Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида



Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида
Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида
Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида
Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида
Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида
Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида
Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида

 


Владельцы патента RU 2496866:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН) (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная фармацевтическая академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности биодеградации органических соединений с помощью микроорганизмов. Предложен способ биодеградации дротаверина гидрохлорида (спазмолитик НОШПА). Способ предусматривает процесс взаимодействия дротаверина гидрохлорида с клетками штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608. Процесс ведут в аэробных условиях в среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли. При этом в качестве дополнительного источника углерода в питательной среде может быть использована глюкоза. Клетки штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 могут быть использованы в иммобилизованном виде. Штамм хранится в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ). Биодеградации дротаверина гидрохлорида составляет не менее 80% за 25 суток. Изобретение позволяет сократить сроки биодеструкции дротаверина гидрохлорида и рассматривать используемый штамм как потенциальный агент для очистки окружающей среды. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается биотрансформации и биодеградации органических соединений с помощью микроорганизмов.

В настоящее время в почве, донных осадках водоемов, поверхностных, сточных, грунтовых и даже питьевых водах все чаще обнаруживаются фармацевтические вещества и их метаболиты [1]. Резкое увеличение "фармацевтического" загрязнения природной среды обусловлено ростом фармацевтической индустрии, частым и повсеместным потреблением лекарственных препаратов населением, в ветеринарии и на рыбоводческих фермах, недостаточной эффективностью методов уничтожения фармацевтических отходов [2]. Попадающие в окружающую среду высокостабильные, биоактивные и токсичные фармполлютанты оказывают хроническое необратимое воздействие на организм человека и способствуют нарушению экологического баланса.

Поиск эффективных способов нейтрализации токсичных фармполлютантов включает разработку безопасных способов их обезвреживания, в том числе с помощью микроорганизмов, обладающих способностью деградировать лекарственные вещества различного химического строения, изучения степени биодеградабельности и токсического действия данных соединений на микроорганизмы-деструкторы.

Известно, что актинобактерии рода Rhodococcus являются группой микроорганизмов, чаще других упоминаемых в литературе в связи с направленной деградацией различных ксенобиотиков. Олиготрофный образ жизни родококков, способность к фиксации молекулярного азота, высокая сопротивляемость конкурентам, лабильность метаболической системы и полифункциональность, синтез поверхностно-активных веществ, специфика оксидоредуктаз и, наконец, высокая катаболическая активность в экстремальных условиях внешней среды свидетельствуют об исключительной пластичности их генома [3]. Представленное указывает на явные технологические преимущества родококков и является одной из важнейших предпосылок к их широкому использованию в качестве потенциальных биокатализаторов процессов деструкции и трансформации многих органических соединений, в том числе и лекарственных средств.

Фармакологически активными веществами многих лекарственных средств являются разнообразные гетероциклические соединения. Одним из наиболее часто и повсеместно используемых препаратов в современной медицинской практике является дротаверина гидрохлорид - лекарственное вещество спазмолитического действия, производное азотсодержащего гетероцикла изохинолина (NO-SPA®). Ежегодное потребление его в развитых странах составляет сотни тонн, что неизбежно приводит к попаданию дротаверина в окружающую среду. Есть данные исследований, указывающие на эмбриотоксическое действие дротаверина в отношении млекопитающих [4].

К настоящему времени накоплен экспериментальный материал по биодеградации/биотрансформации почвенными и водными бактериями хинолиновых и изохинолиновых соединений, не являющихся фармацевтическими препаратами, обнаружено много микробных культур, способных деструктировать эти соединения [5]. Однако микробная трансформация фармацевтических препаратов изохинолинового ряда, их метаболические пути обмена и продукты биодеградации до сих пор остаются неизвестными. Информации по микробной деградации вышеуказанного фармацевтического препарата - дротаверина гидрохлорида - не обнаружено. Однако характеристика его бактериальных метаболитов и их свойств необходимы для эффективной работы систем очистки сточных вод и оценки экологической ситуации в окружающей среде.

Задачей изобретения является изыскание возможностей биодеградации дротаверина гидрохлорида с помощью эффективного и безопасного микроорганизма - биодеструктора, и вследствие этого повышение экологической безопасности природной среды.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является обеспечение биодеградации дротаверина гидрохлорида с помощью культуры родококков на основе эффективной технологии и подобранных условий проведения процесса биодеградации.

