Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека


 


Владельцы патента RU 2506594:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека. В лунках микропанели сорбируют тромбин, вносят анализируемую пробу, содержащую компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА), выливают содержимое лунок, вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C3 человека и субстрат этого фермента. Расчет активности компонента C3 проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью C3 в качестве стандарта. Предложенная группа изобретений позволяет определять функциональную активность компонента C3 комплемента человека без необходимости активации всей системы комплемента и обладает хорошей воспроизводимостью результатов. 2 н.п. ф-лы. 1 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Известен способ иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропанели комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов С1, С2 и С4 (присутствующий компонент С3 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против С3 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание С3 на молекулах активатора - сорбированного иммуноглобулина. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3, конъюгированных с ферментом.

Известен также способ [2], позволяющий определять функциональную активность компонента С3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата дерината для использования в качестве активатора классического пути комплемента и заменой комплемента морской свинки гомологичным реагентом R3 - сыворотки крови человека, лишенной активности С3.

Наконец, для активации компонента С3, необходимой для связывания на микропанели с последующим определением количества связавшегося теми же приемами, в способе [3] используется альтернативная С3 конвертаза, формируемая в результате активации альтернативного пути с помощью сорбируемого на микропанели лизоцима - активатора альтернативного пути и реагента R3, как источника факторов В и D человека, необходимых для формирования С3 конвертазы альтернативного пути комплемента.

Недостатком всех этих способов является участие в процессе активации компонента С3, С3 конвертазы, формируемой из компонентов комплемента морской свинки в первом случае, либо из компонентов или факторов комплемента реагента R3, во втором и в третьем случаях, поскольку при проведении определения активности компонента С3 в сыворотках крови неизбежно создаются условия активации комплемента по классическому или альтернативному пути, что затрагивает и другие компоненты комплемента и может приводить к их неспецифической сорбции на поверхности лунок микропанели.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата тромбина для использования в качестве активатора компонента С3 без активации комплемента и без применения источников других компонентов или факторов комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата тромбина, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии этилендиаминатетраацетата натрия (ЭДТА) для блокирования всех путей активации комплемента, в ходе которой происходит активация функционально активного С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном тромбине, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека, отмывание несвязавшегося конъюгата, внесение субстрата конъюгиро-ванного фермента и проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Тем самым достигается определение функциональной активности С3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации всей системы комплемента.

Пример 1. Иммуноферментное определение функциональной активности компонента С3 комплемента человека. Растворяют препарат тромбина быка в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (эти-лендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл того же буферного раствора, содержащего ЭДТА. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый компонент С3 в том же буфере. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного компонента С3 рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рис.1 представлено определение функциональной активности компонента С3 комплемента человека методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента СЗ. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известным содержанием активного компонента С3 в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С3 с коэффициентом корреляции R=0.9998, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С3 в концентрациях от 0,6 мкг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по классическому пути. 2005. Патент РФ 2251697. Бюл. №13. 10.05.2005.

2. Козлов Л.В., Гора Н.В., Бичучер A.M. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека. Патент РФ 2417375. Бюл. №12. 27.04.2011.

3. Козлов Л.В., Гора Н.В. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по альтернативному пути активации. Патент 2380707. 27.01.2010.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека, отличающийся тем, что в лунках микропанели сорбируют тромбин, затем в лунки микропанели вносят анализируемую пробу, содержащую компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента C3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности использования однократного курса ультразвукового кавитационного орошения полости матки у женщин с хроническим эндометритом.

Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной генетики и касается рекомбинантного полипептида А2, ДНК, его колирующей, штамма продуцирующего полипептид А2 и способов использования такого рекомбинантного полипептида.

