Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток



Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток
Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток

 


Владельцы патента RU 2528764:

СЕНТОКОР ОРТО БАЙОТЕК ИНК. (US)

Настоящее изобретение касается способа размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток. Описанный способ включает стадии: культивирование плюрипотентных клеток и обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B, где указанный ингибитор представляет собой 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион. Представленное изобретение позволяет получить достаточное количество клеточного материала с сохранением способности к дифференцированию для последующего использования в клинических целях. 9 з.п. ф-лы, 15 ил., 11 табл., 11 пр.

 

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу обработки плюрипотентных клеток, позволяющему эффективно размножать плюрипотентные клетки в культуре и дифференцировать их путем обработки ингибитором активности фермента GSK-3B.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета I типа и нехватка островков Лангеранса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулинопродуцирующих клеток или β-клеток, которые могли бы использоваться для трансплантации. Одним из возможных подходов является генерация функциональных β-клеток из плюрипотентных клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.

При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF-3 beta, GATA-4, Mixl1, CXCR4 и SOX-17.

Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX-1. В отсутствие PDX-1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорсального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX-1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.

Для получения достаточного количества клеточного материала для трансплантации необходим источник требуемого клеточного материала, который можно было бы эффективно размножать в культуре, а затем эффективно дифференцировать в требуемые ткани, например в функциональные β-клетки.

Известные на сегодняшний день способы культивации эмбриональных стволовых клеток человека достаточно сложны и требуют применения экзогенных факторов или культуральной среды химически определенного состава для поддержания пролиферации клеток без потери их плюрипотентности. Кроме того, дифференцирование эмбриональных стволовых клеток часто приводит к сокращению количества клеток, доступных для дальнейшего размножения в культуре.

В одном примере, в работе Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005), описывается не содержащая питающих клеток и сыворотки культуральная система, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной заменяющей сыворотку среде (SR) с добавлением различных факторов роста, способных запускать самообновление эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере, US 20050233446, описывается среда с определенным составом, которая может быть использована при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе данная среда является существенно изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. При культивировании клеток указанная среда содержит основную среду и количества bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточные для поддержания роста зародышевых стволовых клеток без их существенного дифференцирования.

В другом примере, WO 2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним из членов семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGFβ), одним из членов семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.

Известно, что ингибиторы гликогенсинтазы киназы-3 (GSK-3) стимулируют пролиферацию и размножение стволовых клеток взрослой особи. В одном примере, Tateishi et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352: 635), показано, что ингибирование GSK-3 повышает эффективность роста и выживаемость сердечных стволовых клеток человека (hCSCs), выделенных из сердца новорожденного или взрослого человека и обладающих мезенхимальными признаками.

Например, в работе Rulifson et al. (PNAS 144, 6247-6252, (2007)) утверждается, что активация каскада передачи сигнала Wnt стимулирует пролиферацию островковых β-клеток.

В другом примере, WO 2007016485, утверждается, что добавление ингибиторов GSK-3 к культуре неэмбриональных стволовых клеток, включая мультипотентные клетки-предшественники взрослых особей, приводит к поддержанию плюрипотентного фенотипа в процессе размножения и позволяет получить более четко выраженный дифференцировочный отклик.

В другом примере, US 2006030042, используется способ ингибирования GSK-3 путем добавления либо Wnt, либо низкомолекулярного ингибитора активности фермента GSK-3 для поддержания эмбриональных стволовых клеток без использования слоя питающих клеток.

В другом примере, WO 2006026473, сообщается о добавлении ингибитора GSK-3B для стабилизации плюрипотентных клеток через транскрибционную активацию c-myc и стабилизации белка c-myc.

В другом примере, WO 2006100490, сообщается об использовании культуральной среды для стволовых клеток, содержащей ингибитор GSK-3 и агонист gp130, для поддержания самовозобновляющейся популяции плюрипотентных стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые клетки мыши или человека.

В другом примере, Sato et al. (Nature Medicine (2004) 10:55-63), показано, что ингибирование GSK-3 специфическим фармакологическим препаратом может сохранять недифференцированный фенотип эмбриональных стволовых клеток и поддерживать уровень экспрессии специфичных для плюрипотентного состояния факторов транскрипции, таких как Oct-3/4, Rex-1 и Nanog.

В другом примере, Maurer et al. (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198-1208), показано, что обработанные ингибитором GSK-3 нервные стволовые клетки взрослой особи демонстрируют более высокую эффективность нейронального дифференцирования, в особенности путем стимулирования транскрипции целевых генов β-катенина и торможения апоптоза.

В другом примере, Gregory et al. (Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049:97-106), сообщается, что ингибиторы GSK-3B повышают эффективность остеогенеза in vitro.

В другом примере, Feng et al. (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324:1333-1339), показано, что гемопоэтическое дифференцирование эмбриональных стволовых клеток связано с понижением эффективности каскада Wnt/β-катенин, где Wnt представляет собой естественный ингибитор GSK3.

Поэтому сохраняется значительная потребность в разработке способов обработки плюрипотентных стволовых клеток для их размножения с последующим использованием в клинических целях и при этом с сохранением их способности к дифференцированию в панкреатические эндокринные клетки, панкреатические экспрессирующие гормоны клетки или панкреатические секретирующие гормоны клетки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток путем обработки упомянутых плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, включающий:

а. культивирование плюрипотентных клеток, и

b. обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Упомянутые плюрипотентные клетки могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки человека или могут быть экспрессирующими маркеры плюрипотентности производными от эмбриональных стволовых клеток человека клетками в соответствии со способами, раскрытыми в публикации 60/913475.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (I):

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (II):

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (III):

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 показан эффект добавления соединения JNJ 17189731 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 2 показан эффект добавления соединения JNJ 17163796 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 3 показан эффект добавления соединения JNJ 17223375 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 4 показан эффект добавления соединения JNJ 18157698 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 5 показан эффект добавления соединения JNJ 26158015 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 6 показан эффект добавления соединения JNJ 26483197 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 7 показан эффект добавления соединения JNJ 26483249 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 8 показан эффект добавления соединения JNJ 10220067 в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Sox-17, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Приведенные результаты были получены для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (белые столбики) или эмбриональных стволовых клеток человека линии H9 (черные столбики) на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).

На фиг. 9 приведены уровни экспрессии CXCR4 на поверхности клеток, определенные способами иммунофлюоресцентного окрашивания и проточной цитометрии, для клеток, обработанных указанными соединениями согласно способам, описанным в примере 8.

На фиг. 10 приведены уровни экспрессии CXCR4 (часть A), HNF-3 beta (часть B) и Sox-17 (часть C), определенные методом ПЦР в реальном времени, для клеток, обработанных указанными соединениями согласно способам, описанным в примере 8.

На фиг. 11 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии Pdx-1, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводились на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 9.

На фиг. 12 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на уровень экспрессии Pdx-1 (белые столбики) и HNF-6 (черные столбики), определенные методом ПЦР в реальном времени. Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 9.

На фиг. 13 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии инсулина, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 10.

На фиг. 14 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на уровень экспрессии Pdx-1 (белые столбики) и инсулина (черные столбики), определенные методом ПЦР в реальном времени. Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 10.

На фиг. 15 показан эффект добавления указанных соединений в различной концентрации на численность клеток, определенную по числу наблюдаемых ядер (часть A), и на уровень экспрессии инсулина, определенный по интенсивности иммунофлюоресцентной окраски (часть B). Измерения проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Клетки обрабатывали согласно способам, описанным в примере 11.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания, а не в ограничение изобретения, приведенное ниже подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

Определения

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

По потенциалу развития стволовые клетки классифицируются следующим образом: (1) тотипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным и внеэмбриональным типам клеток; (2) плюрипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным типам клеток; (3) мультипотентные, т.е. способные давать начало группе клеточных линий дифференцирования в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гематопоэтические стволовые клетки (HSC) могут давать таких потомков, как HSC (самообновление), олигопотентные предшественники, ограниченные клетками крови, и все типы клеток и клеточных элементов (таких как тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, т.е. способные давать начало более ограниченному набору клеточных линий дифференцирования, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, т.е. способные давать начало единственной клеточной линии дифференцирования (например, сперматогенные стволовые клетки).

Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования клетки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.

Используемый в настоящей заявке термин «β-клеточная линия дифференцирования» относится к клеткам, положительным по экспрессии гена транскрипционного фактора PDX-1 и как минимум одного из следующих транскрипционных факторов: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для β-клеточной линии дифференцирования, включают β-клетки.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: SOX-17, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включают клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезоэндодермы и клетки сформированной эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX-1, HNF-1 beta, PTF-1 alpha, HNF-6 и HB9. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы, включают клетки панкреатической эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 и PTF-1 alpha. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки, включают панкреатические эндокринные клетки, панкреатические экспрессирующие гормоны клетки и панкреатические секретирующие гормоны клетки, а также клетки β-клеточной линии дифференцирования.

Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, церберус, OTX2, гузекоид, C-Kit, CD99 и Mixl1.

Используемый в настоящей заявке термин «внеэмбриональная эндодерма» относится к популяции клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX-7, AFP и SPARC.

Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка мезэндодермы» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: CD48, эомезодермин (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.

Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая эндокринная клетка» или «панкреатическая экспрессирующая гормоны клетка» относится к клеткам, способным к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая секретирующая гормоны клетка» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка-предшественник клетки первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Nodal и FGF8

Используемый в настоящей заявке термин «клетка первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like или FGF4.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, заключающийся в обработке упомянутых плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предлагает способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, включающий:

c. культивирование плюрипотентных клеток, и

d. обработку плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B.

В одном из вариантов осуществления упомянутые плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбраны из группы, включающей следующие маркеры: SOX17, GATA4, Hnf-3beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Brachyury, гомеобоксный белок Mix-like, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. В рамках настоящего изобретения возможно использование клеток - производных плюрипотентных клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.

Упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от приблизительно одного до приблизительно 72 часов. В качестве альтернативы упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от приблизительно 12 до приблизительно 48 часов. В качестве альтернативы упомянутые плюрипотентные клетки могут быть обработаны ингибитором активности фермента GSK-3B в течение приблизительно 48 часов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации от приблизительно 100 нМ до приблизительно 100 мкМ. В качестве альтернативы упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ. В качестве альтернативы упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B используется в концентрации приблизительно 10 мкМ.

Соединения, пригодные для применения в способах, составляющих предмет настоящего изобретения

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (I):

,

где:

R1 представляет собой фенил, замещенный фенил, где заместители для фенила выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена, нитро, трифторметила и нитрила; или пиримидинила;

R2 представляет собой фенил, замещенный фенил, где заместители для фенила выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена, нитро, трифторметила и нитрила; или пиримидинила, который необязательно несет в качестве заместителя C1-4алкил, и по меньшей мере один из заместителей R1 и R2 представляет собой пиримидинил;

R3 представляет собой водород, 2-(триметилсилил)этоксиметил, C1-5алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, арил-C1-5алкилоксикарбонил, арил-C1-5алкил, замещенный арил-C1-5алкил, где упомянутые один или несколько заместителей для арильного фрагмента каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: C1-5алкил, C1-5алкокси, галоген, амино, C1-5алкиламино и ди-C1-5алкиламино, фталимидо-C1-5алкил, амино-C1-5алкил, диаминоC1-5алкил, сукцинимидо-C1-5алкил, C1-5алкилкарбонил, арилкарбонил, C1-5алкилкарбонил-C1-5алкил и арилоксикарбонил-C1-5алкил;

R4 представляет собой фрагмент -(A)-(CH2)q-X;

A представляет собой винилен, этинилен или ;

R5 выбран из следующей группы заместителей: водорода, C1-5алкила, фенила и фенил-C1-5алкила;

q равен 0-9;

X выбран из следующей группы заместителей: водорода, гидрокси, винила, замещенного винила, где один или несколько заместителей для винильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фтора, брома, хлора и йода, этинила, замещенного этинила, где заместители для этинильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фтора, брома, хлора и йода, C1-5алкила, замещенного C1-5алкила, где упомянутые один или несколько заместителей для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкокси, тригалоалкила, фталимидо и амино, C3-7циклоалкила, C1-5алкокси, замещенного C1-5алкокси, где заместители для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: фталимидо и амино, фталимидоокси, фенокси, замещенный фенокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, фенила, замещенного фенила, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, арил-C1-5алкила, замещенного арил-C1-5алкила, где упомянутые один или несколько заместителей для арильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, арилокси-C1-5алкиламино, C1-5алкиламино, ди-C1-5алкиламино, нитрила, оксима, бензилоксиимино, C1-5алкилоксиимино, фталимидо, сукцинимидо, C1-5алкилкарбонилокси, фенилкарбонилокси, замещенного фенилкарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, фенил-C1-5алкилкарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, галогена и C1-5алкокси, аминокарбонилокси, C1-5алкиламинокарбонилокси, ди-C1-5алкиламинокарбонилокси, C1-5алкоксикарбонилокси, замещенного C1-5алкоксикарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: метила, этила, изопропила и гексила, феноксикарбонилокси, замещенного феноксикарбонилокси, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: C1-5алкила, C1-5алкокси и галогена, C1-5алкилтио, замещенного C1-5алкилтио, где заместители для алкильной группы выбраны из следующей группы заместителей: гидрокси и фталимидо, C1-5алкилсульфонила, фенилсульфонила, замещенного фенилсульфонила, где упомянутые один или несколько заместителей для фенильной группы выбраны из следующей группы заместителей: брома, фтора, хлора, C1-5алкокси и трифторметила; с тем условием, что если A представляет собой , q равен 0, и X представляет собой H, то R3 не может представлять собой 2-(триметилсилил)этоксиметил; а также их фармацевтически приемлемые соли.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R1 представляет собой замещенный фенил и R2 представляет собой пиримидин-3-ил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R1 представляет собой 4-фторфенил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R3 представляет собой водород, арил-C1-5алкил или замещенный арил-C1-5алкил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где R3 представляет собой водород или фенил-C1-5алкил.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где A представляет собой этинилен и q равен 0-5.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где X представляет собой сукцинимидо, гидрокси, метил, фенил, C1-5алкилсульфонил, C3-6циклоалкил, C1-5алкилкарбонилокси, C1-5алкокси, фенилкарбонилокси, C1-5алкиламино, ди-C1-5алкиламино или нитрил.