Данный технический результат достигается реализацией предлагаемого способа биодеградации дротаверина гидрохлорида, который заключается в том, что в аэробных условиях осуществляют взаимодействие дротаверина гидрохлорида с клетками штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608.

При осуществлении процесса клетки штамма могут использоваться в свободном или в иммобилизованном виде.

Процесс ведут в культуральной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли.

Предпочтительно используют среду, содержащую глюкозу в качестве источника углерода.

Осуществление заявленного способа обеспечивает высокую эффективность удаления дротаверина клетками указанного штамма родококков. Если процесс ведут в присутствии глюкозы с применением планктонных клеток, эффективность удаления дротавернина составляет более 80% от исходной концентрации через 25 суток, с дальнейшим полным исчезновением (утилизацией) дротаверина в среде.

Таким образом, заявленный способ оказался эффективным в отношении удаления дротаверина из жидких сред и может быть применен для очистки сточных вод, содержащих дротаверина гидрохлорид.

Применяемый в способе штамм Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 является известным, содержится в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур (WFCC) #768) Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (г.Пермь, Россия) [6]. Информация о нем содержится в вышеуказанном каталоге.

Способ иллюстрируют 3 примера.

Пример 1. Использование свободных клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608

Дротаверин, выпускаемый в форме гидрохлорида (C24H31NO4, CAS: 985-12-6, 1-(3,4-диэтоксибензилиден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин), обладает спазмолитическим, миотропным и сосудорасширяющим действием. В работе использовали изохинолин ("Lancaster", Великобритания), дротаверина гидрохлорид - в виде фармацевтической субстанции (светло-желтый с зеленоватым оттенком кристаллический порошок без запаха, чистота 98,5%, умеренно растворимый в воде, производства Ирбитского химико-фармацевтического завода, Россия). Дротаверина гидрохлорид вносили в среду культивирования из стерильного концентрированного раствора (0,1%) до конечной концентрации 0,02%.

В работе исследовали 93 штамма актинобактерий из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур (WFCC) #768) [6]. Культуры принадлежали к шести видам Rhodococcus: R. erythropolis (12 штаммов), R. fascians (14 штаммов), "R. longus" (14 штаммов), R. opacus (12 штаммов), R. rhodochrous (12 штаммов), R. ruber (14 штаммов), двум видам Gordonia: G. rubriperctincta (5 штаммов), G. terrae (5 штаммов), а также Dietzia mans (5 штаммов). По результатам исследований был отобран штамм Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608, обеспечивающий приемлемый уровень биодеструкции дротаверина.

Использованные в экспериментах химические реагенты, в том числе ацетонитрил, хлороформ и этанол, имели квалификацию х.ч., ч.д.а или о.с.ч. (Россия), "Merk" (Германия) H"Sigma-Aldrich" (США).

Минимальные подавляющие концентрации дротаверина в отношении культур родококков определяли методом серийных разведении. Штамм Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 отличался выраженной устойчивостью к дротаверину (МПК=300 мг/л).

В экспериментах по биодеструкции дротаверина гидрохлорида применяли минерально-солевую среду RS (г/л): K2HPO4 2,0; KH2PO4 2,0; KNO3 1,0; (NH4)2SO4 2,0; NaCl 1,0; MgSO4×7H2O 0,2; CaCl2×2H2O 0,02; FeCl3×7Н2О 0,001. Исходное значение pH реакционной среды было отрегулировано до 6,8 до начала инокуляции. В качестве источника углерода и энергии использовали дротаверина гидрохлорид в концентрации 200 мг/л, а инокулята - отмытые дважды 10 мМ K-Na-фосфатным буфером (рН 7,0) клетки Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608, предварительно выращенные в течение 3-х сут на мясопептонном агаре ("Oxoid", Великобритания), которые вносили в среду культивирования до конечной концентрации 6,8×107 кл./мл. В отдельных экспериментах родококки предварительно выращивали в питательной среде LB ("Sigma", США) в присутствии 0,0007% изохинолина. Биодеструкцию дротаверина исследовали также при дополнительном внесении энергетических косубстратов, в качестве которых использовали D-глюкозу (0,1%) и некоторые другие.

