуется студенистый осадок, увлекающий микроорганизмы на дно. д) Выделение методом изменения градиента плотности. Сырая биомасса имеет удельный вес 1,05-1,10 т/м³. При увеличении плотности вмещающей среды за счет добавления растворимых солей биомасса всплывает и собирается в плавающем слое. е) Выделение методом фильтрования. Для отделения биомассы от очищаемой среды используют бактериальные фильтры.

Для выделения микроорганизмов из твердой среды (почва, грунт, наполнитель) ее разжижают водой до текучего состояния, осаждают минеральные компоненты, затем применяют один из вышеперечисленных методов или их сочетание.

Пример 1 поясняет порядок учета энергетического потенциала при расчете количества активирующих добавок и выхода биомассы. Имеется 4 т смеси органических соединений: ацетон, дизельное топливо, изоамилацетат, толуол, по 1 т массы каждого. В справочниках находим суммарную величину энергетического потенциала перечисленных компонентов (10³ МДж): ацетон 31,5; дизельное топливо 44; изоамилацетат 33,5; толуол 42,5. Всего 151,5·10³ МДж. Согласно изобретению, масса макродобавок составит от 151,5·10³ МДж · (1·10^-3) кг/МДж до 151,5·10³ МДж · (8·10^-3) кг/МДж, или от 0,151 до 1,21 т, масса микроэлементов незначительна. Теоретически всю массу органики и добавок (4 т + 1,21 т) можно перевести в биомассу микроорганизмов. В данном примере выход сухой биомассы с учетом потерь составит 151,5·(1,1·10^-2-3,4·10^-2) т или от 1,67 до 5,15 тонн. При ином количестве активирующих добавок или их отсутствии процесс нестабилен, выход биомассы меньше расчетного, КПД способа низок.

Следующий пример демонстрирует обеспечение биологической доступности энергетического и вещественного потенциала утилизируемых органических соединений для микроорганизмов-продуцентов полезного продукта.

Пример 2. Требуется получить средство защиты растений (предпосевного обеззараживания семян зерновых культур) на базе грибов Trichoderma harzianum. Имеется водный раствор общим объемом 5 м³ с произвольным содержанием загрязняющих соединений (кг/м³): фенол 1,3; диоксан 0,6; анилин 0,4; тиофен 0,21. Представители вида Т.harzianum не способны усваивать перечисленные вещества. По этой причине согласно изобретению применяют консорциум микроорганизмов-утилизаторов, способный усваивать данные вещества, а их биомассу используют для производства полезного продукта.

Решение: на первом этапе к водной смеси добавлены селектированные микроорганизмы-утилизаторы, минеральные соли NH₄NO₃, (NH₄)₂HPO₄, KCl, Na₂SO₄, MgCl₂ и микроэлементы в расчетном количестве. Выросшая на смеси органических соединений биомасса выделена из среды при помощи центрифуги. Поскольку грибы вида T.harzianum обладают высокой ферментативной активностью и способны усваивать биополимеры, то можно ограничиться поверхностной дезинтеграцией микроорганизмов-утилизаторов с разрушением клеточных оболочек. Влажную биомассу с содержанием воды 70 % подвергали тепловой обработке в автоклаве при 110°С в течение 1 часа. Биомасса, подвергнутая термодеструкции, разбавлялась стерильной водой в отношении 1:9. После внесения инокулята в дозе 0,5 г на 1 литр субстрата проводили выращивание T.harzianum в условиях глубинной аэрации 100 литров воздуха на 1 литр среды в час при температуре 25°С и рН 6,5. Процесс продолжается 120 часов. Анализ показал, что субстрат из биомассы утилизаторов содержит весь набор источников питания, необходимых для размножения грибов вида T.harzianum и не нуждается во внесении каких-либо дополнительных веществ.

Следующий пример характеризует подход, при котором часть полезных продуктов выделяется, а часть используется в переработанной среде.