Соединения формулы (I) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 6214830, полностью включенном в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Соединение Название
1 5(4)-(4-фторфенил)-4(5)-(4-пиридил)имидазол,
2 4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
3 5-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-4-(4-пиридил)имидазол,
4 4-(4-фторфенил)-2-йод-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
5 4-(4-фторфенил)-2-(4-гидроксибутин-1-ил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
6 4-(4-фторфенил)-5-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
7 5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
8 5-(4-фторфенил)-2-йод-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
9 5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-2-(триметилсилил)этинил-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]имидазол,
10 2-(2-хлорвинил)-5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)имидазол,
11 5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-имидазол-2-карбоксальдегид,
12 2-[2,2-дибромэтилен-1-ил]-5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-имидазол-2-карбоксальдегид,
13 5(4)-(4-фторфенил)-2-(3-гидрокси-3-фенилпропин-1-ил)-4(5)-(4-пиридил)имидазол,
14 5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-1-[2-(триметилсилил)этоксиметил]-2-оксиминоимидазол,
15 5-(4-фторфенил)-4-(4-пиридил)-2-имидазола оксим,
16 2-(5-хлорпентин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
17 4-(4-фторфенил)-2-(4-N-фенилкарбамоилоксибутин-1-ил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол,
18 2-(4-хлорбутин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол и
19 2-(4-диметиламинобутин-1-ил)-4-(4-фторфенил)-1-(3-фенилпропил)-5-(4-пиридил)имидазол.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (I), где упомянутое соединение представляет собой соединение 5 формулы:

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (II):

,

где:

R выбран из следующей группы заместителей: Ra, -C1-8алкил-Ra, -C2-8алкенил-Ra, -C2-8алкинил-Ra и циано;

Ra выбран из следующей группы заместителей: циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила;

R1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкил-R5, -C2-8алкенил-R5, -C2-8алкинил-R5, -C(O)-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-арил-R8, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -C(O)-NH(C1-8алкил-R9), -C(O)-NH(арил-R8), -C(O)-N(C1-8алкил-R9)2, -SO2-(C1-8)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6, -арил-R6 и -гетероарил-R6; где гетероциклил и гетероарил присоединены к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероциклильного или гетероарильного фрагмента;

R5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C1-8)алкила, -O-(C1-8)алкил-OH, -O-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-NH2, -O-(C1-8)алкил-NH(C1-8алкил), -O-(C1-8)алкил-N(C1-8алкил)2, -O-(C1-8)алкил-S-(C1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-SO2-(C1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-SO2-NH2, -O-(C1-8)алкил-SO2-NH(C1-8алкил), -O-(C1-8)алкил-SO2-N(C1-8алкил)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-8)алкил, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1-8алкил), -O-C(O)-N(C1-8алкил)2, -O-(C1-8)алкил-C(O)H, -O-(C1-8)алкил-C(O)-(C1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-CO2H, -O-(C1-8)алкил-C(O)-O-(C1-8)алкил, -O-(C1-8)алкил-C(O)-NH2, -O-(C1-8)алкил-C(O)-NH(C1-8алкил), -O-(C1-8)алкил-C(O)-N(C1-8алкил)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкил, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил), -C(O)-N(C1-8алкил)2, -SH, -S-(C1-8)алкил, -S-(C1-8)алкил-S-(C1-8)алкил, -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил, -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил-OH, -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил-NH2, -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил-NH(C1-8алкил), -S-(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкил-N(C1-8алкил)2, -S-(C1-8)алкил-NH(C1-8алкил), -SO2-(C1-8)алкил, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8алкил), -SO2-N(C1-8алкил)2, -N-R7, циано, (гало)1-3, гидрокси, нитро, оксо, -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6, -арил-R6 и -гетероарил-R6;

R6 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкила, -C2-8алкенила, -C2-8алкинила, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкила, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкила, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкила), -C(O)-N(C1-8)алкил)2, -SO2-(C1-8)алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8алкила), -SO2-N(C1-8алкил)2, -(C1-8)алкил-N-R7, -(C1-8)алкил-(гало)1-3, -(C1-8)алкил-OH, -арил-R8, -(C1-8)алкил-арил-R8 и -(C1-8)алкил-гетероарил-R8; с тем условием, что когда заместитель R6 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R6 может также быть выбран из следующей группы заместителей: -C1-8алкокси, -(C1-8)алкокси-(гало)1-3, -SH, -S-(C1-8)алкила, -N-R7, циано, гало, гидрокси, нитро, оксо и -гетероарил-R8;

R7 представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкила, -C2-8алкенила, -C2-8алкинила, -(C1-8)алкил-OH, -(C1-8)алкил-O-(C1-8)алкила, -(C1-8)алкил-NH2, -(C1-8)алкил-NH(C1-8алкил), -(C1-8)алкил-N(C1-8алкил)2, -(C1-8)алкил-S-(C1-8)алкила, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкила, -C(O)-O-(C1-8)алкила, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил), -C(O)-N(C1-8алкил)2, -SO2-(C1-8)алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8алкил), -SO2-N(C1-8алкил)2, -C(N)-NH2, -циклоалкил-R8, -(C1-8)алкил-гетероциклил-R8, -арил-R8, -(C1-8)алкил-арил-R8 и -(C1-8)алкил-гетероарил-R8;

R8 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкила, -(C1-8)алкил-(гало)1-3 и -(C1-8)алкил-OH; с тем условием, что когда заместитель R8 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R8 может также быть выбран из следующей группы заместителей: -C1-8алкокси, -NH2, -NH(C1-8алкил), -N(C1-8алкил)2, циано, гало, -(C1-8)алкокси-(гало)1-3, гидрокси и нитро;

R9 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкокси, -NH2, -NH(C1-8алкил), -N(C1-8алкил)2, циано, (гало)1-3, гидрокси и нитро;

R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкил-R5, -C2-8алкенил-R5, -C2-8алкинил-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил-R9), -C(O)-N(C1-8алкил-R9)2, -C(O)-NH(арил-R8), -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-8)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -циклоалкил-R6, -арил-R6 и -(C1-8)алкил-N-R7; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-8алкокси-R5, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R6 и -гетероарил-R6;

R3 представляет собой от 1 до 3 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкил-R10, -C2-8алкенил-R10, -C2-8алкинил-R10, -C1-8алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил-R9), -C(O)-N(C1-8алкил-R9)2, -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-8)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R8, -гетероциклил-R8, -арил-R8 и -гетероарил-R8;

R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-8алкил-R10, -C2-8алкенил-R10, -C2-8алкинил-R10, -C1-8алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-8алкил-R9), -C(O)-N(C1-8алкил-R9)2, -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-8)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -SH, -S-(C1-8)алкил-R10, -SO2-(C1-8)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-8алкил-R9), -SO2-N(C1-8алкил-R9)2, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R8, -гетероциклил-R8, -арил-R8 и -гетероарил-R8;

R10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -NH2, -NH(C1-8алкил), -N(C1-8алкил)2, циано, (гало)1-3, гидрокси, нитро и оксо; и

Y и Z каждый независимо выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); а также их фармацевтически приемлемые соли.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R выбран из следующей группы заместителей: Ra, -C1-4алкил-Ra, -C2-4алкенил-Ra, -C2-4алкинил-Ra и циано.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где Ra выбран из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила и гетероарила.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Ra выбран из следующей группы заместителей: дигидропиранила, фенила, нафтила, тиенила, пирролила, имидазолила, пиразолила, пиридинила, азаиндолила, индазолила, бензофурила, бензотиенила, дибензофурила и дибензотиенила.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5, -C2-4алкенил-R5, -C2-4алкинил-R5, -C(O)-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-арил-R8, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -C(O)-NH(C1-4алкил-R9), -C(O)-NH(арил-R8), -C(O)-N(C1-4алкил-R9)2, -SO2-(C1-4)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6, -арил-R6 и -гетероарил-R6; где гетероциклил и гетероарил присоединены к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероциклильного или гетероарильного фрагмента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5, -арил-R6 и -гетероарил-R6; где гетероарил присоединен к атому азота в первом положении азаиндольного ядра через кольцевой атом углерода гетероарильного фрагмента.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R1 выбран из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5 и -нафтил-R6.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C1-4)алкила, -O-(C1-4)алкил-OH, -O-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкила, -O-(C1-4)алкил-NH2, -O-(C1-4)алкил-NH(C1-4алкил), -O-(C1-4)алкил-N(C1-4алкил)2, -O-(C1-4)алкил-S-(C1-4)алкил, -O-(C1-4)алкил-SO2-(C1-4)алкил, -O-(C1-4)алкил-SO2-NH2, -O-(C1-4)алкил-SO2-NH(C1-4алкил), -O-(C1-4)алкил-SO2-N(C1-4алкил)2, -O-C(O)H, -O-C(O)-(C1-4)алкила, -O-C(O)-NH2, -O-C(O)-NH(C1-4алкил), -O-C(O)-N(C1-4алкил)2, -O-(C1-4)алкил-C(O)H, -O-(C1-4)алкил-C(O)-(C1-4)алкил, -O-(C1-4)алкил-CO2H, -O-(C1-4)алкил-C(O)-O-(C1-4)алкил, -O-(C1-4)алкил-C(O)-NH2, -O-(C1-4)алкил-C(O)-NH(C1-4алкил), -O-(C1-4)алкил-C(O)-N(C1-4алкил)2, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкила, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкила, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил), -C(O)-N(C1-4алкил)2, -SH, -S-(C1-4)алкила, -S-(C1-4)алкил-S-(C1-4)алкил, -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкила, -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкил-OH, -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкил-NH2, -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкил-NH(C1-4алкил), -S-(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкил-N(C1-4алкил)2, -S-(C1-4)алкил-NH(C1-4алкил), -SO2-(C1-4)алкил, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4алкил), -SO2-N(C1-4алкил)2, -N-R7, циано, (гало)1-3, гидрокси, нитро, оксо, -циклоалкил-R6, -гетероциклил-R6, -арил-R6 и -гетероарил-R6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C1-4)алкила, -N-R7, гидрокси и -гетероарил-R6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R5 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -O-(C1-4)алкила, -N-R7, гидрокси, -имидазолил-R6, -триазолил-R6 и -тетразолил-R6.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R6 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -C2-4алкенила, -C2-4алкинила, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкила, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкила, -C(O)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил), -C(O)-N(C1-4)алкил)2, -SO2-(C1-4)алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4алкил), -SO2-N(C1-4алкил)2, -(C1-4)алкил-N-R7, -(C1-4)алкил-(гало)1-3, -(C1-4)алкил-OH, -арил-R8, -(C1-4)алкил-арил-R8 и -(C1-4)алкил-гетероарил-R8; с тем условием, что когда заместитель R6 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R6 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-4алкокси, -(C1-4)алкокси-(гало)1-3, -SH, -S-(C1-4)алкила, -N-R7, циано, гало, гидрокси, нитро, оксо и -гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R6 представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R7 представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -C2-4алкенила, -C2-4алкинила, -(C1-4)алкил-OH, -(C1-4)алкил-O-(C1-4)алкила, -(C1-4)алкил-NH2, -(C1-4)алкил-NH(C1-4алкил), -(C1-4)алкил-N(C1-4алкил)2, -(C1-4)алкил-S-(C1-4)алкила, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкила, -C(O)-O-(C1-4)алкила, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил), -C(O)-N(C1-4алкил)2, -SO2-(C1-4)алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4алкил), -SO2-N(C1-4алкил)2, -C(N)-NH2, -циклоалкил-R8, -(C1-4)алкил-гетероциклил-R8, -арил-R8, -(C1-4)алкил-арил-R8 и -(C1-4)алкил-гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R7 представляет собой 2 заместителя, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкила, -C(O)-O-(C1-4)алкила, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4алкил) и -SO2-N(C1-4алкил)2.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R8 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода или атому азота и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкила, -(C1-4)алкил-(гало)1-3 и -(C1-4)алкил-OH; с тем условием, что когда заместитель R8 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R8 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-4алкокси, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, гало, -(C1-4)алкокси-(гало)1-3, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R8 представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R9 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкокси, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, (гало)1-3, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R9 представляет собой водород.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5, -C2-4алкенил-R5, -C2-4алкинил-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил-R9), -C(O)-N(C1-4алкил-R9)2, -C(O)-NH(арил-R8), -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-4)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -циклоалкил-R6, -арил-R6 и -(C1-4)алкил-N-R7; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-4алкокси-R5, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R6 и -гетероарил-R6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5, -C2-4алкенил-R5, -C2-4алкинил-R5, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R9, -циклоалкил-R6, -арил-R6 и -(C1-4)алкил-N-R7; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому азота, не происходит образования четвертичной соли; и с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -C1-4алкокси-R5, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, оксо, -гетероциклил-R6 и -гетероарил-R6.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R2 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода или атому азота и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R5 и -арил-R6; с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому азота, не происходит образования четвертичной соли; и с тем условием, что когда заместитель R2 присоединен к атому углерода, упомянутый заместитель R2 может также выбираться из следующей группы заместителей: -N-R7, галогена, гидрокси и -гетероарил-R6.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R3 представляет собой от 1 до 3 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4алкенил-R10, -C2-4алкинил-R10, -C1-4алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил-R9), -C(O)-N(C1-4алкил-R9)2, -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -SO2-(C1-8)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -N-R7, -(C1-4)алкил-N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R8, -гетероциклил-R8, -арил-R8 и -гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R3 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4алкенил-R10, -C2-4алкинил-R10, -C1-4алкокси-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, галогена, гидрокси и нитро.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R3 представляет собой один заместитель, присоединенный к атому углерода и выбранный из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, галогена и гидрокси.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4алкенил-R10, -C2-4алкинил-R10, -C1-4алкокси-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-NH2, -C(O)-NH(C1-4алкил-R9), -C(O)-N(C1-4алкил-R9)2, -C(O)-циклоалкил-R8, -C(O)-гетероциклил-R8, -C(O)-арил-R8, -C(O)-гетероарил-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(O)-O-(C1-4)алкил-R9, -C(O)-O-арил-R8, -SH, -S-(C1-4)алкил-R10, -SO2-(C1-4)алкил-R9, -SO2-арил-R8, -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-4алкил-R9), -SO2-N(C1-4алкил-R9)2, -N-R7, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкил-R8, -гетероциклил-R8, -арил-R8 и -гетероарил-R8.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -C1-4алкил-R10, -C2-4алкенил-R10, -C2-4алкинил-R10, -C1-4алкокси-R10, -C(O)H, -CO2H, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, галогена, гидрокси, нитро, -циклоалкила, -гетероциклила, -арила и -гетероарила.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, C1-4алкил-R10, C1-4алкокси-R10, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, галогена и гидрокси.

В одном из вариантов осуществлении настоящего изобретения R4 представляет собой от 1 до 4 заместителей, присоединенных к атому углерода и независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, C1-4алкил-R10, C1-4алкокси-R10, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, хлора, фтора и гидрокси.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где R10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода, -NH2, -NH(C1-4алкил), -N(C1-4алкил)2, циано, (гало)1-3, гидрокси, нитро и оксо.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода и (гало)1-3.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R10 представляет собой от 1 до 2 заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: водорода и (фтор)3.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают соединения формулы (II), где Y и Z каждый независимо выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O, S, (H,OH) и (H,H).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Y и Z каждый независимо выбран из группы O и (H,H); с тем условием, что один из Y и Z представляет собой атом O, а второй выбран из группы O и (H,H).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения Y и Z представляют собой атомы O.