В качестве контролей использовали (1) стерильный раствор лекарственного вещества в минеральной среде RS (для оценки абиотической деструкции дротаверина); (2) стерильный раствор лекарственного вещества в минеральной среде RS с инактивированными клетками родококков (для оценки степени адсорбции дротаверина на бактериальных клетках), при этом бактериальные клетки инактивировали автоклавированием при 1,0 атм. трехкратно в течение 20 мин; (3) минеральную среду RS, содержащую глюкозу с клетками родококков, без лекарственного вещества (контроль для разграничения метаболитов, появляющихся в результате разложения дротаверина).

Численность жизнеспособных свободных клеток родококков в инкубационной среде определяли методом точечных высевов на мясопептонном агаре.

В сравнительных экспериментах по биодеструкции дротаверина использовали одинаковое количество планктонных и иммобилизованных клеток родококков.

Аналитические методы

Изменение количественного содержания лекарственного вещества в процессе биодеструкции регистрировали методом ВЭЖХ с помощью хроматографа "LC Prominence" ("Shimadzu", Япония), оборудованном колонкой с обращено-фазовым сорбентом Discovery® С18 и диодноматричным детектором. Подвижная фаза: 0,1% раствор трифторуксусной кислоты - ацетонитрил. Режим элюирования градиентный: исходная доля ацетонитрила в элюенте составляла 20% в течение первых 10 мин, с 10 по 20 мин. доля ацетонитрила возрастала до 80%. Скорость потока подвижной фазы 1,0 мл/мин, длина волны детектирования 240 нм; объем вводимой пробы 20 мкл; температура термостата колонки 40°C. Время удерживания дротаверина 8,64±0,02 мин. Подготовку проб для данного анализа осуществляли посредством их центрифугирования в течение 5 мин при 10000 об/мин.

Отбор проб (30 мл) проводили с интервалом от 24 до 120 ч каждые 3-5 сут. Состав продуктов разложения дротаверина анализировали методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) на хроматографе "6890-5973N" фирмы "Agilent Technologies" (США), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. В качестве газа-носителя использовали гелий. Температура инжектора и интерфейса составляла 250 и 280°C соответственно. Температура колонки программировалась от 70 до 300°C с повышением температуры со скоростью 10°C/мин. Ввод хлороформного экстракта в количестве 1 мкл осуществляли без деления потока газа-носителя. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 40 до 500 m/z. Полученные масс-спектры сравнивали с масс-спектрами библиотеки NIST 98 Mass Spectral Library with Windows Search Program (Version 1.7) For Use with Microsoft® Windows™ Users' Guide. Масс-спектры считали идентифицированными при совпадении масс-спектров исследуемого вещества с библиотечными с коэффициентом подобия более 90%.

Подготовку проб для данного анализа осуществляли посредством экстрагирования 30 мл культуральной жидкости трехкратно равными (по 10 мл) объемами хлороформа. Объединенные экстракты сушили над Na2SO4, растворитель удаляли на роторном испарителе.

При хромато-масс-спектрометрическом анализе экстрактов культуральной жидкости сделано заключение о том, что в первые 10 сут эксперимента среди продуктов биодеструкции дротаверина детектируются соединения предполагаемой структуры: 1-(3,4-диэтоксибензоил)-6,7-диэтокси-3,4-дигидроизохинолин, m/z=411,2 и 1-(3,4-диэтоксибензоил-6,7-диэтоксиизохинолин, m/z=409,0.

Наряду с указанными продуктами регистрировалось соединение предполагаемой структуры 1-оксо-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин, характеризующееся m/z=235,2, M+, 70,0%. Это наиболее вероятное соединение является структурным аналогом производных изокарбостирила. Образование данного гидрированного производного 6,7-диэтокси-изохинолин-1(2Н)-она согласуется с общими представлениями о химическом окислении производных 1-бензилизохинолина. Известно, что замещенные 1(2Н)-изохинолоны широко используются как строительные блоки в органическом синтезе и обладают разнообразными видами биологической активности [7]. Вышеуказанные соединения к концу ферментации не обнаруживались в инкубационной среде, что свидетельствовало о дополнительных стадиях превращения метаболитов.

