Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение



Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение
Конъюгаты интерлейкина-1 и их применение

 


Владельцы патента RU 2441067:

ЦИТОС БИОТЕХНОЛОГИ АГ (CH)

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. Описана композиция, содержащая упорядоченный и повторяющийся набор антигенов, где антиген представляет собой белок IL-1, мутеин IL-1 или фрагмент IL-1. Предложена также вакцина на основе композиции. Композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять для получения вакцин, предназначенных для лечения воспалительных заболеваний и хронических аутоиммунных заболеваний, генетических болезней и сердечнососудистых заболеваний. Композиции, предлагаемые в изобретении, эффективно индуцируют иммунные ответы, в частности гуморальные иммунные ответы. Кроме того, композиции, предлагаемые в изобретении, наиболее целесообразно применять для эффективной индукции аутогенных иммунных ответов. 6 н. и 40 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к областям медицины, здравоохранения, иммунологии, молекулярной биологии и вирусологии. Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим вирусоподобную частицу (ВПЧ) или вирусную частицу и по меньший один антиген, где антиген представляет собой белок интерлейкина-1 (IL-1), фрагмент или пептид IL-1 или мутеин IL-1, ковалентно связанный с ВПЧ или вирусной частицей. Изобретение относится также к способу получения композиций. Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для получения вакцин, предназначенных для лечения различных нарушений у человека, включая ревматоидный артрит, остеоартрит и другие нарушения. При этом композиции, предлагаемые в изобретении, индуцируют эффективные иммунные ответы, прежде всего гуморальные иммунные ответы.

Ссылки на родственные заявки

IL-1 представляет собой эффективный провоспалительный цитокин, который продуцируется различными типами клеток, в том числе макрофагами, дентритными клетками, В-клетками и Т-клетками (Dinarello С.A., Blood 77(8), 1991, c.1627-1652). Он представлен двумя видами молекул, IL-1α и IL-1β, которые характеризуются лишь ограниченной идентичностью последовательностей, но обладают сходной биологической активностью в результате связывания с IL-1-рецептором типа I (IL-1RI) (Dinarello С.А. и др., Cytokine & Growth Factor Rev. 8, 1997, с.253). Обе молекулы IL-1 связываются также с вторым IL-1-рецептором (IL-1RII), в котором отсутствует внутриклеточный домен передачи сигнала и который, вероятно, играет регуляторную роль в качестве рецептора-«ловушки» (Dinarello С.А. и др., Cytokine & Growth Factor Rev. 8, 1997, с.253). Кроме того, третий представитель IL-1-семейства, антагонист IL-1-рецептора (IL-1ra) связывается с обоими рецепторами, не проявляя какой-либо агонистической активности. IL-1ra в сочетании с IL-1RII и выделенными формами IL-1RI и IL-1RII противодействуют активности IL-1α и IL-1β и обеспечивают точную регуляцию воспалительного ответа.

Нарушение регуляции опосредуемого IL-1 воспалительного ответа обнаружено при многих нарушениях у человека, включая ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, болезни почек, остеопороз и другие нарушения. При каждом из указанных заболеваний избыточное производство IL-1 и/или недостаточное производство IL-1ra провоцирует развитие заболевания (Arend W.P., Cytokine & Growth Factor Reviews 13, 2002, c.323-340). Рекомбинантная версия IL-1rа (анакинра, Kineret®) обладает эффективностью в отношении снижения воспаления и предупреждения поражения ткани при некоторых воспалительных нарушениях, однако необходимость применения этого лекарственного средства системно в высоких концентрациях и его короткое время полужизни приводит к необходимости частого (ежедневного) введения в высоких дозах (~100 мг), что обусловливает высокую стоимость лекарства и может вызывать проблемы у пациентов, связанные с соблюдением режима и схемы лечения (информация на прописи к Kineret®, фирма Amgen; Granowitz E.V. и др., Cytokine 4, 1992, с.353). Кроме того, у большой части пациентов вырабатываются антитела к Kineret®, что может нейтрализовать биологическую активность лекарственного средства (Fleischmann R.M. и др., Arthritis Rheum 46, 2003, с.2287). По этой причине новые терапевтические методики сфокусированы на стратегиях активных иммунизаций, которые индуцируют производство нейтрализующих IL-1 антител иммунной системой пациента. Svenson с соавторами (J. Immunol. Methods 236, 2000, c.1-8) приводили иммунизацию мышей рекомбинантным IL-1α, перекрестно сшитым химически с очищенным белковым производным туберкулина (ППД), и обнаружили индукцию антител, которые нейтрализовали биологическую активность IL-1α. Эта стратегия основана на открытии того факта, что Т-клетка помогает аутореактивным В-клеткам физически связывать аутоантиген с чужеродным антигеном.

В US 6093405 описан метод снижения уровня цитокина в кровотоке с помощью иммунизации иммуногенной композицией, содержащей химически или физически инактивированный сам цитокин. Хотя при использовании этого метода нативным цитокинам придавали иммуногенность с помощью физической или химической обработки, в указанном изобретении описан метод получения придания нативным цитокинам иммуногенности путем их презентации в виде часто повторяющегося набора на поверхности ВПЧ. Кроме того, в WO 2003/084979 описано применение иммуногенных соединений, содержащих полученные из цитокинов пептиды, которые состоят из 5-40 аминокислот, для лечения заболеваний, ассоциированных со сверхпроизводством цитокинов.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что предлагаемые в изобретении композиции и вакцины соответственно, которые содержат по меньшей мере одну молекулу IL-1, не только обладают способностью индуцировать иммунные ответы против IL-1, и прежде всего гуморальные иммунные ответы, но могут также нейтрализовать провоспалительную активность IL-1 in vivo. При создании изобретения также неожиданно было установлено, что молекула IL-1 при ее ковалентной связи с ВПЧ, предлагаемой в изобретении, может защищать от воспаления и клинических симптомов артрита на мышиной модели ревматоидного артрита. Кроме того, при создании изобретения было установлено, что предлагаемые в изобретении композиции защищали мышей от развития симптомов артрита более эффективно, чем рекомбинантный антагонист IL-1-рецептора Kineret®, применение которого разрешено для лечения ревматоидного артрита у людей (пример 7). При создании изобретения также неожиданно было установлено, что композиции, предлагаемые в изобретении, могут ингибировать развитие симптомов атеросклероза при инъекции генетически чувствительным мышам (пример 4) и поэтому обладают эффективностью при лечении атеросклероза. Кроме того, при создании изобретения было продемонстрировано, что IL-1α принимает участие в патогенезе атеросклероза.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является композиции, содержащая (а) вирусоподобную частицу (ВПЧ), которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения; и (б) по меньшей мере один антиген, который несет по меньшей мере один второй сайт присоединения, где по меньшей мере один антиген представляет собой молекулу IL-1, предпочтительно выбранную из группы, включающей белок IL-1, зрелый фрагмент IL-1, пептид IL-1 и мутеин IL-1, где (а) и (б) сцеплены через по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй сайт присоединения, предпочтительно с образованием упорядоченного и повторяющегося набора антигенов. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения вирусоподобные частицы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, содержат рекомбинантный белок, предпочтительно рекомбинантный оболочечный белок, его мутанты или фрагменты, вируса, предпочтительно РНКового бактериофага. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере один зрелый фрагмент IL-1, предпочтительно обладает биологической активностью IL-1. Таким образом, в настоящем изобретении предложено применение аутоантигена в виде часто повторяющегося набора на вирусоподобных частицах для стимуляции аутореактивных В-клеток.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция вакцины. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу введения композиции вакцины человеку или животному, предпочтительно млекопитающему. Вакцина, предлагаемая в настоящем изобретении, может индуцировать сильный иммунный ответ, в частности гуморальный иммунный ответ, как правило и предпочтительно, в отсутствии какого-либо адъюванта. Так, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вакцина не содержит какого-либо адъюванта. Отказ от применения адъюванта может снижать появление возможных нежелательных воспалительных Т-клеточных ответов.

Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ представляет собой ВПЧ РНКового бактериофага. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения РНКовый бактериофаг представляет собой РНКовый бактериофаг, выбранный из группы, включающей: Qβ, fro, GA и АР205. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения ВПЧ РНКового бактериофага, входящую в композицию и состав вакцины соответственно, получают методом рекомбинации в хозяине, и ВПЧ РНКового бактериофага практически не содержит РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновой кислоты хозяина. Предпочтительно снижать количество РНК хозяина или предпочтительно элиминировать его для того, чтобы избежать нежелательных Т-клеточных ответов, а также других нежелательных побочных действий, таких как лихорадка.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ лечения заболевания, выбранного из группы, включающей (а) сосудистые заболевания; (б) наследственные IL-1-зависимые воспалительные заболевания; (в) хронические аутоиммунные воспалительные заболевания; (г) дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани; (д) аллергические заболевания и (е) неврологическое заболевание; при указанных заболеваниях белок IL-1 опосредует или участвует в этом состоянии, при этом способ заключается в том, что вводят предлагаемую в изобретении композицию или предлагаемую в изобретении композицию вакцины соответственно животному, предпочтительно человеку. Заболевания, которые белок IL-1 опосредует или оказывает влияние на обусловленные ими состояния, представляют собой, например, атеросклероз, семейную средиземноморскую лихорадку, ревматоидный артрит, остеоартрит и аллергию.

Следующим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая предлагаемую в изобретении композицию и приемлемый фармацевтический носитель.

И еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения, композиции, предлагаемой в изобретении, заключающийся в том, что (а) получают ВПЧ, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения; (б) получают по меньшей мере один антиген, где антиген представляет собой молекулу IL-1, белок IL-1, зрелый фрагмент IL-1, пептид IL-1 или мутеин IL-1, который несет по меньшей мере один второй сайт присоединения и (в) объединяют ВПЧ и по меньшей мере один антиген так, чтобы получать композицию, в которой по меньшей мере один антиген и ВПЧ сцеплены через по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй сайты присоединения.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1: результат сочетания белка mIL-1β119-269 с капсидным белком Qβ. Белки анализировали на 12% ДСН-полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым голубым. На левом крае даны молекулярные массы маркерных белков в кДа, идентичные белковым полосам, указанным на правом крае. Полоса 1: предварительно окрашенный маркерный белок (фирма New England Biolabs). Полоса 2: дериватизированный капсидный белок Qβ. Полоса 3: свободный восстановленный белок mIL-1β119-269. Полоса 4: результат реакции сочетания Qβ-mIL-1β119-269;

на фиг.2: Результат сочетания белка mIL-1α117-270 с капсидным белком Qβ.

Белки анализировали на 12% ДСН-полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым голубым. На левом крае даны молекулярные массы маркерных белков в кДа, идентичные белковым полосам, указанным на правом крае. Полоса 1: предварительно окрашенный маркерный белок (фирма New England Biolabs). Полоса 2: дериватизированный капсидный белок Qβ. Полоса 3: свободный восстановленный белок mIL-1α117-270. Полоса 4: результат реакции сочетания Qβ-mIL-1α117-270.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные понятия, употребляемые в настоящем описании, имеют общепринятые значения, которые очевидны специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение.

Адъювант: Понятие «адъювант» в контексте настоящего описания относится к неспецифическим стимуляторам иммунного ответа или субстанциям, которые обеспечивают образование депо в хозяине, и при объединении с вакциной и фармацевтической композицией соответственно, предлагаемыми в настоящем изобретении, могут еще в большей степени усиливать иммунный ответ. Предпочтительными адъювантами являются полный и неполный адъювант Фрейнда, адъювант на основе алюминия, предпочтительно гидроксид алюминия, и модифицированный мурамилдипептид. Кроме того, адъювантами являются минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол, а также адъюванты, которые можно применять для введения человеку, такие как БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области. Другие адъюванты, которые можно вводить в сочетании с композициями, предлагаемыми в изобретении, включают (но, не ограничиваясь ими) монофосфорильный липидный иммуномодулятор, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, соли алюминия (квасцы), MF-59, ОМ-174, ОМ-197, ОМ-294 и адъювант, применяемый в технологии, основанной на использовании вирус-липосомной (Virosomal) вакцины и адъюванта. Адъюванты могут также представлять собой смеси указанных субстанций. ВПЧ, как правило, относят к адъюванту. Однако понятие «адъювант» в контексте настоящего описания относится к адъюванту, который не представляет собой ВПЧ, применяемую в предлагаемых в изобретении композициях, а относится к дополнительному, отличному от ВПЧ компоненту.

Антиген: В контексте настоящего описания понятие «антиген» относится к молекуле, которая обладает способностью связываться антителом или Т-клеточным рецептором (ТКР), если презентируется с помощью молекул ГКГ. Понятие «антиген» в контексте настоящего описания включает также Т-клеточные эпитопы. Кроме того, антиген обладает способностью распознаваться иммунной системой и/или обладает способностью индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, что приводит к активации В- и/или Т-лимфоцитов. Однако по меньшей мере в некоторых случаях для этого может требоваться, чтобы антиген содержал или был связан с Th-клеточным эпитопом и использовался в адъюванте. Антиген может нести один или несколько эпитопов (В- и Т-эпитопы). Описанная выше специфическая реакция подразумевает, что антиген должен предпочтительно реагировать, как правило, с высокой степенью избирательности, с соответствующим ему антителом или ТКР и не вступать в реакцию с множеством других антител или ТКР, которые могут вырабатываться в ответ на другие антигены. В контексте настоящего описания антигены могут представлять собой также смеси нескольких индивидуальных антигенов.

Эпитоп: Понятие «эпитоп» относится к непрерывным или прерывистым областям антигена, предпочтительно полипептида, которые могут иммуноспецифически связываться антителом или Т-клеточным рецептором в контексте молекулы ГКГ. Касательно антител, специфическое связывание исключает неспецифическое связывание, но не обязательно исключает перекрестную реактивность. Эпитоп, как правило, содержит 5-10 аминокислот в пространственной конформации, которая является уникальной для области детерминанты.

Специфическое связывание (антитело/антиген): В контексте настоящего описания считается, что антитела специфически связываются, если их связывание с антигеном характеризуется аффинностью к связыванию (Ka) 106M-1 или более, предпочтительно 107М-1 или более, более предпочтительно 108M-1 или более и наиболее предпочтительно 109M-1 или более. Аффинность антитела легко может определять обычный специалист в данной области (например, с помощью анализа Скэтчарда, с помощью ELISA или Biacore-анализа).

Специфическое связывание (IL-1/рецептор IL-1): Взаимодействие между рецептором и лигандом рецептора можно характеризовать с помощью биофизических методов, хорошо известных в данной области, включая, например, ELISA или Biacore-анализ. Считается, что молекула IL-1 обладает способностью специфически связываться с рецептором IL-1, когда аффинность к связыванию (Ka) указанного IL-1 с указанным рецептором IL-1 составляет по меньшей мере 105M-1, предпочтительно по меньшей мере 106M-1, более предпочтительно по меньшей мере 107M-1, еще более предпочтительно по меньшей мере 108M-1 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 109M-1; где предпочтительно указанный рецептор IL-1 представляет собой мышиный или человеческий рецептор IL-1, наиболее предпочтительно человеческий рецептор. Предпочтительно также указанный рецептор IL-1 содержит или более предпочтительно состоит из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:166 - SEQ ID NO:169, наиболее предпочтительно указанный рецептор IL-1 содержит или предпочтительно состоит из любой из последовательностей, представленный в SEQ ID NO:166 и SEQ ID NO:167.

Ассоциированный: Понятия «ассоциированный» или «ассоциация» в контексте настоящего описания относится ко всем возможным путям, предпочтительно химическим взаимодействиям, с помощью которых две молекулы соединяют друг с другом. Химические взаимодействия включают ковалентные и нековалентные взаимодействия. Типичными примерами нековалентых взаимодействий являются ионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия или водородные связи, а основой ковалентных взаимодействий являются, например, ковалентные связи, такие как сложноэфирные связи, связи, осуществляемые с помощью простого эфира, сложного фосфоэфира, амидные, пептидные связи, связи типа углерод-фосфор, связи типа углерод-сера, такие как тиоэфирные связи, или имидные связи.

Сайт присоединения, первый: В контексте настоящего описания понятие «первый сайт присоединения» относится к элементу, который встречается в естественных условиях в ВПЧ или который искусственно добавляют к ВПЧ и с которым может связываться второй сайт присоединения. Первый сайт присоединения предпочтительно представляет собой белок, полипептид, аминокислоту, пептид, сахар, полинуклеотид, природный или синтетический полимер, вторичный метаболит или соединение (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид), или химически реактивную группу, такую как аминогруппа, карбоксильная группа, сульфгидрильная группа, гидроксильная группа, гуанидинильная группа, гистидинильная группа, или их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения химически реактивная группа в качестве первого сайта присоединения представляет собой аминогруппу аминокислоты, предпочтительно лизина. Первый сайт присоединения локализован, как правило, на поверхности, и предпочтительно на наружной поверхности ВПЧ. Множество первых сайтов присоединения присутствует на поверхности, предпочтительно на наружной поверхности вирусоподобной частицы, как правило, они имеют повторяющуюся конфигурацию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первый сайт присоединения ассоциирован с ВПЧ по меньшей мере через одну ковалентную связь, предпочтительно по меньшей мере через одну пептидную связь. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения первый сайт присоединения представляет собой встречающийся в естественных условиях в ВПЧ. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления изобретения первый сайт присоединения искусственно добавляют к ВПЧ.

Сайт присоединения, второй: в контексте настоящего описания понятие «второй сайт присоединения» относится к элементу, который встречается в естественных условиях в сочетании с молекулой IL-1 или который искусственно добавлен к молекуле и с которым может связываться первый сайт присоединения. Второй сайт присоединения молекулы IL-1 предпочтительно представляет собой белок, полипептид, пептид, аминокислоту, сахар, полинуклеотид, природный или синтетический полимер, вторичный метаболит или соединение (биотин, флуоресцеин, ретинол, дигоксигенин, ионы металлов, фенилметилсульфонилфторид), или химически реактивную группу, такую как аминогруппа, карбоксильная группа, сульфгидрильная группа, гидроксильная группа, гуанидинильная группа, гистидинильная группа, или их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления изобретения химически реактивная группа в качестве второго сайта присоединения представляет собой сульфгидрильную группу аминокислоты, предпочтительно такой аминокислоты, как цистеин. Таким образом, понятие «молекула IL-1, несущая по меньший мере один второй сайт присоединения», относится к конструкции, содержащей молекулу IL-1 и по меньшей мере один второй сайт присоединения. Однако в случае второго сайта присоединения, который не встречается в естественных условиях в сочетании с молекулой IL-1, такая конструкция, как правило и предпочтительно, дополнительно содержит «линкер». В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения второй сайт присоединения ассоциирован с молекулой IL-1 по меньшей мере через одну ковалентную связь, предпочтительно по меньшей мере через одну пептидную связь. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения второй сайт присоединения искусственно добавляют к молекуле через аминокислотный линкер, где линкер содержит или в альтернативном варианте представляет собой цистеин. Предпочтительно линкер сливают с молекулой IL-1 с помощью белковой связи.

Оболочечный белок: В контексте настоящего описания понятие «оболочечный белок» и понятие «капсидный белок», которые используются взаимозаменяемо в контексте настоящего описания, относится к вирусному белку, предпочтительно субъединице встречающегося в естественных условиях капсида вируса, предпочтительно РНКового фага, который обладает способностью включаться в вирусный капсид или ВПЧ.

Молекула IL-1: Понятие «молекула IL-1» или сокращенно «IL-1» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:130 - SEQ ID NO:140 и SEQ ID NO:163 - SEQ ID NO:165. Понятие «молекула IL-1» в контексте настоящего описания предпочтительно относится к любой из следующих молекул: белок IL-1, фрагмент IL-1, зрелый фрагмент IL-1, пептид IL-1 или мутеин IL-1, которые содержат или в другом варианте состоят из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:130 - SEQ ID NO:140 и SEQ ID NO:163 - SEQ ID NO:165. Кроме того, понятие молекула IL-1 в контексте настоящего описания, как правило и предпочтительно, относится к ортологам белков IL-1 из любых видов животных. Молекула IL-1 предпочтительно, но не обязательно, обладает способностью связываться с рецептором IL-1 и также предпочтительно обладает биологической активностью.

Молекула IL-1 альфа: Понятие «молекула IL-1 альфа» или сокращенно «IL-1 альфа» в контексте настоящего описания относится в белку IL-1 альфа, фрагменту IL-1 альфа, зрелому фрагменту IL-1 альфа, пептиду IL-1 альфа или мутеину IL-1 альфа, которые содержат или в другом варианте состоят из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO:36-48, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67-SEQ ID NO:88 и SEQ ID NO:163. В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения IL-1 альфа представляет собой человеческий IL-1 альфа 119-271 (SEQ ID NO:63).

Молекула IL-1 бета: Понятие «молекула IL-1 бета» или сокращенно «IL-1 бета» в контексте настоящего описания относится в белку IL-1 бета, фрагменту IL-1 бета, зрелому фрагменту IL-1 бета, пептиду IL-1 бета или мутеину IL-1 бета, которые содержат или в другом варианте состоят из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO:49 - SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:89-SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:130 - SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:165. В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения IL-1 бета представляет собой человеческий IL-1 бета 117-269 (SEQ ID NO:64).

Белок IL-1: Понятие «белок IL-1» в контексте настоящего описания относится к встречающемуся в естественных условиях белку, где аминокислотная последовательность указанного встречающегося в естественных условиях белка по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:62; или где указанный встречающейся в естественных условиях белок обладает способностью связываться с рецептором IL-1 и предпочтительно обладает биологической активностью. Понятие «белок IL-1» в контексте настоящего описания предпочтительно относится к встречающемуся в естественных условиях белку, где аминокислотная последовательность указанного встречающегося в естественных условиях белка по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:62; и где указанный встречающейся в естественных условиях белок обладает способностью связываться с рецептором IL-1 и предпочтительно обладает биологической активностью. Как правило и предпочтительно, понятие «белок IL-1» в контексте настоящего описания относится по меньшей мере к одному встречающемуся в естественных условиях белку, где указанный белок обладает способностью связываться с рецептором IL-1 и предпочтительно обладает биологической активностью и где указанный белок также содержит или в альтернативном варианте состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:62. Соответственно понятие «белок IL-1 альфа» относится к белку IL-1, содержащему или в альтернативном варианте состоящему из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:48, а понятие « белок IL-1 бета» относится к белку IL-1, содержащему или в альтернативном варианте состоящему из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:49 - SEQ ID NO:62.

Фрагмент IL-1: Понятие «фрагмент IL-1» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который содержит состоящий из последовательно расположенных остатков участок белка IL-1, где указанный полипептид состоит по меньшей мере из 50, предпочтительно по меньшей мере из 100, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 150 аминокислот. Как правило и предпочтительно, указанный фрагмент IL-1 состоит максимум из 300, более предпочтительно максимум из 250 и наиболее предпочтительно максимум из 200 аминокислот. Как правило и предпочтительно, фрагменты IL-1 обладают способностью связываться с рецептором IL-1 и также предпочтительно обладают биологической активностью. Таким образом, понятие «фрагмент IL-1 альфа» и «фрагмент IL-1 бета» относятся к фрагменту IL-1, как он определен выше, где белок IL-1 представляет собой белок IL-1 альфа или белок IL-1 бета соответственно.