Соединения формулы (II) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 7125878, полное раскрытие которого включено в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (II), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Соединение Название
1 3-(2-хлорфенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
2 3-(2-хлорфенил)-4-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
3 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-нафталенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
4 3-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-нафталенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
5 3-(5-хлорбензо[b]тиен-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
6 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1H-индазол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион,
7 3-(1-этил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
8 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-метоксифенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
9 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(3-метоксифенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
10 3-(2-хлор-4-фторфенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
11 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-[2-(трифторметил)фенил]-1H-пиррол-2,5-дион,
12 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-пиридинил)-1H-пиррол-2,5-дион,
13 3-[3-хлор-5-(трифторметил)-2-пиридинил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
14 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-тиенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
15 3-(2,5-дихлор-3-тиенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
16 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пиразол-3-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
17 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1H-имидазол-2-ил)-1H-пиррол-2,5-дион,
18 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-имидазол-4-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
19 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-имидазол-4-ил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
20 3-[1-[3-(диметиламино)пропил]-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(2-нафталенил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
21 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(2-нафталенил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
22 3-[(E)-2-(4-фторфенил)этенил]-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
23 3-(3,4-дигидро-2H-пиран-6-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
24 4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-[3,3'-би-1H-пиррол]-2,5-дион,
25 3-(2-бензофуранил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
26 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-метил-1H-пиразол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион,
27 2,5-дигидро-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-карбонитрил,
28 3-дибензо[b,d]тиен-4-ил-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
29 3-(4-дибензофуранил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
30 3-(2-гидроксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
31 3-(3,4-диметоксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
32 3-(3,4-дигидроксифенил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
33 3-(2-метоксифенил)-4-[1-(2-нафталенил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
34 [3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-ил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]-карбаминовой кислоты 2-метилпропиловый эфир,
35 3-[1-(3-аминопропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(2-метоксифенил)-1H-пиррол-2,5-дион,
36 N-[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-ил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]ацетамид,
37 N-[3-[3-[2,5-дигидро-4-(2-метоксифенил)-2,5-диоксо-1H-пиррол-3-ил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил]пропил]сульфамид,
38 3-(2-метоксифенил)-4-[1-[3-(1H-тетразол-1-ил)пропил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
39 3-(2-метоксифенил)-4-[1-[3-(2H-тетразол-2-ил)пропил]-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
40 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-пиразин-2-ил-пиррол-2,5-дион,
41 3-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
42 4-{3-[4-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил}бутиронитрил,
43 4-{3-[4-(1-метил-1H-пиразол-3-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]пирроло[2,3-b]пиридин-1-ил}бутиронитрил и
44 3-(2,4-диметоксипиримидин-5-ил)-4-(1-фенэтил-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил)пиррол-2,5-дион.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (II), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутый ингибитор активности фермента GSK-3B представляет собой соединение формулы (III):

,

где

фрагменты A и E каждый независимо выбран из фрагмента CH и атома азота; где выбран из следующей группы: 1H-индола, 1H-пирроло[2,3-b]пиридина, 1H-пиразоло[3,4-b]пиридина и 1H-индазола;

Z представляет собой атом O; в качестве альтернативы Z представляет собой два атома водорода, где каждый атом водорода присоединен через одинарную связь;

R4 и R5 каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C2-8алкенила и C2-8алкинила, необязательно несущие в качестве заместителей оксогруппы;

R2 выбран из следующей группы заместителей: -C1-8алкил-, -C2-8алкенил-, -C2-8алкинил-, -O-(C1-8)алкил-O-, -O-(C2-8)алкенил-O-, -O-(C2-8)алкинил-O-, -C(O)-(C1-8)алкил-C(O)- (где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп представляет собой линейную углеводородную цепь, необязательно несущую от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, -C(O)O-(C1-8)алкила, -C1-8алкил-C(O)O-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкил), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C1-8)алкила и оксо; и где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп необязательно несет от одного до двух заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила, гетероарила, гетероциклил-(C1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила, гетероарил-(C1-8)алкила, спироциклоалкила и спирогетероциклила (где любой из вышеупомянутых циклоалкильного, гетероциклильного, арильного и гетероарильного заместителей необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где любой из вышеупомянутых гетероциклильных заместителей необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)), циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила (где циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы), -(O-(CH2)1-6)0-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)0-5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR6-C(O)-, -C(O)-NR6-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- и -SO2- (где R6, R7 и R8 независимо выбираются из следующей группы заместителей: водорода, C1-8алкила, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), гидрокси-(C1-8)алкила, гетероциклил-(C1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила и гетероарил-(C1-8)алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)); с тем условием, что если в качестве A и E выбраны фрагменты CH, то заместитель R2 выбран из следующей группы заместителей: -C2-8алкинил-, -O-(C1-8)алкил-O-, -O-(C2-8)алкенил-O-, -O-(C2-8)алкинил-O-, -C(O)-(C1-8)алкил-C(O)- (где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп предсталяет собой линейную углеводородную цепь, необязательно несущую от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, -C(O)O-(C1-8)алкила, -C1-8алкил-C(O)O-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C1-8)алкила и оксо; и где любая из вышеупомянутых алкильной, алкенильной и алкинильной мостиковых групп необязательно несет от одного до двух заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: гетероциклила, арила, гетероарила, гетероциклил-(C1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила, гетероарил-(C1-8)алкила, спироциклоалкила и спирогетероциклила (где любой из вышеупомянутых циклоалкильного, гетероциклильного, арильного и гетероарильного заместителей необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где любой из вышеупомянутых гетероциклильных заместителей необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)), циклоалкил (где циклоалкил необязательно несет от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила), -(O-(CH2)1-6)1-5-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-O-, -(O-(CH2)1-6)1-5-NR6-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-NR6-, -(O-(CH2)1-6)0-5-S-, -O-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-O-, -O-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR9-C(O)-, -C(O)-NR9-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)0-6-C(O)-(CH2)1-6-C(O)-(CH2)0-6-NR7-, -NR6-C(O)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-O-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S- и -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-NR7- (где R6, R7 и R8 каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: водорода, C1-8алкила, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), гидрокси-(C1-8)алкила, гетероциклил-(C1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила и гетероарил-(C1-8)алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно дополнительно несет в качестве заместителей оксогруппы); и где R9 выбран из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), гидрокси-(C1-8)алкила, гетероциклил-(C1-8)алкила, арил-(C1-8)алкила и гетероарил-(C1-8)алкила (где вышеупомянутые гетероциклильные, арильные и гетероарильные заместители необязательно несут от одного до четырех заместителей, независимо выбранных из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, C1-8алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: C1-4алкила, амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила; и где гетероциклил необязательно несет в качестве заместителей оксогруппы)); и,

R1 и R3 каждый независимо выбран из следующей группы заместителей: водорода, C1-8алкила, C2-8алкенила, C2-8алкинила (где алкил, алкенил и алкинил необязательно несут заместитель, выбранный из следующей группы заместителей: C1-8алкокси, алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкила (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), (гало)1-3, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси, гидрокси-(C1-8)алкила и оксо), C1-8алкокси, C1-8алкоксикарбонила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, C1-8алкилтио, арила, гетероарила (где арил и гетероарил необязательно несут заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: C1-8алкила, C1-8алкокси, алкокси-(C1-8)алкила, карбоксила, карбоксил-(C1-8)алкила, амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), амино-(C1-8)алкил (где аминогруппа несет заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), галогена, (гало)1-3(C1-8)алкила, (гало)1-3(C1-8)алкокси, гидрокси и гидрокси-(C1-8)алкила), амино (несущая заместитель, независимо выбранный из следующей группы заместителей: водорода и C1-4алкила), циано, галогена, гидрокси и нитро; а также их фармацевтически приемлемые соли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение формулы (III) представляет собой соединение, выбираемое из следующей группы соединений:

,

где все остальные химические переменные выбраны в соответствии с вышеприведенным описанием; а также их фармацевтически приемлемые соли.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соединение формулы (III) представляет собой соединение, выбранное из следующей группы соединений:

,

где все остальные химические переменные выбраны в соответствии с вышеприведенным описанием; а также их фармацевтически приемлемые соли.

Соединения формулы (III) раскрыты в выданном авторам настоящего изобретения патенте США за номером 6828327, полностью включенном в настоящую заявку путем ссылки.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (III), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Соединение Название
1 6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5H-дипиридо[2,3-k:3',2'-q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]триоксадиазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
2 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-декагидро-9,4:24,29-диметено-1H-дипиридо[2,3-n:3',2'-t]пирроло[3,4-q][1,4,7,10,13,22]тетраоксадиазациклотетракозан-1,3(2H)-дион,
3 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-додекагидро-9,4:27,32-диметено-1H-дипиридо[2,3-q:3',2'-w]пирроло[3,4-t][1,4,7,10,13,16,25]пентаоксадиазацикло-гептакозан-1,3(2H)-дион,
4 6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5H-дибензо[h,n]пирроло[3,4-k][1,4,7,16]диоксадиазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
5 6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]триоксадиазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
6 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23-декагидро-9,4:24,29-диметено-1H-дибензо[n,t]пирроло[3,4-q][1,4,7,10,13,22]тетраоксадиазациклотетракозан-1,3(2H)-дион,
7 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-додекагидро-9,4:27,32-диметено-1H-дибензо[q,w]пирроло[3,4-t][1,4,7,10,13,16,25]пентаоксадиазацикло-гептакозан-1,3(2H)-дион,
8 12-гидро-6H,19H-5,22:13,18:7,11-триметенопиридо[2,3-j]пирроло[3,4-m][1,9]бензодиазациклогептадецин-19,21(20H)-дион,
9 12-гидро-6H,19H-5,22:13,18-диметено-7,11-нитрилопиридо[2,3-j]пирроло[3,4-m][1,9]бензодиазациклогептадецин-19,21(20H)-дион,
10 6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5H-пиридо[2,3-k]пирроло[3,4-n][4,7,1,10]бензодиоксадиазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
11 6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5H-пиридо[2,3-n]пирроло[3,4-q][4,7,10,1,13]бензотриоксадиазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
12 11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
13 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-метил-23H-5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
14 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(1-метилэтил)-23H-5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
15 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-8,11,14-триметил-6H,23H-5,26:17,22-диметенодибензо[n,t]пирроло[3,4-q][1,4,7,10,13]пентаазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
16 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-метил-23H-5,26-метено-17,22-нитрило-5H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
17 11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26-метено-17,22-нитрило-5H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
18 11-этил-6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5H,9H-дипиридо[2,3-k:3',2'-q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
19 6,7,9,10,12,13,15,16-октагидро-23H-5,26:17,22-диметено-5H-дипиридо[2,3-k:3',2'-q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатиадиазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
20 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-(6H,23H-5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3-n:3',2'-t]пирроло[3,4-q][1,7,13]триазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
21 11-этил-7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-декагидро-6H,23H-5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3-n:3',2'-t]пирроло[3,4-q][1,7,13]триазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
22 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-22H-5,25:16,21-диметено-5H-дипиридо[2,3-m:3',2'-s]пирроло[3,4-p][1,6,12]триазациклоэйкозан-22,24(23H)-дион,
23 10-этил-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-22H-5,25:16,21-диметено-5H-дипиридо[2,3-m:3',2'-s]пирроло[3,4-p][1,6,12]триазациклоэйкозан-22,24(23H)-дион,
24 7,8,9,15,16,17,18-гептагидро-6H,25H-5,28:19,24-диметено-10,14-нитрилодипиридо[2,3-b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклотрикозан-25,27(26H)-дион,
25 7,8,9,10,11,13,14,15,16-нонагидро-6H,23H-5,26:17,22-диметенодипиридо[2,3-b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклогенейкозан-12,23,25(24H)-трион,
26 7,8,9,11,12,13,14-гептагидро-6H,21H-5,24:15,20-диметенодипиридо[2,3-b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклононадецин-10,21,23(22H)-трион,
27 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15-декагидро-7,14-дигидрокси-(7R,14R)-22H-5,25:16,21-диметено-5H-дипиридо[2,3-b:3',2'-h]пирроло[3,4-e][1,10]диазациклоэйкозан-22,24(23H)-дион,
28 6,7,9,10,12,13-гексагидро-20H-5,23:14,19-диметено-5H-дипиридо[2,3-h:3',2'-n]пирроло[3,4-k][1,4,7,16]диоксадиазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
29 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(2-метоксиэтил)-23H-5,26-метено-17,22-нитрило-5H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
30 6,7,10,11,12,13,15,16-октагидро-11-(2-гидроксиэтил)-23H-5,26:17,22-диметено-5H,9H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,7,4,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион и
31 6,7,9,10,12,13,14,15,16,17-декагидро-14-метил-24H-5,27:18,23-диметено-5H-дибензо[l,r]пирроло[3,4-o][1,4,7,11,20]диоксатриазациклодокозан-24,26(25H)-дион.

Пример варианта осуществления настоящего изобретения включает соединение формулы (III), где упомянутое соединение выбрано из следующей группы соединений:

Другие примеры вариантов осуществления настоящего изобретения включают соединение, выбранное из следующей группы соединений:

Соединение Название
1a Будет представлено позднее
2a 3-[1-[3-[(2-гидроксиэтил)метиламино]пропил]-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(3-пиридинил)-1H-индол-3-ил]-1H-пиррол-2,5-дион,
3a 3,5-дихлор-N-[3-хлор-4-[(3,4,12,12a-тетрагидро-1H-[1,4]тиазино[3,4-c][1,4]бензодиазепин-11(6H)-ил)карбонил]фенил]-бензамид,
4a 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
5a 3-(2-метоксифенил)-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
6a 6-[[2-[[4-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-метил-1H-имидазол-2-ил)-2-пиримидинил]амино]этил]амино]-3-пиридинкарбонитрил,
7a 3-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-имидазол-1-илпропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
8a 3-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-[1,2,3]триазол-1-илпропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
9a 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-3-ил]-4-(1-метил-1H-пиразол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
10a Будет представлено позднее
11a 3-[1-(3-гидрокси-3-метилбутил)-1H-индазол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
12a 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-4-(1-пиримидин-5-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
13a 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиримидин-5-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион,
14a (11Z)-8,9,10,13,14,15-гексагидро-2,6:17,21-ди(метено)пирроло[3,4-h][1,15,7]диоксазациклотрикозан-22,24(1H,23H)-дион,
15a 3-(5-хлор-1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-4-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
16a 3-(2-метоксифенил)-4-[1-(3-метоксипропил)-1H-пирроло[3,2-c]пиридин-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
17a 3-[1-(3-гидроксипропил)-1H-индазол-3-ил]-4-[1-(тетрагидропиран-4-ил)-1H-индол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
18a 2-{3-[4-(5-хлор-1-метил-1H-индол-3-ил)-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил]-индазол-1-ил}-N-(2-гидроксиэтил)-ацетамид,
19a 4-(3-хлорфенил)-6-(3-диметиламинопропил)-5,6-дигидро-4H-2,4,6-триазациклопента[c]фтор-1,3-дион,
20a 14-этил-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-диметенодибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
21a 14-бензил-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
22a 3-(1-{2-[2-(2-гидроксиэтокси)-этокси]-этил}-1H-индол-3-ил)-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
23a 6,7,8,9,10,11,12,13-октагидро-8,11-диметил-5,23:14,19-диметено-20H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10]тетраазациклооктадецин-20,22(21H)-дион,
24a 7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-декагидро-8,17-диметил-15H,26H-5,29:20,25-диметено-6H-дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19,22]диоксатетраазациклотетракозан-26,28(27H)-дион,
25a 14-(2-фурилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
26a 14-(2-тиенилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
27a 14-(1-нафтилметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
28a 14-(пиридин-4-илметил)-6,7,9,10,13,14,15,16-октагидро-12H,23H-5,26:17,22-ди(метено)дибензо[k,q]пирроло[3,4-n][1,4,7,10,19]диоксатриазациклогенейкозан-23,25(24H)-дион,
29a 3-[1-(2-{2-[2-(1,2,3,4-тетрагидронафтален-1-иламино)-этокси]-этокси}-этил)-1H-индол-3-ил]-4-{1-[2-(1,2,3,4-тетрагидронафтален-1-иламино)-этил]-1H-индол-3-ил}-пиррол-2,5-дион,
30a 3-[1-(3-диметиламинофенил)-1H-индол-3-ил]-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион,
31a 3-[5-хлор-1-(6-диметиламинопиридин-3-ил)-1H-индол-3-ил]-4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-пиррол-2,5-дион и
32a 5-(5-хлор-3-{4-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индазол-3-ил]-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-3-ил}-индол-1-ил)-никотиновой кислоты метиловый эфир.