Пример 3. Поставлена задача получить полезные продукты при очистке почвы от отходов нефтехимического производства. Загрязнения представлены сульфатокислотами, углеводородами и толуолом в отношении (кг/т) 16:11:0,1. Решение: смесь органических соединений подвергают утилизации по описанной выше схеме с участием микроорганизмов-мезофилов. После снижения концентрации загрязнителей до уровня ПДК слой почвы, насыщенный микроорганизмами, обрабатывают в анаэробных условиях, например, в емкости. Микроорганизмы-мезофиллы, выступавшие в роли утилизаторов, подвергают ферментативному лизису при температуре 50-60°С, вносят термофильные метанобразующие микроорганизмы, полученные продукты лизиса становятся объектом метанового брожения. Отходящие газы состоят на 90-95 % из метана, углекислого газа и азота. Полученный биогаз может быть использован в виде топлива или для органического синтеза. Образующийся твердый остаток является источником азота, фосфора, калия, магния и микроэлементов и может быть использован в качестве органического удобрения для увеличения плодородия почвы.

Пример 4 показывает, как без применения дорогостоящего оборудования накапливать рабочий объем микроорганизмов для утилизации больших объемов загрязняющих органических соединений или отходов. Для выполнения крупномасштабной работы - очистки от загрязнителей площадки 18 га - требуется большое количество микробиологической культуры. Территория загрязнена нефтью - 120 кг на 1 т грунта, а также буровыми отходами. Состав буровых отходов: сайпан, габройл, карбоксиметилоцеллюлоза, полипак, суперфлюс, экопак, прасстол, клеар. Общее содержание перечисленных соединений 1,6 кг на 1 т грунта. Грунт также загрязнен пластовыми водами с содержанием солей 18 кг на 1 т грунта. Решение: в лабораторных условиях получен консорциум, способный утилизировать нефть и буровые присадки при указанном уровне засоленности. Методом периодического культивирования за 8 суток выращено 1 кг культуры. Затем на месте проведения работ подготовлена микробиологическая плантация в виде грунтовых грядок и созданы условия для размножения микроорганизмов в грунте на плантации. Грядки в определенном режиме поливают культурой, минеральными удобрениями, нефтью, раствором буровых присадок, пластовой водой. Процесс отслеживают количественно с применением аналитического оборудования. Время удвоения биомассы составило 8-12 часов. Через 4 суток получена смесь с концентрацией микроорганизмов 50 кг/м³, т.е. в 20 м³ грунта содержится более 1000 кг биомассы, что достаточно для выполнения работ по очистке территории.

Примеры 5-9 характеризуют получение различных полезных продуктов из одной смеси органических соединений.

Пример 5. Получение связанного азота. В опыте использована жидкая смесь произвольных органических соединений: в 1 м³ воды содержатся изоамилацетат 1,6 кг; фуран 0,23 кг; резорцин 0,18 кг; толуол 0,11 кг; дизельное топливо 0,09 кг. В смесь вносят селектированные микроорганизмы - азотфиксаторы, усваивающие эти вещества, в дозе 0,11 кг/м³. Вносятся также активирующие добавки, не содержащие азота и обеспечивающие физиологический баланс азотфиксаторов: источник фосфора - NaH₂PO₄, источник калия - KCl, источник магния - MgCl₂, источник серы - Na₂SO₄, микроэлементы Fe, Zn, Mn, Mo, В, Co в соотношениях признаков изобретения. Процесс утилизации загрязнителей до уровня ПДК протекает в условиях аэрации кислородсодержащим газом при рН 5,8-7,2. В итоге получается нетоксичный раствор, содержащий большое количество связанного азота, находящегося как в растворенном виде, так и входящего в белково-нуклеиновый комплекс клеток. После дезинтеграции биомассы она может быть использована как азотсодержащий источник питательных элементов, например, при гидропонном выращивании растений.

