Способ получения трансгенных мышей


 

C12N15 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2425880:

Учреждение Российской Академии Наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (RU)

Способ относится к области генной инженерии и биологии развития. Способ предусматривает трансплантацию зародышей, все клетки которых содержат дополнительную генетическую информацию, реципиентной самке. При этом введение дополнительной генетической информации в одноклеточный зародыш проводят в среде, содержащей 150 мМ NaCl, 2 мМ HEPES и нуклеиновую кислоту в концентрации 5 нг/мкл, путем создания двух серий электрических импульсов с напряженностью поля 100-200 В/см длительностью 750 мс, с интервалом 30 с. Способ позволяет существенно повысить количество получаемых трансгенных мышей и сократить сроки их получения. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Предлагаемый способ относится к генной инженерии и может быть использован для создания трансгенных мышей, в геноме которых присутствует искусственно введенная дополнительная генетическая информация (трансген). Предлагаемый способ может быть использован во всех научных исследованиях, посвященных механизмам действия и взаимодействия генов, визуализации экспрессии генов в контексте целого генома у мыши, а также при создании мышиных моделей многих заболеваний человека.

В настоящее время используют несколько способов получения трансгенных мышей: метод пронуклеарной микроинъекции, ретровирусная трансфекция зародышей, оплодотворение трансформированными сперматозоидами, введение в зародыш трансформированных культур эмбриональных стволовых клеток.

Метод пронуклеарной микроинъекции является основным методом получения трансгенных мышей. Трансген вводят в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши при помощи микроинъекционной пипетки, что приводит к хромосомной интеграции трансгена в 10-40% развившихся после процедуры зародышей (Gordon J.W. Gene Transfer in Mouse Eggs. Microinjection and Organelle Transplantation Techniques. P.351-370. Academic Press Inc. (London) Ltd., 1986). Количество трансгенных мышей, родившихся после пересадки зародышей, трансформированных методом пронуклеарной микроинъекции, реципиентным самкам, составляет не более 2% (R.L.Brinster, H.Y.Chen, M.E.Trumbauer, M.K.Yagle and R.D.Palmiter. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs // Proc. Nail. Acad. Sci., v.82, p.4438-4442, July, 1985; M.Hirabayashi, R.Takahashi, K.Ito, N.Kashiwazaki, M.Hirao, K.Hirasawa, S.Hichi, M.Ueda. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit and pig genomes // Exp. Anim., v.50 (2), p.125-131, 2001). Несмотря на то что введение чужеродных генов в пронуклеус яйцеклетки обеспечивает наличие трансгена во всех клетках новорожденной мыши, метод пронуклеарной инъекции является трудоемким и требует длительного обучения.

Для получения трансгенных мышей методом ретровирусной трансфекции доимплантационные зародыши культивируют в присутствии вирусных векторов либо производят микроинъекцию клеток, производящих вирусный вектор, в перивителлиновое пространство зародыша (С.Lois, E.J.Hong, S.Pease, E.J.Brown, D.Baltimore. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors // Science, v.295 (5556), 1, p.868-72, 2002). К недостаткам метода относят ограниченную емкость вирусных систем, возможное подавление экспрессии трансгенов и вероятность активации клеточных онкогенов.

Для получения трансгенных мышей также проводят инъекцию модифицированных сперматозоидов в неоплодотворенные яйцеклетки мыши (М.Lavitrano, М.Busnelli, M.G.Cerrito, R.Giovannoni, S.Manzini, A.Vargiolu. Sperm-mediated gene transfer // Reprod. Fertil. Dev., v.18 (1-2), p.19-23, 2006). Преимуществом метода является возможность использования сперматозоидов после криоконсервации. Однако этот метод связан с трудностями трансфекции сперматозоидов мыши и большим количеством микроманипуляций (Anthony С.F.Perry, Teruhiko Wakayama, Hidefumi Kishikawa, Tsuyoshi Kasai, Masaru Okabe, Yutaka Toyoda, Ryuzo Yanagimachi. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection // Sceince, v.284, p.14, May, 1999).

Широко используют для получения трансгенных мышей также трансформированные генными конструкциями культуры эмбриональных стволовых клеток мыши. Преимуществом этого подхода является возможность анализа интеграции и экспрессии введенного трансгена непосредственно в культуре клеток. Линии трансформированных эмбриональных стволовых клеток мыши с оптимальными характеристиками используются для получения химерных зародышей, а впоследствии и мышей, у которых в геном части клеток встроена дополнительная генетическая информация (A.Nagy, E.Gocza, E.M.Diaz, V.R.Prideau, E.I.Makkurla, J.Rossant. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse // Development, v.110, p.815-821, 1990; A.Bradley, M.Evans, M.H.Kaufman, E.Robertson. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines // Nature, v.17-23; 309 (5965), p.255-6, May, 1984). Трансформирование эмбриональных стволовых клеток для создания трансгенных мышей проводится различными способами: микроинъекцией, ретровирусной инфекцией, электропорацией.

