Питательная среда для культивирования энтомопатогенных грибов
Владельцы патента RU 2421512:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет (RU)
Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при защите растений. Питательная среда содержит измельченные личинки синантропных мух (живые), древесные опилки и пшено при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить выход биомассы энтомопатогенных грибов и биологическую активность грибов по отношению к живым насекомым-вредителям. 2 табл.
Предлагаемое изобретение относится к сельскому хозяйству и предназначено для биологической защиты культурных растений от вредителей.
В связи с напряженной экологической обстановкой приоритетное значение в настоящее время приобретают биологические методы контроля численности вредителей растений. Одним из направлений биозащиты является использование энтомопатогенных грибов. Энтомопатогенные грибы обладают способностью в естественных условиях заражать вредных насекомых и клещей, могут вызывать их массовые заболевания и гибель (эпизоотии). Кроме того, грибы способны расти на искусственных питательных средах (ПС), что позволяет создавать на их основе биологические препараты.
Известна питательная среда, принятая за аналог. В частности, энтомопатогенные грибы - продуценты биопрепаратов (Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., Metarhizium anisopliae (Metch.) Sor. и др.) - культивируют на твердой ПС, в состав которой входят размолотые пшено и отруби в соотношении 2:1 (Огарков Б.Н., Огаркова Г.Р. Энтомопатогенные грибы Восточной Сибири. - Иркутск, 2000. - С.134).
Однако многократные пересевы грибов на ПС приводят к постепенному снижению их патогенности (Аванесов С.Г. Проявление ферментативной активности как фактора вирулентности гриба Verticillium lecanii при культивировании. // Экологические проблемы защиты растений: тез. докл. конф. молодых ученых. - Л., 1990. - С.217; Thomas P.Hayden, Bidochka M.J., Khachatourians G.G. Entomopathogenicity of Several Fungi toward the English Grain Aphid (Homoptera: Aphididae) and Enchancement of Virulence with Host Passage of Paecilomyces farinosus // J. Econ. Entomol., 1992. - №1. - P.58-64).
Для сохранения патогенных свойств грибов прибегают к пассированию промышленных штаммов через организм насекомого-хозяина (Огарков Б.Н. Биологическое обоснование способов создания и использования грибных препаратов для борьбы с насекомыми. Автореф. дисс… д-pa биол. наук. - Л., 1990. - С.19), однако этот прием достаточно трудоемок и требует больших затрат времени.
Известен способ повышения патогенности штаммов грибов путем введения в состав питательных сред муки из насекомых. В питательную среду для культивирования энтомопатогенных грибов, принятую за прототип, входит мука из личинок комнатной мухи (Томилова О.Г., Усова О.Н., Штерншис М.В. Модификация среды для культивирования энтомопатогенных грибов. // Современная микология в России. - Первый съезд микологов России. - Тез. докл. - М., 2002. - С.214).
Включение в состав питательных сред насекомых в виде термически обработанной муки имеет ряд недостатков. Гриб развивается не на живом насекомом, а на субстрате, который после воздействия высоких температур (120-130°С) существенно изменяет свои физико-химические свойства (Токарев B.C., Накозин В.А. Технология приготовления и хранения кормовой муки из личинок копрофагов. // Биотехнология переработки органических отходов и экология. / Под ред. И.И.Гудилина, А.Ф.Кондратова, Новосибирск. - Новосибирское книжное изд-во, 1999. - С.220-228), что, естественно, приведет к снижению патогенных свойств гриба по отношению к живым (нативным) насекомым-вредителям. Термическая сушка личинок - энергоемкий и дорогостоящий процесс. Для хранения муки из личинок добавляют консерванты, которые могут в некоторой степени сдерживать развитие энтомопатогенных грибов, попадать на растения, а через них - в организм животных, человека и в окружающую среду. В состав питательных сред включены ингредиенты, являющиеся продуктами питания человека, что нерационально по экономическим и этическим причинам.
Кроме того, состав питательной среды, даже самый оптимальный, не учитывает того, что в дальнейшем (после обработки защищаемой культуры) энтомопатогенным грибам придется некоторое время находиться на растении. Как известно, резкая смена субстрата для всех живых организмов приводит к стрессу, задержке в развитии и даже к гибели.
В питательной среде, принятой за прототип, личинки синантропных мух подвергаются термической обработке дважды: сначала при сушке личинок до состояния муки, а второй раз при автоклавировании питательной среды, что удорожает производство и снижает качество питательной среды.
Технической задачей является повышение вирулентности энтомопатогенных грибов путем оптимизации питательной среды для их культивирования и снижение ее себестоимости.
Задача достигается созданием питательной среды, включающей смесь измельченных личинок синантропных мух с древесными опилками и пшеном.
Живых личинок смешивают с древесными опилками в соотношении 1:1 и измельчают, полученную смесь подсушивают. В таком виде личинки могут храниться до 3 месяцев без применения консервантов. К смеси личинок с опилками добавляют размолотое пшено в соотношении 1:1, полученную таким образом питательную среду стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20-30 минут, а затем высевают споры энтомопатогенного гриба.
В случае возможности доставки личинок синантропных мух в живом виде к месту производства питательной среды процесс подсушивания смеси личинок с опилками исключают, а все компоненты питательной среды измельчают одновременно.