К концу ферментации в среде аккумулировались метаболиты со спектроскопическими характеристиками 3,4-диэтоксибензальдегида (m/z (%) 137(100), 138(63), 194(39) (M+), 81(18), 109(17), 3,4-диэтоксибензойной кислоты (m/z (%) 154(100), 137(139), 210(33) (M+), 97(13), 51(11) и этилового эфира 3,4-диэтоксибензойной кислоты m/z (%) 137(100), 154(57), 238(49) (IVT), 109(23), 79(21), 182(19). Данные соединения идентифицированы с помощью библиотеки NIST 98 Mass Spectral Library with Windows Search Program (Version 1.7) For Use with Microsoft® Windows™ Users' Guide. Они обнаруживались в инкубационной среде вплоть до полного исчезновения дротаверина и не выявлялись в контрольных экспериментах.

Ранее в составе метаболитов бактериальной трансформации папаверина, близкого по химической структуре к дротаверину, были также обнаружены ароматические кислоты, в частности производные фенилуксусной кислоты [8]. При этом отсутствовали сведения, подтверждающие факт раскрытия изохинолинового цикла папаверина.

Пример 2. Использование иммобилизованных клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608

Иммобилизацию предварительно выращенных в присутствии изохинолина клеток Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 осуществляли по ранее разработанному способу [9]. В качестве носителя бактериальных клеток использовали материал природного происхождения - адсорбент на основе древесных пород (1-3 мм) из отходов деревообрабатывающего производства. Носитель отмывали горячей водой, гидрофобизовали с помощью олифы на основе льняного масла (Московский лакокрасочный завод "Оливеста", Россия) в массовом соотношении к носителю 1:0,2 и стерилизовали автоклавированием дробно по 15 мин в течение 3 сут при 105°C. Иммобилизацию отмытых клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносили 50 мл клеточной суспензии (OD600 1,0) в буферном растворе и 2 г гидрофобизованного носителя. Смесь непрерывно перемешивали на орбитальной качалке Certomat IS ("Sartorius", Германия) (130 об/мин) в течение 5 сут при комнатной температуре. Процесс адсорбции родококков контролировали нефелометрически (при D600) с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 ("Perkin-Elmer", США). Неадсорбированные клетки дважды отмывали фосфатным буфером (pH 6,9). Количество иммобилизованных на носителе клеток составляло 22,5±1,8 мг сухих кл./г носителя. Хранение полученных препаратов иммобилизованных клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 осуществляли при +5°C.

Периодическое культивирование свободных и иммобилизованных клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с объемом среды RS 100 мл, содержащей 0,02% дротаверина гидрохлорида, при постоянном перемешивании (160 об/мин) и 25°C. Во избежание фотодеградации и фотоинициированного окисления дротаверина содержимое колб защищали от действия света с помощью светонепроницаемого материала.

Анализ продуктов биодеградации проводили как в Примере 1.

Применение иммобилизованных клеток штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 сокращало продолжительность процесса в 1,5 раза по сравнению с таковой при использовании свободных клеток. Известно, что прикрепленные микроорганизмы более устойчивы к действию токсикантов, размножаются быстрее, чем во взвешенном состоянии, характеризуются повышенной метаболической активностью [10].

Данные, приведенные на фиг.1, демонстрируют значительную убыль дротаверина в течение 15 сут эксперимента с иммобилизованными клетками родококков. С учетом адсорбционной емкости носителя она составляла около 78% от исходной концентрации дротаверина.

Пример 3. Определение дыхательной активности родококков (на примере штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608)

При осуществлении эксперимента проводилось определение дыхательной активности родококков как доказательство метаболической активности клеток используемого штамма.