Другие примеры вариантов осуществления настоящего изобретения включают соединение, выбранное из следующей группы соединений:

Клетки, пригодные для обработки, согласно способам, составляющим предмет настоящего изобретения

Плюрипотентные клетки, пригодные для использования в целях настоящего изобретения, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров плюрипотентности, выбранных из следующей группы: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые плюрипотентные клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки. В альтернативном варианте осуществления упомянутые плюрипотентные клетки представляют собой экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, являющиеся производными от эмбриональных стволовых клеток человека. В одном из вариантов осуществления упомянутые эмбриональные стволовые клетки представляют собой клетки человека.

Выделение, размножение и культивирование эмбриональных стволовых клеток человека

Характеристика эмбриональных стволовых клеток человека: Эмбриональные стволовые клетки человека могут экспрессировать один или несколько стадий-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также обнаруживаемые антителами маркеры, обозначаемые как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (при ее наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. Недифференцированные эмбриональные стволовые клетки человека, как правило, обладают щелочно-фосфатазной активностью, которую можно обнаружить путем фиксирования клеток 4% раствором параформальдегида с последующим проявлением с использованием красителя Vector Red в качестве субстрата, следуя рекомендациям производителя (Vector Laboratories, Бурлингем, Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые методом ОТ-ПЦР.

Другим желательным фенотипическим свойством выращенных эмбриональных стволовых клеток человека является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток человека может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для поиска клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциируемых с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии эмбриональных стволовых клеток человека могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получать клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.

Источники эмбриональных стволовых клеток человека: К типам эмбриональных стволовых клеток человека, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из формируемой после вынашивания плода ткани, в том числе из преэмбриональной ткани (например, бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Неограничивающими настоящее изобретение примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые непосредственно из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивируемых в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовятся, как описано в следующих публикациях Thomson et al. (U.S. Pat. № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека: В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эмбриональные стволовые клетки человека культивируют в культуральной системе, существенно свободной от питающих клеток, но, тем не менее, способной поддерживать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека без существенного дифференцирования. Рост эмбриональных стволовых клеток человека в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост эмбриональных стволовых клеток человека в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.

В альтернативном варианте осуществления эмбриональные стволовые клетки человека исходно культивируются на слое питающих клеток, который поддерживает эмбриональные стволовые клетки человека в различных отношениях. Затем эмбриональные стволовые клетки человека переносятся в культуральную систему, существенно свободную от питающих клеток, но тем не менее способную поддерживать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека без существенного дифференцирования.

Примеры соответствующей целям настоящего изобретения кондиционированной среды раскрыты в следующих публикациях: US 20020072117, US 6642048, WO 2005014799 и Xu et al. (Stem Cells 22:972-980, 2004).

Пример соответствующей целям настоящего изобретения среды с химически определенным составом можно найти в US 20070010011.

Соответствующая целям настоящего изобретения культуральная среда может быть приготовлена из следующих компонентов, таких как, например, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092; модифицированная по способу Дульбекко нокаут-среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018; основная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека высевают на соответствующий культуральный субстрат, предварительно обработанный перед проведением обработки в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления упомянутая предварительная обработка состоит в нанесении компонента внеклеточного матрикса, такого как, например, полученного из базальной мембраны компонента или компонента, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления упомянутый соответствующий культуральный субстрат представляет собой субстрат, обработанный препаратом MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Engelbreth-Holm-Swarm, который при комнатной температуре превращается в гель, образуя восстановленную базальную мембрану.

В качестве альтернативы в этих целях могут использоваться и другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. Последние могут включать ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.д. как по отдельности, так и в различных сочетаниях.

Эмбриональные стволовые клетки человека высевают на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.

Выделение, размножение и культивирование экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки получены из эмбриональных стволовых клеток человека способом, включающим:

а. культивирование эмбриональных стволовых клеток человека,

b. дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток сформированной эндодермы, и

c. изъятие клеток и последующее культивирование их в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки получены из эмбриональных стволовых клеток человека способом, включающим:

а. культивирование эмбриональных стволовых клеток человека, и

b. изъятие клеток и последующее культивирование их в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

Культивирование клеток в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение от приблизительно 1 до приблизительно 20 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение от приблизительно 5 до приблизительно 20 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в условиях гипоксии на культуральном субстрате, на который не нанесен слой внеклеточного матрикса, в течение приблизительно 15 дней.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода от приблизительно 1% O2 до приблизительно 20% O2. В альтернативном варианте осуществления упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода от приблизительно 2% O2 до приблизительно 10% O2. В альтернативном варианте осуществления упомянутые условия гипоксии представляют собой содержание кислорода приблизительно 3% O2.

Клетки могут быть культивированы в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку, Activin A и лиганд Wnt. В качестве альтернативы упомянутая среда может также содержать IGF-1.

Концентрация сыворотки в упомянутой культуральной среде может находиться в диапазоне от приблизительно 2% до приблизительно 5%. В альтернативном варианте осуществления концентрация сыворотки может составлять приблизительно 2%.

Activin A может использоваться в концентрации от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 мкг/мл. В альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 1 мкг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 1 пг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В другом альтернативном варианте осуществления концентрация может составлять приблизительно 100 нг/мл.

Упомянутый лиганд Wnt может выбираться из следующей группы лигандов: Wnt-1, Wnt-3a, Wnt-5a и Wnt-7a. В одном из вариантов осуществления упомянутый лиганд Wnt представляет собой Wnt-1. В альтернативном варианте осуществления упомянутый лиганд Wnt представляет собой Wnt-3a.

Упомянутый лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления упомянутый лиганд Wnt может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация лиганда Wnt составляет приблизительно 20 нг/мл.

IGF-1 может использоваться в концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В альтернативном варианте осуществления IGF-1 может использоваться в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл. В одном из вариантов осуществления концентрация IGF-1 составляет приблизительно 50 нг/мл.

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, способны к размножению при культивировании в условиях гипоксии на культуральном субстрате, который не был предварительно обработан белком или внеклеточным матриксом.

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров плюрипотентности, выбранных из следующей группы маркеров: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.

Дальнейшее дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, любым известным в данной области способом.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, фактором роста фибробластов и KAAD-циклопамином с последующим удалением содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин среды и культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример описанного способа раскрыт в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 24:1392-1401, (2006).

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбираются из группы, включающей Pdx1, HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 и PROX1. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.

Дальнейшее дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, любым известным в данной области способом.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в соответствии со способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбираются из группы, включающей NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3 и PTF-1 alpha. В одном из вариантов осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать как минимум один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Для целей настоящего изобретения пригодны клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую экспрессирующую гормоны клетку. В качестве альтернативы панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую секретирующую гормоны клетку.

В одном из аспектов настоящего изобретения упомянутая панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования, экспрессирует Pdx1 и по меньшей мере один из следующих факторов транскрипции: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4 и Pax6. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования, представляет собой β-клетку.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, может быть обнаружено путем проверки на наличие соответствующих маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Способы оценки уровней экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Например, характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких из следующих факторов: ABCG2, крипто, FoxD3, коннексин43, коннексин45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.

После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например, CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, хорошо известны специалистам в данной области, и дополнительные маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, продолжают выявляться. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатической эндодермы. К маркерам, характерным для линии панкреатической эндодермы, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1beta.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.

Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. К маркерам, характерным для линии панкреатических эндокринных клеток, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, NGN-3, NeuroD, Islet-1.

Маркеры, характерные для клеток β-клеточной линии дифференцирования, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для β-клеточной линии дифференцирования. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные β-клеточной линии дифференцирования. К специфичным характеристикам β-клеточной линии дифференцирования относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, Pdx1 (ген панкреатического и дуоденального гомеобокса-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3beta и MafA, а также иных факторов. Такие факторы транскрипции широко используются в данной области для идентификации эндокринных клеток. См., например, обзор Edlund (Nature Reviews Genetics 3:524-632 (2002)).

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В качестве альтернативы эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования.

Способы оценки уровней экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для доступных в интактных клетках маркеров - также способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Примеры антител, используемых для обнаружения определенных белковых маркеров, приведены в таблице IA. Следует отметить, что существуют или могут быть легко созданы альтернативные антитела, связывающиеся с теми же маркерами, которые распознаются перечисленными в таблице IA антителами. Такие альтернативные антитела также можно применять для анализа экспрессии маркеров в клетках, выделенных в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение далее иллюстрируют, помимо прочих, следующие примеры.

Пример 1

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

Линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 были получены из института WiCell Research Institute, Inc., (Мэдисон, Висконсин, США) и культивировались в соответствии с инструкциями, предоставленными указанным выше институтом. Коротко говоря, клетки культивировали на питающем слое из мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) в среде для эмбриональных стволовых клеток, содержащей DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) с добавлением 20% нокаут заменителя сыворотки, 100 нМ раствора заменимых аминокислот MEM, 0,5 мМ бетамеркаптоэтанола, 2мМ L-глутамина и 4 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека (bFGF) (все производства компании Invitrogen/GIBCO). Мышиные эмбриональные фибробласты, выделенные из мышиных эмбрионов E13-13,5, были приобретены в Charles River. Мышиные эмбриональные фибробласты размножали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Hyclone), 2 мМ глутамина и 100 мМ заменимых аминокислот MEM. Субконфлюэнтные культуры мышиных эмбриональных фибробластов обрабатывали 10 мкг/мл митомицина C (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 3 часов для остановки деления клеток, затем обработали трипсином и высеяли с плотностью 2×104/см2 на чашки, покрытые слоем 0,1% бычьего желатина. В качестве питающего слоя использовали мышиные эмбриональные фибробласты со второго по четвертый пассажи. Эмбриональные стволовые клетки человека, высеянные на питающий слой мышиных эмбриональных фибробластов, культивировали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2/ в инкубаторе с увлажнением для тканевых культур. При начале слияния культур (приблизительно через 5-7 дней после нанесения) эмбриональные стволовые клетки человека обработали раствором коллагеназы типа IV с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen/GIBCO) в течение 5-10 мин и затем осторожно соскоблили с поверхности при помощи 5-мл пипетки. Клетки осадили центрифугированием при 900 об/мин в течение 5 мин, осадок ресуспендировали и снова высеяли с соотношением клеток от 1:3 до 1:4 в свежую культуральную среду.

Параллельно эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, H7 и H9 также высеяли на носителе, покрытом слоем препарата MATRIGEL™ с пониженным содержанием факторов роста (BD Biosciences), в разведении 1:30 и культивировали в кондиционируемой среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Культивированные на препарате MATRIGEL™ клетки стандартно пассировали с использованием коллагеназы IV (Invitrogen/GIBCO), диспазы (BD Biosciences) или ферментативной смеси LIBERASE (Source). Некоторые культуры эмбриональных стволовых клеток человека инкубировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2).

Пример 2

Получение и культивирование экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Клетки линий H1 и H9 эмбриональных стволовых клеток человека различных пассажей (пассажи 30-54) культивировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) в течение по меньшей мере трех пассажей. Клетки культивировали в кондиционированной среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL носители в соответствии с примером 1.

Затем клетки обрабатывали средой DMEM/F12 с добавлением 0,5% FBS, 20 нг/мл WNT-3a (Кат. № 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота, США) и 100 нг/мл Activin A (R&D Systems, Миннесота, США) в течение двух дней с последующей обработкой средой DMEM/F12 с добавлением 2% FBS и 100 нг/мл Activin A (AA) в течение еще 3-4 дней. Описанный протокол привел с существенному повышению уровней экспрессии маркеров сформированной эндодермы.

Затем клетки обработали раствором TrypLEExpress (Invitrogen, Калифорния, США) в течение 5 минут. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, восстановили центрифугированием и подсчитали при помощи гемоцитометра. Выделенные клетки высеяли с плотностью 1000-10000 клеток/см2 в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) при температуре 37°C в стандартном культуральном инкубаторе. Полистирольные культуральные сосуды не имели покрытия из препарата MATRIGEL или иных белков внеклеточного матрикса. Культуральную среду меняли ежедневно. Для некоторых культур в среду также добавили 10-50 нг/мл IGF-I (инсулиновый фактор роста-I, R&D Systems, Миннесота, США) или 1X ITS (инсулин, трансферрин и селен, Invitrogen, Калифорния, США). Для некоторых культур в основную среду (DM-F12+2% FBS) также добавили 0,1 мМ меркаптоэтанола (Invitrogen, Калифорния, США) и раствор заменимых аминокислот (1X, NEAA, Invitrogen, Калифорния, США).

Через 5-15 дней культивирования на носителях образовались хорошо определенные колонии клеток, окруженные большим количеством клеток увеличенного размера, которые находились в фазе старения. При степени слияния 50-60% полученные культуры пассировали путем обработки раствором TrypLEExpress в течение 5 минут при комнатной температуре. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM-F12+2% FBS, восстановили центрифугированием, высеяли с плотностью 10000 клеток/см2 в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A+/-50 нг/мл IGF-I. Указанная среда будет далее именоваться «ростовая среда».

