Способ получения композиционных рассасывающихся матриц на основе хитозана и коллагена для выращивания клеток кожи человека

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, а именно к получению пленочных и губчатых материалов на основе хитозана и коллагена, пригодных для выращивания на них клеток кожи человека и их трансплантации на раны. Способ получения композиционных рассасывающихся матриц на основе хитозана и коллагена для выращивания клеток кожи человека включает приготовление растворов полисахарида - хитозана и белка - коллагена, смешивание их в заданных соотношениях и формование из растворов смесей полимеров пленочных и губчатых матриц. Для этого предварительно готовят растворы хитозана и коллагена концентрации 1,0-4,0% (мас.) в общем растворителе (водном 2%-ном растворе уксусной кислоты), смешивают их в заданных пропорциях и формуют из приготовленных растворов пленочные и губчатые матричные материалы. Количество коллагена в смесях полимеров составляет 2,5-10% (от массы хитозана). Далее пленки и губки подвергают прогреву в интервале температур 50-100°С в течение 1,0-5,0 часов в атмосферной среде. Использование заявленного способа позволяет получать на основе природных полимеров пленочные и губчатые рассасывающиеся композиционные материалы, пригодные для выращивания клеток кожи человека. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Способ относится к химии природных высокомолекулярных соединений, а именно получению композиционных материалов на основе хитозана и коллагена в виде пленок и губок, способных рассасываться в организме человека и пригодных для выращивания на них клеток кожи человека. Изобретение позволяет получать композиционные матричные материалы, пригодные для биомедицинских целей, при использовании в качестве общего растворителя двух природных полимеров (хитозана и коллагена) экологически безопасного 2%-ного водного раствора уксусной кислоты. С целью повышения стабильности матричных материалов в культуральной жидкости, времени их рассасывания на поверхности раны и повышения адгезии клеток к поверхности материала, их подвергают прогреву, в результате чего происходит химическая сшивка макромолекул полимеров.

В качестве полимерных матриц для выращивания клеток человека используют природные полимеры, такие как химически модифицированный хитин, хитозан, желатин, фиброин шелка и синтетические полимеры, например полилактоновую (полимолочную) кислоту [D.Ozdemir, G.Schoukens, O.Goktepe, F.Goktepe. Preparation of Di-Butyryl-Chitin Scaffolds by Using Salt Leaching Method for Tissue Engineering and Their Characteristics. // Journal of Applied Polymer Science. 2008. Vol.109. P. 2882-2887; M.N.V.Ravi Kumar, R.A.A. Muzzarelli, C.Muzzarelli, H.Sashiwa, A.J.Domb. Chitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives. // Chem. Rev. 2004. Vol.104. P.6017-6084; H.Yamada, Y.Igarashi, Y.Takasu, H.Saito, K.Tsubouchi. Identification of fibroin-derived peptides enhancing the proliferation of cultured human skin fibroblasts. // Biomaterials. 2004. Vol.25. P. 467-472; A.Prokop, A.Jubel, H.J.Helling, T.Eibach, C.Peters, S.E.Baldusc, K.E.Rehm. Soft tissue reactions of different biodegradable polylactide implants. // Biomaterials. 2004. Vol.25. P. 259-267].

Наиболее близким по сущности является способ получения матричных материалов на основе хитозана и коллагена, предназначенных для выращивания клеток эпидермоидного рака [N.Shanmugasundaram, P.Ravichandran, P.N.Reddy, N.Ramamurty, S.Pal, K.Panduranga Rao. Collagen-chitosan polymeric scaffolds for the in vitro culture of human epidermoid carcinoma cells. // Biomaterials. 2001. Vol.22. P. 1943-1951]. Предварительно готовят растворы хитозана и коллагена с концентрацией 0,6-1,4% (массовых) в ледяной уксусной кислоте. Полученные растворы полимеров смешивают в заданных пропорциях, перемешивают и отливают на стеклянные пластины. С целью уменьшения набухания получаемых композиционных пленок в культуральной среде в растворы смесей полимеров вводят раствор глутарового альдегида в толуоле, с помощью которого проводят химическую сшивку макромолекул хитозана и коллагена. Получают композиционные материалы с содержанием коллагена 30,0-70,0% (массовых).

Существенными и очевидными недостатками способа являются использование в качестве растворителя полимеров ледяной уксусной кислоты и дополнительная стадия процесса химической сшивки макромолекул полимеров глутаровым альдегидом, растворенным в толуоле. Ледяная уксусная кислота при контакте с кожей человека вызывает сильные химические ожоги, а ее пары раздражают слизистые поверхности и глаза человека. Толуол является токсичным продуктом, по степени воздействия на организм человека относится к 3-му классу опасности и при высоких концентрациях его пары действуют наркотически. Поэтому требуется контроль за отсутствием толула в получаемых матричных материалах. Большое содержание коллагена в матричных материалах приводит к ухудшению прочностных характеристик полученных матриц.