Определение потребления кислорода бактериальными клетками проводили с использованием 6-канального респирометра Micro-OxymaxR ("Columbus Instruments", США) непрямого замкнутого цикла, подключенного к персональному компьютеру. Эксперименты проводили в защищенных от света флаконах MicroOxymax вместимостью 500 мл с объемом минеральной среды RS 100 мл, содержащей 0,02% дротаверина гидрохлорида, при постоянном перемешивании (400 об/мин, Т=28±2°С) с помощью магнитной мешалки RT 10 ("Power IKAMAG", Германия) в течение 72 ч. В качестве инокулята использовали предварительно выращенные в присутствии изохинолина свободные клетки Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 в концентрации 6,8×107 кл./мл. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин-1), а также количество потребляемого кислорода и выделяемого углекислого газа (мкл). Измерение клеточного дыхания проводили при 25±2°C каждые 42 мин в течение 1-3 сут. В качестве контролей использовали (1) стерильный раствор лекарственного вещества в минеральной среде RS, содержащей 0,02% дротаверина гидрохлорида; (2) среду RS с клетками родококков без дротаверина гидрохлорида.

Сравнительный анализ дыхательной активности свободных клеток родококков показал, что в присутствии глюкозы на стадии максимальной убыли дротаверина регистрируется более высокая метаболитическая активность клеток родококков по отношению к дротаверину гидрохлориду (фиг.2). Так, через 26 ч эксперимента в присутствии глюкозы клетки поглощали 2056 мкл O2, тогда как в среде без косубстрата количество потребляемого O2 составляло лишь 972 мкл (фиг.2А). Аналогичная закономерность отмечалась в экспериментах по образованию CO2 в процессе деградации дротаверина гидрохлорида. По нашим данным, несмотря на незначительное снижение скорости респирации в первые часы эксперимента, скорость потребления O2 и выделения CO2 в присутствии косубстрата была всегда выше аналогичных показателей варианта без глюкозы (фиг.2Б). Через 15 ч скорость респирации во всех вариантах стабилизировалась и оставалась постоянной до конца эксперимента. Данные, полученные в результате измерения интенсивности дыхания родококков, являются подтверждением того, что внесение в среду культивирования глюкозы в качестве дополнительного энергетического субстрата способствовало повышению функциональной активности родококков и ускорению, тем самым, процесса биодеградации дротаверина гидрохлорида.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что дротаверина гидрохлорид подвергается биоконверсии под действием штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608. Штамм обладает способностью к биодеструкции дротаверина при весьма высокой начальной концентрации 200 мг/л в течение довольно длительного периода. Важную роль в процессе разложения дротаверина играло присутствие в инкубационной среде глюкозы в качестве дополнительного источника углерода.

Как видно из фиг.3, наиболее выраженная убыль дротаверина как единственного источника углерода регистрировалась в первые 10-25 сут эксперимента при использовании свободных клеток Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608. Остаточное содержание дротаверина в инкубационной среде на 60 сут ферментации составляло около 25% (см. фиг.3, кривая 2). В контроле абиотической деструкции исходная концентрация дротаверина изменялась в пределах от 5 до 10%. В контрольном варианте опыта с инактивированными клетками родококков обнаруживалось незначительное (менее 10%) понижение исходной концентрации дротаверина, что свидетельствует о неспецифической биосорбции лекарственного вещества мертвыми клетками родококков.

Для повышения деградирующей способности исследуемых родококков были использованы прединкубация их в присутствии изохинолина - структурного аналога метаболизируемого субстрата; введение в инкубационную среду энергетических косубстратов.

Использование клеток Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608, предварительно выращенных в присутствии изохинолина, позволяло сократить продолжительность процесса разложения дротаверина гидрохлорида до 60 сут (см. фиг.3). Скорость деградации при исходной концентрации дротаверина 200 мг/л в первые 5 сут эксперимента составляла 5,0 мг/л в час. Содержание дротаверина в среде через 25 сут эксперимента снижалось на 75%.

Как видно из фиг.4, в присутствие в инкубационной среде глюкозы скорость деградации дротаверина в первые 5 сут опыта составляла 8,3 мг/л в час. Количество колониеобразующих единиц достигало максимальных (2,0×108 кл./мл) значений и практически не изменялось в течение 23 сут. Культивирование предварительно выращенных в присутствии изохинолина родококков в данных условиях позволяло сократить продолжительность процесса полной биодеструкции дротаверина до 45 сут. В присутствии других источников углерода - сахарозы, этанола или глицерина биоконверсия дротаверина была выражена значительно в меньшей степени.