В качестве прототипа предлагаемого способа выбран способ получения трансгенных мышей с использованием линии эмбриональных стволовых клеток мыши, трансформированных методом электропорации (Khillan. Jaspal S. (Cherry Hill, NJ). Efficient method for production of compound transgenic animals, United States Patent 6281408, 2001; F.Paul. Lurquin Gene transfer by electroporation // Mol. Biotechnol, v.7(1), p.5-35, Feb, 1997). При помощи электропорации трансген вводят в культуру эмбриональных стволовых клеток мыши. Трансгенные эмбриональные стволовые клетки мыши инъецируют в зародыш мыши, находящийся на стадии морулы или бластоцисты, или смешивают с клетками зародыша. После этого зародыш трансплантируют в матку реципиентной самке. Новорожденные мыши являются химерами и могут нести в себе разное количество трансгенных клеток, развившихся из пересаженных в зародыш трансформированных эмбриональных стволовых клеток. Наличие трансгена в половых клетках родившихся мышей анализируют в процессе их скрещиваний с мышами дикого типа. Недостаток метода заключается в сложности методики, необходимости поддерживать дорогостоящие линии эмбриональных стволовых клеток мыши и в том, что скрещивания для выведения гомозиготной по вносимому трансгену мыши требуют много времени.

В предлагаемом способе, также как и в прототипе, для получения трансгенных мышей производят манипуляции с зародышами мыши в культуре, после чего зародыши переносят в матку самке и получают новорожденных мышей. Также как и прототипе, в предлагаемом способе трансген в геном клеток мыши вводят при помощи электропорации. Но в отличие от прототипа, в предлагаемом способе электропорации подвергают целиком зародыш мыши на стадии одной клетки. При этом не нужно использовать линии эмбриональных стволовых клеток и травмировать зародыши мыши для получения химер. Так как введение дополнительной генетической информации в предлагаемом способе осуществляется на стадии одной клетки, то новорожденные мыши, в отличие от мышей, получаемых с использованием линии эмбриональных стволовых клеток, будут содержать трансген во всех клетках организма. Поэтому не понадобятся дополнительные скрещивания, которые необходимы для получения трансгенных мышей в прототипе предлагаемого способа.

Задачей предлагаемого способа является разработка способа введения дополнительной генетической информации в геном зародыша мыши. Поставленная задача решается тем, что введение дополнительной генетической информации в геном зародыша мыши осуществляется при помощи метода электропорации зародышей мыши на стадии одной клетки.

Сущность предлагаемого способа заключается во введении трансгена в зародыши мыши на стадии одной клетки методом электропорации: до 50 оплодотворенных зародышей мыши помещают в изотонический солевой буферный раствор, содержащий нуклеиновую кислоту в концентрации не менее 5 нг/мкл раствора; электропорацию проводят два раза с интервалом 20-40 секунд, генерируя 3 электрических импульса длительностью 500-1000 мс с напряженностью поля 100-200 В/см. После электропорации зародыши культивируют до стадии бластоцисты. Развившиеся бластоцисты трансплантируют самкам мыши для рождения трансгенных мышей. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки получения трансгенных мышей и значительно повысить их количество.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Оплодотворенные мышиные ооциты F1, полученные от самок СВА и самцов C57BL/6, выделяли спустя 13-15 часов после оплодотворения в фосфатном буфере (раствор Дульбекко), содержащем 250 ед./мл гиалуронидазы, свободные от кумулюсных клеток зародыши отмывали семь раз от гиалуронидазы раствором Виттена. Зародыши трансформировали линейным фрагментом гена Igf2 длиной 1143 п.н. с заменой трех нуклеотидов в сайте узнавания рестриктазы StuI (последовательность «AGGCCT» изменена на «AGGGGT»), которая не приводит к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта. Для трансформации проводили электропорацию 50 зародышей мыши в 1-мм кювете в 220 мкл раствора, содержащего 200 мкл буферного раствора (150 мМ NaCl и 2 мМ HEPES) и 20 мкл раствора 1 мкг модифицированного фрагмента гена Igf2 в деонизированной воде. Проводили 3 электрических импульса, с напряжением 15 В и длительностью 750 мс с повтором процедуры два раза с интервалом в 30 секунд. Трансформированные зародыши пять раз отмывали свежей средой Виттена и культивировали 4 суток в герметичном флаконе в 500 мкл среды Виттена. Развившиеся бластоцисты трансплантировали в матку ложнобеременным самкам. Наличие модифицированного фрагмента гена Igf2 в геноме новорожденных мышей определяли полимеразной цепной реакцией с рестрикцией. ДНК выделяли из тканей ушной раковины новорожденных мышей, проводили ПЦР с праймерами к фрагменту гена Igf2, содержащему сайт рестрикции StuI, амплифицированный в ходе ПЦР фрагмент подвергали рестрикции рестриктазой StuI. У 48% новорожденных мышей наблюдали после рестрикции и электрофореза наличие трех продуктов в агарозном геле (717 п.н., 426 п.н. и 1143 п.н.), что показывает, что в одном аллеле гена Igf2 отсутствует сайт узнавания рестриктазы StuI, то есть новорожденные мыши являются гетерозиготами по модифицированному фрагменту гена Igf2. Общая эффективность трансгенеза (отношение числа полученных трансгенных мышей к общему числу пересаженных эмбрионов) составила 9,7%.