Пример 6. Получение лизина. В водную систему вносят консорциум микроорганизмов, селектированный на указанных в примере 5 органических соединениях, в дозе 0,2 кг/м³. Вводятся источники N, Р, К, Mg, S. Выращенную биомассу отделяют от культуральной жидкости. После кислотного гидролиза и нейтрализации избытка кислоты проводят посев культуры, являющейся продуцентом лизина, например Brevibacterium flavum. Поскольку микроорганизмы вида Brevibacterium flavum обладают недостаточной литической активностью, проводят такую дезинтеграцию, при которой достигается деполимеризация биополимеров до уровня моно- и олигомеров, после чего питательная среда становится легкодоступной для микроорганизмов - продуцентов лизина. Применение микробной биомассы в качестве субстрата выгодно в том отношении, что в питательную среду не нужно вносить макро- и микроэлементы и факторы роста, в данном случае биотин, так как они в достаточном количестве содержатся в продуктах гидролиза.

Пример 7. Получение рибофлавина - витамина В₂. Выращенную по примеру 5 биомассу микроорганизмов-утилизаторов подвергают температурной деструкции при автоклавировании. Полученный субстрат засевают продуцентом рибофлавина, например Bacillus subtilis. Процесс накопления рибофлавина протекает в известном режиме. В данную систему также нет необходимости вносить факторы роста и минеральные компоненты.

Пример 8. Получение биогаза. Выращенная по примеру 5 биомасса помещается в анаэробные условия с температурным оптимумом 50-60°С, где разводится метанобразующая термофильная культура, например Metanospilum. Полученный метан используют, например, как топливо.

Пример 9. Водоем загрязнен смесью органических соединений того же состава, что и в примерах 5-8, однако концентрация веществ в тысячу раз ниже. После биологической утилизации извлечение биомассы микроорганизмов-утилизаторов не выгодно из-за их малой концентрации. По этой причине в водоем внесен зоопланктон. Объектом его питания являются микроорганизмы-утилизаторы, а сам зоопланктон является пищей для личинок беспозвоночных и рыб. Тем самым в очищенном водоеме сформирована схема полезной пищевой цепи.

Из примеров 5-8 видно, что одна и та же смесь органических веществ или ей подобная может выступать в качестве питательного субстрата для получения самых различных биотехнологических продуктов. Возможно и обратное явление - получение из различных источников одинаковых продуктов. Необходимо отметить, что субстрат, полученный из биомассы микроорганизмов-утилизаторов, доступен для переработки и обычными ферментными препаратами, без участия клеточных систем.

Микроорганизмы-азотфиксаторы способны утилизировать почти все органические соединения, за исключением галоидсодержащих. Однако само наличие галоидсодержащих веществ в среде не препятствует процессу азотфиксации. При этом энергетический потенциал загрязняющих органических веществ используется для перевода атмосферного азота в связанную форму, усваиваемую растениями.