Применение иммобилизованных родококков сокращало продолжительность процесса в 1,5 раза по сравнению с таковой при использовании свободных клеток. Известно, что прикрепленные микроорганизмы более устойчивы к действию токсикантов, размножаются быстрее, чем во взвешенном состоянии, характеризуются повышенной метаболической активностью [10]. Нами ранее было показано, что иммобилизованные родококки ускоряют процесс окисления н-алканов и ацетаминофена (парацетамола) [11]. Данные, приведенные выше на фиг.1, демонстрируют значительную убыль дротаверина в течение 15 сут эксперимента с иммобилизованными клетками родококков. С учетом адсорбционной емкости носителя она составляла около 78% от исходной концентрации дротаверина.

Использование свободных клеток Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608, предварительно выращенных в присутствии изохинолина, позволило сократить продолжительность процесса биодеструкции дротаверина в условиях кометаболизма до 45 сут, а иммобилизованных на твердом носителе до 30 сут. При этом биологическое превращение дротаверина гидрохлорида сопровождалось образованием устойчивых метаболитов, среди которых детектированы простые ароматические соединения - производные 3,4-дигидроксибензойной кислоты (протокатеховой кислоты). Штамм Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 имеет адекватные деструктирующие способности и, следовательно, потенциально пригоден к использованию для биодеградации дротаверина, что позволяет рассматривать этот штамм как потенциальный компонент систем очистки сточных вод. Полученные данные расширяют представление не только о каталитической активности родококков и их возможном вкладе в деконтаминацию природных экосистем от фармполлютантов, но и могут быть использованы при разработке технологии высокоэффективного удаления фармполлютантов из сточных вод. Применение устойчивых смешанных микробных культур, поиск эффективных условий аэрации, оптимального уровня кислотности среды, внесение специфических индукторов, направленный подбор наиболее эффективных и относительно дешевых косубстратов обеспечат условия, необходимые для интенсификации процесса биодеградации дротаверина и доведения его, возможно, до частичной минерализации исходного фармполлютанта.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых изображено:

На Фиг.1. Динамика биодеградации дротаверина (г/мл×10-4) с использованием иммобилизованных клеток R. rhodochrous ИЭГМ 608. 1 - контроль адсорбционной емкости носителя; 2 - иммобилизованные клетки.

На Фиг.2. Динамика респираторной активности (А - количество потребляемого кислорода (•) и выделяемого CO2 (о); Б - скорость респирации) клеток R. rhodochrous ИЭГМ 608. 1 - контроль абиотической деструкции; 2 - биотический контроль; 3 - дротаверин + клетки R. rhodochrous ИЭГМ 608; 4 - дротаверин + глюкоза + клетки R. rhodochrous ИЭГМ 608.

На Фиг.3. Динамика биодеградации дротаверина (г/мл×10-4) с использованием свободных клеток R. rhodochrous ИЭГМ 608. 1 - контроль абиотической деструкции; 2 - контроль биосорбции; 3 - количество колониеобразующих единиц (КОЕ) ×107 клеток/мл); 4 - неадаптированные клетки; 5 - адаптированные клетки.

На Фиг.4. Динамика биодеградации дротаверина (г/мл×10-4) с использованием адаптированных к изохинолину клеток R. rhodochrous ИЭГМ 608 в присутствии косубстратов. 1 - контроль абиотической деструкции; 2 - контроль биосорбции; 3 - глицерин; 4 - этанол; 5 - сахароза; 6 - глюкоза.

1. Способ биодеградации дротаверина гидрохлорида, предусматривающий взаимодействие в аэробных условиях дротаверина гидрохлорида с клетками штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 608 используют в иммобилизованном виде.

3. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что процесс ведут в культуральной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что процесс ведут в культуральной среде, содержащей глюкозу в качестве дополнительного источника углерода.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новому, высокоэффективному способу получения такролимуса (FK-506) методом микробиологического синтеза. Способ предусматривает приготовление инокулята клеток Streptomyces sp.

Плазмида для экспрессии в клетках бактерии рода escherichia неактивного предшественника мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент предшественника рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, предшественник рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, способ получения рекомбинантного мутеина [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека, рекомбинантный мутеин [c112s] легкой цепи энтерокиназы человека // 2495934
Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет способ получения рекомбинантного мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий неактивный предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой пептид, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую предшественник мутеина [C112S] легкой цепи энтерокиназы человека с неотщепляемым С-концевым гексагистидиновым кластером под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.