Технической задачей и положительным результатом предлагаемого способа является получение пленочных и губчатых композиционных рассасывающихся матриц на основе хитозана и коллагена из растворов полимеров в безопасном для здоровья человека растворителе, без использования химического сшивающего реагента в растворе толуола и с небольшим содержанием коллагена. Разработанный способ прост в исполнении. В качестве общего растворителя полимеров используется водный 2,0%-ный раствор уксусной кислоты, а для повышения стабильности матриц взамен введения в растворы смесей полимеров химического сшивающего реагента (глутарового альдегида) используется прогревание полученных материалов при повышенной температуре в атмосферной среде.

Указанная задача и результат достигаются тем, что способ включает приготовление растворов полисахарида - хитозана и белка - коллагена концентрации 1,0-4,0%) (мас.) в общем растворителе (водном 2%-ном растворе уксусной кислоты), их смешении в заданных соотношениях и формовании из растворов смесей полимеров пленочных и губчатых матриц. Формование пленок проводят путем отлива раствора через фильеру с регулируемым зазором на стеклянную подложку и последующим испарением растворителя. Получение губчатых материалов проводят путем отлива раствора смесей полимеров на полимерную подложку с его последующим замораживанием при Т=-45°C и лиофильной сушкой до полного удаления растворителя. С целью повышения стабильности матричных материалов в культуральной жидкости, времени их рассасывания на поверхности раны и повышения адгезии клеток к поверхности материала их подвергают прогреву в интервале температур 50-100°C в течение 1,0-5,0 часов в атмосферной среде. Количество коллагена в смесях полимеров составляет 2,5-10% (от массы хитозана).

Пример 1. Получение композиционной пленки, содержащей 1,0% коллагена (от массы хитозана).

3 г хитозана растворяют в 97 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 3%-ный раствор хитозана. 0,5 г коллагена растворяют в 99,5 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 0,5%-ный раствор коллагена. К 100 г 3%-ного раствора хитозана добавляют при перемешивании 6 г 0,5%-ного раствора коллагена в течение 1 часа. Полученный раствор смеси полимеров подвергают диализу против воды с целью уменьшения в растворе полимеров уксусной кислоты. Раствор смеси полимеров с помощи фильеры наносится на стеклянную подложку (или выливается в чашки Петри), после чего сушится при комнатной температуре до полного удаления растворителя. Полученная композиционная пленка содержит 1,0% (мас.) коллагена (табл.1, пример 1).

Пример 4. Получение композиционной пленки, содержащей 10,0% коллагена (от массы хитозана).

3 г. хитозана растворяют в 97 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 3%-ный раствор хитозана. 0,5 г коллагена растворяют в 99,5 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 0,5%-ный раствор коллагена. К 100 г 3%-ного раствора хитозана добавляют при перемешивании 60 г 0,5%-ного раствора коллагена в течение 1 часа. Полученный раствор смеси полимеров подвергают диализу против воды с целью уменьшения в растворе полимеров уксусной кислоты. Раствор смеси полимеров с помощи фильеры наносится на стеклянную подложку (или выливается в чашки Петри), после чего сушится при комнатной температуре до полного удаления растворителя. Полученная композиционная пленка содержит 10,0% (мас.) коллагена (табл.1, пример 4).

Таблица 1
Деформационно-прочностные характеристики композиционных пленок на основе хитозана и коллагена
Примеры Содержание коллагена (мас.%) Свойства пленок
Модуль Юнга, Е, ГПа Прочность на разрыв, σp, МПа Удлинение при разрыве, ε, % Удельная поверхность, м2
1 0 5,2 96,0 13,3 1,261
2 2,5 6,8 131,2 11,1 -
3 5,0 7,0 140,4 14,1 -
4 10,0 7,2 148,0 14,2 1,412

Примеры 2-3. Получение композиционных пленок осуществляют аналогично примеру 1 и 4.

Пример 5. Получение губчатого матричного материала, содержащего 10,0% коллагена (от массы хитозана).

Раствор смеси полимеров готовят аналогично примерам 1 и 4. Приготовленный раствор выливают в стеклянные или пластмассовые сосуды (или чашки Петри), замораживают при -45°C и подвергают лиофильной сушке. Полученный губчатый материал имеет характеристики:

- пористость - 34,5%;

- кажущаяся плотность - 27,2 кг/м3;

- удельная поверхность - 7,22 м2/г;

- влагопоглощение - 50,0%.

Пример 6. Повышение стабильности матриц в культуральной среде путем их тепловой обработки.

Для придания матрицам стабильности в культуральной среде, повышения адгезии клеток к их поверхности и времени рассасывания матриц на поверхности раны пленки и губки подвергают прогреву в интервале температур 50-100°C в течение 1,0-5,0 часов в атмосферной среде.