Пример 2. Выделяли и трансформировали зародыши мыши как описано в примере 1, но в качестве трансгена использовали не линейный фрагмент ДНК, а плазмиду pEGFP-N1, которая несет ген зеленого флуоресцентного белка GFP. Детекцию последовательности гена EGFP в геноме новорожденных мышей проводили методом ПЦР. ДНК выделяли так, как описано в примере 1. У 29% новорожденных мышей методом электрофореза детектировали продукт реакции - 200 п.н.; отношение числа полученных трансгенных мышей к общему числу пересаженных эмбрионов составило 8,6%. Среди полученного от трансгенных по гену EGFP мышей потомства F2 определяли гомозигот EGFP/EGFP методом ПЦР в реальном времени. Анализ экспрессии трансгена EGFP у мышей EGFP/EGFP проводили с помощью микроскопического флюоресцентного анализа. Зародыши мышей EGFP/EGFP выделяли и культивировали до стадии бластоцисты как описано в примере 1. Бластоцисты переносили из среды Виттена в каплю буфера PBS и фотографировали в двух каналах: в проходящем свете (выдержка 50 мс) и в канале GFP (выдержка 100 мс). У 100% трансгенных бластоцист наблюдали наличие экспрессии белка GFP в виде ярких светлых включений в клетках бластоцист в канале GFP (см. чертеж). На криосрезах тканей печени, мозга и матки самок EGFP/EGFP также наблюдали свечение в канале GFP, что говорит о функциональной активности введенного в геном мыши экзогенного гена EGFP методом электропорации зародышей мыши.

1. Способ получения трансгенных мышей, предусматривающий трансплантацию зародышей, все клетки которых содержат дополнительную генетическую информацию, реципиентной самке, отличающийся тем, что введение дополнительной генетической информации в одноклеточный зародыш проводят в среде, содержащей 150 мМ NaCl, 2 мМ HEPES и нуклеиновую кислоту в концентрации 5 нг/мкл, путем создания двух серий электрических импульсов с напряженностью поля 100-200 В/см длительностью 750 мс, с интервалом 30 с.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда для проведения электропорации содержит до 50 оплодотворенных зародышей мыши.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано для селекции генетически модифицированных клеток. .
Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано в медицинской генетике
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза

Изобретение относится к области медицины

Изобретение относится к способам и композициям, пригодным для модулирования состояний заболевания, связанного с экспрессией и/или активностью OX40L, таких как повышение экспрессии и/или активности, или нежелательная экспрессия и/или активность

Изобретение относится к способам и композициям, пригодным для модулирования состояний заболевания, связанного с экспрессией и/или активностью OX40L, таких как повышение экспрессии и/или активности, или нежелательная экспрессия и/или активность

Изобретение относится к рекомбинантному химерному белку фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена (TNHH), кодирующей его полинуклеотидной последовательности, рекомбинантному вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, микроорганизму, трансформированному указанным вектором, и фармацевтической композиции, содержащей указанный рекомбинантный химерный белок фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена

Изобретение относится к рекомбинантному химерному белку фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена (TNHH), кодирующей его полинуклеотидной последовательности, рекомбинантному вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, микроорганизму, трансформированному указанным вектором, и фармацевтической композиции, содержащей указанный рекомбинантный химерный белок фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена

Изобретение относится к рекомбинантному химерному белку фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена (TNHH), кодирующей его полинуклеотидной последовательности, рекомбинантному вектору, содержащему указанную полинуклеотидную последовательность, микроорганизму, трансформированному указанным вектором, и фармацевтической композиции, содержащей указанный рекомбинантный химерный белок фактора ингибирования нейтрофилов и гиругена
Наверх