Плазмида для экспрессии в клетках бактерии рода escherichia предшественника рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (тап) человека (ретеплазы), бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент предшественника рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы) или [-1]метионил-фрагмент тап человека (ретеплазы), предшественник рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы), способ получения предшественника рекомбинантного фрагмента тап человека (ретеплазы) // 2495933
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения предшественника рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (ТАП) человека (ретеплазы) с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантного фрагмента тканевого активатора плазминогена (ТАП) человека (ретеплазы), включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой пептид, включающий декагистидиновый кластер и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназы, или фрагмент ДНК, кодирующий [-1]метионил-фрагмента ТАП человека (ретеплазы), под контролем промотора, функционирующего в указанной бактериальной клетке.
Проводят ферментацию питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом. Проводят ультрафильтрацию полученного фильтрата культуральной жидкости с активностью 4250±250 ИЕ/см3 через мембраны с отсечением 5 кДа.
Изобретение относится к биотехнологии, сельскому хозяйству и зоотехнии и может быть использовано для промышленного выращивания бройлеров высокопродуктивных кроссов.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму Bacillus subtilis 8A. Штамм депонирован под номером RCAM 00876 в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. В настоящем изобретении раскрывается кодон-оптимизированный ген, кодирующий главный капсидный белок L1 вируса папилломы человека, который способен, после трансдукции в клетку дрожжей, к эффективной экспрессии главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложен штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита Е (HEV) генотипа 3.
Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в растениеводстве. Штамм гриба Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 используют в качестве продуцента ингибитора возбудителя бактериального ожога плодовых культур.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу приготовления бактериального препарата ацидофильных культур, и может быть использовано при получении молочнокислых микроорганизмов при производстве биологически активной пищевой добавки для профилактики дисбактериозов, дисфункции кишечника у детей и взрослых, а также у сельскохозяйственных животных.
Изобретение относится к мелиорации почв и может быть использовано при рекультивации почв, загрязненных нефтью. Для снижения токсичности почв и затрат на мелиорацию используют 3 вида глин различного химического состава с добавлением мелассы и биопрепарата Линекс в следующих соотношениях, масс.%: глина диалбекулит - 38-40; глина ирлит 1 - 28-32; глина ирлит 7 - 16-20; меласса - 8-12; биопрепарат Линекс - 2-4.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новому, высокоэффективному способу получения такролимуса (FK-506) методом микробиологического синтеза. Способ предусматривает приготовление инокулята клеток Streptomyces sp.
Изобретение относится к синбиотическому препарату, содержащему N-ацетил-лактозамин и/или олигосахарид, включающий N-ацетил-лактозамин, и пробиотический штамм Lactobacillus sp.Олигосахарид, содержащий N-ацетил-лактозамин, представляет собой лакто-N-тетраозу или лакто-N-неотетраозу.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму Bacillus subtilis 8A. Штамм депонирован под номером RCAM 00876 в коллекции ГНУ ВНИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ.
Изобретение относится к пищевому продукту с длительным сроком хранения и к применению пробиотических спор и/или покоящихся клеток в качестве пробиотического ингредиента в указанном продукте.
Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано при приготовлении кормов для сельскохозяйственных животных. Биопрепарат содержит микробную массу штамма бактерий Bacillus cereus 1-79.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к способу очистки бактериоцинов. .

Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве пищевых и кормовых добавок для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний. Способ предусматривает смешивание отвара морских беспозвоночных и/или рыбы с измельченным до частиц крупностью 5 мм белковым продуктом животного происхождения (отходы переработки рыбы и/или морепродуктов) и/или белковым продуктом растительного происхождения (соевый жмых) в заданном соотношении с получением питательной среды. Полученную питательную среду пастеризуют при перемешивании и охлаждают. Охлажденную питательную среду с температурой около 38-40°C засевают ацидофильными кисломолочными микроорганизмами с последующим культивированием при температуре 51-52°C в течение 6-6,5 часов при перемешивании с получением добавки. Изобретение позволяет ускорить культивирование ацидофильных кисломолочных микроорганизмов. 7 пр.
Наверх