Уменьшение доли личинок менее 20-25% по отношению к другим компонентам не приводит к значительному увеличению вирулентности энтомопатогенного гриба, а увеличение их доли удорожает себестоимость питательной среды без существенного повышения активности. Снижение доли пшена в питательной среде менее 50% приведет к снижению роста вегетативной массы энтомопатогена, а увеличение доли этого компонента не повышает выход биомассы и спор, что нерационально.
Автоклавирование питательной среды в течение 20-30 минут при давлении 0,5 атм наиболее рационально, так как при давлении в автоклаве менее 0,5 атм не достигается требуемое обеззараживание питательной среды, а увеличение давления более 0,5 атм приведет к удорожанию производства. Автоклавирование менее 20 минут также не обеспечит требуемого обеззараживания питательной среды. Автоклавирование более 30 минут приведет к удорожанию производства.
Состав питательной среды для культивирования энтомопатогенных грибов, соотношение компонентов мас.%:
| - личинки синантропных мух, живые | 20-25% |
| - опилки древесные | 20-25% |
| - пшено размолотое | 60-50% |
От прототипа заявляемая питательная среда отличается тем, что личинки синантропных мух смешивают с древесными опилками в пропорции 1:1, а затем измельчают. В процессе измельчения опилки поглощают влагу, выделяющуюся из живых личинок, способствуя лучшей сохранности биологически активных веществ насекомых. При непосредственном приготовлении ПС в смесь личинок с древесными опилками добавляют размолотое пшено в необходимом количестве, среду стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20-30 минут. В отличие от сухих личинок, подвергшихся сушке при высоких температурах, при автоклавировании достигается обеззараживание среды от посторонних микроорганизмов с высокой степенью сохранности белков, аминокислот, хитина и других БАВ, содержащихся в живых насекомых (Токарев B.C., Накозин В.А. Технология приготовления и хранения кормовой муки из личинок копрофагов. // Биотехнология переработки органических отходов и экология. / Под ред. И.И.Гудилина, А.Ф.Кондратова. Новосибирск. - Новосибирское книжное изд-во. 1999. - С.220-228). Использование в питательной среде древесных опилок на 25% снижает расход пшена, являющегося продуктом питания.
Использование отличительных признаков - смешивание личинок синантропной мухи с древесными опилками с последующим измельчением полученной смеси с целью получения питательной среды для культивирования энтомопатогенных грибов - авторам и заявителю неизвестны.
Заявляемая питательная среда максимально сохраняет физико-химические свойства личинок, неустойчивые к высоким температурам вещества (ювенильные гормоны, экдизоны, простагландины, ферменты), содержащиеся в личинках комнатной мухи, позволяет экономить на процессе сушки до 500 л жидкого топлива на каждой тонне личинок и 400 кВт/ч электроэнергии.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется ниже следующим описанием состава питательной среды для культивирования энтомопатогенных грибов, мас.%:
| - личинки синантропных мух, живые | 20-25% |
| - опилки древесные | 20-25% |
| - пшено размолотое | 60-50% |
При выращивании энтомопатогенных грибов на заявляемой среде на 14-е сутки роста титр жизнеспособных спор на единицу площади увеличивается в 1,5-3,6 раза (L. muscarium), в 3-5,1 раза (В. bassiana) по сравнению со средой-аналогом (Таблица 1).
Биологическая эффективность гриба Lecanicillium muscarium (Petch) Zare et W. Gams (синоним - Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas) штамм F-8 (новосибирский) с титром рабочей суспензии 107 спор/мл, культивируемого на среде предлагаемого состава, увеличивается в зависимости от суток на 29,1-8,7% по сравнению со средой-аналогом и находится на уровне гриба, пассированного через живого хозяина (тест-объект - обыкновенный паутинный клещ - Tetranychus urticae Koch.). При использовании менее патогенного штамма гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill в отношении гусениц галлерии - Galleria mellonella наблюдается более существенное увеличение биологической активности (28-22,5% на 7 и 10-е сутки после заражения) по сравнению с грибом, культивируемым на среде-аналоге (таблица 2).
| Таблица 1 | ||
| Титр жизнеспособных спор энтомопатогенных грибов на 14 сутки роста, культивируемых на ПС различного состава | ||
| Вид гриба | Титр, спор/мл | |
| Среда-аналог | Предлагаемая среда | |
| Beauveria bassiana | 0,65-3,68×107 | 3,3-11,0×107 |
| Lecanicillium muscarium | 1,1-3,4×107 | 1,6-12,3×107 |
| Таблица 2 | |||
| Биологическая эффективность энтомопатогенных грибов (титр рабочей суспензии 107 спор/мл) | |||
| Вид гриба | Биологическая эффективность на 7 и 10 сутки, % | ||
| Предлагаемая среда | Среда-аналог | Гриб, пассированный через хозяина | |
| Beauveria bassiana* | 33,2-45,5 | 5,2-23,0 | 50,0-66,3 |
| Lecanicillium muscarium** | 88,1-96,0 | 59,0-87,3 | 92,9-98,5 |
| Примечание: - тест-объект * - Galleria mellonella, ** - Tetranychus urticae |
Питательная среда для культивирования энтомопатогенных грибов, включающая живые измельченные личинки синантропных мух, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит опилки и пшено при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| личинки синантропных мух, живые | 20-25% |
| опилки древесные | 20-25% |
| пшено размолотое | 60-50% |