Зрелый фрагмент IL-1: Понятие «зрелый фрагмент IL-1» в контексте настоящего описания относится фрагменту IL-1, где указанный фрагмент IL-1 представляет собой встречающийся в естественных условиях продукт созревания белка IL-1. Таким образом, понятия «зрелый фрагмент IL-1 альфа» и «зрелый фрагмент IL-1 бета» в контексте настоящего описания относится к зрелым фрагментам IL-1, как они определены выше, где указанный белок IL-1 представляет собой белок IL-1 альфа или белок IL-1 бета соответственно. Предпочтительными вариантами зрелых фрагментов IL-1 альфа являются SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:163. Предпочтительными вариантами зрелых фрагментов IL-1 бета являются SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:165.

Предпочтительные зрелые фрагменты IL-1 альфа содержат или предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей: (а) человеческий IL-1 альфа 119-271 (SEQ ID NO:63); (б) мышиный IL-1 альфа 117-270 (SEQ ID NO:65); (в) мышиный IL-1 альфа 117-270 (SEQ ID NO:163); и (г) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:163.

Предпочтительные зрелые фрагменты IL-1 бета содержат или предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей: (а) человеческий IL-1 бета 117-269 (SEQ ID NO:64); (б) человеческий IL-1 бета 116-269 (SEQ ID NO:165); (в) мышиный IL-1 бета 119-269 (SEQ ID NO:66); (г) мышиный IL-1 бета 119-269 (SEQ ID NO:164); и (д) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:165.

Пептид IL-1: Понятие «пептид IL-1» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, который содержит состоящий из последовательно расположенных остатков участок встречающегося в естественных условиях белка, где указанный белок обладает способностью связываться с рецептором IL-1 и предпочтительно обладает биологической активностью, где указанный полипептид состоит из 4-49, предпочтительно 6-35, наиболее предпочтительно 10-25 аминокислот. Пептид IL-1 может обладать, но, как правило, не обладает способностью связываться с рецептором IL-1 и, как правило, не обладает биологической активностью. Таким образом, понятия «пептид IL-1 альфа» и «пептид IL-1 бета» в контексте настоящего описания относятся к пептидам IL-1, как они определены выше, в которых указанный встречающийся в естественных условиях белок представляет собой белок IL-1 альфа или белок IL-1 бета соответственно. Предпочтительные пептиды IL-1 представлены в SEQ ID NO:82 - SEQ ID NO:116.

Мутеин IL-1: Понятие «мутеин IL-1» в контексте настоящего описания относится к молекуле, которая содержит или предпочтительно состоит из полипептида, выведенного из молекулы IL-1, предпочтительно из белка IL-1 альфа или IL-1 бета, фрагмента IL-1 альфа или IL-1 бета, зрелого фрагмента IL-1 альфа или IL-1 бета, или пептида IL-1 альфа, или IL-1 бета, где предпочтительно указанный полипептид обладает пониженной биологической активностью по сравнению с молекулой IL-1, из которой он выведен. Таким образом, мутеины IL-1 альфа и IL-1 бета представляют собой мутеины IL-1, как они определены выше, в которых указанный полипептид выведен из молекулы IL-1 альфа или молекулы IL-1 бета соответственно.

Биологическая активность предпочтительных мутеинов IL-1 составляет менее чем 80%, более предпочтительно менее чем 60%, еще более предпочтительно менее чем 40%, еще более предпочтительно менее чем 20% от биологической активности молекулы IL-1, из которой они выведены. Предпочтительные мутеины IL-1 выводят также из зрелого фрагмента IL-1, при этом биологическая активность такого мутеина IL-1 составляет менее чем 80%, более предпочтительно менее чем 60%, еще более предпочтительно менее чем 40%, еще более предпочтительно менее чем 20% от биологической активности зрелого фрагмента IL-1, из которого выведен этот мутеин IL-1. Наиболее предпочтительные мутеины IL-1 не обладают биологической активностью. Также предпочтительно, но не обязательно, мутеины IL-1 обладают способностью специфически связываться с рецептором IL-1. Наиболее предпочтительными являются мутеины IL-1, выведенные из (I) белка IL-1, предпочтительно из SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:62; или (II) более предпочтительно зрелого фрагмента IL-1, предпочтительно из любой из SEQ ID NO:63 - SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:130 и SEQ ID NO:163 - SEQ ID NO:165.

Мутеины IL-1, которые можно применять в настоящем изобретении, описаны у Kamogashira и др., J. Biochem. 104, 1988, c.837-840; Gehrke и др., The Journal of Biological Chemistry 265(11), 1990, c.5922-5925; Conca и др., The Journal of Biological Chemistry 266(25), 1991, c.16265-16268; Ju и др., PNAS 88, 1991, c.2658-2662; Auron и др., Biochemistry 31, 1992, c.6632-6638; Guinet и др., Eur. J. Biochem 211, 1993, c.583-590; Camacho, Biochemistry 32, 1993, c.8749-8757; Baumann, Journal of Recepror Research 13(1-4), 1993, c.245-262; Simon, The Journal of Biological Chemistry 268(13), 1993, c.9771-9779 и Simoncsits, Cytokine 6(2), 1994, c.206-214, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпочтительные мутеины IL-1 содержат или предпочтительно состоят из полипептида, который имеет аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности белка IL-1, фрагмента IL-1, зрелого фрагмента IL-1 или пептида IL-1 1-10, предпочтительно 1-6, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный остаток(ки) представляет(ют) собой остаток(ки), который(е): (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III). В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные аминокислотные остатки находятся в одном состоящем из последовательно расположенных остатков участке. Предпочтительными также являются мутеины IL-1, которые содержат или предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности белка IL-1, фрагмента IL-1, зрелого фрагмента IL-1, предпочтительно зрелого фрагмента IL-1, 1-10, предпочтительно 1-6, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный остаток (и) представляет(ют) собой остаток(ки), который(е): (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III).

Предпочтительными являются также мутеины IL-1, которые содержат или более предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:48 или SEQ ID NO:49 - SEQ ID NO:62, 1-10, предпочтительно 1-6, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(е) остаток(и) представляет(ют) собой остаток(ки), который(е): (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III). Предпочтительными являются также мутеины IL-1, которые содержат или предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей (I) любую из SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:163, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:63; или (II) любую последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:165, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64, 1-10, предпочтительно 1-6, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 аминокислотными остатками и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(е) остаток(ки) представляет(ют) собой (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III).

Предпочтительные мутеины IL-1 представляют собой также мутеины IL-1 альфа, где мутеины IL-1 альфа содержат или более предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:48 1-6, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный остаток (и) представляет(ют) собой остаток(ки), который(е): (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III).

Предпочтительные мутеины IL-1 альфа содержат или предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей (I) любую из SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:163, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:63, 1-6, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 аминокислотными остатками и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(е) остаток(и) представляет(ют) собой остаток(ки), которые: (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (1)-(III). Наиболее предпочтительные мутеины IL-1 альфа содержат или предпочтительно состоят из полипептиды, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63, 1-10, предпочтительно 1-6, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 аминокислотными остатками и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(е) остаток (и) представляет(ют) собой остаток(ки), которые: (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III).

Предпочтительными мутеинами IL-1 являются также мутеины IL-1 бета, где мутеины IL-1 бета содержат или более предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:49 - SEQ ID NO:62, 1-6, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 аминокислотными остатками и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(е) остаток(и) представляет(ют) собой остаток(ки), который(е): (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III). Другие предпочтительные мутеины IL-1 бета содержат или более предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:165, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64, 1-6, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 аминокислотными остатками и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(е) остаток (и) представляет(ют) собой остаток(ки), который(е): (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III). Наиболее предпочтительные мутеины IL-1 бета содержат или предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:64, 1-10, предпочтительно 1-6, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 аминокислотными остатками и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком, где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(е) остаток(и) представляет(ют) собой остаток(ки), который(е): (I) удален(ы) из полипептида в результате делеции, (II) встроен(ы) в полипептид, (III) заменен(ы) на другой аминокислотный остаток или (IV) или изменен(ы) в результате комбинации (I)-(III). Еще более предпочтительные мутеины IL-1 бета содержат или предпочтительно состоят из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из любой последовательности из группы, включающей SEQ ID NO:131 - SEQ ID NO:140.

Агонистическое действие/биологическая активность IL-1: Понятия «биологическая активность» или «биологически активный» в контексте настоящего описания касательно IL-1 относятся к способности молекулы IL-1 индуцировать производство IL-6 после системного введения животным, предпочтительно согласно методу, изложенному в примере 2Д и примере 3Д. Под биологической активностью молекулы IL-1 понимают также способность индуцировать пролиферацию тимоцитов (Epps и др., Cytokine 9(3), 1997 c.149-156), Т-хелперных клеток D10.G4.1 (Orencole и Dinarello, Cytokine 1(1), 1989, c.14-22) или способность индуцировать производство IL-6 из клеток MG64 или НаСаТ (Boraschi и др., J. Immunol. 155, 1995, с.4719-4725) или фибробластов (Dinarello и др., Current Protocols in Immunology 2000, c.6.2.1-6-2-7), или производство IL-2 из клеток тимомы EL-4 (Simon и др., J. Immunol. Methods 84(1-2), 1985, c.85-94), или способность ингибировать рост линии клеток человеческой меланомы А375 (Nakai и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 154, 1988, c.1189-1196).

Сцепленный: Понятие «сцепленный» или «сцепление (связь)» в контексте настоящего описания относится ко всем возможным путям, предпочтительно химическим взаимодействиям, с помощью которых по меньшей мере один первый сайт присоединения и по меньшей мере один второй сайт присоединения соединяют друг с другом. Химические взаимодействия включают ковалентные и нековалентные взаимодействия. Типичными примерами нековалентых взаимодействий являются ионные взаимодействия, гидрофобные взаимодействия или водородные связи, в то время как основой ковалентных взаимодействий являются, например, ковалентные связи, такие как сложноэфирные связи, связи, осуществляемые с помощью простого эфира, сложного фосфоэфира, амидные, пептидные связи, связи типа углерод-фосфор, связи типа углерод-сера, такие как тиоэфирные связи, или имидные связи. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения первый сайт присоединения и второй сайт присоединения сцепляют по меньшей мере через одну ковалентную связь, предпочтительно по меньшей мере через одну непептидную связь и еще более предпочтительно исключительно через непептидную(ые) связь(и). Однако под понятие «сцепленный» в контексте настоящего описания подпадает не только непосредственное сцепление по меньшей мере одного первого сайта присоединения и по меньшей мере одного второго сайта присоединения, но также в другом варианте и предпочтительно косвенное сцепление по меньшей мере одного первого сайта присоединения и по меньшей мере одного второго сайта присоединения через промежуточную(ые) молекулу(ы), и, как правило и предпочтительно, с помощью по меньшей мере одного, предпочтительно одного, гетеробифункционального перекрестносшивающего агента. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения первый сайт присоединения и второй сайт присоединения сцепляют через по меньшей мере одну ковалентную связь, предпочтительно через по меньшей мере одну пептидную связь и еще более предпочтительно исключительно через пептидную(ые) связь(и). В очень предпочтительном варианте осуществления изобретения первый сайт присоединения и второй сайт присоединения сцепляют исключительно с помощью пептидных связей, предпочтительно с помощью генного слияния, либо непосредственно, либо предпочтительно через аминокислотный линкер. В еще одном предпочтительном варианте осуществления второй сайт присоединения сцепляют с С-концом первого сайта присоединения исключительно с помощью пептидных связей, предпочтительно с помощью генного слияния.

Линкер: «Линкер» в контексте настоящего описания либо участвует в ассоциации второго сайта присоединения с молекулой IL-1 или уже содержит, практически состоит или состоит из второго сайта присоединения. Предпочтительно «линкер» в контексте настоящего описания уже содержит второй сайт присоединения, как правило и предпочтительно, но не обязательно, в виде одного аминокислотного остатка, предпочтительно остатка цистеина. «Линкер» в контексте настоящего описания обозначают также как «аминокислотный линкер», прежде всего, когда линкер, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток. Таким образом, понятия «линкер» и «аминокислотный линкер» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо. Однако не предусматривается, что линкер состоит только из аминокислотных остатков, даже если состоящий из аминокислотных остатков линкер является предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. Аминокислотные остатки линкера предпочтительно представляют собой встречающиеся в естественных условиях аминокислоты или не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты, известные в данной области, включая их полностью L- или D-изомеры и их смеси. Другими предпочтительными вариантами линкера, предлагаемого в настоящем изобретении, являются молекулы, содержащие сульфгидрильную группу или цистеиновый остаток, и следовательно такие молекулы также подпадают под объем изобретения. Другие линкеры, которые можно применять согласно настоящему изобретению, представляют собой молекулы, содержащие C1-C6алкильный, циклоалкильный, такой как циклопентильный или циклогексильный, циклоалкенильный, арильный или гетероарильный фрагмент. Однако в качестве линкеров, предлагаемых в настоящем изобретении, можно применять также линкеры, содержащие предпочтительно C1-C6алкильный, циклоалкильный (C5, C6), арильный или гетероарильный фрагмент и дополнительную(ые) аминокислоту(ы), и они подпадают под объем настоящего изобретения. Ассоциация линкера с молекулой IL-1 предпочтительно осуществляется с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, более предпочтительно с помощью по меньшей мере одной пептидной связи. Касательно связи посредством генного слияния линкер может отсутствовать или предпочтительно он представляет собой аминокислотный линкер, более предпочтительно аминокислотный линкер, состоящий исключительно из аминокислотных остатков. Очень предпочтительными линкерами для генного слияния являются гибкие аминокислотные линкеры. Касательно связи посредством генного слияния линкеры предпочтительно состоят из 1-20, более предпочтительно 2-15, еще более предпочтительно 2-10, еще более предпочтительно 2-5 и наиболее предпочтительно из 3 аминокислот. Очень предпочтительные линкеры для генного слияния содержат или предпочтительно состоят из GSG (SEQ ID NO:189).

Упорядоченный и повторяющийся набор антигенов: В контексте настоящего описания понятие «упорядоченный и повторяющийся набор антигенов», как правило, относится к повторяющейся организации антигена, как правило и предпочтительно, отличающейся единообразным пространственным расположением антигенов относительно вирусоподобной частицы соответственно. В одном из вариантов осуществления изобретения повторяющаяся организация может представлять собой геометрическую организацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие антигены, сшитые с ВПЧ РНКовых бактериофагов, являются типичными и предпочтительными примерами соответствующих упорядоченных и повторяющихся наборов антигенов, которые имеют также точно повторяющиеся паракристаллические схемы расположения антигенов, предпочтительно с интервалом от 1 до 30 нм, предпочтительно от 2 до 15 нм, еще более предпочтительно от 2 до 10 нм, еще более предпочтительно от 2 до 8 нм и наиболее предпочтительно от 1,6 до 7 нм.

Упакованная: Понятие «упакованная» в контексте настоящего описания относится к состоянию полианионной макромолекулы или иммуностимулирующих субстанций относительно ВПЧ. Понятие «упакованная» в контексте настоящего описания включает связывание, которое может быть ковалентным, например, путем химического сочетания, или нековалентным, например, путем ионных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, водородных связей и т.д. Понятие относится также к включению или частичному включению полианионной макромолекулы. Так, полианионная макромолекула или иммуностимулирующие субстанции можно включать в ВПЧ без осуществления фактического связывания, в частности с помощью ковалентной связи. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одну полианионную макромолекулу или иммуностимулирующие субстанции упаковывают внутрь ВПЧ, наиболее предпочтительно с помощью нековалентной связи. В том случае, когда указанные иммуностимулирующие субстанции представляют собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно ДНК, понятие упакованная означает, что нуклеиновая кислота недоступна для гидролиза нуклеазами, предпочтительно недоступна для гидролиза ДНКазами (например, ДНКазой I или бензоназой), где предпочтительно указанную доступность оценивают с помощью методов, описанных в примерах 11-17 WO 2003/024481 А2.

Полипептид: В контексте настоящего описания понятие «полипептид» относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), которые сцеплены линейно амидными связями (которые называют также пептидными связями). Понятие относится к молекулярной цепи аминокислот и не конкретизирует длину продукта. Так, под понятие полипептид подпадают пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды и белки. Под понятие подпадают также пост-трансляционные модификации полипептида, осуществляемые, например, путем гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т.п.

Рекомбинантная ВПЧ: Понятие «рекомбинантная ВПЧ» в контексте настоящего описания относится к ВПЧ, полученной с помощью процесса, который включает по меньшей мере одну стадию рекомбинантной ДНК. Понятие «полученная рекомбинантно ВПЧ» в контексте настоящего описания относится к ВПЧ, которую получают с помощью процесса, который включает по меньшей мере одну стадию рекомбинантной ДНК. Таким образом, понятия «рекомбинантная ВПЧ» и «полученная рекомбинантно ВПЧ» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо, и они имеют идентичное значение.

Вирусная частица: Понятие «вирусная частица» в контексте настоящего описания относится к морфологический форме вируса. У некоторых типов вируса она содержит геном, окруженный капсидным белком; у других имеет дополнительные структуры (например, оболочки, хвосты и т.д.).

Вирусоподобная частица (ВПЧ) в контексте настоящего описания относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной вирусной частице, или относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной структуре, напоминающей вирусную частицу, предпочтительно капсид вируса. Понятие «нерепликативный» в контексте настоящего описания обозначает отсутствие у генома, входящего в ВПЧ, способности к репликации. Понятие «неинфекционный» в контексте настоящего описания обозначает неспособность проникать в клетку-хозяина. Предпочтительно вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, является нерепликативной и/или неинфекционной, поскольку у нее отсутствуют полностью или частично вирусный геном или функции генома. В одном из вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирусную частицу, в которой вирусный геном инактивирован физически или химически. Как правило и более предпочтительно, у вирусоподобной частицы отсутствуют все или часть репликативных и инфекционных компонентов вирусного генома.

Вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, может содержать нуклеиновую кислоту из генома, отличного от ее генома. Обычным и предпочтительным вариантом вирусоподобной частицы, предлагаемой в настоящем изобретении, является вирусный капсид, такой как вирусный капсид соответствующего вируса, бактериофага, предпочтительно РНКового бактериофага. Понятия «вирусный капсид» или «капсид» относятся к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка. Как правило, они состоят из 60, 120, 180, 240, 300, 360 и более субъединиц вирусного белка. Как правило и предпочтительно, взаимодействия этих субъединиц приводит к формированию вирусного капсида или напоминающей вирусной капсид структуре с присущей ей повторяющейся организацией, при этом структура, как правило, является сферической или трубчатой. Например, капсиды РНКовых бактериофагов или HbcAg (внутренний (коровый) антиген вируса гепатита В) имеют сферическую форму, обладающую икосаэдральной симметрией. Понятие «капсидоподобная структура» в контексте настоящего описания относится к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка, которая имеет морфологическое строение, сходное с капсидом, как он определен выше, но не имеет характерного симметричного строения, сохраняя при этом достаточную упорядоченность и частоту встречаемости. Одной из общих характерных особенностей вирусной частицы и вирусоподобной частицы является высокая упорядоченность и повторяемость строения их субъединиц.

Вирусоподобная частица РНКового бактериофага: В контексте настоящего описания понятие «вирусоподобная частица РНКового бактериофага» относится к вирусоподобной частице, содержащей или предпочтительно практически состоящей или состоящей из оболочечных белков, их мутантов или фрагментов РНКового бактериофага. Кроме того, вирусоподобная частица РНКового бактериофага, имея структуру РНКового бактериофага, является нерепликативной или неинфекционной, и, как правило, у нее отсутствуют ген или гены, кодирующие комплекс репликации РНКового бактериофага, и, как правило, она лишена также гена или генов, кодирующих белок или белки, которые ответственны за связывание вируса с хозяином или за проникновение в хозяина. Однако под это определение подпадают также вирусоподобные частицы РНКовых бактериофагов, в которых вышеупомянутый(ые) ген или гены еще присутствуют, но являются неактивными, и вследствие этого такие частицы также представляют собой нерепликативные и неинфекционные вирусоподобные частицы РНКового бактериофага. Предпочтительные ВПЧ, выведенные из РНКовых бактериофагов, обладают икосаэдральной симметрией и состоят из 180 субъединиц (мономеров). Предпочтительными методами, с помощью которых вирусоподобной частице РНКового бактериофага придают нерепликативность и/или неинфекционность, являются физическая, химическая инактивация, например, УФ-облучение, обработка формальдегидом, как правило и предпочтительно, генетическая манипуляция.

Один или несколько: В контексте настоящего описания упоминание единственного числа может обозначать «по меньшей мере один» или «один или несколько», если не указано иное.

Идентичность аминокислотных последовательностей полипептидов можно определять общепринятым методом с помощью известных компьютерных программ, таких как программа Bestfit. При использовании программы Bestfit или любой другой программы для сравнительного анализа последовательностей, предпочтительно при использовании программы Bestfit, для решения вопроса о том, идентична ли конкретная последовательность, например, на 95% аминокислотной последовательности, с которой проводят сравнение, параметры устанавливают так, чтобы процент идентичности рассчитывать для полноразмерной аминокислотной последовательности, с которой проводят сравнение, и при этом допускается наличие «брешей» в гомологии вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в последовательности, с которой проводят сравнение. Вышеуказанный метод определения процента идентичности полипептидов применим для всех белков, полипептидов или их фрагментов, описанных в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении предложены композиции и способы повышения иммунных ответов против IL-1 у животного или человека. Композиции, предлагаемые в изобретении, содержат: (а) коровую частицу, несущую по меньшей мере один первый сайт присоединения, где коровая частица представляет собой вирусоподобную частицу (ВПЧ) или вирусную частицу; и (б) по меньшей мере один антиген, несущий по меньшей мере один второй сайт присоединения, где по меньшей мере один антиген представляет собой молекулу IL-1, предпочтительно выбранную из группы, включающей белок IL-1, зрелый фрагмент IL-1, пептид IL-1 и мутеин IL-1, где (а) и (б) ковалентно сцеплены через по меньшей мере один первый и по меньшей мере один второй сайт присоединения. Предпочтительно молекула IL-1 сцеплена с коровой частицей так, чтобы образовывать упорядоченный и повторяющийся набор антиген-ВПЧ. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 60, еще более предпочтительно по меньшей мере 120 и еще более предпочтительно по меньшей мере 180 молекул IL-1 сцеплены с коровой частицей.

В качестве ВПЧ, предлагаемой в изобретении, можно использовать любой вирус, известный в данной области, обладающий упорядоченной и повторяющейся структурой. Приведенные в качестве примера иллюстрации ДНКовых или РНКовых вирусов, оболочечный или капсидный белок которых можно применять для получения ВПЧ, описаны в WO 2004/009124 на странице 25, строки 10-21, на странице 26, строки 11-28, и на странице 28, строка 4 до страницы 31, строка 4. Указанный документ включен в настоящее описание в качестве ссылки.