Изменение деформационно-прочностных характеристик матриц и их растворимости в воде показано на примере хитозановых пленок (табл.2).

Таблица 2
Изменение деформационно-прочностных характеристик и растворимости в воде хитозановых пленок в зависимости от времени их прогрева.
Дополнительная обработка пленок Свойства пленок
Модуль Юнга, Е, ГПа Прочность на разрыв, σp, МПа Удлинение при разрыве, ε, % Растворимость в воде, %
Свежесформованная пленка 4,7 122,0 38,0 100
Прогрев 3 часа при 100°C 6,4 158,1 22,3 0

После дополнительного прогрева пленок происходит увеличение их прочности и модуля Юнга (упругости), указывающее на повышение жесткости пленок, а также потеря растворимости в воде.

1. Способ получения композиционных рассасывающихся матриц на основе хитозана и коллагена для выращивания клеток кожи человека, отличающийся тем, что пленочные матрицы готовят из смеси растворов хитозана и коллагена общей концентрации 1,0-4,0 мас.% в 2%-ном водном растворе уксусной кислоты и формуют на стеклянной подложке; для получения губчатых матриц растворы смесей хитозана с коллагеном замораживают при -45°С и подвергают лиофильной сушке, при этом количество коллагена в смесях полимеров составляет 2,5-10% от массы хитозана.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для придания матрицам стабильности в культуральной среде, повышения адгезии клеток к их поверхности и времени рассасывания матриц на поверхности раны пленки и губки подвергают прогреву в интервале температур 50-100°С в течение 1,0-5,0 ч в атмосферной среде.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к сердечно-сосудистой хирургии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к сердечно-сосудистой хирургии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и касается лекарственных средств для восстановления тканей пародонта и устранения послеоперационной ретракции тканей альвеолярных отростков при проведении пародонтологических и имплантологических вмешательств.

Изобретение относится к медицине и касается биоинженерной конструкции для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани, которая представляет собой гибридный имплантат в виде пористой мембраны из политетрафторэтилена с многофункциональным, биосовместимым, нерезорбируемым покрытием МБНП, легированным элементами M-Ca-P-C-O-N или M-Ca-C-O-N, где M - металл, выбранный из ряда, включающего Ti, Zr, Hf, Nb, Та, на поверхности которого пассированы аутогенные или аллогенные стромальные клетки, выделенные из жировой ткани или костного мозга.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для коррекции дистрофических и травматических изменений хрящевой ткани, а также для коррекции процессов роста при идиопатическом сколиозе на ранних стадиях развития патологии.

Изобретение относится к пористым матрицам, основой которых являются биологически приемлемые полимер либо полимерная смесь, к клеточным имплантатам, которые формируют на последних, к другим клеточным имплантатам, основой которых являются клеточные смеси, образованные из гепатоцитов и клеток островков Лангерганса, к способу получения пористых матриц и к матрицам, которые можно получить при использовании данного способа.

Изобретение относится к медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения хондро-остеогенных клеток in vitro и их применению. .

Изобретение относится к медицине и биологии, точнее к способу определения пригодности поджелудочной железы как источника терапевтически применимых островков. .

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к реконструктивной хирургии, предназначено для применения в области трансплантологии, травматологии, хирургии и онкологии