Пример 10 поясняет комплексное применение способа для очистки среды с получением полезного продукта и демонстрирует обеспечение биологической доступности загрязняющих органических соединений для растений. Требуется очистить почву, загрязненную органическими веществами, и повысить в ней содержание усваиваемого растениями азота. Пример загрязнений: мета-крезол 0,8 кг; фенол 1,2 кг; нафталин 0,4 кг; ДДТ 0,22 кг на 1 т почвы. Эти загрязнения не содержат азота, а ДДТ является высокотоксичным галоидсодержащим соединением. Решение: селектируют микроорганизмы-азотфиксаторы, усваивающие крезол, фенол и нафталин, и вносят их в очищаемую среду в количестве 4·10^-2 кг на 1 т очищаемой почвы. Кроме того, селектируют и вносят в очищаемую среду микроорганизмы-деструкторы ДДТ, в количестве по 2·10^-2 кг на 1 т очищаемого грунта. На 1 т грунта добавляют 1 кг суперфосфата, 1 кг хлорида калия, 0,1 кг хлорида магния, 0,1 кг сульфата натрия, 0,01 кг соединений, содержащих Fe, Zn, Mn, Mo, Co, В. В процессе утилизации органических соединений азотфиксаторами на каждый 1 МДж энергии загрязнителей синтезировали 6·10^-3 кг связанного азота в пересчете на ион NH₄. Поскольку биодеструкция ДДТ протекает поэтапно, с образованием фрагментов, не содержащих галогены, то энергетический потенциал ДДТ частично используется микроорганизмами-азотфиксаторами. В свою очередь азот, образовавшийся в почве, обеспечивает потребность в этом элементе микроорганизмов-деструкторов ДДТ. Однако в данном процессе образуется аммонийная форма азота, которая неустойчива и обладает высокой летучестью. Для фиксации азота в очищаемую среду добавляют нитрофиксатор - биотехнологический штамм, переводящий неустойчивый ион (+NH₄) в устойчивый (-NO₃). По завершении процесса почва не только очищена, но обогащена источниками связанного азота, доступного для древесно-травяной растительности. Как показали опыты, урожайность зерновых культур увеличилась на 10% в сравнении с контролем, что полностью окупает биотехнологические операции.

Примеры 11-13 поясняют организацию полезных пищевых биосхем.

Пример 11. Обеспечение доступности загрязняющих органических соединений для зоологических объектов. Серая лесная почва загрязнена смесью следующих органических соединений: нафтиламин, пиран, ризоцин, авиационный керосин. Содержание веществ 0,32; 0,46; 2,1; 1,3 кг на 1 тонну почвы соответственно. После микробиологической деструкции в почву, насыщенную биомассой микроорганизмов, запустили дождевых червей, в количестве 1000 особей на 1 м³. Питаясь микроорганизмами, черви размножались и наращивали свою биомассу. Дождевые черви, в свою очередь, поедаются птицами и грызунами. Следовательно, вещественно-энергетический потенциал загрязняющих органических веществ переведен в форму, доступную для зоологических объектов.

Пример 12. Формирование видового состава в экологических системах. Почва загрязнена, например, мазутом, о-ксилолом и фенолом. Концентрация загрязнений по 0,8 кг на 1 тонну грунта. Согласно признакам изобретения внесены микроорганизмы-утилизаторы (в данном случае - клубеньковые азотфиксаторы), макро- и микроэлементы, за исключением источника азота. Территория засеяна смесью семян растений, относящихся к злакам, крестоцветным и бобовым. Так как клубеньковые азотфиксаторы в основном концентрируются на корневой системе бобовых, это позволило бобовым стать доминирующими растениями в данной экологической системе. В данном частном случае микроорганизмы-утилизаторы преобразуют загрязняющие органические соединения в источник азота для бобовых растений.

Пример 13. Регулирование биоценоза и организация полезной пищевой биосхемы. Вода в двух замкнутых водоемах загрязнена диоксаном, монометиловым эфиром этиленгликоля, бензойной кислотой. Содержание каждого вещества 10^-1 кг на 1 м³. Аборигенную микрофлору селектировали описанным выше способом. Утилизацию органических соединений проводили в двух кислородных режимах: в первом водоеме при содержании кислорода 6·10^-3 кг на 1 м³, во втором водоеме при содержании кислорода 2·10^-2 кг на 1 м³. Утилизация загрязнителей протекает одинаково, однако при различном содержании кислорода в заявленном диапазоне видовой состав вторичных биоценозов различен. При минимальном содержании кислорода формируется пищевая цепочка микроорганизмы - беспозвоночные - амфибии. При умеренном содержании кислорода 2·10^-2 кг на 1 м³ его становится достаточно для разведения рыб, поэтому вместо амфибий доминирующими позвоночными в данном биоценозе становятся рыбы.

Пример 14. Консервация углерода.