Вирус или вирусоподобную частицу можно получать и очищать из зараженной вирусом клеточной культуры. Полученный в результате вирус или вирусоподобная частица, предназначенные для приготовления вакцины, предпочтительно должны быть нерепликативными или неинфекционными, более предпочтительно нерепликативными и неинфекционными. УФ-облучение, химическая обработка, например, формальдегидом или хлороформом, представляют собой общие методы, известные специалистам в данной области, которые предназначены для инактивации вируса.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления коровая частица представляет собой вирусную частицу, и при этом предпочтительно вирусная частица представляет собой бактериофаг, и при этом предпочтительно также бактериофаг представляет собой РНКовый бактериофаг, и при этом еще более предпочтительно также РНКовый бактериофаг представляет собой РНКовый бактериофаг, выбранный из Qβ, fr, GA или АР205.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения коровая частица представляет собой ВПЧ. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ВПЧ представляет собой рекомбинантную ВПЧ. Практически все обычные известные вирусы секвенированы и доступны научной общественности. Ген, кодирующий оболочечный белок, легко может идентифицировать специалист в данной области. Получение ВПЧ с помощью рекомбинантной экспрессии оболочечного белка в хозяине находится в компетенции специалиста в данной области.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица содержит или в другом варианте состоит из рекомбинантных белков, их мутантов или фрагментов вирусов, выбранных из группы, включающих а) РНКовые бактериофаги; б) бактериофаги; в) вирус гепатита В, предпочтительно его капсидный белок (Ulrich и др., Virus Res. 50, 1998, c.141-182) или его поверхностный белок (WO 92/11291); г) вирус кори (Warnes и др., Gene 160, 1995, c.173-178); д) вирус Синдбис; е) ротавирус (US 5071651 и US 5374426); ж) вирус ящура (Twomey и др., Vaccine 13, 1995, c.1603-1610); з) вирус Норвалка (Jiang X. и др., Science 250, 1990, c.1580-1583; Matsui S.M. и др., J. Clin. Invest. 87, 1991, c.1456-1461); и) альфавирус; к) ретровирус, предпочтительно его белок GAG (WO 96/30523); л) ретротранспозон Ту, предпочтительно белок р1; м) вирус человеческой папилломы (WO 98/15631); н) вирус полиомы; о) вирус табачной мозаики; и п) вирус домашних стад (Flock House Virus).

ВПЧ, которая содержит или состоит более чем из одного рекомбинантного белка, как правило, в контексте настоящего описания обозначают как мозаичная ВПЧ. В одном из вариантов осуществления изобретения ВПЧ представляет собой мозаичную ВПЧ, где мозаичная ВПЧ содержит или состоит более чем из одного рекомбинантного белка, предпочтительно двух рекомбинантных белков, наиболее предпочтительно двух рекомбинантных капсидных белков, их мутантов или фрагментов.

Понятие «фрагмент рекомбинантного белка» или понятие «фрагмент оболочечного белка» в контексте настоящего описания относится к полипептиду, длина которого составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% от длины рекомбинантного белка или оболочечного белка дикого типа соответственно, и который предпочтительно сохраняет способность формировать ВПЧ. Предпочтительно фрагмент получают с помощью по меньшей мере одной внутренней делеции, по меньшей мере одного укорочения или по меньшей мере одной их комбинации. Предпочтительно также фрагмент получают с помощью максимум 5, 4, 3 или 2 внутренних делеции, с помощью максимум 2 укорочений или с помощью одной их конкретной комбинации.

Понятие «фрагмент рекомбинантного белка» или «фрагмент оболочечного белка» относится также к полипептиду, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% аминокислотной последовательности «фрагмента рекомбинантного белка» или «фрагмента оболочечного белка» соответственно, как они определены выше, и который предпочтительно обладает способностью к сборке с образованием вирусоподобной частицы.

Понятие «мутантный оболочечный белок» относится к полипептиду, аминокислотная последовательность которого выведена из рекомбинантного белка дикого типа или оболочечного белка дикого типа соответственно, при этом аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85, 90, 95, 97 или 99% идентична последовательности дикого типа и предпочтительно сохраняет способность к сборке с образованием ВПЧ.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, представляет собой вирус гепатита В. Получение вирусоподобных частиц гепатита В описано среди прочего в WO 00/32227, WO 01/85208 и WO 01/056905. Все три документа специально включены в настоящее описание в качестве ссылки. Другие варианты HBcAg, пригодные для воплощения на практике настоящего изобретения, описаны на страницах 34-39 WO 01/056905.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения остаток лизиа интродуцируют в полипептид HBcAg с целью опосредования сцепления молекулы IL-1 с ВПЧ HBcAg. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения ВПЧ и композиции, предлагаемые в изобретении, получают с использованием HBcAg, который содержит или в другом варианте состоит из аминокислот 1-144 или 1-149, 1-185 SEQ ID NO:1, которая модифицирована, в результате чего аминокислоты в положениях 79 и 80 заменены на пептид, имеющий аминокислотную последовательность Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO:170). Это модификация приводит к замене SEQ ID NO:1 на SEQ ID NO:2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения остатки цистеина в положениях 48 и 110 SEQ ID NO:2 или в ее соответствующих фрагментах, предпочтительно 1-144 или 1-149, заменены в результате мутации на серин. Изобретение относится также к композициям, содержащим мутанты коревого белка вируса гепатита В, которые имеют вышеуказанные аминокислотные замены. Изобретение относится также к композициям и вакцинам соответственно, содержащим полипептиды HBcAg, которые содержат или в альтернативном варианте состоят из аминокислотных последовательностей, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентичны SEQ ID NO:2

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, содержит, практически состоит или в другом варианте состоит из рекомбинантных оболочечных белков, их мутантов или фрагментов РНКового бактериофага. Предпочтительно РНКовый бактериофаг выбирают из группы, включающей а) бактериофаг Qβ; б) бактериофаг R17; в) бактериофаг fr; г) бактериофаг GA; д) бактериофаг SP; е) бактериофаг MS2; ж) бактериофаг M11; з) бактериофаг МХ1; и) бактериофаг NL95; к) бактериофаг f2; л) бактериофаг РР7 и м) бактериофаг АР205.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения композиция содержит оболочечный белок, его мутанты или фрагменты РНКовых бактериофагов, где оболочечный белок имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей: (a) SEQ ID NO:3, относящуюся к СР (оболочечный белок) Qβ; (б) смесь SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 (относится к белку A1 Qβ); (в) SEQ ID NO:5 (капсидный белок R17); (г) SEQ ID NO:6 (капсидный белок fr); (д) SEQ ID NO:7 (капсидный белок GA); (е) SEQ ID NO:8 (капсидный белок SP); (ж) смесь SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; (з) SEQ ID NO:10 (капсидный белок MS2); (и) SEQ ID NO:11 (капсидный белок М11); (к) SEQ ID NO:12 (капсидный белок МХ1); (л) SEQ ID NO:13 (капсидный белок NL95); (м) SEQ ID NO:14 (капсидный белок f2); (н) SEQ ID NO:15 (капсидный белок РР7); и (о SEQ ID NO:21 (капсидный белок АР20).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ представляет собой мозаичную ВПЧ, которая содержит или в другом варианте состоит более чем из одной аминокислотной последовательности, предпочтительно двух аминокислотных последовательностей, оболочечных белков, их мутантов или фрагментов РНКового бактериофага.

В одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ содержит или в другом варианте состоит из двух различных оболочечных белков РНКового бактериофага, указанные два оболочечных белка имеют аминокислотную последовательность СР Qβ (SEQ ID NO:3) и СР Qβ A1 (SEQ ID NO:4) или СР SP (SEQ ID NO:8) и СР SP A1 (SEQ ID NO:9).

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, содержит или в другом варианте практически состоит или в другом варианте состоит из рекомбинантных оболочечных белков РНКового бактериофага Qβ, fr, AP205 или GA.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ, предлагаемая в изобретении, представляет собой ВПЧ РНКового бактериофага Qβ. Установлено, что капсид или вирусоподобная частица фага Qβ обладает икосаэдральной фагоподобной капсидной структурой с диаметром 25 нм и квази-симметрией Т=3. Капсид содержит 180 копий оболочечного белка, которые сцеплены в ковалентные пентамеры и гексамеры дисульфидными мостиками (Golmohammadi R. и др., Structure 4, 1996, c.543-5554), что позволяет получать обладающий высокой стабильностью капсид оболочечного белка Qβ. Однако капсиды или ВПЧ, полученные из рекомбинантного оболочечного белка Qβ, могут содержать субъединицы, не связанные или не полностью связанные дисульфидными мостиками с другими субъединицами капсида. Капсид или ВПЧ Qβ обладает также необычной устойчивостью к органическим растворителям и денатурирующим агентам. При создании изобретения неожиданно было установлено, что ДМСО и ацетонитрил при их применении в концентрациях порядка 30% и гуанидиний в концентрациях порядка 1М не оказывают воздействия на стабильность капсида. Высокая стабильность капсида или ВПЧ Qβ является имеющим преимущество признаком, в частности при их применении для иммунизации и вакцинации млекопитающих и человека согласно настоящему изобретению.

Другие предпочтительные согласно настоящему изобретению вирусоподобные частицы РНКовых бактериофагов, в частности Qβ и fr, представлены в WO 02/056905, содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Конкретно в примере 18 WO 02/056905 дано подробное описание получения частиц ВПЧ из Qβ.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ВПЧ, предлагаемая в изобретении, представляет собой ВПЧ РНКового бактериофага AP205. Компетентные в отношении сборки мутантные формы ВПЧ AP205, содержащие оболочечный белок AP205 с заменой пролина в положении 5 аминокислотной последовательности на треонин, можно применять также для воплощения на практике изобретения, и они являются предпочтительными дополнительными вариантами осуществления изобретения. В WO 2004/007538 описано, в частности в примере 1 и в примере 2, как получать ВПЧ, содержащие оболочечные белки АР205, и в частности их экспрессия и очистка. WO 2004/007538 включена в настоящее описание в качестве ссылки. ВПЧ АР205 обладают высокой иммуногенностью и их можно сцеплять с молекулой IL-1, как правило и предпочтительно, для получения конструкций вакцины, презентующих молекулу IL-1, ориентированную повторяющимся образом.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ, предлагаемая в изобретении, содержит или состоит из мутантного оболочечного белка вируса, предпочтительно РНКового бактериофага, где мутантный оболочечный белок модифицирован путем удаления по меньшей мере одного остатка лизина посредством замены и/или посредством делеции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ВПЧ, предлагаемая в изобретении, содержит или состоит из мутантного оболочечного белка вируса, предпочтительно РНКового бактериофага, где мутантный оболочечный белок модифицирован посредством добавления по меньшей мере одного остатка лизина путем замены и/или путем инсерции. Делеция, замена или добавление по меньшей мере одного остатка лизина позволяет варьировать уровень сочетания, т.е. количество молекул IL-1 на субъединицу ВПЧ вируса, предпочтительно РНКовых бактериофагов, в частности, для совместимости и соответствия требованиям, предъявляемым к вакцине.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции и вакцины, предлагаемые в изобретении, имеют антигенную плотность от 0,05 до 4,0. Понятие «антигенная плотность» в контексте настоящего описания относится к среднему количеству молекул IL-1, которое связано с субъединицей, и предпочтительно с оболочечным белком ВПЧ и предпочтительно ВПЧ РНКового бактериофага. При этом указанное значение рассчитывают как среднее для всех субъединиц ВПЧ, предпочтительно ВПЧ РНКового бактериофага, в композиции или вакцинах, предлагаемых в изобретении.

ВПЧ или капсиды из оболочечного белка фага Qβ презентуют определенное количество остатков лизина на своей поверхности, которые характеризуются определенной топологией, а именно, три остатка лизина направлены внутрь капсида и связываются с РНК, а четыре других остатка лизина выставлены снаружи капсида. Предпочтительно по меньшей мере один первый сайт присоединения представляет собой остаток лизина, направленный или расположенный на наружной поверхности ВПЧ.

В настоящем изобретении можно использовать мутанты Qβ, в которых «выставленные» остатки лизина заменены на остатки аргинина. Так, еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения вирусоподобная частица содержит, практически состоит или в другом варианте состоит из мутантных оболочечных белков Qβ. Предпочтительно эти мутантные оболочечные белки содержат или в другом варианте состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей a) Qβ-240 (SEQ ID NO:16, замена Lys13-Arg в SEQ ID NO:3) б) Qβ-243 (SEQ ID NO:17, замена Asn10-Lys в SEQ ID NO:3); в) Qβ-250 (SEQ ID NO:18, замена Lys2-Arg в SEQ ID NO:3) г) Qβ-251 (SEQ ID NO:19, замена Lys16-Arg в SEQ ID NO:3); и д) Qβ-259 (SEQ ID NO:20, замены Lys2-Arg, Lys16-Arg в SEQ ID NO:3). Конструирование, экспрессия и очистка описанных выше мутантных оболочечных белков Qβ, мутантных ВПЧ и капсидов на основе оболочечных белков Qβ соответственно описаны в WO 02/056905. В частности, следует упомянуть пример 18 вышеуказанной заявки.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения вирусоподобная частица содержит или в другом варианте практически состоит, или в другом варианте состоит из мутантных оболочечных белков Qβ или их мутантов или фрагментов и соответствующего белка А1. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения вирусоподобная частица содержит или в другом варианте практически состоит, или в другом варианте состоит из мутантного оболочечного белка, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:16, 17, 18, 19 или 20, и соответствующего белка А1.

Обнаружены также другие оболочечные белки РНКовых бактериофагов, которые обладают способностью к самосборке при экспрессии в бактериальном хозяине (Kastelein R.A. и др., Gene 23, 1983, c.245-254, Kozlovskaya T.M. и др., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287, 1986, c.452-455, Adhin M.R. и др., Virology 170, 1989, c.238-242 (1989), Priano С. и др., J. Mol. Biol. 249, 1995, c.283-297). Выявлены конкретные биологические и биохимические свойства фага GA (Ni CZ. и др., Protein Sci. 5, 1996, c.2485-2493. Tars K. и др., J. Mol.Biol. 271, 1997, c.759-773) и фага fr (Pushko P. и др., Prot. Eng. 6, 1993, c.883-891; Liljas L. и др., J Mol. Biol. 244, 1994, c.279-290). Определена кристаллическая структура некоторых РНКовых бактериофагов (Golmohammadi R. и др., Structure 4, 1996, c.543-554). На основе этой информации можно идентифицировать находящиеся на поверхности остатки и благодаря этому оболочечные белки РНКовых бактериофагов можно модифицировать таким образом, чтобы один или несколько реакционноспособных аминокислотных остатков можно было встраивать путем инсерции или замены. Другим преимуществом ВПЧ, выведенных из РНКовых бактериофагов, является их высокий уровень экспрессии в бактериях, что позволяет получать большие количества материала по приемлемой цене.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один антиген, предпочтительно 1-4, более предпочтительно 1-3, еще более предпочтительно 1-2 антигена и наиболее предпочтительно только один антиген, где антиген представляет собой молекулу IL-1, предпочтительно белок IL-1, фрагмент IL-1, зрелый фрагмент IL-1, пептид IL-1 или мутеин IL-1, где молекула IL-1 предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:130 - SEQ ID NO:140 и SEQ ID NO:163 - SEQ ID NO:165.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антиген представляет собой молекулу IL-1, полученную из организма, который выбран из группы, включающей: (а) люди; (б) приматы; (в) грызуны; (г) лошади; (д) овцы; (е) кошки; (ж) коровы; (з) свиньи; (и) кролики; (к) собаки; (л) мыши и (к) крысы. Наиболее предпочтительно молекулу IL-1 получают из организма человека, предпочтительно она содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, любой из SEQ ID NO:67-110 и любой из SEQ ID NO:130-140 и SEQ ID NO:165.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу IL-1 получают из организма крысы или мыши, предпочтительно мыши, где молекула IL-1 предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, любой из SEQ ID NO:111 - SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:163 и SEQ ID NO:164.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой молекулу IL-1 альфа, предпочтительно белок IL-1 альфа, фрагмент IL-1 альфа, зрелый фрагмент IL-1 альфа, пептид IL-1 альфа или мутеин IL-1 альфа, где молекула IL-1 альфа предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO:36-48, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67-88 и SEQ ID NO:165. В частности, предпочтительными вариантами осуществления молекул IL-1 альфа являются человеческие молекулы IL-1 альфа, предпочтительно человеческие белки IL-1 альфа, человеческие фрагменты IL-1 альфа или человеческие зрелые фрагменты IL-1 альфа, где молекулы IL-1 альфа предпочтительно содержат или еще более предпочтительно состоят из пептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:63 и SEQ ID NO:163, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:63.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой молекулу IL-1 бета, предпочтительно белок IL-1 бета, фрагмент IL-1 бета, зрелый фрагмент IL-1 бета, пептид IL-1 бета или мутеин IL-1 бета, где молекула IL-1 бета предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO:49-62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:89-116, SEQ ID NO:130 - SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:165. В частности, предпочтительными вариантами осуществления молекул IL-1 бета являются человеческие молекулы IL-1 бета, предпочтительно человеческие белки IL-1 бета, человеческие фрагменты IL-1 бета или человеческие зрелые фрагменты IL-1 бета, где молекулы IL-1 бета предпочтительно содержат или еще более предпочтительно состоят из пептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:130 - SEQ ID NO:140 и SEQ ID NO:165, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой белок IL-1, фрагмент IL-1 или предпочтительно зрелый фрагмент IL-1, где белок IL-1, фрагмент IL-1 или зрелый фрагмент IL-1 предпочтительно обладают способностью связываться с рецептором IL-1 и еще более предпочтительно дополнительно обладает также биологической активностью.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой белок IL-1, где белок IL-1 предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:62.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой белок IL-1 альфа, где белок IL-1 альфа предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:48. Наиболее предпочтительно белок IL-1 альфа представляет собой человеческий белок IL-1 альфа, где человеческий белок IL-1 альфа предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична SEQ ID NO:36.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой белок IL-1 бета, где белок IL-1 бета предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO:49 - SEQ ID NO:62. Наиболее предпочтительно белок IL-1 бета представляет собой человеческий белок IL-1 бета, где человеческий белок IL-1 бета предпочтительно содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична SEQ ID NO:49.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой фрагмент IL-1, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1, и где фрагмент IL-1 или зрелый фрагмент IL-1 предпочтительно получают из организма мыши или человека, наиболее предпочтительно человека. Предпочтительно фрагмент IL-1 или зрелый фрагмент IL-1 содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:63 - SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:130 и SEQ ID NO:163 - SEQ ID NO:165.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения зрелый фрагмент IL-1 представляет собой зрелый фрагмент IL-1 альфа, где зрелый фрагмент IL-1 альфа предпочтительно обладает биологической активностью и, кроме того, где зрелый фрагмент IL-1 альфа содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:65, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:63.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения зрелый фрагмент IL-1 представляет собой зрелый фрагмент IL-1 бета, где зрелый фрагмент IL-1 бета предпочтительно обладает биологической активностью и, кроме того, где зрелый фрагмент IL-1 бета содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:130, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой пептид IL-1, где пептид IL-1 получают из организма мыши или человека, наиболее предпочтительно человека. Предпочтительно пептид IL-1 содержит или еще более предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:67 - SEQ ID NO:116.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 представляет собой мутеин IL-1, где предпочтительно мутеин IL-1 обладает пониженной биологической активностью или более предпочтительно не обладает биологической активностью, и где мутеин IL-1 обладает способностью связываться с рецептором IL-1. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мутеин IL-1 содержит или предпочтительно состоит из полипептида, аминокислотная последовательность которого отличается от аминокислотной последовательности зрелого фрагмента IL-1 1-3, более предпочтительно 1-2 и наиболее предпочтительно точно 1 аминокислотным остатком. В другом варианте осуществления изобретения мутеин IL-1 представляет собой мутеин IL-1 бета, предпочтительно человеческий мутеин IL-1 бета, наиболее предпочтительно человеческий мутеин IL-1 бета, выбранный из SEQ ID NO:131 - SEQ ID NO:140.

Настоящее изобретение относится к способу получения композиции, предлагаемой в изобретении, заключающемуся в том, что (а) получают ВПЧ, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения; (б) получают по меньшей мере один антиген, где антиген представляет собой молекулу IL-1, белок IL-1, фрагмент IL-1, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1, пептид IL-1 или мутеин IL-1, которые несут по меньшей мере один второй сайт присоединения; и (в) объединяют ВПЧ и по меньшей мере один антиген с получением композиции, где по меньшей мере один антиген и ВПЧ сцепляют через первый и второй сайты присоединения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения получение по меньшей мере одного антигена, т.е. молекулы IL-1, белка IL-1, фрагмента IL-1, предпочтительно зрелого фрагмента IL-1, пептида IL-1 или мутеина IL-1, которые несут по меньшей мере один второй сайт присоединения, осуществляют с помощью экспрессии, предпочтительно с помощью экспрессии в бактериальной системе, предпочтительно в E.coli. Как правило, для облегчения процесса очистки добавляют используемую в очистке метку, такую как His-метка, Мус-метка, Fc-метка или НА-метка. Согласно другому подходу пептиды IL-1 или мутеины IL-1, которые состоят не более чем из 50 аминокислот, получают с помощью химического синтеза.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ, несущую по меньшей мере один первый сайт присоединения, сцепляют с молекулой IL-1 с помощью по меньшей мере одного второго сайта присоединения через по меньшей мере одну пептидную связь. Ген, кодирующий молекулу IL-1, предпочтительно фрагмент IL-1, лигируют в рамке считывания, либо внутри нее, либо предпочтительно связывают с N- или С-концом гена, кодирующего оболочечный белок ВПЧ. Слияние можно осуществлять также путем встраивания последовательностей IL-1 в мутантные оболочечные белки, где часть последовательности оболочечного белка удалена путем делеции, который обозначают также как укороченные мутанты. Укороченные мутанты могут иметь делеции части последовательности оболочечного белка на N- или С-конце или внутренние делеции. Например, конкретно в ВПЧ HbcAg аминокислоты 79-80 заменяют на чужеродный эпитоп. Слитый белок должен предпочтительно сохранять способность к сборке в ВПЧ при экспрессии, что можно оценивать с помощью электронной микроскопии.

Для увеличения расстояния между оболочечным белком и чужеродным эпитопом можно добавлять фланкирующие аминокислотные остатки. Остатки глицина и серина являются особенно предпочтительными аминокислотами для применения в фланкирующих последовательностях. Такая фланкирующая последовательность обеспечивает дополнительную гибкость, которая может снижать потенциальное дестабилизирующее действие слияния чужеродной последовательности с последовательностью субъединиц ВПЧ и может уменьшать воздействие присутствия чужеродного эпитопа на сборку.

В других вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одну молекулу IL-1, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1, можно сливать с несколькими другими вирусными оболочечными белками, например, с С-концом укороченной формы белка A1 Qβ (Kozlovska Т.М., и др., Intervirology 39, 1996, c.9-15), или встраивать между положением 72 и 73 СР-удлинения. В качестве другого примера IL-1 можно встраивать между аминокислотами 2 и 3 СР фага fr, что позволяет получать слитый белок: IL-1 - СР fr (Pushko P. и др., Prot. Eng. 6, 1993, c.883-891). Кроме того, IL-1 можно сливать с N-концом выступающей β-«шпильки» оболочечного белка РНКового бактериофага MS-2 (WO 92/13081). В другом варианте IL-1 можно сливать с капсидным белком вируса папилломы, предпочтительно с основным капсидным белком L1 бычьего вируса папилломы типа 1 (BPV-1) (Chackerian В. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1999, c.2373-2378, WO 00/23955). Замена аминокислот 130-136 L1 BPV-1 на IL-1 представляет собой также предпочтительный вариант осуществления изобретения. Другие варианты слияния молекулы IL-1 с оболочечным белком, его мутантами или фрагментами, с оболочечным белком вируса, описаны в WO 2004/009124 со стр.62, строка 20 до стр.68, строка 17 и включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В US 5698424 описан модифицированный оболочечный белок бактериофага MS-2, который может образовывать капсид, где оболочечный белок модифицируют путем встраивания остатка цистеина в N-концевую область «шпильки», и путем замены каждого из остатков цистеина, локализованных вне N-концевой области «шпильки», на остаток аминокислоты, отличной от цистеина. Встроенный цистеин затем можно сцеплять непосредственно с требуемыми видами молекул, которые требуется презентировать, такими как эпитоп или антигенный белок.