Пример 3

Получение экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных из одноклеточной суспензии эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Эмбриональные стволовые клетки человека линий H1 (P33) и H9 (P45) культивировали в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) в течение по меньшей мере трех пассажей. Клетки культивировали в кондиционированной среде MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL носители в соответствии с примером 1. При степени слияния приблизительно 60% полученные культуры обрабатывали раствором TrypLEExpress (Invitrogen, Калифорния, США) в течение 5 минут. Выделенные клетки ресуспендировали в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, восстановили центрифугированием и подсчитали при помощи гемоцитометра. Выделенные клетки высеяли с плотностью 1000-10000 клеток/см2 в полистирольные культуральные сосуды (TCPS) и культивировали в среде DMEM-F12+2% FBS+100 нг/мл Activin A+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I+0,1 мМ меркаптоэтанол (Invitrogen, Калифорния, США) и растворе заменимых аминокислот (1X, NEAA, Invitrogen, Калифорния, США) в условиях гипоксии (приблизительно 3% O2) при температуре 37°C в стандартном культуральном инкубаторе. Полистирольные культуральные сосуды не имели покрытия из препарата MATRIGEL или иных белков внеклеточного матрикса. Культуральную среду меняли ежедневно. Клетки первого пассажа обозначаются P1.

Пример 4

Различные ростовые среды, пригодные для размножения экспрессирующих маркеры плюрипотентности производных от эмбриональных стволовых клеток человека клеток

Экспрессирующие маркеры плюрипотентности производные от эмбриональных стволовых клеток человека клетки успешно культивировали в средах перечисленного ниже состава в течение по меньшей мере 2-30 пассажей:

1. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A

2. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

3. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

4. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

5. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+10 нг/мл WNT-3A+50 нг/мл IGF-I

6. DM-F12+2% FBS+50 нг/мл AA+20 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

7. DM-F12+2% FBS+100 нг/мл AA+10 нг/мл WNT-3A+10 нг/мл IGF-I

8. Среда определенного состава HEScGRO (Chemicon, Калифорния, США)

Основной компонент перечисленных выше сред может быть заменен на другие подобные среды, такие как RPMI, DMEM, CRML, Knockout DMEM и F12.

Пример 4

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3β на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток

Получение и поддержание экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток проводили, как описано в примере 2. Клетки выращивали в среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS (Invitrogen), 100 нг/мл Activin A, 20 нг/мл Wnt-3a и 50 нг/мл IGF(R&D Biosystems). Клетки высеяли с плотностью 10000 клеток/см2 в полистирольные флаконы типа Falcon и выращивали в монослойной культуре при температуре 37°C, в атмосфере 5% CO2 и пониженной концентрации кислорода. При достижении степени слияния 60-70% полученные клетки пассировали путем промывания монослоя раствором PBS и инкубирования с раствором TrypLE (Invitrogen) в течение 3-5 минут для открепления клеток и получения одноклеточной суспензии.

Скрининг проводили с использованием тестовых соединений из патентованной библиотеки малых молекул, отобранных по их способности ингибировать активность фермента GSK-3B. Соединения из этой библиотеки были предоставлены в виде исходных растворов концентрации 1 мМ на 96-луночных планшетах в 50 мМ HEPES, 30% DMSO. Для проведения анализа экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки промыли, подсчитали и высеяли в нормальной культуральной среде с плотностью 20000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты, состоящие из непрозрачных лунок с прозрачным дном (Costar). Предварительные эксперименты показали, что указанная плотность посева дает оптимальное образование монослоя при культивировании в течение одной ночи. На следующий день культуральную среду удалили, монослои клеток трижды промыли раствором PBS и в лунки добавили 80 мкл аликвоты испытываемых соединений, разведенных в среде для проведения анализа до конечной концентрации 10 мкМ. На 2 день анализа из всех лунок удалили старую среду и заменили ее на свежую аликвоту испытываемых соединений, разведенных в среде для проведения анализа. Среда для проведения анализа на 1 и 2 день культивирования состояла из среды DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A. На 3 и 4 день анализа из всех лунок удалили старую среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A (без испытываемых соединений). На 4 день анализа в каждую лунку добавили 15 мкл MTS (Promega), планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 1,5-4 часов, и затем измерили оптические плотности лунок на длине волны 490 нм с помощью анализатора SpectraMax (Molecular Devices). Для каждого дублирующего набора рассчитали статистические характеристики: среднее значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации. Для каждой лунки с испытываемым образцом также рассчитали токсичность относительно положительного контрольного образца (лунки, обработанные Activin A и Wnt3a на 1 и 2 день культивирования).

Сводка всех результатов скрининга приведена в таблице II. В данном анализе экспрессирующие маркеры плюрипотентности клетки изначально высеяли в виде слитного монослоя, поэтому полученные результаты адекватно отражают степень токсичности за четырехдневный период культивирования. Полученные результаты представлены в виде процентной доли выживаемости клеток по отношению к контрольному образцу и демонстрируют различную токсичность некоторых соединений при использованных для скрининга концентрациях 10 мкМ. Большинство испытанных соединений показали минимальную токсичность или оказались нетоксичны в проведенном клеточном анализе.

Небольшой набор выбранных соединений повторно проверили в узком диапазоне дозировок с использованием экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток в анализе, аналогичном описанному выше. В таблице III приведены полученные в этом анализе результаты, свидетельствующие о наличии эффекта варьирования дозировки для испытанного набора токсичных и нетоксичных соединений.

Пример 5

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3β на дифференцирование и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека, установленный с помощью одновременного многопараметрического анализа

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линия H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Используемые в анализе кластеры клеток однородно ресуспендировали в нормальной культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и восстановления использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в увлажняемом боксе.

Скрининг проводили с использованием тестовых соединений из патентованной библиотеки малых молекул, отобранных по их способности ингибировать активность фермента GSK-3B. Соединения из этой библиотеки были предоставлены в виде исходных растворов концентрацией 1 мМ на 96-луночных планшетах в 50 мМ HEPES, 30% DMSO. Испытание соединений проводили в двух или трех повторностях. Первичный скрининговый анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом от 80 до 100 мкл, содержащие основную среду DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems), плюс 10 мкМ испытываемого соединения. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с заменой испытываемого соединения на 10-20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems). Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали основную среду с добавлением 0,5% FCS и только Activin A (только AA) или в качестве альтернативы - 0,5% FCS, без Activin A или Wnt3a (без обработки). На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и заменили на идентичную по составу свежую среду. На 3 и 4 день из всех тестовых лунок удалили среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A (без испытываемого соединения или Wnt3a); лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и Activin A (только AA) или в качестве альтернативы - 2% FCS, без Activin A (без обработки).

По окончании культивирования находящиеся в 96-луночных планшетах клетки зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. В качестве альтернативы клетки зафиксировали ледяным 70% спиртом в течение ночи при температуре -20°C, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали раствором 0,5% Triton X-100 в течение 5 минут при температуре 4°C. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Sox17 и козий античеловеческий HNF-3beta; R&D Systems) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили к клеткам после их трехкратной промывки раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 5 мМ Draq5 (Alexis Biochemicals) на пять минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Draq5 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок с вторичными антителами только для необработанных отрицательных контрольных образцов. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по двенадцать проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность клеток для Sox-17 и HNF-3beta измеряли с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.6 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для повторностей рассчитали средние значения и их стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000 и форм-факторам от 0,4 и выше. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и их стандартных отклонений.

В таблице IV приведена представительная сводка всех результатов проведенного скрининга. В таблице V приведен список положительных результатов проведенного скрининга. Сильно положительные результаты определяются как более чем или равные 120% от контрольных значений; умеренно положительные результаты определяются как находящиеся в диапазоне 60-120% от контрольных значений. В данном анализе значительное число соединений индуцировали пролиферативный отклик. Параллельно в данном анализе значительное число соединений индуцировали дифференцирование, измеряемое по уровню экспрессии белков факторов транскрипции Sox17 и Hnf-3b.

Пример 6

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3β на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека, установленный с помощью спектрофотометра вертикального сканирования

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линии H9 или H1) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 площади монослоя для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в этих примерах линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Используемые в анализе кластеры клеток однородно ресуспендировали в нормальной культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGEL 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и восстановления использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в увлажняемом боксе.

Первичный скрининговый анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом от 80 до 100 мкл, содержащие основную среду DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems) и 10 мкМ испытываемого соединения. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с заменой испытываемого соединения на 10-20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems). Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали основную среду с добавлением 0,5% FCS, без Activin A или Wnt3a. Скрининг соединений проводили в трех повторностях. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и заменили на идентичную по составу свежую среду. На 3 и 4 день из всех тестовых лунок удалили среду и заменили ее на среду DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, за исключением лунок с отрицательными контрольными образцами, которые поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

На 4 день анализа в каждую лунку добавили 15-20 мкл MTS (Promega) и инкубировали планшеты при температуре 37°C в течение 1,5-4 часов. Оптические плотности лунок на длине волны 490 нм измерили с помощью спектрофотометра вертикального сканирования Molecular Devices. Для каждого дублирующего набора рассчитали среднее значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации. Результаты для каждой лунки с испытываемым образцом сравнили с результатом для положительного контрольного образца Activin A/Wnt3a и рассчитали степень пролиферации как процентную величину по отношению к контрольному образцу.

В таблице VI приведена представительная сводка всех результатов проведенного скрининга. В таблице VII приведен список положительных результатов проведенного скрининга. Сильно положительные результаты определяются как более чем или равные 120% от контрольных значений; умеренно положительные результаты определяются как находящиеся в диапазоне 60-120% от контрольных значений. В данном анализе значительное число соединений индуцировали пролиферативный отклик.

Пример 7

Эффект ингибиторов активности фермента GSK-3β на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека: титрование дозы эффективных соединений

Было важно подтвердить активность соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, и далее титрованием дозы проанализировать диапазон активности. Свежие образцы выбранного подмножества соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, получили в виде сухих порошков, растворили для получения свежих маточных растворов и разбавили для проведения вторичных подтверждающих анализов по оценке их воздействия на эмбриональные стволовые клетки человека.

Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека двух линий (H1 и H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии на покрытых препаратом MatrigelTM (Invitrogen) полистирольных носителях, используя для покрытия поверхности разведение 1:30 препарата MatrigelTM в среде DMEM:F12. Клетки разделили ферментативным пассированием со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании монослой клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-60 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линий H1 или H9 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MatrigelTM 96-луночные планшеты типа Packard VIEWPLATE (PerkinElmer) в объемах 100 мкл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в увлажняемом боксе.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных подтверждающих анализов использовали подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Двадцать соединений, доступных в виде сухих порошков, растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили 1:1000 до получения 10 мкМ раствора испытываемого соединения в основной среде DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems). Полученные растворы далее последовательно разбавили вдвое, получив для каждого соединения кривые разбавления из семи точек, также используя для разбавления основную среду DMEM:F12 с 0,5% FCS и 100 нг/мл Activin A.

Вторичный скрининговый анализ: Анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом 100 мкл, содержащие основную среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования находящиеся в 96-луночных планшетах клетки дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Sox17; R&D Systems) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили в каждую лунку к клеткам после их трехкратной промывки раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами, в качестве необработанных отрицательных контрольных образцов. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность Sox-17 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значение и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка Sox17 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000 и форм-факторам от 0,4 и выше. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Результаты

Приведены результаты для восьми ингибиторов фермента GSK-3B, где титрованием в описанном вторичном анализе была подтверждена активность ингибитора и определена его эффективность. Приведенные данные демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток и интенсивность Sox17, где соответствующие точки получены усреднением по наборам повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. В приведенном примере уровень экспрессии Sox17 является индикатором дифференцирования в линию сформированной эндодермы. Результаты по количеству клеток и интенсивности Sox17, полученные для линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека, приведены в таблицах VIII и IX, соответственно. Результаты для линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека приведены в таблицах X и XI. Величины для положительных контрольных образцов нормированы на 1,000 для численности клеток и интенсивности Sox17. Величины для отрицательных контрольных образцов составили менее чем 0,388 для численности клеток и менее чем 0,065 для интенсивности Sox17 для обеих клеточных линий. Графическое изображение полученных данных, со сравнением двух линий эмбриональных стволовых клеток человека и включением титрования дозы для каждого соединения, приведено на фиг. 1-8. Численность клеток представлена в части A; интенсивность Sox17 представлена в части B каждого рисунка. Приведенные данные подтверждают, что каждое соединение может стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека и их дифференцирование в клетки линии сформированной эндодермы, и указывают оптимальные диапазоны активности.

Пример 8

Эффект ингибиторов фермента GSK-3β на уровни экспрессии дополнительных маркеров, ассоциируемых с линией дифференцирования сформированной эндодермы

Было важно показать способность соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, в дополнение к фактору транскрипции Sox17 индуцировать также другие маркеры, характерные для дифференцирования по линии сформированной эндодермы. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию CXCR4, белка поверхностного рецептора и HNF-3 beta, фактора транскрипции, который также ассоциирован с дифференцированием по линии сформированной эндодермы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGELTM (в разбавлении 1:30) 6-луночные планшеты (Corning) в объемах 2 мл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных анализов использовали подмножество из семи соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Чистые соединения растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили до получения конечной концентрации в диапазоне от 1 мкМ до 5мкМ в основной среде DMEM:F12 (Invitrogen) с добавлением 0,5% FCS (HyClone) и 100 нг/мл Activin A (R&D Biosystems).

Анализ: Анализ начали с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Затем в лунки добавили испытываемые образцы объемом 2 мл, содержащие основную среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов с 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду, и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования монослои клеток промыли раствором PBS и собрали с культуральных планшетов путем инкубации с раствором TrypLE™ Express (Invitrogen) в течение 5 минут. Затем клетки ресуспендировали в кондиционированной среде MEF и разделили на пары равных образцов. Один набор образцов далее окрасили с помощью меченных различными флюоресцентными метками антител и анализировали способом проточной цитометрии (FACS). Второй параллельный набор образцов анализировали способом количественного ПЦР.

Клетки для цитометрического анализа промыли в растворе PBS и в течение 15 минут блокировали при температуре 4°C в 0, 125% растворе гамма-глобулина человека (Sigma, Кат. № G-4386), разведенного в растворе PBS и буфере для окрашивания BD FACS. Аликвоты клеток (приблизительно 105 клеток каждая) окрашивали в течение 30 минут при температуре 4°C антителами, непосредственно сопряженными с флюоресцентной меткой и специфичными по отношению к CD9 PE (BD № 555372), CD99 PE (Caltag № MHCD9904) или CXCR-4 APC (R&D Systems, Кат. № FAB173A). После ряда промывок в окрашивающем буфере BD FACS клетки окрасили 7-AAD (BD № 559925) для оценки их жизнеспособности и анализировали на анализаторе BD FACS Array (BD Biosciences), накапливая не менее 10000 событий. Для получения процентной доли положительных клеток использовали мышиные IgG1k изотипические контрольные антитела к PE и APC.