Одной из причин глобального потепления является ежегодный выброс в атмосферу нескольких миллиардов тонн двуокиси углерода. Свою долю вносит разложение загрязняющих органических веществ и токсичных отходов. Полезно снижение интенсивности потока СО₂ в атмосферу, что достигается консервацией углерода. Для этого биомассу, выращенную на смеси органических соединений по любому из приведенных примеров, подвергают термодеструкции, например нагреву до 600°С. Биомасса разлагается с образованием элементарного углерода (сажа), воды, азота, минеральных солей. Полученный таким способом углерод может храниться бесконечно долго, т.е. консервируется и изымается из оборота СО₂ в природе.

Пример 15. Получение биомассы при наличии солей тяжелых металлов. Утилизация органических соединений, например спиртов и альдегидов спиртов алифатического ряда, с одновременным наращиванием органической массы для питательных субстратов иногда затруднена из-за высокой концентрации тяжелых металлов. Содержанием солей тяжелых металлов 180 кг/м³ и выше ингибирует процесс. Использование веществ-осадителей тяжелых металлов не всегда оправдано, так как токсичные объемные осадки включают в себя и часть выращенной биомассы, что приводит к потере ценного биологического сырья. По этой причине целесообразно применить электролиз среды. Электролиз ведут постоянным или пульсирующим током, используя электроды из биологически нейтрального и нерастворимого в воде материала, например угля, графита. Изменяя напряжение тока в цепи, последовательно осаждают тяжелые металлы на катоде, начиная с металла, имеющего наименьший потенциал восстановления. Прирост биомассы может прекратиться, если восстановление приводит к образованию токсичных для микроорганизмов веществ, например хлора, брома и др. В этом случае соответствующий электрод изолируют от основного объема перерабатываемой среды, например заключают электрод в полупроницаемую мембрану.

При переходе части тяжелых металлов в биомассу микроорганизмов область применения получаемых питательных субстратов ограничена из-за их токсичности. Для очистки биомассы ее подвергают дезинтеграции при температуре кипения. Химически устойчивые комплексы тяжелых металлов с биоорганическими веществами клетки разрушают, проводя дезинтеграцию в кислой среде и переводя тяжелые металлы в водорастворимые соли. Затем нейтрализуют кислоты и электролитическим методом очищают многоцелевой субстрат от тяжелых металлов. Очевидно, при достаточно большом содержании тяжелых металлов заявленный способ экономически оправдан и для получения тяжелых металлов, преимущественно редких.

Пример 16. В воде растворены глюкоза, глицерин, этанол по 0,5 кг на 1 м³ с присутствием сульфата меди 5 кг/м³, сульфата цинка 22 кг/м³. Необходимо переработать органические соединения в биомассу, перевести биомассу в субстрат и очистить его от тяжелых металлов. Решение: в емкость помещают микроорганизмы-утилизаторы, активирующие добавки, обеспечивают аэрацию воздухом или кислородом, регулируют кислотность. После завершения утилизация органических соединений до уровня ПДК биомассу микроорганизмов отделяют центрифугированием. К биомассе добавляют 1%-ный раствор серной кислоты в отношении 9 объемов раствора H₂SO₄ на 1 объем биомассы. Смесь прогревают в течение 30 минут при 100°С, затем кислоту нейтрализуют раствором NaOH до рН 7. Вводят угольные электроды и подают напряжение 2V при силе тока 25А. На катоде осаждаются цинк и медь. После снижения концентрации цинка и меди до уровня ПДК питательный субстрат используют для производства полезного продукта.