Однако следует отметить, что присутствие в капсиде выступающего свободного остатка цистеина может приводить к олигомеризации капсидов в результате образования дисульфидных мостиков. Кроме того, связь между капсидами и антигенными белками с помощью дисульфидных мостиков является лабильной, в частности, в молекулах, содержащих сульфгидрильную группу, и кроме того является менее стабильной в сыворотке по сравнению, например, с тиоэфирными связями (Martin F.J. и Papahadjopoulos D. Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles, J. Biol. Chem. 257, 1982, c.286-288).

Таким образом, согласно еще одному наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения ассоциация или сцепление между ВПЧ и по меньшей мере одним антигеном, т.е. молекулой IL-1, не содержит дисульфидный мостик. Кроме того, является предпочтительным, чтобы по меньшей мере одна вторая связь содержала или предпочтительно представляла собой сульфгидрильную группу. Согласно еще одному также наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения ассоциация или сцепление между ВПЧ и по меньшей мере одной молекулы IL-1 не содержит связь типа сера-сера. Согласно еще одному наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере один второй сайт присоединения содержит или предпочтительно представляет собой сульфгидрильную группу. В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один первый сайт присоединения не представляет собой или не содержит сульфгидрильную группу. И согласно еще одному наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере один первый сайт присоединения не представляет собой или не содержит сульфгидрильную группу цистеина.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере один первый сайт присоединения содержит аминогруппу, а второй сайт присоединения содержит сульфгидрильную группу.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения только один из указанных вторых сайтов присоединения ассоциирован с первым сайтом присоединения по меньшей мере через одну непептидную ковалентную связь, приводящую к одному и однородному типу связывания молекулы IL-1 с коровой частицей, где только один второй сайт присоединения, который ассоциирован с первым сайтом присоединения, представляет собой сульфгидрильную группу и где молекула IL-1 и коровая частица взаимодействует посредством ассоциации с образованием упорядоченного и повторяющегося набора антигенов.

В другом предпочтительном варианте осуществления молекула IL-1, предпочтительно белок IL-1, более предпочтительно зрелый фрагмент IL-1, еще более предпочтительно зрелый фрагмент IL-1, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:63 - SEQ ID NO:66, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:64, сливают либо с N-, либо с С-концом, предпочтительно с С-концом, оболочечного белка, его мутантов или фрагментов РНКового бактериофага АР205. ВПЧ, содержащие слитые белки оболочечного белка бактериофага АР205 с антигеном, описаны в целом в WO 2006/032674 A1, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. В одном из других предпочтительных вариантов осуществления изобретения слитый белок содержит также линкер, где линкер сливают с оболочечным белком, его фрагментами или мутантами АР205 и молекулой IL-I. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулу IL-I сливают с С-концом оболочечного белка АР205, его фрагментов или мутантов через линкер.

Было установлено, что молекулы IL-I, в частности белки IL-I и фрагменты IL-I, содержащие по меньшей мере 100 и вплоть до 300 аминокислот, как правило и предпочтительно, примерно от 140 до 160 аминокислот, и наиболее предпочтительно примерно 155 аминокислот, можно сливать с оболочечным белком бактериофагов, предпочтительно с оболочечным белком АР205, сохраняя при этом способность оболочечного белка к самосборке в ВПЧ.

С учетом большого размера белков IL-I, фрагментов IL-I и зрелых фрагментов IL-I, а также с позиций стерических особенностей, конструировали систему экспрессии, продуцирующую мозаичные ВПЧ, содержащие оболочечные белки АР205, слитые с молекулой IL-I, а также с субъединицами оболочечного белка дикого типа (wt). В этой системе супрессия стоп-кодона позволяет получать слияние оболочечного белка АР205 - IL-1, а правильная терминация позволяет получать оболочечный белок АР205 дикого типа. Оба белка получают одновременно в клетке и осуществляют сборку с получением мозаичной ВПЧ. Преимуществом такой системы является то, что крупные белки можно презентовать без воздействия на сборку ВПЧ. Уровень включения слитого белка АР205 - IL-1 в мозаичную ВПЧ зависит от уровня подавления, АР205 - IL-1 экспрессируют в клетках E.coli, которые уже содержат плазмиду, сверхэкспрессирующую супрессорную тРНК. Для супрессиии опал-мутации использовали плазмиду pISM3001 (Smiley B.K., Minion, F.C., «Enhanced readthrough of opal (UGA) stop codons and production of Mycoplasma pneumoniae P1 epitopes in Escherichia coli». Gene 134, 1993, c.33-40), которая кодирует супрессорную тРНК, распознающую опал-стоп-кодон и интродуцирующую Trp. Супрессию амбер-терминации можно повышать путем использования плазмиды pISM579, в которой происходит сверхэкспрессия тРНК, также распознающей амбер-стоп-кодон и интродуцирующей Trp. Плазмиду pISM579 создавали путем «вырезания» гена trpT176 из pISM3001 с помощью рестриктазы EcoRI и ее замены EcoRI-фрагментом из плазмиды pMY579 (любезно предоставлена Michael Yarus), которая содержит тРНК гена-супрессора амбер-мутации. Этот ген-супрессор тРНК является мутантом trpT175 (Raftery LA. и др., J. Bacteriol. 158, 1984, c.849-859) и отличается от trpT по трем положениям: G33, А24 и Т35. Экспрессия слитого белка АР205 - интерлейкин-1 альфа в штамме E.coli с амбер-супрессией (supE или glnV), таком как E.coli JM109, позволяет создавать часть слитых белков АР205 - IL-1 с Gln вместо Trp, интродуцированном в амбер-стоп-кодон, в дополнение к слитым белкам АР205 - IL-1, у которых Trp интродуцирован в амбер-стоп-кодон. Таким образом, идентичность аминокислотной трансляции на стоп-кодоне может зависеть от комбинации сверхэкспрессируемой супрессиорной тРНК и фенотипа штамма. Как описано у Miller JH и др., J. Mol. Biol. 164, 1983, c.59-71) и как хорошо известно в данной области, эффективность супрессии зависит от контекста. В частности, 3'-кодон стоп-кодона и первое основание в направлении 3'-конца от стоп кодона являются наиболее важными. Например, как правило, эффективно подавляются стоп-кодоны, за которыми расположено пуриновое основание.

Так, в предпочтительном варианте осуществления изобретения ВПЧ представляет собой мозаичную ВПЧ, где мозаичная ВПЧ содержит или предпочтительно состоит по меньшей мере из одного, предпочтительно одного первого полипептида и по меньшей мере одного, предпочтительно одного, второго полипептида, где первый полипептид представляет собой рекомбинантный капсидный белок, его мутант или фрагменты; и второй полипептид представляет собой продукт генного слияния рекомбинантного капсидного белка, его мутанта или фрагментов, предпочтительно первого полипептида, с молекулой IL-1. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первый полипептид представляет собой рекомбинантный капсидный белок бактериофага АР205 или его мутанта или фрагмента. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первый полипептид выбирают из SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения первый полипептид имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:21. Мозаичные ВПЧ на основе бактериофага АР205, содержащие антиген, описаны в целом в WO 2006/032674 A1, в частности, в разделе 107 указанной публикации. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения второй полипептид представляет собой продукт генного слияния рекомбинантного капсидного белка, его мутанта или фрагментов, предпочтительно первого полипептида, с молекулой IL-1, где молекула IL-1 слита с С-концом рекомбинантного капсидного белка, его мутанта или фрагментов, предпочтительно через аминокислотный линкер. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула IL-1 содержит или предпочтительно состоит из 100-300 аминокислот, как правило, и предпочтительно примерно 140-160 аминокислот, и наиболее предпочтительно примерно из 155 аминокислот. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения молярное соотношение первого полипептида и второго полипептида в мозаичной ВПЧ составляет от 10:1 до 5:1, предпочтительно от 8:1 до 6:1, наиболее предпочтительно примерно 7:1. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения композиция содержит или в другом варианте практически состоит из вирусоподобной частицы, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения, сцепленный по меньшей мере с одним антигеном, т.е. молекулой IL-1, которая несет по меньшей мере один второй сайт присоединения, через по меньшей мере одну ковалентную связь, где предпочтительно ковалентная связь представляет собой непептидную связь. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первый сайт присоединения содержит или предпочтительно представляет собой аминогруппу, предпочтительно аминогруппу остатка лизина. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения второй сайт присоединения содержит или предпочтительно представляет собой сульфгидрильную группу, предпочтительно сульфгидрильную группу цистеина.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один первый сайт присоединения представляет собой аминогруппу, предпочтительно аминогруппу остатка лизина, а по меньшей мере один второй сайт присоединения представляет собой сульфгидрильную группу, предпочтительно сульфгидрильную группу цистеина.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления молекулу IL-1 сцепляют с ВПЧ с помощью химического перекрестного сшивания, как правило и предпочтительно, с помощью гетеробифункционального перекрестносшивающего агента. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения гетеробифункциональный перекрестносшивающий агент содержит функциональную группу, которая может вступать во взаимодействие с предпочтительными первыми сайтами присоединения, предпочтительно с аминогруппой, более предпочтительно с аминогруппами остатка(ов) лизина ВПЧ, и дополнительную функциональную группу, которая может вступать во взаимодействие с предпочтительным вторым сайтом присоединения, т.е. сульфгидрильной группой, предпочтительно присущей остатку(ам) цистеина, или искусственно добавленной к молекуле IL-1, и необязательно может обеспечивать также его доступность для реакции путем восстановления. В данной области известно несколько гетеробифункциональных перекрестносшивающих агентов. Они представляют собой предпочтительные перекрестносшивающие агенты SMPH (фирма Pierce), сульфо-MBS, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMPB, сульфо-SMCC, SVSB, SIA и другие перекрестносшивающие агенты, которые выпускаются, например, фирмой Pierce Chemical Company, и имеют одну функциональную группу, реакционноспособную в отношении аминогрупп, и одну функциональную группу, реакционноспособную в отношении сульфгидрильных групп. Все указанные выше перекрестносшивающие агенты приводят к образованию амидной связи после взаимодействия с аминогруппой и тиоэфирной связи после взаимодействия с сульфгидрильными группами. Другой класс перекрестносшивающих агентов, которые можно применять для воплощения изобретения на практике, отличается тем, что при сшивании происходит введение дисульфидного мостика между молекулой IL-1 и ВПЧ. Предпочтительные перекрестносшивающие агенты, принадлежащие к этому классу, представляют собой, например, SPDP и сульфо-LC-SPDP (фирма Pierce).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, дополнительно содержит линкер. Так, в некоторых вариантах осуществления изобретения создание второго сайта присоединения в молекуле IL-1 достигают путем ассоциации линкера, который предпочтительно содержит по меньшей мере одну аминокислоту, пригодную в качестве второго сайта присоединения. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкер ассоциируют с молекулой IL-1 с помощью по меньшей мере одной ковалентной связи, предпочтительно с помощью по меньшей мере одной, предпочтительно одной пептидной связи. Предпочтительно линкер содержит или в альтернативном варианте состоит из второго сайта присоединения. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения линкер содержит сульфгидрильную группу, предпочтительно остатка цистеина. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислотный линкер представляет собой остаток цистеина.

Выбор линкера должен зависеть от природы молекулы IL-1, от ее биохимических свойств, таких как pI, распределение заряда и гликозилирование. В целом, предпочтительными являются гибкие аминокислотные линкеры. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения линкер состоит из аминокислот, предпочтительно также линкер состоит максимум из 25, предпочтительно максимум из 20, более предпочтительно максимум из 15 аминокислот. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислотный линкер содержит 1-10 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения линкер выбирают из группы, включающей: (a) CGG (SEQ ID NO:171); (б) N-концевой линкер гамма 1, предпочтительно CGDKTHTSPP (SEQ ID NO:172); (в) N-концевой линкер гамма 3, предпочтительно CGGPKPSTPPGSSGGAP, SEQ ID NO:173); (г) шарнирные области Ig; (д) N-концевые глициновые линкеры, предпочтительно GCGGGG (SEQ ID NO:174); (e) (G)kC(G)n, где n=0-12 и k=0-5 (SEQ ID NO:175); (ж) N-концевые глицин-сериновые линкеры, предпочтительно (GGGGS)n, n=1-3 (SEQ ID NO:176) с одним дополнительным остатком цистеина; (з) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n, где n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2 (SEQ ID NO:177); (и) GGC (SEQ ID NO:178); (к) GGC-NH2 (SEQ ID NO:179); (л) С-концевой линкер гамма 1, предпочтительно DKTHTSPPCG (SEQ ID NO:180); (м) С-концевой линкер гамма 3, предпочтительно PKPSTPPGSSGGAPGGCG (SEQ ID NO:181); (н) С-концевые глициновые линкеры, предпочтительно GGGGCG (SEQ ID NO:182); (о) (G)nC(G)k, где n=0-12 и k=0-5 (SEQ ID NO:183); (п) С-концевые глицин-сериновые линкеры, предпочтительно (SGGGG)n, где n=1-3 (SEQ ID NO:184) с одним дополнительным цистеином; (р) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k, где n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2 и o=0-8 (SEQ ID NO:185). В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения линкер добавляют к N-концу молекулы IL-1. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения линкер добавляют к С-концу молекулы IL-1.

Предпочтительными линкерами, предлагаемыми в изобретении, являются глициновые линкеры (G)n, дополнительно содержащие остаток цистеина в качестве второго сайта присоединения, такие как N-концевой глициновый линкер (GCGGGG, (SEQ ID NO:174) и С-концевой глициновый линкер (GGGGCG, SEQ ID NO:182). В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения линкеры представляют собой С-концевой глицин-лизиновый линкер (GGKKGC, SEQ ID NO:186) и N-концевой глицин-лизиновый линкер (CGKKGG, SEQ ID NO:187), GGCG (SEQ ID NO:188) и GGC (SEQ ID NO:178) или GGC-NH2-линкеры (SEQ ID NO:179, «NH2» обозначает группу, предназначенную для амидирования) на С-конце пептида или CGG (SEQ ID NO:171) на его N-конце. Как правило, глициновые остатки должны быть встроены между имеющими большой объем аминокислотами, а остаток цистеина следует применять в качестве второго сайта присоединения, для того, чтобы избегать возможной стерической помехи, связанной с объемной аминокислотой при реакции сочетания.

Сцепление молекулы IL-1 с ВПЧ с помощью гетеробифункционального перекрестносшивающего агента согласно описанным выше предпочтительным методам позволяет осуществлять сочетание молекулы IL-1 с ВПЧ в определенной ориентации. Другие методы сцепления молекулы IL-1 с ВПЧ включают методы, при которых молекулу IL-1 перекрестно сшивают с ВПЧ с использованием карбодиимида ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и NHS (N-гидроксисукцинимид). Молекулу IL-1 можно также сначала тиолировать с помощью реакции, например, с SATA, SATP или иминотиоланом. Затем молекулу IL-1 после удаления при необходимости защитной группы можно сшивать с ВПЧ с помощью следующего метода. После отделения избытка тиолирующего реагента молекулу IL-1 подвергают взаимодействию с ВПЧ, которую предварительно активируют с помощью гетеробифункционального перекрестносшивающего агента, который содержит реактивный остаток цистеина и поэтому несет по меньшей мере одну или несколько функциональных групп, обладающих реакционной способностью в отношении остатков цистеина, с которым тиолированная молекула IL-1 может вступать в указанное выше взаимодействие. Необязательно в реакционную смесь вносят небольшие количества восстановителя. Согласно другим методам молекулу IL-1 присоединяют к ВПЧ с помощью гомобифункционального перекрестносшивающего агента, такого как глутаровый альдегид, DSG, ВМ[РЕО]4, BS3 (фирма Pierce) или других известных гомобифункциональных перекрестносшивающих агентов, несущих функциональные группы, которые обладают реакционной способностью в отношении аминогруппы или карбоксильных групп ВПЧ.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит или в другом варианте практически состоит из вирусоподобной частицы, сцепленной с молекулой IL-1 посредством химических взаимодействий, где по меньшей мере одно из этих взаимодействий не представляет собой ковалентную связь.

Сцепление ВПЧ с молекулой IL-1 можно осуществлять путем биотинилирования ВПЧ и экспрессии молекулы IL-1, предлагаемой в изобретении, в виде белка, слитого со стрептавидином.

Одну или несколько молекул антигена, т.е. молекул IL-1, можно присоединять к одной субъединице ВПЧ, предпочтительно из оболочечных белков РНКового бактериофага, предпочтительно через выступающие остатки лизина ВПЧ из оболочечных белков РНКового бактериофага, если это можно осуществлять с позиций стерического строения. Специфической особенностью ВПЧ из РНКовых бактериофагов и прежде всего ВПЧ из оболочечных белков Qβ является возможность к связыванию нескольких антигенов на субъединицу. Это позволяет создавать наборы антигенов с высокой плотностью.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекулу IL-1 сцепляют через остаток цистеина, который добавляют либо к N-концу, либо С-концу молекулы IL-1, либо через встречающийся в естественных условиях остаток цистеина в молекуле IL-1, с остатками лизина оболочечных белков ВПЧ РНКового бактериофага и прежде всего оболочечного белка Qβ.

Как описано выше, четыре остатка лизина выступают (презентуются) на поверхности ВПЧ из оболочечного белка Qβ. Как правило, эти остатки дериватизируют путем реакции с молекулой перекрестносшивающего агента. В случае, когда не все выступающие (презентованные) остатки лизина могут быть сшиты с антигеном, остатки лизина, которые прореагировали с перекрестносшивающим агентом, после стадии дериватизации сохраняются на молекуле перекрестносшивающего агента, присоединенными к ε-аминогруппе. Этот приводит к исчезновению одного или нескольких положительных зарядов, что может оказывать отрицательное воздействие на растворимость и стабильность ВПЧ. При создании изобретения установлено, что путем замены некоторых остатков лизина на остатки аргинина, как это описано для мутантов оболочечных белков Qβ, можно препятствовать чрезмерному уменьшению положительных зарядов, поскольку остатки аргинина не вступают во взаимодействие с предпочтительными перекрестносшивающими агентами. Кроме того, замена остатков лизина на остатки аргинина может приводить к получению более правильных наборов антигенов, так как для реакции с антигеном доступно меньшее количество сайтов.

Таким образом, выступающие (презентованные) остатки лизина заменяли остатками аргинина в следующих мутантах оболочечного белка Qβ: Qβ-240 (Lys13-Arg; SEQ ID NO:16), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO:18), Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO:20) и Qβ-251; (SEQ ID NO:19). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения описан мутантный оболочечный белок Qβ с одним дополнительным остатком лизина Qβ-243 (Asn10-Lys; SEQ ID NO:17), который можно применять для еще большего повышения плотности наборов антигенов.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения ВПЧ получают рекомбинантно в хозяине, и при этом ВПЧ практически свободна от РНК хозяина, предпочтительно от нуклеиновых кислот хозяина. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит также по меньшей мере одну полианионную макромолекулу, связанную, предпочтительно включенную или упакованную в ВПЧ. В еще одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения полианионная макромолекула представляет собой полиглутаминовую кислоту и/или полиаспарагиновую кислоту.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит также по меньшей мере одну иммуностимулирующую субстанцию, связанную, предпочтительно включенную или упакованную в ВПЧ. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующая субстанция представляет собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно ДНК, наиболее предпочтительно олигонуклеотид, содержащий неметилированный CpG.

Практически свободный от РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновых кислот хозяина: Понятие «практически свободный от РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновых кислот хозяина» в контексте настоящего описания относится к количеству РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновых кислот хозяина, входящему в состав ВПЧ, которое, как правило и предпочтительно, составляет менее 30 мкг, предпочтительно менее 20 мкг, более предпочтительно менее 10 мкг, еще более предпочтительно менее 8 мкг, еще более предпочтительно менее 6 мкг, еще более предпочтительно менее 4 мкг, наиболее предпочтительно менее 2 мкг на 1 мг ВПЧ. Понятие «хозяин» в вышеуказанном контексте относится к хозяину, в котором ВПЧ получают рекомбинантным путем. Общепринятые методы определения количества РНК, предпочтительно нуклеиновых кислот, известны специалисту в данной области. Обычный и предпочтительный метод определения количества РНК, предпочтительно нуклеиновых кислот, предлагаемый в настоящем изобретении, описан в примере 17 WO 2006/037787 A2. Идентичные, сходные или аналогичные условия, как правило и предпочтительно, используют для определения количества РНК, предпочтительно нуклеиновых кислот, в предлагаемых в изобретении композициях, которые содержат ВПЧ, отличные от ВПЧ Qβ. Модификации условий, которые могут потребоваться, известны специалисту в данной области. Численное значение определяемых количеств, как правило и предпочтительно, следует понимать, как значения, находящиеся в пределах стандартного отклонения ±10%, предпочтительно в пределах стандартного отклонения ±5%, от указанного численного значения.

Полианионная макромолекула: Понятие «полианионная макромолекула» в контексте настоящего описания относится к молекуле с относительной высокой молекулярной массой, которая содержит повторяющиеся отрицательно заряженные группы, структура которых практически состоит из множества повторов единиц, полученных, фактически или умозрительно, из молекул с относительно невысокой молекулярной массой. Полианионная макромолекула должна иметь молекулярную массу по меньшей мере 2000 Да, более предпочтительно по меньшей мере 3000 Да и еще более предпочтительно по меньшей мере 5000 Да. Понятие «полианионная макромолекула» в контексте настоящего описания, как правило и предпочтительно, относится к молекуле, которая не может активировать Толл-подобные рецепторы. Так, под понятие «полианионная макромолекула», как правило и предпочтительно, не подпадают лиганды Толл-подобных рецепторов и еще более предпочтительно не подпадают иммуностимулирующие субстанции, такие как лиганды Толл-подобных рецепторов, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты и липополисахариды (LPS). Более предпочтительно понятие «полианионная макромолекула» в контексте настоящего описания относится к молекуле, которая не может индуцировать производство цитокинов. Еще более предпочтительно под понятие «полианионная макромолекула» не подпадают иммуностимулирующие субстанции. Понятие «иммуностимулирующая субстанция» в контексте настоящего описания относится к молекуле, которая обладает способностью индуцировать и/или усиливать иммунный ответ конкретно в отношении антигена, предлагаемого в настоящем изобретении.

РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновые кислоты хозяина: Понятие «РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновые кислоты хозяина» или понятие «РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновые кислоты хозяина, имеющие вторичную структуру» в контексте настоящего описания относятся к РНК или предпочтительно нуклеиновым кислотам, которые исходно синтезируются в хозяине. Однако РНК, предпочтительно нуклеиновые кислоты, могут подвергаться химическим и/или физическим изменениям в процессе восстановления или элиминации количества РНК, предпочтительно нуклеиновых кислот, как правило и предпочтительно, с помощью предлагаемых в изобретении способов, например, РНК, предпочтительно нуклеиновые кислоты, можно укорачивать или можно изменять их вторичную структуру. Однако даже такая образовавшаяся РНК или нуклеиновые кислоты все еще рассматриваются как РНК хозяина или нуклеиновые кислоты хозяина.