Клетки для количественного ПЦР обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, Калифорния, США) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM 7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, Калифорния, США) с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: CXCR4 (Hs00237052), GAPDH (4310884E), HNF3b (Hs00232764), SOX17 (зондовая часть № 450025, прямая и обратная часть № 4304971).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP 7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла (Ct) как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct (∆Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2-∆Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

На фиг. 9 приведены результаты цитометрического анализа (FACS) процента положительных клеток с экспрессией поверхностного рецептора CXCR4 после обработки различными ингибиторами GSK3. Приведены данные для двух концентраций каждого соединения в диапазоне от 1 мкМ до 5 мкМ в сравнении с необработанной популяцией клеток (отрицательный контрольный образец) и клетками, обработанными Activin A и Wnt3 (положительный контрольный образец). На фиг. 10A, B и C приведены данные ПЦР в реальном времени для CXCR4, Sox17 и HNF3beta, которые также рассматриваются в качестве маркеров сформированной эндодермы. И цитометрический анализ, и анализ ПЦР в реальном времени свидетельствуют о значительном росте каждого из указанных маркеров в дифференцированных клетках относительно необработанных контрольных клеток. В ряде случаев уровни экспрессии указанных маркеров сформированной эндодермы оказались эквивалентны соответствующим уровням в положительных контрольных образцах, тем самым демонстрируя, что ингибитор GSK3 может заменить Wnt3a на этой стадии клеточной дифференцирования.

Пример 9

Эффект ингибиторов фермента GSK-3β на формирование панкреатической эндодермы

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3β на стадии индуцирования сформированной эндодермы не препятствует дальнейшему дифференцированию клеток других типов, таких как, например, клетки панкреатической эндодермы. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию PDX1 и HNF6, ключевых факторов транскрипции, ассоциированных с дифференцированием по линии панкреатической эндодермы.

Поддержание эмбриональных стволовых клеток человека (линий H1 и H9) проводили, как описано в примере 1. Колонии клеток поддерживали в недифференцированном плюрипотентном состоянии со средним интервалом четыре дня между последовательными пассированиями. При пассировании культуры клеток обрабатывали раствором коллагеназы (1 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 10-30 минут при температуре 37°C, затем осторожно соскоблили кончиком пипетки, получив кластеры клеток. Полученным кластерам дали осесть под собственным весом и затем промыли их для удаления остатков коллагеназы. Кластеры клеток разделили в соотношении 1:3 для стандартного поддерживающего культивирования или в соотношении 1:1 для немедленного анализа. Использованные в анализе линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее 50 и периодически проверяли на нормальный кариотипический фенотип и отсутствие примесей микоплазмы.

Подготовка клеток для анализа: Используемые в анализе кластеры клеток линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека однородно ресуспендировали в культуральной среде и высеяли на покрытые препаратом MATRIGELTM (в разбавлении 1:30) 24-луночные планшеты (черные лунки; Arctic White) в объеме 1 мл/лунку. Для первоначального посева и размножения использовали кондиционированную среду MEF с добавлением 8 нг/мл bFGF. Во втором эксперименте кластеры клеток линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека высеяли на 96-луночные планшеты с нанесенным питающим слоем из мышиных эмбриональных фибропластов, инактивированных обработкой митомицином C (Sigma Chemical Co). Культуральная среда для эмбриональных стволовых клеток человека на монослоях мышиных эмбриональных фибробластов состояла из среды DMEM:F12 с 20% нокаут-заменителем сыворотки (Invitrogen) с добавлением минимально необходимых незаменимых аминокислот (Invitrogen), L-глутамина и 2-меркаптоэтанола. Ежедневное питание осуществляли путем отсасывания отработанной культуральной среды из каждой лунки и ее замены тем же объемом свежей среды. Перед началом анализа культуры размножали в течение от одного до трех дней после посева. В течение всего анализа планшеты держали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2.

Подготовка соединений и среды для анализа: Для проведения дальнейших исследований и вторичных анализов использовали подмножество из восьми соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге. Чистые соединения растворили в DMSO до концентрации 10 мМ и до использования хранили с дессикатором при температуре -20°C. Непосредственно перед проведением анализа маточные растворы соединений разбавили до получения конечной концентрации в диапазоне от 1 мкМ до 5 мкМ в основной среде с добавками.

Анализ: В этом анализе ингибиторы GSK3 вводили только на 1 и 2 день стадии дифференцирования по линии сформированной эндодермы, заменяя ими Wnt3a. Анализ культур эмбриональных стволовых клеток на покрытых препаратом MATRIGELTM носителях начали, как описано в примерах 7 и 8 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 0,5 мл/лунку для 24-луночных планшетов, 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду DMEM:F12 с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 и 4 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 и 4 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ циклопамина 3-кето-N-(аминоэтил-аминокапроил-дигидроциннамоила (KAAD) (EMD Biosciences) и 20 нг/мл фактора роста фибробластов FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS (стадия 2) или 1% B27 (стадия 3) без каких-либо других добавок.

Параллельно на питающих слоях мышиных эмбриональных фибробластов выращивали культуры клеток линии H9 эмбриональных стволовых клеток человека и дифференцировали их в клетки панкреатической эндодермы. Дифференцирование сформированной эндодермы провели путем культивирования клеток в среде, состоящей из основной среды RPMI-1640 (Invitrogen), не содержащей сыворотки на 1 день и содержащей 0,2% FCS на 2 и 3 дни, с добавлением различных концентраций испытываемых ингибиторов и 100 нг/мл Activin A. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду (с сывороткой или без сыворотки) с 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду (с сывороткой или без сыворотки), без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой RPMI-1640 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3 день поддерживали в основной среде RPMI-1640 с добавлением 2% FCS. Клетки дифференцировали в клетки линии панкреатической эндодермы путем четырехдневной обработки, ежедневно внося основную среду RPMI-1640 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 50 нг/мл фактора роста фибробластов FGF10 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду RPMI-1640 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 50 нг/мл FGF10. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде RPMI-1640 с добавлением 2% FCS (стадия 2) или 1% B27 (стадия 3) без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании дифференцирования клетки проанализировали методом ПЦР в реальном времени на уровни экспрессии генов, как описано в примере 8 выше. Для флюоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, снова трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (козий античеловеческий Pdx1; Santa Cruz) развели 1:100 в 4% куриной сыворотке и добавили к клеткам на два часа при комнатной температуре. Сопряженные с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичные антитела (куриный антикозий IgG; Molecular Probes) развели 1:200 в растворе PBS и добавили в каждую лунку после трехкратной промывки клеток раствором PBS. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность Pdx1 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка Pdx1 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Клетки для количественного ПЦР лизировали в буфере RLT (Qiagen) и затем обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, Калифорния, США) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM 7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: PDX1 (Hs00236830_m1), GAPDH (4310884E) и HNF6 (Hs00413554_m1).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP 7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла (Ct) как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct (∆Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2-∆Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3β. Представленные на фиг. 11 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность Pdx1 (часть B) для линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека, где соответствующие точки получены усреднением по наборам повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. Представленные на фиг. 12 результаты ПЦР в реальном времени демонстрируют эффект описываемых низкомолекулярных ингибиторов на индуцированную экспрессию двух факторов транскрипции, Pdx1 и HNF6. В приведенных примерах уровни экспрессии Pdx1 и HNF6 являются индикатором дифференцирования в линию панкреатической эндодермы. В проведенных анализах соединения-ингибиторы GSK3β могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования; формируемые при этом клетки сохраняют способность к образованию панкреатической эндодермы в ходе последующих стадий дифференцирования.

Пример 10

Эффект ингибиторов фермента GSK-3β на формирование панкреатических эндокринных клеток

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3 на стадии индуцирования сформированной эндодермы не препятствует дальнейшему дифференцированию клеток других типов, таких как, например, панкреатических эндокринных клеток или клеток, вырабатывающих инсулин. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили на способность стимулировать экспрессию панкреатических гормонов.

Подготовка клеток для анализа: Клетки панкреатичекой эндодермы, полученные в соответствии с описанными в примере 9 способами (культивированные на 96-луночных и 24-луночных планшетах), затем обработали агентами, приводящими к дифференцированию клеток в панкреатические экспрессирующие гормоны клетки.

Анализ культур эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 на покрытых препаратом MATRIGELTM носителях начали, как описано в примерах 7-9 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 0,5 мл/лунку для 24-луночных планшетов, 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3, 4 и 5 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3, 4 и 5 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 20 нг/мл FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на стадиях 2 и 3 все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS или 1% B27 без каких-либо других добавок. После формирования панкреатической эндодермы клетки обрабатывали далее в течение шести дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 с 1 мкМ DAPT (ингибитор гамма-секретазы: EMD Biosciences) и 50 нг/мл Exendin 4 (Sigma-Aldrich). Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27, 50 нг/мл Exendin 4, 50 нг/мл IGF (R&D Biosystems) и 50 нг/мл HGF (R&D Biosystems). Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 1% B27 без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования клетки обработали, как описано в примерах 7 и 8 выше, для анализа методами одновременного многопараметрического анализа или ПЦР в реальном времени.

Для флуоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки снова трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (морской свинки антисвиной инсулин, перекрестная активность с инсулином человека; DakoCytomation) развели 1:500 в 4% козьей сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Клетки трижды промыли раствором PBS и затем окрасили сопряженными с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичными антителами (козий антиморской свинки IgG; Molecular Probes), разбавленными 1:100 в 4% козьей сыворотке. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность инсулина измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка инсулин выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора трех повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Клетки для количественного ПЦР лизировали в буфере RLT (Qiagen) и затем обработали для выделения РНК, очистки и синтеза кДНК. Образцы РНК очистили путем связывания с силикагелевой мембраной (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) в присутствии этанолсодержащего высокосолевого буферного раствора, а затем промыли для удаления примесей. Затем РНК очищали далее, используя набор TURBO DNA-free (Ambion, Inc.), элюировав в воду РНК высокого качества. Выход и чистоту полученной РНК оценивали по измеряемому на спектрофотометре поглощению на длинах волн 260 и 280 нм. Копии кДНК получили с очищенной РНК, используя набор высокой емкости для получения кДНК из архивного материала компании Applied Biosystems, Inc. (ABI, Калифорния, США).

Если не указано иное, все реактивы для ПЦР-амплификации в реальном времени и количественного определения приобретались у компании ABI. Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы для определения последовательности ABI PRISM®7900 Sequence Detection System. Использовали набор TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, Калифорния, США) с 20 нг обратно транскрибированной РНК при полном объеме реакционной смеси 20 мкл. Каждый образец кДНК анализировали дважды для коррекции погрешности пипетирования. Праймеры и меченные красителем FAM зонды TAQMAN®использовали в концентрациях 200 нМ. Уровень экспрессии для каждого целевого гена нормировали по эндогенному контрольному образцу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе человека (ГАФДГ), ранее разработанному компанией ABI. Использовали следующие комплекты праймеров и зондов: PDX1 (Hs00236830_m1), Insulin (Hs00355773) и GAPDH (4310884E).

После начальной инкубации при температуре 50°C в течение 2 мин с последующей инкубацией при температуре 95°C в течение 10 минут с образцами провели 40 двухстадийных циклов, включающих стадию денатурации при температуре 95°C продолжительностью 15 секунд и следующую за ней стадию отжига/роста при температуре 60°C продолжительностью 1 минута. Анализ данных проводили с использованием программного пакета GENEAMP®7000 Sequence Detection System. Для каждого комплекта праймеров и зондов определялось значение порогового цикла Ct как номер цикла, при котором интенсивность флюоресценции достигала определенного значения в середине экспоненциальной области амплификации. Уровни относительной экспрессии генов вычисляли методом сравнения Ct. Коротко говоря, для каждого образца кДНК значение Ct эндогенного контрольного образца вычитали из значения Ct целевого гена и получали величину дельта Ct (∆Ct). Нормированное количество целевого гена рассчитывали как 2-∆Ct, принимая, что амплификация имеет 100% эффективность. Окончательные данные были выражены относительно калибровочного образца.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3B. Представленные на фиг. 13 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность инсулина (часть B) для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1, где соответствующие точки получены усреднением по наборам трех повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. Представленные на фиг. 14 результаты ПЦР в реальном времени демонстрируют эффект соединений для Pdx1 и инсулина. В приведенных примерах уровни экспрессии Pdx1 и инсулина являются индикатором дифференцирования в линию панкреатической эндодермы и выработки гормон-положительных клеток. В проведенных анализах соединения-селективные ингибиторы GSK3β могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования и могут индуцировать и поддерживать формирование панкреатических бета-клеток в ходе последующих стадий дифференцирования, как показывают результаты и инсулинового иммуноокрашивания, и ПЦР в реальном времени.

Пример 11

Аддитивные эффекты ингибиторов фермента GSK-3β на формирование панкреатических эндокринных клеток

Было важно показать, что обработка ингибиторами GSK3β может улучшить дифференцирование панкреатических бета клеток, если ингибиторы добавляются на нескольких стадиях коммитирования клеток. Выбранное подмножество соединений, показавших положительный результат при первичном скрининге, проверили методом последовательного добавления на способность повышать уровень экспрессии инсулина, ассоциируемый с панкреатическими гормон-положительными клетками.

Подготовка клеток для анализа: Клетки панкреатичекой эндодермы, полученные в соответствии с описанными в примерах 9 и 10 способами (культивированные на 96-луночных планшетах), затем обработали агентами, приводящими к дифференцированию клеток в панкреатические экспрессирующие гормоны клетки.

Анализ культур эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 на покрытых препаратом MATRIGELTM носителях начали, как описано в примерах 7-9 выше, с отсасывания культуральной среды из каждой лунки с монослоем клеток с последующей трехкратной промывкой лунки раствором PBS для удаления остатков факторов роста и сыворотки. Для дифференцирования в клетки сформированной эндодермы в лунки добавили испытываемые образцы (объемом 100 мкл/лунку для 96-луночных планшетов), содержащие среду с добавлением 0,5% FCS, варьируемую концентрацию испытываемых ингибиторов, 100 нг/мл Activin A, без Wnt3a. Лунки с положительными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, 100 нг/мл Activin A и 20 нг/мл Wnt3a (R&D Biosystems), без испытываемого соединения. Лунки с отрицательными контрольными образцами содержали ту же основную среду с 0,5% FCS, без Activin A, Wnt3a и испытываемого соединения. На 2 день анализа из лунок отсосали отработанную среду и лунки снова наполнили растворами с теми же концентрациями испытываемых соединений или контрольными растворами. На 3, 4 и 5 день содержимое всех лунок отсосали и лунки наполнили средой DMEM:F12 с добавлением 2% FCS и 100 нг/мл Activin A, без тестовых соединений и Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами на 3, 4 и 5 день поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS. Для дифференцирования по линии панкреатической эндодермы клетки обрабатывали в течение трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с 2% FCS с добавлением 0,25 мкМ KAAD-циклопамина (EMD Biosciences) и 20 нг/мл FGF7 (R&D Biosystems). Затем клетки обрабатывали в течение еще четырех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen), 0,25 мкМ KAAD-циклопамина, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA; Sigma-Aldrich) и 20 нг/мл FGF7. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 2% FCS или 1% B27 без каких-либо других добавок. После формирования панкреатической эндодермы клетки обрабатывали далее в течение шести дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27 с 1 мкМ DAPT (ингибитор гамма-секретазы: EMD Biosciences) и 50 нг/мл Exendin 4 (Sigma-Aldrich) и 1 мкМ ингибитора II TGFbeta R1 (ингибитор ALK5; EMD Biosciences). В течение данного шестидневного периода ингибиторы GSK3β добавляли в соответствующие лунки, используя те же концентрации, что и при предыдущей обработке для инициации дифференцирования. Затем клетки обрабатывали в течение еще трех дней, ежедневно внося основную среду DMEM:F12 с добавлением 1% B27, 50 нг/мл Exendin 4, 50 нг/мл IGF (R&D Biosystems) и 50 нг/мл HGF (R&D Biosystems), и 1 мкМ ингибитора II TGFbeta R1 (ингибитор ALK5; EMD Biosciences). В течение данного трехдневного периода ингибиторы GSK3β добавляли в соответствующие лунки, используя те же концентрации, что и при предыдущей обработке для инициации дифференцирования. Лунки с параллельными положительными контрольными образцами обрабатывали в присутствии или в отсутствии 20 нг/мл Wnt3a. Лунки с параллельными отрицательными контрольными образцами все время поддерживали в основной среде DMEM:F12 с добавлением 1% B27 без каких-либо других добавок.