Таким образом, для решения технической задачи совмещают два условия: снижение концентрации органических соединений до уровня ПДК и выход максимального количества биомассы. Выращенная на утилизируемых органических соединениях биомасса микроорганизмов-утилизаторов может быть использована, по крайней мере, тремя путями. Во-первых, она может быть оставлена в почве или воде в форме удобряющих компонентов, повышающих ее плодородие или продуктивность. Во-вторых, будучи выделена, биомасса может быть использована в качестве универсального биологического субстрата для жизнедеятельности большинства микроорганизмов-продуцентов. В этом случае организуют биоцикл, в котором массу и энергию загрязнителей трансформируют в биомассу посредников, т.е. микроорганизмов-утилизаторов, которую, в свою очередь, используют для питания микроорганизмов-продуцентов. На выходе получают полезный продукт, например рибофлавин, метан, связанный азот и др. Наконец, биомасса микроорганизмов-утилизаторов пригодна для прямого технологического использования, например для ферментирования, сжигания в целях консервации углерода, выращивания зоопланктона, в форме кормов для животных и пр.

Преимущества способа получения и использования биомассы микроорганизмов по изобретению. В силу своей многофункциональности заявленный способ имеет экономический, экологический и социальный аспекты. Решена задача не просто утилизировать органические соединения в воду, СО₂, тепло, как в аналогах и прототипе, но полностью перевести вещественный и энергетический потенциал вредных/бесполезных органических соединений в форму, пригодную для дальнейшего использования. Способ обеспечивает преобразование любых токсичных органических соединений, в том числе при наличии тяжелых металлов, в биомассу микроорганизмов с последующим переводом ее в универсальный субстрат, пригодный для выращивания микроорганизмов-продуцентов. Помимо синтеза полезных биотехнологических продуктов способ позволяет снизить выбросы в атмосферу двуокиси углерода, получить из биомассы тяжелые металлы или биотопливо. Возможен перевод биомассы микроорганизмов в биомассу другой биологической формы, пригодной для питания животных (рыбы, птицы), т.е. способ позволяет сформировать заданные экологические взаимоотношения между биологическими видами, организовать полезные пищевые биосхемы.

Источники информации

1. Биотехнология // Под ред. А.А.Балева. М., 1988.

2. Патент РФ №2067570, опубл. 09.05.1999.

3. Патент РФ №2315670, опубл. 27.01.2008 (прототип).

1. Способ получения биомассы микроорганизмов при биологической утилизации органических соединений в очищаемой среде, включающий определение содержания органических соединений в очищаемой среде, селекцию аборигенных микроорганизмов, выделенных из очищаемой среды, внесение полученного консорциума в очищаемую среду с добавлением макроэлементов: азота, фосфора, калия, магния, серы и микроэлементов: железа, цинка, марганца, молибдена, кобальта, бора и регулирование физико-химических характеристик перерабатываемой среды, отличающийся тем, что селекцию микроорганизмов проводят по признаку наибольшей скорости прироста биомассы, содержание кислорода в очищаемой среде поддерживают от 2·10^-3 до 1,4 кг/м³, а рН очищаемой среды поддерживают от 5 до 7,5, причем макро- и микроэлементы вносят с учетом их наличия в очищаемой среде в суммарном количестве (1-8)·10^-3 кг для макроэлементов и 1,1·10^-7-1·10^-5 кг для микроэлементов на 1 МДж полной энергии окисления утилизируемых органических соединений в среде кислорода, при этом при получении биомассы азотофиксирующих микроорганизмов азот не вносят.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что относительное массовое соотношение упомянутых макроэлементов выбирают в пределах N:P:K:Mg:S=(6-14):(1-3):(1-3):(0,01-0,1):(0,05-0,2), относительное массовое соотношение упомянутых микроэлементов выбирают в пределах Fe:Zn:Mn:Mo:Co:B=(1-5):(0,1-2,2):(0,1-2,4):(0,1-0,6):(0,01-0,4):(0,01-0,3).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что засоленность очищаемой среды солями щелочных и щелочноземельных металлов не выше 380 кг/м³, а засоленность солями тяжелых металлов не выше 180 кг/м³.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что концентрацию солей тяжелых металлов в очищаемой среде снижают электролизом.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что осуществляют защиту микроорганизмов-утилизаторов от продуктов электролиза путем окружения электродов полупроницаемыми мембранами.