Методы определения количества РНК и снижения количества РНК, входящей в ВПЧ, описаны в предварительной заявке на патент, поданной 5 октября 2004 г. на имя этого же агента и полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Снижение количества или элиминация РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновой кислоты хозяина, минимизирует или снижает нежелательные Т-клеточные ответы, такие как воспалительный Т-клеточный ответ и цитотоксический Т-клеточный ответ, и другие нежелательные побочные действия, такие как лихорадка, поддерживая при этом сильный специфический гуморальный иммунный ответ против IL-1.

Одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения является способ получения предлагаемых в изобретении композиций и ВПЧ РНКового бактериофага, предлагаемого в изобретении, в котором ВПЧ получают рекомбинантно с использованием хозяина и в котором ВПЧ практические свободна от РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновых кислот хозяина, заключающийся в том, что: а) получают рекомбинантно с использованием хозяина вирусоподобную частицу (ВПЧ), которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения, где ВПЧ содержит оболочечные белки, их варианты или фрагменты РНКового бактериофага; б) «разбирают» вирусоподобную частицу до оболочечных белков РНКового бактериофага, их мутантов или фрагментов; (в) очищают оболочечные белки, их мутанты или фрагменты; (г) осуществляют повторную сборку очищенных оболочечных белков РНКового бактериофага, их мутантов или фрагментов с получением вирусоподобной частицы, где вирусоподобная частица практически свободна от РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновых кислот хозяина; и (д) сцепляют по меньший мере один антиген, предлагаемый в изобретении, который несет по меньший мере один второй сайт присоединения, с ВПЧ, полученной на стадии (г). В предпочтительном варианте осуществления изобретения повторную сборку оболочечных белков, их вариантов или фрагментов осуществляют в присутствии по меньшей мере одной полианионной макромолекулы.

Одним из объектов настоящего изобретения является вакцина, содержащая композицию, предлагаемую в изобретении. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения молекулу IL-1, которую сцепляют с ВПЧ в составе вакцины, можно получать из организма животного предпочтительно млекопитающего или человека. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения IL-1, предлагаемый в изобретении, получают из организма человека, быка, собаки, кошки, мыши, крысы, свиньи или лошади.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения в состав вакцины входит также по меньшей мере один адъювант. Введение по меньшей мере одного адъюванта осуществляют до, одновременно или после введения композиции, предлагаемой в изобретении. Понятие «адъювант» в контексте настоящего описания относится к неспецифическим стимуляторам иммунного ответа или субстанциям, которые обеспечивают образование депо в хозяине, и при объединении с вакциной и фармацевтической композицией соответственно, предлагаемыми в настоящем изобретении, могут еще в большей степени усиливать иммунный ответ.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в состав вакцины не входит адъювант.

Важной особенностью настоящего изобретения является высокая иммуногенность композиции, даже в отсутствии адъювантов. Отсутствие адъювантов минимизирует также возникновение нежелательных воспалительных Т-клеточных ответов, что является важным с позиций проблемы безопасности при вакцинации против аутоантигенов. Таким образом, введение вакцины, предлагаемой в изобретении, пациенту предпочтительно осуществляют без введения по меньшей мере одного адъюванта этому пациенту до, одновременно или после введения вакцины.

В изобретении описан также способ иммунизации, заключающийся в том, что животному или человеку вводят вакцину, предлагаемую в настоящем изобретении. Животное предпочтительно представляет собой млекопитающее, такое как кошка, овца, свинья, лошадь, бык, собака, крыса, мышь и прежде всего человек. Вакцину можно вводить животному или человеку различными хорошо известными в данной области путями, но, как правило, ее вводят путем инъекции, инфузии, ингаляции, орально или с использованием других пригодных физических методов. Альтернативно этому конъюгаты можно вводить внутримышечно, внутривенно, через слизистую, чрескожно, интраназально, внутрибрюшинно или подкожно. Компонентами конъюгатов, предназначенных для введения, являются стерильные водные (например, физиологические) растворы или неводные растворы и суспензии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекции органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Для повышения способности проникать через кожу и повышения абсорбции антигена можно применять носители или окклюзионные повязки.

Считается, что вакцины, предлагаемые в изобретении, являются «фармакологически приемлемыми», если при их введении они могут переносится конкретным реципиентом. Кроме того, вакцины, предлагаемые в изобретении, следует вводить в «терапевтически эффективном количестве» (т.е. в количестве, которое вызывает требуемое физиологическое действие). Природа или тип иммунного ответа не имеет решающего значения в контексте настоящего описания. Не ограничивая объем настоящего изобретения следующим механистическим объяснением, вакцина, предлагаемая в изобретении, может индуцировать антитела, которые связываются с IL-1 и в результате снижает его концентрацию и/или оказывает воздействие на его физиологическую или патологическую функцию.

Одним из вариантов осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, и приемлемый фармацевтивтический носитель. Когда вакцину, предлагаемую в изобретении, вводят индивидууму, она может находиться в форме, которая содержит соли, буферы, адъюванты или другие субстанции, которые требуются для повышения эффективности конъюгата. Примеры материалов, которые можно применять для приготовления фармацевтических композиций, даны в многочисленных справочниках, включая Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Osol А, изд-во Mack Publishing Co., 1990.

Изобретение относится к способу получения композиции, предлагаемой в изобретении, заключающемуся в том, что: (а) получают ВПЧ, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения; (б) получают молекулу IL-1, которая несет по меньшей мере один второй сайт присоединения, и (в) объединяют ВПЧ и молекулу IL-1 с получением композиции, в которой молекула IL-1 и ВПЧ сцеплены через первый и второй сайты присоединения.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения стадия получения ВПЧ, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения, включает следующие дополнительные стадии, при осуществлении которых (а) «разбирают» вирусоподобную частицу до оболочечных белков, их мутантов или фрагментов; (б) очищают оболочечные белки, их мутанты или фрагменты; (в) осуществляют повторную сборку очищенных оболочечных белков, их мутантов или фрагментов указанного РНКового бактериофага с получением вирусоподобной частицы, где вирусоподобная частица практически свободна от РНК хозяина, предпочтительно нуклеиновых кислот хозяина. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения повторную сборку оболочечных белков осуществляют в присутствии по меньшей мере одной полианионной макромолекулы.

Изобретение относится к способу применения композиций, предлагаемых в изобретении, для лечения и/или ослабления заболеваний или состояний, при которых IL-1 обладает важной патологической функцией, в организме животного или человека. Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно собаки, кошки, лошади или человека, наиболее предпочтительно человека, где заболевание выбирают из группы, включающей: (а) сосудистые заболевания, предпочтительно заболевание коронарной артерии, атеросклероз и васкулит, наиболее предпочтительно атеросклероз; (б) наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF), семейный простудный аутовоспалительный синдром (FCAS), мультисистемное воспалительное заболевание, начинающееся у новорожденных (NOMID) и синдром Мукля Веллса (Muckle Wells), наиболее предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF); (в) хронические аутоиммунные воспалительные заболевания, предпочтительно ревматоидный артрит, системный идиопатический артрит, начинающийся в юношеском возрасте, начинающаяся у взрослых болезнь Стилла, псориаз, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, наиболее предпочтительно ревматоидный артрит; (г) дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани, предпочтительно подагра, остеопороз и остеоартрит, наиболее предпочтительно остеоартрит; (д) аллергические заболевания, предпочтительно контактная гиперчувствительность, гиперчувствительность типа 1 и аллергия, наиболее предпочтительно аллергия; и (е) неврологические заболевания, предпочтительно болезнь Альцгеймера, эпилепсия, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз, наиболее предпочтительно рассеянный склероз.

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтических композиций, предлагаемых в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни у животного, предпочтительно собаки, кошки, лошади, или человека, наиболее предпочтительно человека, где заболевание представляет собой сосудистое заболевание, предпочтительно заболевание коронарной артерии, атеросклероз и васкулит, наиболее предпочтительно атеросклероз, и где по меньшей мере один антиген, входящий в состав композиции, вакцины или фармацевтической композиции, представляет собой молекулу IL-1 альфа, предлагаемую в изобретении, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1 альфа, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:63 или ее мутеин.

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно собаки, кошки, лошади, или человека, наиболее предпочтительно человека, где заболевание выбирают из группы, включающей: (а) наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF), семейный простудный аутовоспалительный синдром (FCAS), мультисистемное воспалительное заболевание, начинающееся у новорожденных (NOMID) и синдром Мукля Веллса (Muckle Wells), наиболее предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF); (б) хронические аутоиммунные воспалительные заболевания, предпочтительно ревматоидный артрит, системный идиопатический артрит, начинающийся в юношеском возрасте, начинающаяся у взрослых болезнь Стилла, псориаз, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, наиболее предпочтительно ревматоидный артрит; (в) дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани, предпочтительно подагра, остеопороз и остеоартрит, наиболее предпочтительно остеоартрит; (г) аллергические заболевания, предпочтительно контактная гиперчувствительность, гиперчувствительность типа 1 и аллергия, наиболее предпочтительно аллергия; и (д) неврологические заболевания, предпочтительно болезнь Альцгеймера, эпилепсия, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз, наиболее предпочтительно рассеянный склероз, и где по меньшей мере один антиген, входящий в состав композиции, вакцины или фармацевтической композиции, представляет собой молекулу IL-1 бета, предлагаемую в изобретении, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1 бета, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64 или ее мутеин.

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно собаки, кошки, лошади, или человека, наиболее предпочтительно человека, где заболевание представляет собой наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF); и где по меньшей мере один антиген, входящий в состав композиции, вакцины или фармацевтической композиции, представляет собой молекулу IL-1 бета, предлагаемую в изобретении, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1 бета, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64 или ее мутеин.

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно у человека, где заболевание представляет собой сосудистое заболеваниее, предпочтительно атеросклероз.

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно у человека, где заболевание представляет собой наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF).

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно у человека, где заболевание представляет собой хронические аутоиммунные заболевания, предпочтительно ревматоидный артрит.

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно у человека, где заболевание представляет собой дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани, предпочтительно остеоартрит.

Изобретение относится также к применению композиций, предлагаемых в изобретении, или вакцин, предлагаемых в изобретении, или фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, предпочтительно у человека, где заболевание представляет собой неврологическое заболевание, предпочтительно рассеянный склероз.

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно собаке, кошке, лошади, или человеку, наиболее предпочтительно человеку, где заболевание выбирают из группы, включающей: (а) сосудистые заболевания, предпочтительно заболевание коронарной артерии, атеросклероз и васкулит, наиболее предпочтительно атеросклероз; (б) наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF), семейный простудный аутовоспалительный синдром (FCAS), мультисистемное воспалительное заболевание, начинающееся у новорожденных (NOMID) и синдром Мукля Веллса (Muckle Wells), наиболее предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF); (в) хронические аутоиммунные воспалительные заболевания, предпочтительно ревматоидный артрит, системный идиопатический артрит, начинающийся в юношеском возрасте, начинающаяся у взрослых болезнь Стилла, псориаз, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, наиболее предпочтительно ревматоидный артрит; (г) дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани, предпочтительно подагра, остеопороз и остеоартрит, наиболее предпочтительно остеоартрит; (д) аллергические заболевания, предпочтительно контактная гиперчувствительность, гиперчувствительность типа 1 и аллергия, наиболее предпочтительно аллергия; и (е) неврологические заболевания, предпочтительно болезнь Альцгеймера, эпилепсия, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз, наиболее предпочтительно рассеянный склероз.

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно собаке, кошке, лошади, или человеку, наиболее предпочтительно человеку, где заболевание представляет собой сосудистые заболевания, предпочтительно заболевание коронарной артерии, атеросклероз и васкулит, наиболее предпочтительно атеросклероз, и где по меньшей мере один антиген, входящий в состав композиции, вакцины или фармацевтической композиции, представляет собой молекулу IL-1 альфа, предлагаемую в изобретении, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1 альфа, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:63 или ее мутеин.

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно собаке, кошке, лошади, или человеку, где заболевание выбирают из группы, включающей: (а) наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF), семейный простудный аутовоспалительный синдром (FCAS), мультисистемное воспалительное заболевание, начинающееся у новорожденных (NOMID) и синдром Мукля Веллса (Muckle Wells), наиболее предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF); (б) хронические аутоиммунные воспалительные заболевания, предпочтительно ревматоидный артрит, системный идиопатический артрит, начинающийся в юношеском возрасте, начинающаяся у взрослых болезнь Стилла, псориаз, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, наиболее предпочтительно ревматоидный артрит; (в) дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани, предпочтительно подагра, остеопороз и остеоартрит, наиболее предпочтительно остеоартрит; (г) аллергические заболевания, предпочтительно контактная гиперчувствительность, гиперчувствительность типа 1 и аллергия, наиболее предпочтительно аллергия; и (д) неврологические заболевания, предпочтительно болезнь Альцгеймера, эпилепсия, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз, наиболее предпочтительно рассеянный склероз, и где по меньшей мере один антиген, входящий в состав композиции, вакцины или фармацевтической композиции, представляет собой молекулу IL-1 бета, предлагаемую в изобретении, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1 бета, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64 или ее мутеин.

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно собаке, кошке, лошади или человеку, где заболевание выбирают из группы, включающей: наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF); и где по меньшей мере один антиген, входящий в состав композиции, вакцины или фармацевтической композиции, представляет собой молекулу IL-1 бета, предлагаемую в изобретении, предпочтительно зрелый фрагмент IL-1 бета, наиболее предпочтительно SEQ ID NO:64 или ее мутеин.

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно человеку, где заболевание представляет собой сосудистое заболевание, предпочтительно атеросклероз.

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно человеку, где заболевание представляет собой наследственные зависящие от IL-1 воспалительные заболевания, предпочтительно семейную средиземноморскую лихорадку (FMF).

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно человеку, где заболевание представляет собой хронические аутоиммунные заболевания, предпочтительно ревматоидный артрит.

Изобретение относится также к способу лечения заболевания, заключающемуся в том, что вводят композицию, предлагаемую в изобретении, вакцину, предлагаемую в изобретении, или фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, животному, предпочтительно человеку, где заболевание представляет собой дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани, предпочтительно остеоартрит.

Все процитированные в настоящем описании ссылки полностью включены в него в качестве ссылки.

Примеры

Пример 1

Клонирование, экспрессия и очистка мышиного IL1α117-270 и IL-1β119-269

Нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 117-270 мышиного IL-1α, амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК активируемых TNFα мышиных макрофагов с использованием олигонуклеотидов IL1α1 (5'-ATATATGCTAGCCCCTTACACCTACCAGAGTGATTTG-3'; SEQ ID NO:24) и IL1α2 (5'-ATATATCTCGAGTGATATCTGGAAGTCTGTCATAGAG-3'; SEQ ID NO:25). С использованием этой же библиотеки кДНК нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 119-269 мышиного предшественника IL-1β, амплифицировали с помощью олигонуклеотидов IL1β1 (5'-ATATATGCTAGCCCCCATTAGACAGCTGCACTACAGG-3'; SEQ ID NO:26) и IL1β2 (5'-ATATATCTCGAGGGAAGACACAGATTCCATGGTGAAG-3'; SEQ ID NO:27). Оба ДНК-фрагмента расщепляли с помощью NheI и XhoI и клонировали в экспрессионном векторе pModEC1 (SEQ ID NO:29)

Вектор pModEC1 (SEQ ID NO:29) является производным рЕТ22b(+) (фирма Novagen Inc.) и его конструировали в две стадии. На первой стадии множественный сайт клонирования вектора рЕТ22b(+) изменяли путем замены оригинальной последовательности между сайтами NdeI и XhoI с использованием ренатурированных олигонуклеотидных праймеров, таких как праймер MCS-1F (5'-TATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTA AACGGCGGCCGCAT-3'; SEQ ID NO:30) и праймер MCS-1R (5'-TCGAATGCGGCCG CCGTTTAAACCCTCGAGCGCTAGCCGGATCCA-3'; SEQ ID NO:31) (ренатурация в 15 мМ трис-HCl-буфере, рН 8). Образовавшуюся плазмиду обозначили как pMod00, и она включала сайты растрикиции NdeI, BamHI, NheI, XhoI, PmeI и NotI в множественном сайте клонирования. Ренатурированную пару олигонуклеотидов Bamhis6-EK-Nhe-F (5'-GATCCACACCACCACCACCACCACGGTTCTGGTGACGACGATGACAAAGCGCTAGCCC-3'; SEQ ID NO:32) и Bamhis6-EKNhe-R (5'-TCGAGGGCTAGCGCTTTGTCATCGTCGTCACCAGAACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTG-3'; SEQ ID NO:33) и ренатурированную пару олигоF-C-глициновый линкер (5'-TCGAGGGTGGTGGTGGTGGTTGCGGTTAATAAGTTTAAACGC-3'; SEQ ID NO:34) и олиго1R-С-глициновый линкер (5'-GGCCGCGTTTAAACTTATTA ACCGCAACCACCACCACCACCC-3'; SEQ ID NO:35) встраивали путем совместного лигирования в расщепленную с помощью BamHI-NotI плазмиду Mod00, получая плазмиду pModEC1, которая кодирует N-концевую гексагистидиновую метку, сайт расщепления энтерокиназой и С-концевой глициновый линкер, содержащий один остаток цистеина.

Клонирование вышеуказанных фрагментов в pModEC1 позволяло получать плазмиды pModEC1-His-EK-mIL1α117-270 и pModEC1-His-EK-mIL1β119-269 соответственно. Эти плазмиды кодируют слитые белки, состоящие из N-концевой His-метки, сайта расщепления энтерокиназой, зрелого мышиного IL-1α или IL-1β соответственно и С-концевого содержащего цистеин линкера (GGGGGCG, SEQ ID NO:28). Для экспрессии клетки Escherichia coli BL21, несущие любую из указанных плазмид, выращивали при 37°С до достижения ОП при 600 нм 1,0 и затем индуцировали, добавляя изопропил-β-D-тиогалактопиранозид в концентрации 1 мМ. Бактерии выращивали в течение еще 4 ч при 37°С, собирали центрифугированием и ресуспендировали в 80 мл буфера для лизиса (10 мМ Na2HPO4, 30 мМ NaCl, pH 7,0). Затем клетки разрушали облучением ультразвуком и клеточную ДНК и РНК расщепляли путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре в присутствии 64 мкл 2М MgCl2 и 10 мкл бензоназы. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (ротор SS34, 20000 об/мин 4°С, 60 мин) и осветленный лизат вносили на содержащую Ni2+-NTA агарозную колонку (фирма Qiagen, Гильден, Германия). После экстенсивной промывки колонки буфером для отмывки (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, pH 8,0) белки элюировали буфером для элюции (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 200 мМ имидазол, рН 8,0). Осуществляли диализ очищенных белков в противотоке ЗФР, рН 7,2, замораживали их в жидком азоте и хранили при -80°C до дальнейшего применения.

Пример 2

А. Сочетание мышиного IL-1β119-269 с вирусоподобными частицами Qβ

Раствор, содержащий 1,3 мг/мл очищенного мышиного белка IL-1β119-269, полученного согласно методу, описанному в примере 1 (SEQ ID NO:66), в ЗФР, рН 7,2 инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре с эквимолярным количеством ТСЕР для восстановления С-концевого остатка цистеина.

Раствор, содержащий 6 мл капсидного белка Qβ в концентрации 2 мг/мл в ЗФР, рН 7,2, затем подвергали взаимодействию в течение 60 мин при комнатной температуре с 131 мкл раствора SMPH (65 мМ в ДМСО). Реакционный раствор подвергали диализу при 4°С в противотоке 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,2 с использованием трех замен по 3 л в течение 24 ч. 75 мкл дериватизированного и подвергнутого диализу раствора Qβ смешивали с 117 мкл Н2О и 308 мкл очищенного предварительно восстановленного мышиного белка IL-1β119-269 и инкубировали в течение ночи при 15°С для химического перекрестного сшивания. Несшитый белок удаляли с помощью фильтрации в тангенциальном потоке против ЗФР с использованием мембран из сложных эфиров целлюлозы, частота среза молекулярной массы которых составляла 300000 Да.

Сшитые продукты анализировали в 12%-ных ДСН-полиакриламидных гелях в восстанавливающих условиях. Окрашенный кумасси гель показан на фиг.1. Обнаружено несколько полос, соответствующих более высокой молекулярной массе по сравнению с молекулярной массой мономера капсида Qβ, что ясно демонстрирует, что произошло успешное перекрестное сшивание мышиного белка IL-1β119-269 с капсидом Qβ.

Б. Иммунизация мышей мышиным белком IL-1β119-269, сшитым с капсидом Qβ(Qβ-mIL-1β119-269)

Пять самок мышей линии balb/c иммунизировали Qβ-mIL-1β119-269 (SEQ ID NO:66). 55 мкг общего белка разбавляли в ЗФР до объема 200 мкл и инъецировали подкожно (100 мкл в две стороны брюшного отдела) в день 0 и день 21, У мышей брали кровь из ретроорбитального сплетения в день 0, 21 и 35 и сыворотку анализировали с помощью специфического для IL-1β119-269 ELISA.

В. ELISA

Планшеты для ELISA сенсибилизировали мышиным белком IL-1β119-269 в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты блокировали и затем инкубировали с серийно разведенной мышиной сывороткой, полученной в дни 0, 21 и 35. Связанные антитела выявляли с помощью меченого ферментом мышиного антитела в виде IgG. Титры антитела в мышиной сыворотке рассчитывали в виде среднего значения разведении, при использовании которых оптическая плотность при 450 нм составляла половину от максимальной. Средний титр мышиного антитела к IL-1β119-269 составлял 1:22262 в день 21 и 1:309276 в день 35. Эти результаты свидетельствуют о том, что иммунизация капсидом Qβ, сшитым с мышиным белком IL-1β119-269, может преодолевать иммунологическую толерантность и приводить к образованию высоких титров антител, которые специфически распознают IL-1β119-269.

Г. Нейтрализация in vitro IL-1β

Затем оценивали способность сыворотки мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269 (SEQ ID NO:66), ингибировать связывание мышиного белка IL-1β с его рецептором. Для этой цели планшеты для ELISA сенсибилизировали рекомбинантным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали совместно с серийными разведениями сыворотки мышей, которых иммунизировали либо мышиным IL-1β119-269, сшитым с капсидом Qβ, либо мышиным IL-1α117-270, сшитым с капсидом Qβ, и 100 нг/мл мышиного IL-1β119-269. Связывание IL-1β119-269 с иммобилизованным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc выявляли с помощью биотинилированного антитела к мышиному IL-1β и конъюгированного с пероксидазой из хрена стрептавидина. Все образцы сыворотки, полученные из организма мышей, иммунизированных против мышиного IL-1β119-269, полностью ингибировали связывание мышиного IL-1β119-269 с его рецептором в концентрации ≥0,4%, в то время как образцы сыворотки из организма мышей, иммунизированных против мышиного IL-1α117-270, не обладали ингибирующим действием даже при наиболее высокой из изученных концентраций (3,3%). Эти данные демонстрируют, что иммунизация мышиным IL-1β119-269, сшитым с капсидом Qβ, может приводить к образованию антител, которые могут нейтрализовать взаимодействие мышиного IL-1β119-269 с его рецептором.