Настоящее изобретение относится к способам диагностики фиброза печени у субъекта, включающим определение уровней экспрессии плазминогена урокиназного типа, матричной металлопротеиназы 9 и β-2-микроглобулина, вычисление на их основании балльной оценки и постановку диагноза.
Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается прогноза исходов химиолучевой терапии плоскоклеточных карцином головы и шеи. Сущность способа: проводят иммуноферментное исследование уровня ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови, дополнительно определяют размер первичной опухоли согласно международной классификации TNM, степень дифференцировки опухоли, возраст больного и рассчитывают дискриминантные функции по уравнениям: Y1=-138,748+Х1*15,963+Х2*(-4,803)+Х3*0,018+Х4*2,319+Х5*1,188 Y2=-159,545+Х1*17,918+Х2*(-4,266)+Х3*0,028+Х4*2,427+Х5*1,242, где X1 - размер первичной опухоли согласно международной классификации TNM; Х2 - степень дифференцировки опухоли; Х3 - сывороточный уровень ТИМП-1, нг/мл; Х4 - возраст больного, лет; Х5 - сывороточный уровень ТИМП-2, нг/мл.

Изобретение относится к области медицине, а именно онкологии, и может быть использовано для оценки радиочувствительности рака верхних дыхательных путей. Для этого определяют частоту гемопоэтических стволовых клеток с иммунофенотипом CD34+CD45low среди лимфоцитов периферической крови на стадиях рака Т3 или Т4 до лечения и сравнивают с ее дискриминационным уровнем 6,0×10-4.

Группа изобретений относится к области аналитической химии и может быть использована для детектирования целевых компонентов в жидком образце. Картридж (100) для детектирования целевых компонентов в жидком образце содержит: камеру (SC) для образцов; по меньшей мере, два резервуара (131 и 132), заполненные магнитными частицами (MP, MP'), которые специфичны по отношению к разным целевым компонентам; по меньшей мере, две чувствительные зоны (121 и 122) для детектирования магнитных частиц и/или целевых компонентов, причем магнитные частицы (MP, MP') разных резервуаров преимущественно достигают разных чувствительных зон, мигрируя в образце, заполняющем камеру для образцов, под влиянием магнитного (В) поля активации.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено антитело, специфичное к TENB2, содержащее легкую и тяжелую цепи.

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для прогнозирования туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью у впервые выявленных больных туберкулезом легких (ТБ).

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии и нефрологии, и может быть использовано для диагностики мочекаменной болезни (уролитиаза). Сущность способа: исходную пробу мочи разделяют на два одинаковых образца, получают гистограммы распределения частиц по размерам, по которой определяют процентное содержание олигомерной формы Т&НЕ(7) белка Тамма-Хорсфалла и сравнивают гистограммы образцов.

Изобретение относится к медицине и иммунологии и представляет собой новый способ проведения диагностики, основанный на определении белковых молекул - антител - к специфичной и чувствительной комбинации опухоле-ассоциированных гликанов на фоне индивидуальных особенностей конкретного больного.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики. Предложен способ качественного и количественного анализа липидов, прочносвязанных с геномной ДНК, включающий стадии выделения из клеток геномной ДНК, связанной с липидами, детергентным способом, гидролиза ДНК гидролизующим ферментом, выделения липидов в смеси хлороформ-метанол-вода при 37˚С, выпаривания растворителя, стабилизации липидов 2,6-ди-трет-бутил-п-крезолом, смешивания липидов с TMSH, хроматографии с помощью газового хроматографа с последующей масс-спектрометрией.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. .
Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к модуляторам пути передачи сигнала HGF/c-met. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу идентификации -секретазы и ее ингибиторов, и может быть использовано в медицине при поиске активных соединений для лечения болезни Альцгеймера.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области молекулярной фармакологии. .
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа определения активации плазминогена бактериями. Способ включает внесение протамина сульфата в подготовленный супернатант, инкубацию полученной смеси, осаждение клеток центрифугированием, инкубацию супернатанта с протамин сульфатом, осаждение белка и регистрацию активации плазминогена бактериями по количеству отщепившегося аргинина, содержание которого определяют методом Сакагуши по окрашиванию проб в красный цвет. Изобретение позволяет проводить регистрацию явления активации плазминогена бактериями в условиях in vitro с помощью протамина. 4 табл., 4 пр.
Наверх