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, предназначено для применения в трансплантологии, травматологии, хирургии и онкологии и может быть использовано для замещения костных дефектов
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен способ получения эпителиоподобных клеток легкого плода буйволицы путем длительного беспересевного культивирования, обладающих высокой чувствительностью к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3, вирусной диареи - болезни слизистых оболочек и аденовирусной инфекции. Изобретение может быть использовано при диагностике вирусных инфекций. 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения стволовых клеток, включающий центрифугирование гепаринизированного костного мозга с гидроксиэтилкрахмалом в соотношении исходных ингредиентов 1:2 со скоростью 700g в течение 15 мин в замкнутой системе трех гематологических контейнеров, соединенных между собой трубками, с последующим удалением примесей жира и плазмы в контейнер №1, перевод мононуклеарной фракции костного мозга, части супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения двух сред, в контейнер №2, при этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты, центрифугирование полученного образца со скоростью 900g в течение 15 мин в контейнере №2 для получения клеточного материала для внутрисосудистого введения, при этом после упомянутого центрифугирования удаляют часть супернатанта в контейнер №1 без разгерметизации системы. Благодаря получению паракринного эффекта мононуклеаров костного мозга и обеспечению безопасности способ может быть использован в медицине для внутрисосудистого введения полученного клеточного материала, а также в регенераторной терапии в области кардиологии, в частности, с целью внутрисосудистого введения для регенерации органа. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицинскому протезу для имплантации в человеческий организм и, в частности, к биологическому имплантату переносицы, используемому в пластической хирургии переносицы. Имплантат переносицы изготовлен согласно способу, который включает отбор, стерилизацию и обрезку до нужного размера материала животного происхождения в виде сухожилий либо связок из организмов крупного рогатого скота или свиней; извлечение клеток из материала животного происхождения; придание формы имплантату из материала животного происхождения для создания желаемой формы переносицы; кросслинкинг материала животного происхождения; извлечение антигенов из материала животного происхождения, проведение щелочной обработки и ввод в материал животного происхождения активных веществ, способствующих склеиванию ростового фактора и стволовых клеток; упаковку импланта в контейнер, содержащий стерилизационный раствор. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к регенеративной медицине и тканевой инженерии. Предложены сконструированные многослойные сосудистые трубочки, содержащие, по меньшей мере, один слой дифференцированных взрослых фибробластов, по меньшей мере, один слой дифференцированных взрослых гладкомышечных клеток. При этом любой слой, кроме того, содержит дифференцированные взрослые эндотелиальные клетки. Указанные трубочки имеют следующие характеристики: соотношение эндотелиальных клеток к гладкомышечным клеткам составляет примерно от 1:99 до 45:55; трубочка является деформируемой; внутренний диаметр трубочки составляет примерно 6 мм или меньше; длина трубочки составляет примерно до 30 см; толщина трубочки является по существу равномерной вдоль участка трубочки. Условием является также то, что сосудистая трубочка не содержит какого-либо предварительно образованного каркаса. Кроме того, предложен способ формирования указанных трубочек. Изобретения обеспечивают создание терапевтически приемлемых альтернативных сосудистых трубочек, в т.ч. при необходимости их малого диаметра, выдерживающие физиологическое давление, для трансплантации их пациенту, а также для использования в тестировании лекарственных средств или устройств для сердечно-сосудистой системы. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 4 пр., 3 ил., 2 табл.

Группа изобретений относится к области медицины и касается способов создания зуба, обладающего требуемым размером, и восстановления утраченной части зубов ротовой полости путем трансплантации созданного зуба в область утраты зубов. В частности, способ создания зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, включает стадии: расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток; культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя, при этом размер зуба корректируют путем коррекции длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в одном заданном направлении. Способ определения длины контакта первого и второго агрегатов клеток, необходимой для получения зуба, обладающего требуемым размером, включает получение множества типов структур, которые содержат структуры с различной длиной контакта первого и второго агрегата клеток в одном заданном направлении; культивирование каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя; измерение длины зуба, полученного на предшествующей стадии, в одном направлении; определение корреляции между данной длиной и длиной контакта и основанный на этой корреляции расчет требуемой длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток. Группа изобретений позволяет получить зуб, обладающий требуемым размером, что дает возможность получения одиночного зуба, который может быть использован как есть в форме трансплантата. 9 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр., 13 ил.
Группа изобретений относится к медицине. Описан биологический материал, включающий: a) жидкий носитель, включающий вязкий раствор, содержащий, по меньшей мере, один натуральный и/или полусинтетический полисахарид и имеющий динамическую вязкость, измеренную при 20ºС и при скорости сдвига D=350 с-1, в диапазоне от 100 до 250 сантипуаз и/или кинематическую вязкость в диапазоне от 99 до 248 сантистокс (измеренную в тех же условиях); b) культуру мезенхимальных стволовых клеток аутологичного или гетерологичного типа и/или c) обогащенный тромбоцитами продукт крови. Материал в форме вязкой жидкости, в частности, подходит для терапии остеоартрита, повреждения связок и может вводиться внутрь сустава, внутридермально или непосредственно наноситься in situ без изменения свойств мезенхимальных стволовых клеток и/или содержащихся в нем тромбоцитов. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 пр.

Изобретения касаются мембраны, используемой в качестве подложки для выращивания клеток ретинального пигментного эпителия, ее применения для поддержания клеток и способа засевания клеток на такую мембрану. Охарактеризованная мембрана является небиоразлагаемой и пористой, покрытой по меньшей мере с одной стороны покрытием, содержащим гликопротеин, с порами диаметром приблизительно от 0,2 мкм до 0,5 мкм, причем плотность пор мембраны составляет приблизительно от 1×107 до 3×108 пор на 1 см2, а гидравлическая проводимость мембраны превышает 50×10-10 м сек-1 Па-1, и имеющей максимальную толщину 11 мкм. Представленные изобретения позволяют получать трансплантаты для лечения возрастной макулярной дегенерации. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 пр., 3 табл.

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, а именно к получению пленочных и губчатых материалов на основе хитозана и коллагена, пригодных для выращивания на них клеток кожи человека и их трансплантации на раны

Наверх