Д. Нейтрализация in vivo IL-1β

Далее анализировали способность к нейтрализации in vivo антител, образовавшихся в результате иммунизации Qβ-mIL-1β119-269. Для этой цели четырех самок мышей линии balb/c иммунизировали дважды в дни 0 и 14 Qβ-mIL-1β119-269, а четырех мышей иммунизировали в это же время только капсидом Qβ. В день 21 всем мышам вводили внутривенно 1 мкг свободного IL-1β119-269. Для получения данных о воспалительной активности инъецируемого IL-1β119-269 образцы сыворотки анализировали через 3 ч после инъекции для определения относительного возрастания концентрации провоспалительного цитокина IL-6. У иммунизированных Qβ мышей обнаружено среднее возрастание концентрации в сыворотке IL-6, составляющее 1,01±0,61 нг/мл, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269, обнаружено среднее возрастание, составляющее только 0,11±0,30 нг/мл (p=0,04). В качестве контроля в день 28 всем мышам инъецировали 1 мкг mIL-1α. Через 3 ч после инъекции у мышей, иммунизированных только носителем, т.е. Qβ, обнаружено среднее возрастание концентраций в сыворотке IL-6 до 40,24±8,06 нг/мл, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269, обнаружено возрастание до 57,98±29,92 нг/мл (p=0,30). Эти данные свидетельствуют о том, что антитела, продуцируемые в результате иммунизации Qβ-mIL-1β119-269, могут специфически и эффективно нейтрализовать провоспалительную активность IL-1β.

Е. Эффективность Qβ-mIL-1β119-269 на мышиной модели ревматоидного артрита

Эффективность иммунизации с использованием Qβ-mIL-1β119-269 оценивали на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (CIA). Эта модель отражает большинство иммунологических и гистологических аспектов человеческого ревматоидного артрита и поэтому ее, как правило, используют для оценки эффективности противовоспалительных лекарственных средств. Самцов мышей линии DBA/1 иммунизировали подкожно трижды (дни 0, 14 и 28), используя 50 мкг либо Qβ-mIL-1β119-269 (n=8), либо только Qβ (n=8), а затем вводили внутрикожно в день 42200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с полным адъювантом Фрейнда. После бустер-инъекции с использованием 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда, в день 63 у мышей ежедневно оценивали развитие симптомов артрита.

Шкалу клинических баллов от 0 до 3 применяли для оценки каждой конечности с позиций уровня обнаруживаемого покраснения и припухлости и определяли утолщение голеностопного сустава всех задних конечностей. Для каждой конечности в последующие недели был определен клинический балл 3 по следующей шкале: 0 - норма, 1 - слабая эритема и/или припухлость пальцев/лапы, 2 - эритема и припухлость, распространившаяся на всю лапу/сустав, 3 - сильная припухлость, деформация лапы/сустава, ригидность. Кумулятивные клинические баллы мышей индивидуально рассчитывали как сумму клинических баллов для всех четырех конечностей, при этом максимально возможный кумулятивный балл для мыши составлял 12.

Через 2 недели после второй инъекции коллагена у мышей, иммунизированных Qβ, обнаружен средний кумулятивный клинический балл 4,44, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269, обнаружен средний клинический балл только 1,06. Кроме того, среднее увеличение толщины голеностопного сустава составляло 18% у мышей, иммунизированных Qβ, и только 1% у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269. В качестве дополнительных данных о воспалительной реакции определяли уровни в сыворотке IL-6 через 1 неделю после второй инъекции коллагена. У мышей, иммунизированных Qβ, средняя концентрация IL-6 в сыворотке составляла 1,92±0,36, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269, средняя концентрация IL-6 составляла только 0,79±0,16 (p=0,01). В сочетании эти данные свидетельствуют о том, что иммунизация Qβ-mIL-1β119-269 в значительной степени защищает мышей от воспаления и клинических симптомов артрита при использовании CIA-модели.

Пример 3

А. Сочетание мышиного IL-1α117-270 с вирусоподобными частицами Qβ

Раствор, содержащий 1,8 мг/мл очищенного мышиного белка IL-1α117-270, полученного согласно методу, описанному в примере 1 (SEQ ID NO:65), в ЗФР, рН 7,2 инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре с эквимолярным количеством ТСЕР для восстановления C-концевого остатка цистеина.

Раствор, содержащий 6 мл капсидного белка Qβ в концентрации 2 мг/мл в ЗФР, рН 7,2, затем подвергали взаимодействию в течение 60 мин при комнатной температуре с 131 мкл раствора SMPH (65 мМ в ДМСО). Реакционный раствор подвергали диализу при 4°С в противотоке 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl рН 7,2 с использованием трех замен по 3 л в течение 24 ч. 75 мкл дериватизированного и подвергнутого диализу раствора Qβ смешивали с 192 мкл H2O и 233 мкл очищенного предварительно восстановленного мышиного белка IL-1α117-270 и инкубировали в течение ночи при 15°С для химического перекрестного сшивания. Несшитый белок удаляли с помощью фильтрации в тангенциальном потоке против ЗФР с использованием мембран из сложных эфиров целлюлозы, частота среза молекулярной массы которых составляла 300000 Да.

Сшитые продукты анализировали в 12%-ных ДСН-полиакриламидных гелях в восстанавливающих условиях. Окрашенный кумасси гель показан на фиг.2. Обнаружено несколько полос, соответствующих более высокой молекулярной массе по сравнению с молекулярной массой мономера капсида Qβ, что ясно демонстрирует, что произошло успешное перекрестное сшивание мышиного белка IL-1α117-270 с капсидом Qβ.

Б. Иммунизация мышей мышиным белком IL-1α117-270, сшитым с капсидом Qβ (QB-mIL-1α117-270)

Пять самок мышей линии balb/c иммунизировали Qβ-mIL-1α117-270. 50 мкг общего белка разбавляли в ЗФР до объема 200 мкл и инъецировали подкожно (100 мкл в две стороны брюшного отдела) в день 0 и день 21. У мышей брали кровь из ретроорбитального сплетения в день 0, 21 и 35 и сыворотку анализировали с помощью специфического для IL-1α117-270 ELISA.

В. ELISA

Планшеты для ELISA сенсибилизировали мышиным белком IL-1α117-270 в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты блокировали и затем инкубировали с серийно разведенной мышиной сывороткой, полученной в дни 0, 21 и 35. Связанные антитела выявляли с помощью меченого ферментом мышиного антитела в виде IgG. Титры антитела в мышиной сыворотке рассчитывали в виде среднего значения разведении, при использовании которых оптическая плотность при 450 нм составляла половину от максимальной. Средний титр мышиного антитела к IL-1α117-270 составлял 1:9252 в день 21 и 1:736912 в день 35. Эти результаты демонстрируют, что иммунизация капсидом Qβ, сшитым с мышиным белком IL-1α117-270, может преодолевать иммунологическую толерантность и приводить к образованию высоких титров антител, которые специфически распознают IL-1α117-270.

Г. Нейтрализация in vitro IL-1α

Затем оценивали способность сыворотки мышей, иммунизированных Qβ-m IL-1α117-270 ингибировать связывание мышиного белка IL-1α с его рецептором. Для этой цели планшеты для ELISA сенсибилизировали рекомбинантным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали совместно с серийными разведениями сыворотки мышей, которых иммунизировали либо мышиным IL-1α117-270, сшитым с капсидом Qβ, либо мышиным IL-1β119-269, сшитым с капсидом Qβ, и 5 нг/мл мышиного IL-1α117-270. Связывание IL-1α117-270 с иммобилизованным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc выявляли с помощью биотинилированного антитела к мышиному IL-1α и конъюгированного с пероксидазой из хрена стрептавидина. Все образцы сыворотки, полученные из организма мышей, иммунизированных против мышиного IL-1α117-270, полностью ингибировали связывание мышиного IL-1α117-270 с его рецептором в концентрации ≥0,4%, в то время как образцы сыворотки из организма мышей, иммунизированных против мышиного IL-1β119-269, не обладали ингибирующим действием даже при наиболее высокой из изученных концентраций (3,3%). Эти данные демонстрируют, что иммунизация мышиным IL-1α117-270, сшитым с капсидом Qβ, может приводить к образованию антител, которые могут нейтрализовать взаимодействие мышиного IL-1α117-270 с его рецептором.

Д. Нейтрализация in vivo IL-1α

Далее анализировали способность к нейтрализации in vivo антител, образовавшихся в результате иммунизации Qβ-mIL-1α117-270. Для этой цели четырех самок мышей линии balb/c иммунизировали дважды в дни 0 и 14 Qβ-mIL-1α117-270; а четырех мышей иммунизировали в это же время только капсидом Qβ. В день 21 всем мышам вводили внутривенно 1 мкг свободного IL-1α117-270. Для получения данных о воспалительной активности инъецируемого IL-1α117-270 образцы сыворотки анализировали через 3 ч после инъекции для определения относительного возрастания концентрации провоспалительного цитокина IL-6. У иммунизированных Qβ мышей обнаружено среднее возрастание концентрации в сыворотке IL-6, составляющее 8,16±2,33 нг/мл, а у мышей, иммунизированных Qβ-m IL-1α117-270; обнаружено среднее возрастание, составляющее только 0,15±0,27 нг/мл (p=0,0005). В качестве контроля в день 28 всем мышам инъецировали 1 мкг mIL-1β. Через 3 ч после инъекции у мышей, иммунизированных только носителем, т.е. Qβ, обнаружено среднее возрастание концентраций в сыворотке IL-6, составляющее 9,52±7,33 нг/мл, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1α117-270; обнаружено возрастание, составляющее 21,46±27,36 нг/мл (p=0,43). Эти данные свидетельствуют о том, что антитела, продуцируемые в результате иммунизации Qβ-mIL-1α117-270, могут специфически и эффективно нейтрализовать провоспалительную активность IL-1α.

Е. Эффективность Qβ-mIL-1α117-270 нa мышиной модели ревматоидного артрита

Эффективность иммунизации с использованием Qβ-mIL-1α117-270 оценивали на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (CIA). Эта модель отражает большинство иммунологических и гистологических аспектов человеческого ревматоидного артрита и поэтому ее, как правило, используют для оценки эффективности противовоспалительных лекарственных средств. Самцов мышей линии DBA/1 иммунизировали подкожно трижды (дни 0, 14 и 28), используя 50 мкг либо Qβ-mIL-1α117-270 (n=8), либо только Qβ (n=8), а затем вводили внутрикожно в день 42 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с полным адъювантом Фрейнда. После бустер-инъекции с использованием 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда, в день 63 у мышей ежедневно оценивали развитие симптомов артрита. Шкалу клинических баллов, описанную в примере 2Е, применяли для оценки каждой конечности с позиций уровня обнаруживаемого покраснения и припухлости и определяли утолщение голеностопного сустава всех задних конечностей. Через 2 недели после второй инъекции коллагена у мышей, иммунизированных Qβ, средний кумулятивный клинический балл составлял 4,44, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1α117-270; средний клинический балл составлял только 2,31. Кроме того, среднее увеличение толщины голеностопного сустава составляло 18% у мышей, иммунизированных Qβ, и только 7% у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1α117-270. В качестве дополнительных данных о воспалительной реакции определяли уровни в сыворотке IL-6 через 1 неделю после второй инъекции коллагена. У мышей, иммунизированных Qβ, средняя концентрация IL-6 в сыворотке составляла 1,92±0,36, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1α117-270, средняя концентрация IL-6 составляла только 0,94±0,48. В сочетании эти данные свидетельствуют о том, что иммунизация Qβ-mIL-1α117-270 в значительной степени защищает мышей от воспаления и клинических симптомов артрита при использовании CIA-модели.

Пример 4

Эффективность Qβ-mIL-1α117-270 нa мышиной модели атеросклероза

Самцам 7-8-дневных мышей линии Apoe-/- (фирма The Jackson Laboratory, Бар Харбор, шт.Мэн) инъецировали подкожно либо 50 мкг вакцины на основе Qβ-mIL-1α117-270 (n=13), либо 50 мкг только Qβ (n=12) в день 0, 14, 28, 56, 105 и 133 (5 животным, в том числе 3 в группе, обработанной Qβ-mIL-1α117-270, и 2 в группе, обработанной Qβ, вводили вторую бустер-инъекцию в день 33). Мышей кормили сначала обычным кормом для грызунов, который заменяли в день 21 вестерн-кормом (20% жира, 0,15% холестерина, фирма Provimi Kliba AG, Швейцария). У мышей брали образцы крови через регулярные промежутки времени в процессе эксперимента и оценивали в сыворотке гуморальный иммунный ответ против IL-1 альфа. Животных умерщвляли в день 159 и аорту выделяли и препарировали в целом согласно методу, описанному у Tangirala R.K. и др., J. Lipid. Res. 36, 1995, c.2320-2328. Кроме того, выделяли сердца и немедленно замораживали в жидком азоте для последующего гистологического исследования в целом согласно методу, описанному у Paigen В. и др., Atherosclerosis 68, 1987, c.231-240 и у Zhou X. и др., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21, 2001, c.108-114. У животных брали образцы крови с помощью сердечной пункции и осуществляли перфузию холодным ЗФР. Затем обнажали аорту, которую по возможности максимально освобождали от адвентициальной оболочки in situ, и, наконец, аорту отсекали на расстоянии 2 мм от сердца. Сердце разрезали по середине и верхнюю часть немедленно замораживали в сбалансированным солевом растворе Хэнкса в пластиковой пробирке в жидком азоте. На криостате получали серийные срезы (толщиной 7 мкм), проходящие через начало аорты, и отбирали срезы из области, которая начиналась с появления по меньшей мере двух выступов клапанов и простиралась до исчезновения последних выступов клапанов. Срезы фиксировали в формалине, окрашивали масляным красным О и оценивали загрузку бляшками (относительную площадь, занятую бляшками) в 4-7 срезах (3 среза от одного животного из обработанной Qβ группы), полученных из одной мыши, путем количественного визуализирующего анализа. Среднюю площадь бляшек рассчитывали с помощью компьютера для каждого животного на основе площади бляшек каждого среза, используемого для оценки. Среднюю площадь бляшек в группе рассчитывали с помощью компьютера для группы, обработанной Qβ-mIL-1α117-270, и группы, обработанной Qβ, соответственно. Осуществляли статистический анализ с помощью t-критерия Стьюдента. Значение P<0,05 рассматривали как статистически значимое.

Для оценки атеросклероза в целой аорте ее дополнительно очищали от остатков адвентициальной оболочки в стеклянной чашке Петри, заполненной холодным ЗФР, и дугу отсекали на расстоянии 5 мм ниже левой подключичной артерии. Делали продольный разрез на аорте, переносили на черную восковую поверхность и фиксировали в течение ночи в 4%-ном растворе формалина. Затем окрашивали в течение ночи в масляном красном О. Бляшки оценивали количественно с помощью пакета программ для визуализации (Motic Image Plus 2.0) на цифровых фотографиях. Загрузку бляшками выражали в виде суммы площади поверхности всех бляшек аорты вплоть до подвздошной бифуркации, деленной на общую площадь поверхности аорты, измеренную вплоть до подвздошной бифуркации, в процентах. Анализировали различия между средними значениями или медианами загрузки бляшками между группой, обработанной Qβ-mIL-1α117-270; и группой, обработанной Qβ.

Гуморальный иммунный ответ оценивали с помощью классического ELISA с использованием сенсибилизированного рекомбинантным IL-1 альфа планшета для ELISA. Связывание специфических антител определяли с помощью козьего мышиного антитела, конъюгированного с HRP. Титры антител к IL-1 альфа рассчитывали в виде величин, обратных разбавлению сыворотки, при котором связывание составляло половину от максимального, в этом анализе. Специфичность ответа оценивали относительно неиммунной сыворотки. Титр в неиммунной сыворотке был ниже наименьшего разбавления сыворотки, применяемого в анализе. Результаты оценки гуморального иммунного ответа животных в группе, иммунизированной Qβ-mIL-1α117-270, представлены в таблице 1, и они четко демонстрируют, что иммунизация против мышиного IL-1 альфа, сшитого с Qβ, приводит к сильному и постоянному специфическому гуморальному иммунному ответу против IL-1 альфа, поскольку практически никакого титра не было выявлено в неиммунной сыворотке (d0, день 0). Кроме того, индукция гуморального иммунного ответа, специфического в отношении IL-1 альфа, приводит к снижению на 37% площади бляшек в начале аорты в группе, обработанной Qβ-mIL-1α117-270, по сравнению с Qβ-группой (292803±21272 мкм2 против 464694±36545 мкм2, p=0,0005). Кроме того, было выявлено общее снижение на 31% медианы загрузки бляшками в целых аортах, полученное на виде спереди (5,7 против 8,3, p=0,06).

Эти данные демонстрируют, что индукция антител к IL1 альфа с помощью вакцины на основе Qβ-mIL-1α117-270 ингибировала развитие атеросклероза и, следовательно, вакцина на основе Qβ-mIL-1α117-270 представляет собой эффективное средство лечения атеросклероза. Кроме того, эти данные демонстрируют, что IL-1 альфа участвует в патогенезе атеросклероза.

Таблица 1
Среднегеометрические значения титра антитела к IL1 альфа у мышей линии Apoe-/-, иммунизированных Qβ-IL1альфа (среднегеометрическое значение титра ± квадратичная ошибка средней)
D0 d21 d28* d56 d84 d105 d159
Среднегеометрическое значение ± СКО <10000 225400±93385 167867±121345 522864±106887 712061±144922 621687±184389 805370±155764
* Для 5 животных данные получены в день 33.

Пример 5

Защита от индуцированного TNBS (тринитробензолсульфоновая кислота) воспалительного заболевания кишечника с помощью иммунизации Qβ-mIL-1α117-270 и/или Qβ-mIL-1β119-269

Самцам 8-недельных мышей линии SJL (по 5 особей на группу) инъецировали подкожно трижды с двухнедельными интервалами либо 50 мкг Qβ-mIL-1α117-270, либо 50 мкг Qβ-mIL-1β119-269, либо смеси, содержащей по 50 мкг каждого из Qβ-mIL-1α117-270 и Qβ-mIL-1β119-269. В качестве контроля 5 мышам инъецировали по такой же схеме только ВПЧ Qβ. Через 2 недели после последней иммунизации всех мышей подвергали легкой анестезии изофлураном и 1 мкг тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS) в 100 мкл 50%-ного этанола вводили интраректально через полиэтиленовый катетер на глубину 4 см от анального отверстия. В качестве критерия развития болезни ежедневно оценивали вес тела и через 7 дней после введения TNBS всех мышей умерщвляли. Выделяли ободочную кишку каждой мыши, образец кишки, локализованный на расстоянии 2 см от анального отверстия, фиксировали в забуференном ЗФР формалине и степень воспаления оценивали полуколичественно на поперечных срезах ободочной кишки, окрашенных гематоксилином и эозином, по Neurath M.F. и др. (JEM, 182, 1995, c.1281-1290).

Иммунизация либо только Qβ-mIL-1α117-270, либо только Qβ-mIL-1β119-269, либо комбинацией Qβ-mIL-1α117-270 и Qβ-mIL-1β119-269 снижала индуцированную TNBS потерю веса по сравнению с мышами, иммунизированными Qβ. Кроме того, гистологическая оценка поперечных срезов ободочной кишки продемонстрировала, что у иммунизированных Qβ-mIL-1α117-270 и/или Qβ-mIL-1β119-269 мышей обнаружено заметное уменьшение инфильтрации воспалительных клеток в ткань ободочной кишки по сравнению с мышами, иммунизированными Qβ.

Пример 6

Ослабление гиперчувствительности к эндотоксину у мышей, несущих укороченную версию гена MEFV, путем иммунизации Qβ-mIL-1β119-269

Семейная средиземноморская лихорадка представляет собой рецессивно наследуемое воспалительное заболевание, характеризующееся повторяющейся лихорадкой, а также перитонитом, серозитом, артритом и кожной сыпью. Пораженные индивидуумы несут миссенс-мутацию в гене MEFV, что приводит к экспрессии укороченного белка пирина. У мышей с аналогичной мутацией в гене MEFV обнаружена повышенная активность каспазы-1, что приводит к сверхпроизводству зрелого IL-1β и более выраженной гипотермии и летальному исходу после введения LPS. Гомозиготных по гену, приводящему к укороченному пирину, 8-недельных мышей (5 особей в группе) иммунизировали трижды с двухнедельными интервалами 50 мкг Qβ-mIL-1β119-269 или 50 мкг только ВПЧ Qβ. Через 2 недели после последней иммунизации всем мышам вводили внутрибрюшинно смесь, содержащую 20 мг D-галактозамина и 0,01 мкг/г LPS. У мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269, обнаружено заметно уменьшенная гипотермия и пониженный уровень смертности в ответ на обработку LPS по сравнению с иммунизированными Qβ контрольными мышами.

Пример 7

Сравнение воздействия иммунизации Qβ-mIL-1α117-270 и Qβ-mIL-1β119-269 и обработки Kineret® на мышиной модели ревматоидного артрита

Kineret® (анакинра, фирма Amgen) представляет собой рекомбинантную версию антагониста человеческого рецептора IL-1, который разрешен для лечения человеческого ревматоидного артрита. Для достижения клинической пользы относительно большие количества (100 мг) следует вводить путем подкожной инъекции ежедневно. Индуцируемую коллагеном модель артрита применяли для сравнения эффективности иммунизации Qβ-mIL-1α117-270 и Qβ-mIL-1β119-269 при ежедневном применении различных доз Kineret®. Самцов мышей линии DBA/1 иммунизировали подкожно трижды (дни 0, 14 и 28) 50 мкг либо Qβ-mIL-1α117-270 (n=8), либо Qβ-mIL-1β119-269 (n=8), либо только Qβ (n=32), и затем инъецировали внутрикожно в день 42 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с полным адъювантом Фрейнда. Начиная с дня 42, мышей иммунизировали Qβ-mIL-1α117-270 и Qβ-mIL-1β119-269, а одной группе мышей, иммунизированных Qβ (n=8), ежедневно вводили внутрибрюшинно 200 мкл ЗФР, а трем другим иммунизированным Qβ группам вводили ежедневно внутрибрюшинно либо 37,5 мкг (n=8), либо 375 мкг (n=8), либо 3,75 мг (n=8) Kineret®. Суточная инъекции 37,5 мкг Kineret® на мышь примерно соответствовала дозе 1,5 мг/кг, которая находится в пределах рекомендованных эффективных для человека количеств (100 мг). Всех мышей подвергали бустер-инъекции в день 63 путем внутрикожного введения 200 мкг бычьего коллагена типа II с неполным адъювантом Фрейнда и оценивали ежедневно развитие симптомов артрита.

Через 4 недели после второй инъекции коллагена у иммунизированных Qβ контрольных мышей обнаружен средний кумулятивный клинический балл (который определяли согласно методу, описанному в примере 2Е), составляющий 3,75, а у мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1α117-270 и Qβ-mIL-1β119-269, обнаружены средние баллы только 0,81 и 1,44 соответственно (см. таблицу 2). У мышей, обработанных 37,5 мкг или 375 мкг Kineret®, средний балл достигал значения 2,44 и 2,63 соответственно, а у мышей, обработанных 3,75 мг Kineret®, у которых в основном не проявлялись симптомы, максимально достигнутый балл составлял всего лишь 0,19.

В качестве дополнительных критериев воспалительной реакции регулярно оценивали толщину голеностопного сустава задних конечностей у всех животных. Через 4 недели после второй инъекции коллагена у иммунизированных Qβ контрольных животных выявлено среднее увеличение толщины голеностопного сустава задней конечности на 16%, а у иммунизированных Qβ-mIL-1α117-270 мышей выявлено увеличение на 2%, а у иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269 мышей выявлено увеличение на 6%. У мышей, обработанных либо 37,5 мкг, либо 375 мкг Kineret®, выявлено увеличение на 13% и 10% соответственно, а у мышей, обработанных 3,75 мг Kineret®, не обнаружено вообще увеличение голеностопного сустава задней конечности.

Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что три инъекции либо Qβ-mIL-1α117-270, или Qβ-mIL-1β119-269, более эффективно защищали от развития симптомов артрита, чем ежедневные инъекции Kineret® в количествах, соответствующих рекомендуемой для применения человеком дозе, или даже в десять раз более низких по сравнению с рекомендуемой для применения человеком дозе. Только при использовании 100-кратной рекомендуемой для применение человеком дозы Kineret® оказывал повышенное благоприятное воздействие, соответствующее вакцинации с использованием Qβ-mIL-1α117-270 или Qβ-mIL-1β119-269.

Таблица 2
Клинические симптомы заболевания на индуцируемой коллагеном модели артрита
Обработка Средний клинический балл в день 91 Среднее увеличение толщины голеностопного сустава задней конечности (%) в дни 63-91
3×Qβ s.c.+ЗФР i.p. (200 мкл/день) 3,75 16
3×Qβ-mIL-1α117-270 s.c. + ЗФР i.p. (200 мкл/день) 0,81 2
3×Qβ-mIL-1β119-269 s.c.+ЗФР i.p.(200 мкл/день) 1,44 6
3×Qβ s.c. + Kineret® i.p. (37,5 мкг/день) 2,44 13
3×Qβ s.c. + Kineret® i.p. (375 мкг/день) 2,63 10
3×Qβ s.c. + Kineret® i.p.( 3,75 мг/день) 0,19 0

Пример 8

А. Клонирование, экспрессия и очистка вирусоподобных частиц, состоящих из оболочечного белка АР205, генетически слитого в мышиным IL-1α117-270 (АР205 mIL-1α117-270)

С учетом большого размера интерлейкина-1 альфа и с позиций стерического строения конструировали систему экспрессии, продуцирующую так называемые мозаичные частицы, содержащие оболочечные белки АР205, слитые с интерлейкином-1 альфа, а также субъединицы оболочечного белка дикого типа (wt). В этой системе супрессия стоп-кодона позволяла получать слияние оболочечного белка АР205-интерлейкина-1 альфа, и при правильной терминации получали оболочечный wt-белок АР205. Оба белка получали в клетке одновременно, и происходила их сборка в мозаичную вирусоподобную частицу. Создавали две промежуточные плазмиды рАР590 и рАР592, кодирующие ген оболочечного белка АР205, заканчивающийся кодонами-супрессорами TAG (амбер-кодон, рАР590) или TGA (опал-кодон, рАР592). Линкерную последовательность, кодирующую трипептид Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO:189), добавляли по ходу транскрипции в рамке считывания гена оболочечного белка. Добавляли сайты Kpn2I и HindIII для клонирования последовательностей, кодирующих чужеродные аминокислотные последовательности на С-конце аминокислотного линкера Gly-Ser-Gly, С-концевого относительно оболочечного белка АР205. Были получены следующие конструкции: АР590 (SEQ ID NO:117): ген оболочечного белка АР205 - амбер-кодон - GSG(Kpn2I-HindIII), и АР592 (SEQ ID NO:118): ген оболочечного белка АР205 - опал-кодон - GSG(Kpn2I-HindIII). Для конструирования плазмиды рАР590 ПЦР-фрагмент, полученный с помощью олигонуклеотидов p1.44 (5'-NNCCATGGCAAATAAGCCAATGCAACCG-3'; SEQ ID NO:119) и pINC-36 (5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCCTAAGCAGTAGTATCAGACGATACG-3'; SEQ-ID NO:120), расщепляли с помощью NcoI и HindIII, и клонировали в векторе pQβ185, который расщепляли этими же рестриктазами. pQβ185 представляет собой вектор, выведенный из вектора pGEM. Экспрессию клонируемых генов в этом векторе контролировали промотором trp (Kozlovska Т.М. и др., Gene 137, 1993, c.133-37). Аналогичным образом конструировали плазмиду рАР592 путем клонирования расщепленного NcoI/HindIII ПЦР-фрагмента, полученного с помощью олигонуклеотидов p1.44 и pINC-40 (5'-GTAAGCTTAGATGCATTATCCGGATCCTCAAGCAGTAGTATCAGACGATACG-3'; SEQ-ID NO:121) в этом же векторе.

Последовательность, кодирующую аминокислоты 117-270 мышиного IL-1α, амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pModEC1-His-EK-mIL1α117-270 (см. пример 1), используя праймеры pINC-34 (5'-GGTCCGGAGCGCTAGCCCCTTACAC-3'; SEQ ID NO:122) и pINC-35 (5'-GTAAGCTTATGCATTATGATATCTGGAAGTCTGTCATAGA-3'; SEQ ID NO:123), которые обеспечивали добавление сайтов рестрикции Kpn2I и HindIII к 5'- и 3'-концам соответственно. Полученный ДНК-фрагмент расщепляли Kpn2I и HindIII и клонировали как в векторе рАР590, создавая плазмиду рАР594 (супрессия амбер-кодона), так и в векторе рАР592, создавая плазмиду рАР596 (супрессия опал-кодона), соответственно.

Для экспрессии мозаичных ВПЧ АР205, презентующих мышиный IL-1α на их поверхности, клетки E.coli JM109, содержащие плазмиду pISM 579 или pISM 3001, трансформировали плазмидой рАР594 или рАР596 соответственно. Плазмиду pISM579 создавали, вырезая ген trpT176 из pISM3001, с помощью рестриктазы EcoRI и, заменяя его EcoRI-фрагмектом из плазмиды pMY579 (любезно предоставлена Michael Yams), которая содержала ген-супрессор амбер-тРНК. Этот ген-супрессор тРНК представляет собой мутант trpT175 (Raftery LA. и др., J. Bacteriol. 158, 1984, c.849-859) и отличается от trpT по трем положениям: G33, А24 и Т35. Пять мл жидкой LB-среды, содержащей 20 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл канамицина, инокулировали одной колонией и инкубировали при 37°С в течение 16-24 ч без встряхивания. Полученный инокулят разводили в 50 раз М9-средой, содержащей 20 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл канамицина, и инкубировали при 37°С в течение ночи на шейкере. Клетки собирали центрифугированием.

Клетки (1 г клеток, трансформированных плазмидой рАР594 и содержащих pISM579) лизировали путем обработки ультразвуком в буфере для лизиса (20 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТК, 150 мМ NaCl, pH 7,8, 0,1% Твин 20). Лизат осветляли центрифугированием и клеточный дебрис промывали буфером для лизиса. Объединенный супернатант вносили на колонку, заполненную Сефарозой CL-4В, элюировали TEN-буфером (20 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТК, 150 мМ NaCl, pH 7,8). Присутствие капсидов в осветленном лизате и промывочной жидкости супернатанта подтверждали с помощью электрофореза в агарозном геле (1% ТАЕ, окраска гелей бромидом этидия и УФ-выявление). Из колонок элюировалось 2 пика, что установлено с помощью ДСН-ПААГ или УФ-спектрометрического анализа рассеяния света при 310 нм. Фракции второго пика, содержащие капсиды, объединяли и вносили на колонку, заполненную Сефарозой CL-6B. Пики фракций, полученных из CL-6В-колонки, объединяли и концентрировали с помощью центрифужного фильтрующего устройства (Amicon Ultra 15, MWCO 30000, фирма Millipore). Белок дополнительно очищали с помощью еще одного цикла гель-фильтрации на CL-4B и фракции полученного пика объединяли и концентрировали с помощью указанного выше центрифужного фильтрующегося устройства. Буфер заменяли на 10 мМ Hepes, pH 7,5 и добавляли глицерин до конечной концентрации 50%.

Очистку AP205_mIL-1α117-270 из плазмиды рАР596 осуществляли в целом согласно методу, описанному выше для плазмиды рАР594, с включением дополнительной стадии очистки в градиенте сахарозы после последней стадии очистки на СL-4В-колонке. Белок наслаивали на полученный градиент, созданный с использованием следующих растворов сахарозы: 9 мл раствора, содержащего 36% сахарозы, 3 мл - 30% сахарозы, 6 мл - 25% сахарозы, 8 мл - 20% сахарозы, 6 мл - 15% сахарозы, 6 мл - 10% сахарозы и 3 мл - 5% сахарозы. Фракции идентифицировали с помощью УФ-спектроскопии и объединенные фракции, содержащие капсиды, концентрировали с помощью указанного выше центрифужного фильтрующегося устройства, а буфер заменяли на 10 мМ Hepes, pH 7,5. И, наконец, добавляли глицерин до конечной концентрации 50%.

Б. Иммунизация мышей AP205_mIL-1α117-270

Четыре самки мышей линии balb/c иммунизировали AP205_mIL-1α117-270. 25 мкг общего белка разбавляли в ЗФР до объема 200 мкл и инъецировали подкожно (100 мкл в две стороны брюшного отдела) в день 0, день 14 и день 28. У мышей брали кровь из ретроорбитального сплетения в дни 0, 14, 28 и 35 и сыворотку анализировали с помощью специфического для мышиного IL-1α117-270 ELISA.

В. ELISA

Планшеты для ELISA сенсибилизировали мышиным белком IL-1α117-270 в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты блокировали и затем инкубировали с серийно разведенной мышиной сывороткой, полученной в дни 14, 28 и 35. Связанные антитела выявляли с помощью меченого ферментом мышиного антитела в виде IgG. Титры антитела в мышиной сыворотке рассчитывали в виде среднего значения разведении, при использовании которых оптическая плотность при 450 нм составляла половину от максимальной. Средний титр мышиного антитела к IL-1α117-270 составлял 1:4412 в день 14, 1:27955 в день 28 и 1:34824 в день 35. Эти результаты демонстрируют, что иммунизация AP205_mIL-1α117-270 может преодолевать иммунологическую толерантность и приводить к образованию высоких титров антител, которые специфически распознают IL-1α117-270.

Г. Нейтрализация in vitro IL-1α

Затем оценивали способность сыворотки мышей, иммунизированных AP205_mIL-1α117-270, ингибировать связывание мышиного белка IL-1α с его рецептором. Для этой цели планшеты для ELISA сенсибилизировали рекомбинантным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали совместно с серийными разведениями сыворотки мышей, которых иммунизировали либо AP205_mIL-1α117-270; либо только АР205 и 100 нг/мл мышиного IL-1α117-270. Связывание mIL-1α117-270 c иммобилизованным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc выявляли с помощью биотинилированного антитела к мышиному IL-1α и конъюгированного с пероксидазой из хрена стрептавидина. Все образцы сыворотки, полученные из организма мышей, иммунизированных AP205_mIL-1α117-270, полностью ингибировали связывание мышиного IL-1α117-270 с его рецептором в концентрации ≥3,3%, в то время как образцы сыворотки из организма мышей, иммунизированных АР205, не обладали ингибирующим действием ни в одной из изученных концентраций. Эти данные демонстрируют, что иммунизация AP205_mIL-1α117-270 может приводить к образованию антител, которые могут нейтрализовать взаимодействие мышиного IL-1α117-270 с его рецептором.

Д. Нейтрализация in vivo IL-1α

На следующей стадии анализировали способность к нейтрализации in vivo антител, образовавшихся в результате иммунизации AP205_mIL-1α117-270. Для этой цели четырех самок мышей линии balb/c иммунизировали трижды в дни 0, 14 и 28 AP205_mIL-1α117-270, а четырех мышей иммунизировали в это же время только АР205. В день 42 всем мышам вводили внутривенно 1 мкг свободного мышиного IL-1α117-270. Для получения данных о воспалительной активности инъецируемого IL-1α117-270 образцы сыворотки анализировали через 3 ч после инъекции для определения относительного возрастания концентрации провоспалительного цитокина IL-6. У иммунизированных АР205 мышей обнаружено среднее возрастание концентрации в сыворотке IL-6, составляющее 12,92±3,95 нг/мл, а у мышей, иммунизированных AP205_mIL-1α117-270, обнаружено среднее возрастание, составляющее только 0,06±0,05 нг/мл (p<0,01). В качестве контроля в день 28 всем мышам инъецировали 1 мкг mIL-1β. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела, продуцируемые в результате иммунизации AP205_mIL-1α117-270, могут специфически и эффективно нейтрализовать провоспалительную активность IL-1α.

Е. Эффективность АР205_mIL-1α117-270 нa мышиной модели ревматоидного артрита

Эффективность иммунизации с использованием AP205_mIL-1α117-270 оценивали на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (CIA). Самцов мышей линии DBA/1 иммунизировали подкожно трижды (дни 0, 14 и 28), используя 50 мкг либо AP205_mIL-1α117-270 (n=8), либо только АР205 (n=8), а затем им вводили внутрикожно в день 42 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с полным адъювантом Фрейнда. После бустер-инъекции 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда, в день 63 у мышей ежедневно оценивали развитие симптомов артрита. Шкалу клинических баллов от 0 до 3 применяли для оценки каждой конечности с позиций уровня обнаруживаемого покраснения и припухлости и определяли утолщение голеностопного сустава всех задних конечностей. Через 4 недели после второй инъекции коллагена у мышей, иммунизированных АР205, средний кумулятивный клинический балл составлял 5,81, а у мышей, иммунизированных AP205_mIL-1α117-270, средний клинический балл составлял только 2,06. Кроме того, среднее увеличение толщины голеностопного сустава составляло 19% у мышей, иммунизированных АР205, а у мышей, иммунизированных AP205_mIL-1α117-270, только 9%. В сочетании эти данные свидетельствуют о том, что иммунизация AP205_mIL-1α117-270 в значительной степени защищает мышей от воспаления и клинических симптомов артрита при использовании CIA-модели.

Пример 9

А. Клонирование и экспрессия вирусоподобных частиц, состоящих из оболочечного белка АР205, генетически слитого с мышиным IL-1β119-269 (АР205_mIL-1β119-269)

Клонирование, экспрессию и очистку вирусоподобных частиц, содержащих оболочечный белок АР205, генетически слитый с мышиным IL-1β119-269, осуществляли в целом согласно методу, описанному для AP205_mIL-1α117-270 в примере 8. Последовательность мышиного интерлейкина-1 бета амплифицировали из плазмиды pModEC1-His-EK-mIL1β119-269, кодирующей мышиный интерлейкин-1 бета, используя праймеры pINC-75 (5'-GATCCGGAGGTGGTGTCCCCATTAGACAGCT-3', SEQ ID NO:192) и pINC-77 (5'-GTAAGCTTAGGAAGACACAGATTCCAT-3', SEQ ID NO:193). Эти праймеры обеспечивают амплификацию мышиного гена интерлейкина-1 бета с сайтами 5'-Kpn2I и 3'-HindIII и кодирующего дополнительную аминокислотную последовательность Gly-Gly на N-конце мышиного интерлейкина-1 бета. Полученный mur-IL-1β-фрагмент расщепляли Kpn2I и HindIII и клонировали в тех же сайтах рестрикции в векторе рАР590 (супрессия амбер-кодона), получая плазмиду pAP630. Клетки E.coli JM109, содержащие плазмиду pISM 579, обеспечивающую супрессию амбер-кодона, трансформировали плазмидой pAP630. Пять мл жидкой LB-среды, содержащей 20 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл канамицина, инокулировали одной колонией и инкубировали при 37°С в течение 16-24 ч без встряхивания. Полученный инокулят разводили в 50 раз М9-средой, содержащей 20 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл канамицина, и инкубировали при 37°С в течение ночи на шейкере. Клетки собирали центрифугированием.

Б. Клонирование и экспрессия вирусоподобных частиц, состоящих из оболочечного белка АР205, генетически слитого с человеческим IL-1β116-269 (АР205_hIL-1β116-269)

Последовательность интерлейкина-1 бета амплифицировали из плазмиды pET42T-hIL-1β116-269, кодирующей человеческий интерлейкин-1 бета, используя праймеры pINC-74 (5'- GA TCC GGA GGT GGT GCC CCT GTA CGA TCA CTG AAC TG -3', SEQ ID NO:194) и pINC-76 (5'-GTATGCATTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTC-3, SEQ ID NO:195), интродуцируя сайты 5'-Kpn2I и 3'-Mph1103I соответственно. Полученный фрагмент человеческого IL-1β расщепляли с помощью Kpn2I и Mph1103I и клонировали в тех же сайтах рестрикции в векторе рАР590 (супрессия амбер-кодона), получая плазмиду рАР649. Клетки E.coli JM109, содержащие плазмиду pISM 579 (обеспечивающую супрессию амбер-кодона), трансформировали плазмидой pAP630. Пять мл жидкой LB-среды, содержащей 20 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл канамицина, инокулировали одной колонией и инкубировали при 37°С в течение 16-24 ч без встряхивания. Полученный инокулят разводили в 50 раз М9-средой, содержащей 20 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл канамицина, и инкубировали при 37°С в течение ночи на шейкере, Клетки собирали центрифугированием.

В. Иммунизация мышей АР205_mIL-1β119-269

Четырех самок мышей линии balb/c иммунизировали AP205_mIL-1β119-269. 25 мкг общего белка разбавляли в ЗФР до объема 200 мкл и инъецировали подкожно (100 мкл в две стороны брюшного отдела) в день 0, день 14 и день 28. У мышей брали кровь из ретроорбитального сплетения в дни 0, 14, 28 и 35 и сыворотку анализировали с помощью специфического для мышиного mIL-1β119-269 ELISA.

Г. ELISA

Планшеты для ELISA сенсибилизировали мышиным белком IL-1β119-269 в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты блокировали и затем инкубировали с серийно разведенной мышиной сывороткой, полученной в дни 0, 14, 28 и 35. Связанные антитела выявляли с помощью меченого ферментом мышиного антитела в виде IgG. Титры антитела в мышиной сыворотке рассчитывали в виде среднего значения разведении, при использовании которых оптическая плотность при 450 нм составляла половину от максимальной. Иммунизация с использованием AP205_mIL-1β119-269 позволяла получать высокие титры антитела к мышиному IL-1β119-269. Эти результаты демонстрируют, что иммунизация AP205_mIL-1β119-269 может преодолевать иммунологическую толерантность и приводить к образованию высоких титров антител, которые специфически распознают IL-1β119-269.

Д. Нейтрализация in vitro IL-1β

Затем оценивали способность сыворотки мышей, иммунизированных AP205_mIL-1β119-269, ингибировать связывание мышиного белка IL-1β с его рецептором. Для этой цели планшеты для ELISA сенсибилизировали рекомбинантным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали совместно с серийными разведениями сыворотки мышей, которых иммунизировали либо AP205_mIL-1β119-269; либо только АР205 и 100 нг/мл мышиного IL-1β119-269. Связывание IL-1β119-269 с иммобилизованным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc выявляли с помощью биотинилированного антитела к мышиному IL-1β и конъюгированного с пероксидазой из хрена стрептавидина. Все образцы сыворотки, полученные из организма мышей, иммунизированных AP205_mIL-1β119-269, заметно ингибировали связывание мышиного IL-1β119-269 с его рецептором, в то время как образцы сыворотки из организма мышей, иммунизированных АР205, не обладали никаким ингибирующим действием. Эти данные демонстрируют, что иммунизация AP205_mIL-1β119-269 может приводить к образованию антител, которые могут нейтрализовать взаимодействие мышиного IL-1β119-269 с его рецептором.

Б. Нейтрализация in vivo IL-1β

Далее анализировали способность к нейтрализации in vivo антител, образовавшихся в результате иммунизации AP205_mIL-1β119-269. Для этой цели четырех самок мышей линии balb/c иммунизировали трижды в дни 0, 14 и 28 AP205_mIL-1β119-269, а четырех мышей иммунизировали в это же время только АР205. В день 35 всем мышам вводили внутривенно 1 мкг свободного mIL-1β119-269. Для получения данных о воспалительной активности инъецируемого mIL-1β119-269 образцы сыворотки анализировали через 3 ч после инъекции для определения относительного возрастания концентрации провоспалительного цитокина IL-6. У иммунизированных АР205 мышей обнаружено значительное увеличение концентрации IL-6 в сыворотке, в то время как у мышей, иммунизированных AP205_mIL-1β119-269, обнаружено лишь очень небольшое возрастание. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела, продуцируемые в результате иммунизации AP205_mIL-1β119-269, могут специфически и эффективно нейтрализовать провоспалительную активность IL-1β.

Ж. Эффективность АР205_mIL-1β119-269 на мышиной модели ревматоидного артрита

Эффективность иммунизации с использованием AP205_mIL-1β119-269 оценивали на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (CIA). Самцов мышей линии DBA/1 иммунизировали подкожно трижды (дни 0, 14 и 28), используя 50 мкг либо AP205_mIL-1β119-269 (n=8), либо только АР205 (n=8), а затем вводили внутрикожно в день 42 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с полным адъювантом Фрейнда. После бустер-инъекции 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда, в день 63 у мышей ежедневно оценивали развитие симптомов артрита. Шкалу клинических баллов от 0 до 3 применяли для оценки каждой конечности с позиций уровня обнаруживаемого покраснения и припухлости и определяли утолщение голеностопного сустава всех задних конечностей. Через 4 недели после второй инъекции коллагена у мышей, иммунизированных AP205_mIL-1β119-269, установлено значительное снижение среднего клинического балла по сравнению с мышами, иммунизированными только АР205. Кроме того, у мышей, иммунизированных AP205_mIL-1β119-269, обнаружено только незначительное увеличение толщины голеностопного сустава задней конечности, в то время как у мышей, иммунизированных АР205, обнаружено заметное увеличение толщины голеностопного сустава задней конечности. В сочетании эти данные свидетельствуют о том, что иммунизация AP205_mIL-1β119-269 в значительной степени защищает мышей от воспаления и клинических симптомов артрита при использовании CIA-модели.

Пример 10

А. Клонирование, экспрессия и очистка человеческого IL-1β116-269

Нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 116-269 человеческого IL-1β (hIL-1β116-269), амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК человеческой печеночной ткани, используя олигонуклеотиды HIL-1 (5'-ATATATGATATCCCTGTACGATCACTGAACTGCACG-3'; SEQ ID NO:124) и HIL-2 (5'-ATATATCTCGAGGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAG-3'; SEQ ID NO:125), расщепляли с помощью XhoI и EcoRV и клонировали в экспрессионном векторе рЕТ42Т(+).

Плазмиду рЕТ-42Т(+) конструировали путем замены всей области между промотором Т7 и терминатором Т7 плазмиды рЕТ-42а(+) (фирма Novagen) в две стадии с помощью новых линкерных последовательностей, которые облегчают экспрессию представляющего интерес белка в виде слияния с C-концевой меткой (SEQ ID NO:190), содержащей His-метку и цистеиновый линкер. На первой стадии плазмиду рЕТ-42а(+) расщепляли с помощью рестриктаз NdeI и AvrII, что приводило к высвобождению фрагмента длиной 958 пар оснований между промотором Т7 и терминатором Т7, состоящего из GST-метки, S-метки, двух His-меток и множественного сайта клонирования. Оставшийся фрагмент длиной 4972 пары оснований, содержащий каркас вектора рЕТ-42а(+), выделяли и лигировали с ренатурированными комплементарными олигонуклеотидами 42-1 (5'-TATGGATATCGAATTCAAGCTTCTGCAGCTGCTCGAGTAATTGATTAC-3'; SEQ ID NO:126) и 42-2 (5'-CTAGGTAATCAATTACTCGAGCAGCTGCAGAAGCTTGAATTCGATATCCA-3'; SEQ-ID NO:127), получая в результате плазмиду pET-42S(+). На второй стадии плазмиду pET-42S(+) линеаризовали путем расщепления рестриктазами XhoI и AvrII и лигировали с ренатурированными комплементарными олигонуклеотидами 42Т-1 (5'-TCGAGCACCACCACCACCACCACGGTGGTTGCTAATAATAATTGATTAATAC-3'; SEQ ID NO:128) и 42Т-2 (5'-CTAGGTATTAATCAATTATTATTAGCAACCACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGC-3'; SEQ ID NO:129), получая плазмиду рЕТ-42Т(+).

Клонирование вышеуказанного фрагмента hIL-1β116-269 в рЕТ-42Т(+) позволяло получать плазмиду pET42T-hIL-1β116-269. Эта плазмида кодировала слитый белок, соответствующий зрелому человеческому IL-1β, и His-метку и C-концевой содержащий цистеин линкер (GGC, SEQ ID NO:178). Таким образом, слитый белок состоял из SEQ ID NO:190, слитой на С-конце с SEQ ID NO:165. В этом слитом белке присутствующий в исходной последовательности остаток аланина в положении 117 человеческого IL-1R заменяли на изолейцин. Экспрессию и очистку человеческого белка IL-1β116-269 осуществляли в целом согласно методу, описанному для мышиного белка mIL1β119-269, в примере 1.

Б. Клонирование, экспрессия и очистка мутеинов человеческого IL-1β116-269

С помощью сайтнаправленного мутагенеза плазмиды pET42T-hIL-1β116-269 конструировали экспрессионные векторы для 10 различных мутантных слитых белков IL-1β116-269. Для этой цели использовали набор для сайтнаправленного мутагенеза Quik-Change® (фирма Stratagene) согласно инструкциям производителя. Экспрессионные векторы для этих мутантных белков IL-1β119-269 перечислены в таблице 3 в сочетании с олигонуклеотидными парами, применяемыми для их конструирования. Экспрессию и очистку различных мутеинов человеческого IL-1β116-269 осуществляли согласно методу, описанному в примере 1.

Пример 11

Биологическая активность человеческого IL-1β116-269 и мутеинов человеческого IL-1β116-269

Трем самкам мышей линии С3Н/HeJ в каждой группе инъецировали внутривенно 10 мкг либо человеческого белка IL-1β119-269 дикого типа, либо одного из мутеинов человеческого белка IL-1β119-269, описанных в примере 10. Образцы сыворотки отбирали до инъекции и через 3 ч после инъекции и анализировали относительное повышение концентрации провоспалительного цитокина IL-6. У мышей, которым вводили человеческий белок IL-1β119-269 дикого типа, обнаружено значительное повышение концентраций IL-6 в сыворотке, в то время как у мышей, обработанных любым из белков-мутеинов человеческого IL-1β119-269, обнаружено лишь незначительное повышение концентрации или полное отсутствие повышения.

Пример 12

А. Сочетание человеческого IL-1β116-269 и мутеинов человеческого IL-1β116-269 с вирусоподобными частицами Qβ

Химическое поперечное сшивание человеческого белка IL-1β119-269 дикого типа и мутеинов человеческого IL-1β119-269, которые описаны в примере 10, с вирусоподобными частицами Qβ осуществляли в целом согласно методу, описанному в примере 2А.

Б. Иммунизация мышей человеческим IL-1β116-269 и мутеинами человеческого IL-1β116-269, сшитыми с капсидом Qβ

Четырех самок мышей линии balb/c в каждой группе иммунизировали Qβ, сшитым либо с белком дикого типа hIL-1β116-269, либо с одним из белков-мутеинов hIL-1β116-269. 25 мкг общего белка разбавляли в ЗФР до объема 500 мкл и инъецировали подкожно (100 мкл в две стороны брюшного отдела) в день 0, день 14 и день 28. У мышей брали кровь из ретроорбитального сплетения в день 35 и сыворотку анализировали с помощью ELISA, специфических для любого из соответствующих мутеинов человеческого IL-1β116-269, применяемого в качестве иммуногена, либо для белка человеческого IL-1β116-269 дикого типа.

В. ELISA

Планшеты для ELISA сенсибилизировали либо белком человеческого IL-1β116-269 дикого типа, либо соответствующим мутеином hIL-1β116-269 в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты блокировали и затем инкубировали с серийно разведенной мышиной сывороткой, полученной в день 35. Связанные антитела выявляли с помощью меченого ферментом мышиного антитела в виде IgG. Титры антитела в мышиной сыворотке рассчитывали в виде среднего значения разведении, при использовании которых оптическая плотность при 450 нм составляла половину от максимальной, и они представлены в таблице 4.

Таблица 4
Титры специфически в отношении hIL-1β116-269 (дикого типа и мутеин) антител в виде IgG, полученные в ответ на иммунизацию вакциной на основе Qβ-hIL-1β116-269 или мутеинов Qβ-hIL-1β116-269
Вакцина Средний титр IgG к hIL-1β116-269 дикого типа (±СКО) Средний титр IgG к мутеину hIL-1β116-269 (±CKO)
Qβ-hIL-1β116-269 253325±184813 -/-
Qβ-hIL-1β116-269 (R4D) 231879±115475 160666±79478
Qβ-hIL-1β116-269 (L6A) 120224±7658 89377±17965
Qβ-hIL-1β116-269 (T9G) 261249±153716 224809±131823
Qβ-hIL-1β116-269 (R11G) 278342±50296 279290±47232
Qβ-hIL-1β116-269 (D54R) 269807±122351 206516±90998
Qβ-hIL-1β116-269 (D145K) 78365±26983 93241±28856
Qβ-hIL-1β116-269 (ΔEE50,51) 287625±143835 229862±140169
Qβ-hIL-1β116-269 (ΔSND52-54) 68895±14267 106116±25295
Qβ-hIL-1β116-269 (K63S/K65S) 403712±402594 244552±173597
Qβ-hIL-1β116-269 (Q126A/E128A) 195165±71436 170434±86831

Иммунизация с использованием Qβ-hIL-1β116-269 приводила к получению высоких титров антител в виде IgG к hIL-1β116-269. Кроме того, вакцинация любой из вакцин на основе мутеина Qβ-hIL-1β116-269 индуцировала высокие титры IgG как к соответствующему мутеину hIL-1β116-269, применяемому в качестве иммуногена, так и к белку hIL-1β116-269 дикого типа.

Г. Нейтрализация in vitro человеческого IL-1β

Оценивали способность сыворотки мышей, иммунизированных Qβ, сшитым либо с белком hIL-1β116-269 дикого типа, либо с одним из мутеинов hIL-1β116-269, ингибировать связывание мышиного белка IL-1R с его рецептором. Для этой цели планшеты для ELISA сенсибилизировали рекомбинантным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали совместно с серийными разведениями указанной выше сыворотки и 100 нг/мл мышиного IL-1β119-269. Связывание IL-1β119-269 с иммобилизованным слитым белком рецептор I mIL-1-hFc выявляли с помощью биотинилированного антитела к мышиному IL-1β и конъюгированного с пероксидазой из хрена стрептавидина. Все образцы сыворотки, полученные из организма мышей, обработанных вакцинами на основе мутеинов Qβ-hIL-1β116-269, полностью ингибировали связывание 100 нг/мл hIL-1β116-269 дикого типа с hIL-1RI при концентрациях в сыворотке ≥3,3%.

Д. Нейтрализация in vivo IL-1β

Изучали способность к нейтрализации in vivo антител, образовавшихся в результате иммунизации Qβ, сшитыми либо с белком hIL-1β116-269 дикого типа, либо с одним из мутеинов hIL-1β116-269. Для этой цели трех самок мышей линии С3Н/HeJ в каждой группе иммунизировали трижды в дни 0, 14 и 28 50 мкг одной из вакцин. В день 35 всем иммунизированным мышам инъецировали внутривенно 1 мкг свободного hIL-1β116-269 дикого типа. В качестве контроля трем несенсибилизированным мышам инъецировали в это же время такое же количество hIL-1β116-269 дикого типа. Для получения данных о воспалительной активности инъецируемого hIL-1β116-269, образцы сыворотки отбирали непосредственно до и через 3 ч после инъекции для определения относительного возрастания концентрации провоспалительного цитокина IL-6. В то время как у несенсибилизированных мышей выявлено значительное повышение концентраций IL-6 в сыворотке через 3 ч после инъекции hIL-1β116-269, у всех мышей, иммунизированных Qβ, сшитым либо с белком hIL-1β116-269 дикого типа, либо с одним из мутеинов hIL-1β116-269, не выявлено никакого повышения уровня IL-6 в сыворотке, что свидетельствует о том, что инъецируемый hIL-1β116-269 эффективно нейтрализуется антителами, индуцируемыми вакцинами.

Пример 13

Облегчение индуцированного MSU воспаления посредством иммунизации с использованием Qβ-mIL-1β119-269

Подагра представляет собой болезненное воспалительное нарушение, вызываемое осаждением кристаллов мононатрийурата (MSU) в суставах и вокругсуставных тканях. Известно, что кристаллы MSU активируют так называемую NALP3-инфлaммacoмy, что приводит к производству активного IL-1β, который в основном ответствен за инициацию и усиление воспалительного ответа, характерного для этого заболевания. Мышей линии C57BL/6 (5 особей на группу) иммунизировали путем подкожного введения трижды с двухнедельными интервалами 50 мкг Qβ-mIL-1β119-269 или 50 мкг только ВПЧ Qβ. Через 1 неделю после последней иммунизации всем мышам осуществляли подкожное контрольное заражение с использованием 1,5 мг кристаллов MSU. Через 6 ч после контрольного заражения мышей умерщвляли и количество нейтрофилов, а также концентрации хемоаттрактантов для нейтрофилов KС и MIP-2 оценивали в перитонеальных экссудатах. У мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269, обнаружено резкое снижение количества нейтрофилов и концентраций MIP-2 и KC по сравнению с иммунизированными Qβ контрольными животными.

Пример 14

Облегчение экспериментального аутоиммунного энцефалита путем иммунизации Qβ-mIL-1β119-269

С использованием мышиной модели рассеянного склероза мышей линии C57BL/6 (8 особей на группу) иммунизировали путем подкожного введения трижды с двухнедельными интервалами 50 мкг Qβ-mIL-1β119-269 или 50 мкг только ВПЧ Qβ. Через 1 неделю после последней иммунизации всем мышам инъецировали подкожно 100 мкг MOG-пептида (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK, SEQ ID NO:191), смешанного с полным адъювантом Фрейнда. В этот же день и через 2 дня всем мышам инъецировали внутрибрюшинного 400 нг токсина коклюша. У мышей ежедневно оценивали в баллах развитие неврологических симптомов по следующей схеме: 0 - отсутствие клинического проявления болезни; 0,5 - ослабленный кончик хвоста; 1 - полностью ослабленный хвост; 1,5 - ослабленный хвост и слабость задних конечностей (шатающаяся походка и плохая цепкость задних конечностей); 2 - односторонний частичный паралич задних конечностей; 2,5 - двухсторонний частичный паралич задних конечностей; 3 - полный двусторонний паралич задних конечностей; 3,5 - полный двухсторонний паралич задних конечностей и односторонний паралич передних конечностей; 4 - общий паралич задних и передних конечностей. У мышей, иммунизированных Qβ-mIL-1β119-269, выявлено заметное уменьшение клинических симптомов по сравнению с иммунизированными Qβ мышами.

1. Композиция для индукции иммунного ответа против IL-1, содержащая:
(а) вирусоподобную частицу (ВПЧ), которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения; и
(б) по меньшей мере один антиген, который несет по меньшей мере один второй сайт присоединения;
где по меньшей мере один антиген представляет собой молекулу IL-1 и где компоненты (а) и (б) сцеплены по меньшей мере через один первый сайт присоединения и по меньшей мере один второй сайт присоединения.

2. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 выбрана из группы, включающей:
(а) белок IL-1;
(б) зрелый фрагмент IL-1;
(в) фрагмент IL-1;
(г) пептид IL-1; и
(д) мутеин IL-1.

3. Композиция по п.2, в которой молекула IL-1 получена из организма человека.

4. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой молекулу IL-1 бета.

5. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой молекулу IL-1 альфа.

6. Композиция по п.4, в которой молекула IL-1 бета выбрана из группы, включающей:
(а) белок IL-1 бета;
(б) зрелый фрагмент IL-1 бета;
(в) фрагмент IL-1 бета;
(г) пептид IL-1 бета; и
(д) мутеин IL-1 бета.

7. Композиция по п.5, в которой молекула IL-1 альфа выбрана из группы, включающей:
(а) белок IL-1 альфа;
(б) зрелый фрагмент IL-1 альфа;
(в) фрагмент IL-1 альфа;
(г) пептид IL-1 альфа; и
(д) мутеин IL-1 альфа.

8. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой белок IL-1 бета, который содержит или предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей:
(а) человеческий IL-1 бета (SEQ ID NO:49);
(б) любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:50 - SEQ ID NO:62; и
(в) аминокислотную последовательность, которая по меньшей на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:49 - SEQ ID NO:62.

9. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой зрелый фрагмент IL-1 бета, содержащий или предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей:
(а) человеческий IL-1 бета 117-269 (SEQ ID NO:64);
(б) человеческий IL-1 бета 116-269 (SEQ ID NO:165);
(в) мышиный IL-1 бета 119-269 (SEQ ID NO:164); и
(г) аминокислотную последовательность, которая по меньшей на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:165 и SEQ ID NO:164.

10. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой молекулу IL-1 бета мутеина.

11. Композиция по п.10, в которой молекула IL-1 бета мутеина включает или предпочтительно состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, причем указанная аминокислотная последовательность отличается от любой из последовательностей SEQ ID NO:64 и SEQ ID NO:165 1-6, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, наиболее предпочтительно 1-2, и в самом предпочтительном случае 1 аминокислотным(и) остатком(ами), где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(ые) остатки заменяются другим аминокислотным остатком.

12. Композиция по п.10, в которой молекула IL-1 бета мутеина включает или предпочтительно состоит из полипептидов SEQ ID NO:131 - SEQ ID NO: 140.

13. Композиция по п.10, где указанным IL-1 бета мутеином является hIL-1β116-269 (D145K) (SEQ ID NO:136).

14. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой белок IL-1 бета, содержащий или предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей:
(а) SEQ ID NO:89 - SEQ ID NO:116; и
(б) аминокислотную последовательность, которая по меньшей на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:89 - SEQ ID NO: 116.

15. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой белок IL-1 альфа, содержащий или предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей:
(а) человеческий IL-1 альфа (SEQ ID NO:36);
(б) любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:37 - SEQ ID NO:48; и
(в) аминокислотную последовательность, которая по меньшей на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:36 - SEQ ID NO:48.

16. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой зрелый фрагмент IL-1 альфа, содержащий или предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей:
(а) человеческий IL-1 альфа 119-271 (SEQ ID NO:63);
(б) мышиный IL-1 альфа 117-270 (SEQ ID NO:163); и
(в) аминокислотную последовательность, которая по меньшей на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:63 или SEQ ID NO:163.

17. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой молекулу IL-1 альфа мутеина.

18. Композиция по п.17, в которой молекула IL-1 альфа мутеина включает или предпочтительно состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, причем указанная аминокислотная последовательность отличается от любой из последовательностей SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65 и SEQ ID NO:163 1-6, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-4, еще более предпочтительно 1-3, наиболее предпочтительно 1-2, и в самом предпочтительном случае 1 аминокислотным(и) остатком(ами), где предпочтительно указанный(ые) аминокислотный(ые) остатки заменяются другим аминокислотным остатком.

19. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 представляет собой пептид IL-1 альфа, содержащий или предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей:
(а) любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:67 - SEQ ID NO:88; и
(б) аминокислотную последовательность, которая по меньшей на 80% или предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:67 - SEQ ID NO:88.

20. Композиция по п.1, в которой ВПЧ содержит или в другом варианте состоит из рекомбинантных оболочечных белков, их мутантов или фрагментов РНКового бактериофага.

21. Композиция по п.1, в которой ВПЧ представляет собой ВПЧ РНКового бактериофага.

22. Композиция по п.21, в которой РНКовый бактериофаг представляет собой РНКовый бактериофаг, выбранный из Qβ и АР205.

23. Композиция по п.1, в которой ВПЧ включает рекомбинантные белки оболочки РНКового бактериофага Qβ.

24. Композиция по п.1, в которой ВПЧ включает белок оболочки SEQ ID NO: 3.

25. Композиция по п.1, в которой первый сайт присоединения сцеплен со вторым сайтом присоединения через по меньшей мере одну ковалентную связь, где предпочтительно ковалентная связь представляет собой непептидную связь.

26. Композиция по п.1, в которой первый сайт присоединения содержит или предпочтительно представляет собой аминогруппу, предпочтительно аминогруппу лизина.

27. Композиция по п.1, в которой второй сайт присоединения содержит или предпочтительно представляет собой сульфгидрильную группу, предпочтительно сульфгидрильную группу цистеина.

28. Композиция по п.1, в которой первый сайт присоединения представляет собой аминогруппу лизина, а второй сайт присоединения представляет собой сульфгидрильную группу цистеина.

29. Композиция по п.1, в которой первый сайт присоединения не представляет собой сульфгидрильную группу.

30. Композиция по п.1, в которой связь ВПЧ и по меньшей мере одного антигена не представляет собой дисульфидный мостик.

31. Композиция по п.1, в которой только один из вторых сайтов присоединения ассоциирован с первым сайтом присоединения по меньшей мере через одну непептидную ковалентную связь, что приводит к получению одного и однородного типа связи молекулы IL-1 с вирусоподобной частицей, при этом только один второй сайт присоединения, который ассоциирован с первым сайтом присоединения, представляет собой сульфгидрильную группу, и молекула IL-1 и вирусоподобная частица взаимодействуют посредством ассоциации с образованием упорядоченного и повторяющегося набора антигенов.

32. Композиция по п.1, в которой антиген слит с N- или С-концом оболочечного белка АР205, его мутантов или фрагментов.

33. Композиция по п.1, дополнительно содержащая линкер, где указанный линкер связан с молекулой IL-1 посредством по меньшей мере одной ковалентной связи, и где указанный линкер включает или альтернативно состоит из указанного второго сайта присоединения.

34. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:64, или полученный из нее мутеин.

35. Композиция по п.1, в которой молекула IL-1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:63, или полученный из нее мутеин.

36. Вакцина для индукции иммунного ответа против IL-1, которая содержит или состоит из композиции по одному из пп.1-35.

37. Вакцина по п.36, где в вакцине отсутствует адъювант.

38. Способ иммунизации, заключающийся в том, что вводят вакцину по п.36 животному или человеку.

39. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, где заболевание выбрано из группы, включающей:
(а) сосудистые заболевания;
(б) наследственные IL-1-зависимые воспалительные заболевания;
(в) хронические аутоиммунные воспалительные заболевания;
(г) дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани;
(д) аллергические заболевания и
(е) неврологическое заболевание, причем эта композиция содержит:
(а) композицию по одному из пп.1-35 и
(б) приемлемый фармацевтический носитель.

40. Способ получения композиции по одному из пп.1-35, заключающийся в том, что:
(а) получают ВПЧ, которая несет по меньшей мере один первый сайт присоединения;
(б) получают по меньшей мере один антиген, где антиген представляет собой молекулу IL-1, белок IL-1, зрелый фрагмент IL-1, пептид IL-1 или мутеин IL-1, который несет по меньшей мере один второй сайт присоединения; и
(в) сцепляют ВПЧ и по меньшей мере один антиген с получением композиции или вакцины, где по меньшей мере один антиген и ВПЧ сцеплены по меньшей мере через один первый и по меньшей мере один второй сайт присоединения.

41. Применение композиции по одному из пп.1-35 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания, где заболевание выбрано из группы, включающей:
(а) сосудистые заболевания;
(б) наследственные IL-1-зависимые воспалительные заболевания;
(в) хронические аутоиммунные воспалительные заболевания;
(г) дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани;
(д) аллергические заболевания и
(е) неврологическое заболевание, где неврологическим заболеванием является рассеянный склероз;
у животного, предпочтительно у человека.

42. Применение по п.41, где заболевание представляет собой сосудистое заболевание, при этом сосудистое заболевание представляет собой атеросклероз.

43. Применение по п.41, где заболевание представляет собой наследственное IL-1-зависимое воспалительное заболевание, при этом наследственное IL-1-зависимое воспалительное заболевание представляет собой семейную средиземноморскую лихорадку (FMF).

44. Применение по п.41, где заболевание представляет собой хронические аутоиммунные воспалительные заболевания, где хронические аутоиммунные воспалительные заболевания представляют системный идиопатический артрит, начинающийся в юношеском возрасте, или ревматоидный артрит.

45. Применение по п.41, где заболевание представляет собой дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани, при этом дегенеративные заболевания костной и хрящевой ткани представляют собой подагру или остеоартрит.

46. Применение по п.41, где заболевание представляет собой рассеянный склероз.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к противовирусным средствам на основе ген-направленных каталитически активных нуклеиновых кислот. .

Изобретение относится к области химии и медицины и касается новых соединений, являющихся производными N-замещенного 1,4-диазабицикло[2.2.2.]октана. .

Изобретение относится к области ветеринарии и касается мутантного вируса бычьей диареи. .

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для блокирования хронических интеграционных инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом лейкоза крупного рогатого скота (BLV), вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), вирусом лейкоза мышей (MuLV), вирусом инфекционной анемии лошадей (EIA) и вирусом гепатита В.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. .

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации возбудителей болезни легионеров, выделяемых из организма больного и инфицированных объектов внешней среды.

Изобретение относится к области медицинской вирусологии. .
Изобретение относится к биохимии, конкретнее к биологически активным пептидам, обладающим стресспротекторной активностью, которые могут найти применение в медицине и фармакологии.
Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтики. .

Изобретение относится к медицине, биологии, нанотехнологии, и касается получения иммуногенных композиций. .
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение для лечения заболеваний шейки матки. .
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение для лечения предраковых заболеваний шейки матки. .
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, а именно к гинекологии, и может найти применение для лечения предраковых заболеваний шейки матки.
Изобретение относится к области медицины и касается композиции, содержащей вирусоподобную частицу (ВПЧ) и пептид амилоид-бета. .

Изобретение относится к области медицины и касается белков, слитых с кошачьим аллергеном и их применения. .

Изобретение относится к области медицины и иммунологии и касается конъюгата для иммунизации и вакцинации и способа повышения иммуногенности. .

Изобретение относится к медицине, а именно к изготовлению вакцин для интраназального введения. .
Наверх