Оценка результатов анализа: По окончании культивирования клетки обработали, как описано в примере 10 выше, для анализа методом одновременного многопараметрического анализа.

Для флуоресцентного окрашивания, используемого в методе одновременного многопараметрического анализа, клетки в 96-луночных планшетах дважды промыли раствором PBS, зафиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 20 минут, трижды промыли раствором PBS и затем пермеабилизовали, обработав раствором 0,5% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации и пермеабилизации клетки опять трижды промыли раствором PBS и заблокировали раствором 4% куриной сыворотки (Invitrogen) в растворе PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Первичные антитела (морской свинки антисвиной инсулин, перекрестная активность с инсулином человека; DakoCytomation) развели 1:500 в 4% козьей сыворотке и добавили к клеткам на один час при комнатной температуре. Клетки трижды промыли раствором PBS и затем окрасили сопряженными с флюорофором Alexa Fluor 488 вторичными антителами (козий антиморской свинки IgG; Molecular Probes), разбавленными 1:100 в 4% козьей сыворотке. Для контрастной окраски ядер добавили 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342 (Invitrogen) на 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промыли раствором PBS и оставили в 100 мкл раствора PBS/лунку для томографии.

Томографию клеток проводили на анализаторе IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), используя дихроичное зеркало 51008bs для клеток, окрашенных Hoechst 33342 и Alexa Fluor 488. Времена экспозиции оптимизировали с использованием лунок с положительными контрольными образцами и лунок, окрашенных только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур обработки и окрашивания для каждой лунки снимали по 15 проекций. Общее количество клеток и общую интенсивность инсулина измеряли с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общий уровень экспрессии белка инсулин выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение суммарной интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон исключили на основании критериев соответствия ступеням шкалы серых тонов в диапазоне от 300 до 3000. Показатели общей интенсивности нормировали путем деления общей интенсивности для каждой лунки на среднюю общую интенсивность для положительного контрольного образца Wnt3a/Activin A. Для каждого набора трех повторностей рассчитали нормированные данные для средних значений и стандартных отклонений.

Результаты

Результаты приведены для восьми ингибиторов фермента GSK-3β. Представленные на фиг. 15 результаты одновременного многопараметрического анализа демонстрируют эффект испытываемых соединений на численность клеток (часть A) и интенсивность инсулина (часть B) для эмбриональных стволовых клеток человека линии H1, где соответствующие точки получены усреднением по наборам трех повторностей и для каждого параметра извлечены из одних и тех же проекций для одних и тех же лунок. В приведенном примере уровень экспрессии инсулина является индикатором дифференцирования в линию панкреатических гормон-положительных клеток. В проведенных анализах соединения-селективные ингибиторы GSK3β могут заменить Wnt3a на ранних стадиях коммитирования клеток к линии дифференцирования и, при добавлении на более поздних стадиях, стимулируют повышение уровня экспрессии инсулина по отношению к положительному контрольному образцу.

Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включаются в настоящий документ. Хотя различные аспекты настоящего изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения определяется не упомянутым выше описанием, а следующими ниже пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Таблица IA
Список первичных антител, используемых для цитометрического анализа (FACS) и иммуноокрашивания
Антитело Поставщик Изотип Клон
SSEA-1 Chemicon (Калифорния, США) Мышиный IgM MC-480
SSEA-3 Chemicon (Калифорния, США) Мышиный IgG3 MC-631
SSEA-4 Chemicon (Калифорния, США) Крысиный IgM MC-813-70
TRA 1-60 Chemicon (Калифорния, США) Мышиный IgM TRA 1-60
TRA 1-81 Chemicon (Калифорния, США) Мышиный IgM TRA 1-81
TRA 1-85 Chemicon (Калифорния, США) Мышиный IgG1 TRA 1-85
AP R&D systems Мышиный IgG1 B4-78
HNF3β R&D systems Козий IgG
PDX1 Santa Cruz Biotechnology, INC Козий IgG A-17
GATA4 R&D systems Козий IgG
Sox 17 R&D systems Козий IgG
CD 9 BD Мышиный IgG1 M-L13
Таблица IB
Список вторичных сопряженных антител, используемых для цитометрического анализа (FACS) и иммуноокрашивания
Вторичное сопряженное антитело Поставщик Разведе-ние
Козий антимышиный IgG, сопряженный с APC Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США) 1:200
Козий антимышиный IgG, сопряженный с PE Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США) 1:200
Ослиный антикроличий IgG, сопряженный с PE или APC Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США) 1:200
Ослиный антикозий IgG, сопряженный с PE или APC Jackson ImmunoResearch (Пенсильвания, США) 1:200
Козий анти-мышиный IgM, сопряженный с PE SouthernBiotech (Алабама, США) 1:200
Козий антикрысиный IgM, сопряженный с PE SouthernBiotech (Алабама, США) 1:200
Козий антимышиный IgG3, сопряженный с PE SouthernBiotech (Алабама, США) 1:200
Таблица II
Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток
Исходные данные Среднее значение Среднеквадра-тическое
отклонение
Коэффициент вариации, % % контрольного образца
(дублир.)
JNJ5226780 0,785 0,790 0,788 0,00382 0,48 94,0
JNJ10179026 0,148 0,152 0,150 0,00247 1,65 4,8
JNJ17154215 0,427 0,462 0,444 0,02496 5,62 46,0
JNJ17205955 0,643 0,638 0,641 0,00368 0,57 73,5
JNJ180125 0,762 0,762 0,762 0,00007 0,01 90,4
JNJ18157646 0,850 0,824 0,837 0,01824 2,18 101,0
JNJ19370026 0,911 0,884 0,898 0,01881 2,10 109,5
JNJ19567340 0,723 0,743 0,733 0,01421 1,94 86,4
JNJ7830433 0,161 0,169 0,165 0,00559 3,39 6,9
JNJ10179130 0,767 0,789 0,778 0,01556 2,00 92,6
JNJ17154215 0,512 0,555 0,533 0,03048 5,72 58,4
JNJ17205955 0,282 0,293 0,288 0,00792 2,75 24,1
JNJ18014061 0,764 0,723 0,743 0,02892 3,89 87,9
JNJ18157698 0,853 0,858 0,855 0,00382 0,45 103,5
JNJ19376240 0,832 0,837 0,834 0,00361 0,43 100,6
JNJ19567405 0,726 0,725 0,725 0,00042 0,06 85,3
JNJ8706646 0,132 0,137 0,134 0,00368 2,74 2,6
JNJ10182562 0,797 0,793 0,795 0,00346 0,44 95,1
JNJ17157659 0,776 0,787 0,782 0,00792 1,01 93,2
JNJ17205994 0,164 0,148 0,156 0,01131 7,24 5,6
JNJ18014074 0,475 0,383 0,429 0,06548 15,26 43,8
JNJ18157698 0,823 0,774 0,798 0,03444 4,31 95,6
JNJ19386042 0,781 0,729 0,755 0,03649 4,83 89,5
JNJ19573541 0,143 0,149 0,146 0,00396 2,72 4,2
JNJ8710481 0,716 0,716 0,716 0,00014 0,02 84,1
JNJ10182562 0,804 0,802 0,803 0,00148 0,18 96,2
JNJ17163042 0,900 0,877 0,888 0,01626 1,83 108,2
JNJ17226703 0,824 0,799 0,812 0,01725 2,13 97,4
JNJ18018338 0,744 0,819 0,781 0,05261 6,73 93,2
JNJ18157711 0,952 0,966 0,959 0,00933 0,97 118,1
JNJ19410833 0,952 0,919 0,935 0,02277 2,43 114,8
JNJ19574867 0,776 0,777 0,777 0,00042 0,05 92,5
JNJ8710481 0,691 0,617 0,654 0,05254 8,03 75,4
JNJ10184655 0,162 0,134 0,148 0,02022 13,66 4,5
JNJ10166565 0,791 0,608 0,700 0,12947 18,50 81,8
JNJ17982133 0,153 0,129 0,141 0,01676 11,87 3,5
JNJ18018351 0,731 0,585 0,658 0,10317 15,68 75,9
DMSO 0,789 0,700 0,744 0,06279 8,44 88,0
JNJ19410859 0,909 0,675 0,792 0,16546 20,88 94,7
JNJ19574880 0,164 0,151 0,157 0,00926 5,89 5,8
JNJ10148307 0,706 0,672 0,689 0,02404 3,49 83,9
JNJ10222784 0,641 0,601 0,621 0,02878 4,63 73,7
JNJ17174664 0,882 0,748 0,815 0,09504 11,66 102,5
JNJ17989049 0,822 0,802 0,812 0,01400 1,72 102,1
JNJ18047991 0,777 0,764 0,771 0,00919 1,19 95,9
DMSO 0,798 0,771 0,785 0,01916 2,44 98,0
JNJ19410872 0,791 0,789 0,790 0,00134 0,17 98,7
JNJ20948798 0,628 0,640 0,634 0,00806 1,27 75,6
JNJ10164830 0,149 0,135 0,142 0,00969 6,81 2,7
JNJ10222927 0,803 0,782 0,792 0,01492 1,88 99,1
JNJ17187027 0,125 0,129 0,127 0,00318 2,51 0,4
JNJ17994873 0,315 0,542 0,428 0,15995 37,34 45,2
JNJ18055726 0,820 0,748 0,784 0,05091 6,49 97,9
JNJ18157711 0,154 0,165 0,160 0,00806 5,05 5,3
JNJ19558929 0,737 0,730 0,734 0,00481 0,66 90,4
JNJ21192730 0,659 0,647 0,653 0,00813 1,25 78,5
JNJ10164895 0,165 0,154 0,159 0,00785 4,93 5,2
JNJ10231273 0,637 0,554 0,595 0,05876 9,87 69,9
JNJ17187053 0,684 0,588 0,636 0,06809 10,71 76,0
JNJ17994899 0,750 0,624 0,687 0,08945 13,02 83,5
JNJ18077800 0,678 0,618 0,648 0,04285 6,61 77,8
JNJ19363357 0,777 0,667 0,722 0,07757 10,74 88,7
DMSO 0,799 0,649 0,724 0,10564 14,59 89,0
JNJ21194667 0,648 0,625 0,636 0,01662 2,61 76,0
JNJ10172058 0,601 0,620 0,611 0,01308 2,14 72,2
JNJ10259847 0,695 0,702 0,698 0,00552 0,79 85,2
JNJ17193774 0,568 0,709 0,639 0,09956 15,59 76,4
JNJ17994912 0,623 0,765 0,694 0,10041 14,46 84,6
JNJ18157074 0,758 0,762 0,760 0,00297 0,39 94,3
JNJ19369233 0,487 0,434 0,461 0,03769 8,18 49,9
JNJ19567314 0,690 0,686 0,688 0,00262 0,38 83,7
JNJ21196227 0,535 0,550 0,543 0,01089 2,01 62,1
JNJ10178727 0,743 0,638 0,691 0,07446 10,78 84,1
JNJ10259847 0,694 0,603 0,649 0,06449 9,94 77,8
JNJ17200976 0,160 0,186 0,173 0,01824 10,56 7,2
JNJ17994925 0,662 0,566 0,614 0,06788 11,05 72,7
JNJ18157087 0,600 0,514 0,557 0,06102 10,96 64,2
JNJ19369246 0,685 0,524 0,605 0,11427 18,90 71,3
JNJ19567327 0,731 0,525 0,628 0,14552 23,18 74,7
JNJ24843611 0,715 0,596 0,655 0,08436 12,87 78,8
JNJ24843611 0,592 0,572 0,582 0,01393 2,39 70,0
JNJ25758785 0,614 0,611 0,613 0,00177 0,29 74,6
JNJ26064571 0,766 0,849 0,807 0,05869 7,27 104,3
JNJ26130403 0,830 0,813 0,822 0,01195 1,45 106,5
JNJ26170794 0,727 0,730 0,728 0,00198 0,27 92,2
JNJ26241774 0,713 0,836 0,774 0,08733 11,28 99,3
JNJ26367991 0,726 0,719 0,722 0,00523 0,72 91,3
JNJ26483310 0,646 0,681 0,663 0,02510 3,78 82,4
JNJ24326185 0,651 0,649 0,650 0,00120 0,19 80,3
JNJ25758850 0,642 0,622 0,632 0,01407 2,23 77,5
JNJ26067626 0,843 0,672 0,758 0,12099 15,97 96,7
JNJ26134771 0,734 0,815 0,774 0,05728 7,40 99,3
JNJ26170820 0,823 0,743 0,783 0,05699 7,28 100,6
JNJ26241917 0,871 0,874 0,872 0,00219 0,25 114,2
JNJ26714220 0,652 0,642 0,647 0,00721 1,12 79,8
JNJ26483223 0,617 0,633 0,625 0,01174 1,88 76,5
JNJ24843572 0,657 0,655 0,656 0,00134 0,20 81,2
JNJ25758863 0,684 0,809 0,746 0,08803 11,80 95,0
JNJ26067652 0,901 0,735 0,818 0,11731 14,34 106,0
JNJ26150202 0,791 0,768 0,779 0,01591 2,04 100,1
JNJ26170833 0,948 0,764 0,856 0,12982 15,17 111,7
JNJ26243204 0,821 0,608 0,714 0,15033 21,05 90,1
JNJ26399906 0,745 0,685 0,715 0,04243 5,94 90,2
JNJ26483236 0,624 0,618 0,621 0,00417 0,67 76,0
JNJ24843585 0,652 0,624 0,638 0,01916 3,00 78,5
JNJ25873419 0,773 0,662 0,718 0,07792 10,86 90,6
JNJ26069901 0,856 0,834 0,845 0,01570 1,86 110,1
JNJ26153647 0,828 0,800 0,814 0,02008 2,47 105,4
JNJ26177086 0,821 0,841 0,831 0,01421 1,71 108,0
JNJ26247143 0,816 0,787 0,802 0,02072 2,58 103,5
JNJ26399906 0,744 0,737 0,741 0,00453 0,61 94,1
JNJ26483249 0,699 0,679 0,689 0,01464 2,12 86,3
JNJ25753520 0,186 0,208 0,197 0,01541 7,83 11,3
JNJ25887537 0,665 0,699 0,682 0,02432 3,57 85,2
JNJ26077883 0,810 0,683 0,746 0,09030 12,10 95,0
JNJ26158015 0,141 0,162 0,151 0,01506 9,95 4,3
DMSO 0,784 0,605 0,695 0,12671 18,25 87,1
JNJ26248729 0,726 0,590 0,658 0,09624 14,63 81,5
JNJ26399945 0,635 0,620 0,628 0,01068 1,70 76,9
JNJ26483249 0,697 0,695 0,696 0,00113 0,16 87,3
JNJ25753403 0,154 0,153 0,154 0,00042 0,28 4,5
JNJ25900641 0,616 0,645 0,630 0,02072 3,29 82,1
JNJ22791671 0,909 0,830 0,869 0,05614 6,46 121,0
JNJ26158054 0,150 0,150 0,150 0,00028 0,19 3,9
JNJ26177762 0,981 1,056 1,018 0,05303 5,21 145,3
JNJ26261105 0,166 0,189 0,177 0,01626 9,19 8,3
JNJ26399971 0,718 0,451 0,584 0,18887 32,34 74,6
JNJ26483262 0,652 0,647 0,649 0,00389 0,60 85,2
JNJ25757173 0,503 0,529 0,516 0,01860 3,61 63,5
JNJ25900654 0,603 0,609 0,606 0,00424 0,70 78,1
JNJ26116922 0,856 0,793 0,824 0,04419 5,36 113,7
JNJ26893438 0,883 0,848 0,866 0,02503 2,89 120,5
JNJ26184457 0,779 0,784 0,781 0,00368 0,47 106,7
JNJ26361712 0,892 0,914 0,903 0,01591 1,76 126,6
JNJ26399984 0,544 0,537 0,540 0,00460 0,85 67,5
JNJ26511901 0,532 0,682 0,607 0,10543 17,37 78,3
JNJ25757173 0,665 0,645 0,655 0,01400 2,14 86,1
JNJ25900706 0,676 0,677 0,677 0,00035 0,05 89,7
JNJ26120601 0,935 0,807 0,871 0,09115 10,47 121,3
JNJ26158093 0,916 0,859 0,887 0,03981 4,49 124,0
JNJ26219050 0,907 0,891 0,899 0,01124 1,25 125,9
JNJ26361725 0,909 0,896 0,902 0,00919 1,02 126,4
JNJ26399997 0,682 0,797 0,740 0,08118 10,98 99,9
JNJ26511927 0,679 0,644 0,661 0,02510 3,80 87,2
JNJ25757238 0,300 0,223 0,261 0,05452 20,88 22,0
JNJ26047723 0,183 0,175 0,179 0,00573 3,20 8,6
JNJ26120614 0,741 0,728 0,734 0,00884 1,20 99,1
JNJ26158106 0,935 0,906 0,921 0,02051 2,23 129,4
JNJ26219063 0,131 0,128 0,129 0,00212 1,64 0,5
JNJ26366730 0,138 0,137 0,138 0,00092 0,67 1,9
JNJ26400049 0,241 0,227 0,234 0,01032 4,41 17,6
JNJ26941226 0,604 0,639 0,622 0,02475 3,98 80,7
JNJ25758707 0,247 0,182 0,215 0,04617 21,52 14,4
JNJ26054912 0,659 0,634 0,647 0,01718 2,66 84,8
JNJ26128726 0,758 0,575 0,667 0,12961 19,44 88,1
JNJ26161343 0,166 0,170 0,168 0,00276 1,64 6,9
JNJ26220454 0,651 0,559 0,605 0,06541 10,81 78,0
JNJ26367991 0,803 0,694 0,748 0,07693 10,28 101,3
JNJ26483197 0,823 0,634 0,728 0,13378 18,37 98,1
JNJ26511953 0,624 0,618 0,621 0,00431 0,69 80,6
RWJ351001 0,639 0,603 0,621 0,02553 4,11 73,6
RWJ382867 0,143 0,149 0,146 0,00403 2,76 2,9
RWJ682205 0,817 0,818 0,818 0,00071 0,09 102,8
RWJ665862 0,742 0,752 0,747 0,00679 0,91 92,2
RWJ670804 0,856 0,905 0,881 0,03479 3,95 112,1
RWJ673829 0,650 0,576 0,613 0,05268 8,59 72,4
RWJ675260 0,768 0,724 0,746 0,03097 4,15 92,2
RWJ675946 0,556 0,549 0,553 0,00537 0,97 63,4
RWJ351958 0,227 0,242 0,235 0,01103 4,70 16,1
RWJ395477 0,634 0,663 0,649 0,02044 3,15 77,7
RWJ447228 0,141 0,128 0,135 0,00919 6,83 1,3
RWJ666167 0,847 0,832 0,840 0,01110 1,32 106,0
RWJ670908 0,803 0,845 0,824 0,02998 3,64 103,7
RWJ673830 0,860 0,860 0,860 0,00035 0,04 109,1
RWJ675261 0,528 0,497 0,513 0,02227 4,34 57,5
RWJ675948 0,683 0,688 0,686 0,00332 0,48 83,1
RWJ447228 0,611 0,628 0,620 0,01202 1,94 73,3
RWJ414342 0,719 0,749 0,734 0,02143 2,92 90,3
RWJ553709 0,916 0,838 0,877 0,05487 6,26 111,6
RWJ666168 0,771 0,740 0,755 0,02178 2,88 93,5
RWJ670984 0,820 0,852 0,836 0,02305 2,76 105,5
RWJ674239 0,971 0,913 0,942 0,04137 4,39 121,2
RWJ675430 0,839 0,743 0,791 0,06746 8,53 98,8
RWJ676061 0,562 0,527 0,544 0,02440 4,48 62,2
RWJ352190 0,678 0,661 0,670 0,01195 1,78 80,8
RWJ414984 0,722 0,713 0,717 0,00658 0,92 87,9
RWJ659780 0,802 0,801 0,802 0,00106 0,13 100,4
RWJ666205 0,854 0,857 0,855 0,00205 0,24 108,4
RWJ671232 0,767 0,798 0,782 0,02157 2,76 97,5
RWJ674240 0,789 0,776 0,782 0,00870 1,11 97,5
RWJ675266 0,720 0,709 0,714 0,00764 1,07 87,4
RWJ676085 0,641 0,618 0,630 0,01619 2,57 74,9
RWJ352244 0,603 0,584 0,593 0,01372 2,31 69,4
RWJ425264 0,135 0,158 0,146 0,01633 11,18 3,0
RWJ662440 0,792 0,572 0,682 0,15563 22,83 82,6
RWJ666213 0,752 0,593 0,673 0,11292 16,79 81,2
RWJ672667 0,805 0,598 0,702 0,14644 20,87 85,5
RWJ674241 0,599 0,504 0,552 0,06682 12,11 63,2
RWJ675366 0,714 0,593 0,654 0,08549 13,08 78,4
RWJ676137 0,699 0,698 0,698 0,00099 0,14 85,0
RWJ352628 0,690 0,674 0,682 0,01131 1,66 83,3
RWJ425268 0,616 0,634 0,625 0,01301 2,08 74,8
RWJ663860 0,809 0,817 0,813 0,00552 0,68 103,0
RWJ667045 0,128 0,133 0,131 0,00361 2,76 0,7
RWJ672932 0,821 0,811 0,816 0,00721 0,88 103,4
RWJ674320 0,456 0,474 0,465 0,01223 2,63 50,8
RWJ675369 0,762 0,766 0,764 0,00304 0,40 95,7
RWJ676139 0,680 0,663 0,671 0,01195 1,78 81,8
RWJ353258 0,615 0,635 0,625 0,01400 2,24 74,8
RWJ355923 0,681 0,698 0,689 0,01266 1,84 84,5
RWJ664545 0,830 0,807 0,818 0,01584 1,94 103,8
RWJ667046 0,869 0,849 0,859 0,01442 1,68 109,9
RWJ672934 0,821 0,841 0,831 0,01428 1,72 105,7
RWJ674817 0,819 0,840 0,830 0,01485 1,79 105,5
RWJ675430 0,795 0,793 0,794 0,00078 0,10 100,1
RWJ676431 0,640 0,636 0,638 0,00283 0,44 76,7
RWJ355131 0,610 0,628 0,619 0,01266 2,05 73,9
RWJ425271 0,143 0,144 0,144 0,00035 0,25 2,6
RWJ353709 0,804 0,903 0,853 0,07000 8,20 109,0
RWJ667069 0,918 0,854 0,886 0,04483 5,06 113,9
RWJ673313 0,105 1,080 0,593 0,68971 116,37 70,0
RWJ674855 0,877 0,860 0,868 0,01209 1,39 111,3
RWJ675578 0,808 0,695 0,751 0,07941 10,57 93,8
RWJ676432 0,720 0,697 0,709 0,01648 2,33 87,3
RWJ355923 0,636 0,621 0,629 0,01054 1,68 75,4
RWJ425348 0,640 0,634 0,637 0,00474 0,74 76,6
RWJ665436 0,833 0,833 0,833 0,00000 0,00 106,0
RWJ669182 0,887 0,846 0,866 0,02934 3,39 111,0
RWJ673515 0,845 0,877 0,861 0,02326 2,70 110,2
RWJ674855 0,794 0,784 0,789 0,00686 0,87 99,4
RWJ675605 0,770 0,786 0,778 0,01138 1,46 97,8
RWJ67657 0,629 0,659 0,644 0,02128 3,30 77,7
RWJ356205 0,584 0,558 0,571 0,01817 3,18 66,8
RWJ445224 0,707 0,679 0,693 0,01987 2,87 85,0
RWJ665588 0,727 0,578 0,652 0,10536 16,15 78,9
RWJ669327 0,742 0,629 0,685 0,07969 11,63 83,8
DMSO 0,653 0,507 0,580 0,10310 17,78 68,0
RWJ675104 0,722 0,568 0,645 0,10904 16,90 77,9
RWJ675881 0,643 0,581 0,612 0,04384 7,16 72,9
RWJ676639 0,608 0,590 0,599 0,01245 2,08 70,9
JNJ26511966 0,597 0,610 0,603 0,00926 1,54 71,2
JNJ26511979 0,687 0,668 0,677 0,01336 1,97 82,4
JNJ26512005 0,840 0,832 0,836 0,00594 0,71 106,1
JNJ26533065 0,831 0,822 0,826 0,00587 0,71 104,7
JNJ26533091 0,863 0,856 0,860 0,00509 0,59 109,7
JNJ26533104 0,886 0,802 0,844 0,05954 7,05 107,3
JNJ26533156 0,753 0,687 0,720 0,04660 6,47 88,8
JNJ26714181 0,455 0,463 0,459 0,00587 1,28 49,6
JNJ26714194 0,668 0,678 0,673 0,00764 1,13 81,7
JNJ26714207 0,181 0,171 0,176 0,00658 3,74 7,2
JNJ26714220 0,832 0,842 0,837 0,00658 0,79 106,3
JNJ26875563 0,795 0,802 0,798 0,00445 0,56 100,5
JNJ22791671 0,157 0,140 0,148 0,01202 8,11 3,0
JNJ26893438 0,153 0,153 0,153 0,00035 0,23 3,7
JNJ26941226 0,168 0,154 0,161 0,00969 6,02 4,9
JNJ28572128 0,670 0,641 0,655 0,02079 3,17 79,1
RWJ67694 0,706 0,679 0,693 0,01888 2,73 84,7
RWJ676940 0,788 0,666 0,727 0,08627 11,86 89,8
RWJ677545 0,879 0,785 0,832 0,06640 7,98 105,6
RWJ678986 0,168 0,176 0,172 0,00537 3,13 6,6
RWJ680665 0,946 0,848 0,897 0,06972 7,77 115,3
RWJ680667 0,187 0,202 0,194 0,01089 5,61 9,9
RWJ680668 0,906 0,688 0,797 0,15394 19,31 100,3
RWJ680669 0,715 0,674 0,694 0,02850 4,10 84,9
RWJ680858 0,695 0,700 0,697 0,00339 0,49 85,3
RWJ680858 0,665 0,631 0,648 0,02369 3,66 78,0
RWJ680879 0,590 0,613 0,601 0,01655 2,75 71,0
RWJ680885 0,681 0,687 0,684 0,00382 0,56 83,3
RWJ680991 0,829 0,821 0,825 0,00530 0,64 104,5
RWJ680992 0,822 0,790 0,806 0,02270 2,82 101,6
RWJ680993 0,671 0,684 0,677 0,00912 1,35 82,3
RWJ681140 0,686 0,668 0,677 0,01266 1,87 82,3
RWJ681142 0,212 0,197 0,204 0,01047 5,12 11,5
RWJ681146 0,666 0,666 0,666 0,00007 0,01 80,7
RWJ681945 0,736 0,656 0,696 0,05643 8,11 85,1
RWJ68198 0,726 0,610 0,668 0,08217 12,30 81,0
JNJ28850601 0,303 0,310 0,306 0,00488 1,59 26,7
DMSO 0,786 0,659 0,722 0,09001 12,46 89,1
DMSO 0,673 0,649 0,661 0,01676 2,53 79,9
DMSO 0,701 0,686 0,693 0,01011 1,46 84,8
Таблица III
Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на жизнеспособность экспрессирующих маркеры плюрипотентности клеток
Концен-трация соеди-нения Исходные
данные
Среднее значение Среднеквадратиче- ское отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
(мкМ) (дублир.)
Среда EXPRES 01 0,6379 0,6180 0,6280 0,0141 2,2 74,6
Без обработки 0,7412 0,7038 0,7225 0,0264 3,7 88,7
Только AA 0,7674 0,8047 0,7861 0,0264 3,4 98,3
AA+Wnt3a 0,7754 0,8200 0,7977 0,0315 4,0 100,0
JNJ26512005 10 0,1412 0,1515 0,1464 0,0073 5,0 2,4
JNJ26512005 5 0,1501 0,1444 0,1473 0,0040 2,7 2,5
JNJ26512005 2,5 0,1541 0,4254 0,2898 0,1918 66,2 23,9
JNJ26533065 10 0,1272 0,1282 0,1277 0,0007 0,6 -0,4
JNJ26533065 5 0,5862 0,5880 0,5871 0,0013 0,2 68,4
JNJ26533065 2,5 0,7613 0,7603 0,7608 0,0007 0,1 94,5
JNJ26533156 10 0,1481 0,1592 0,1537 0,0078 5,1 3,5
JNJ26533156 5 0,1479 0,1639 0,1559 0,0113 7,3 3,8
JNJ26533156 2,5 0,2861 0,2477 0,2669 0,0272 10,2 20,4
JNJ26714194 10 0,2092 0,2426 0,2259 0,0236 10,5 14,3
JNJ26714194 5 0,6815 0,7128 0,6972 0,0221 3,2 84,9
JNJ26714194 2,5 0,7389 0,7870 0,7630 0,0340 4,5 94,8
JNJ26150202 10 0,1381 0,1398 0,1390 0,0012 0,9 1,3
JNJ26150202 5 0,7826 0,7578 0,7702 0,0175 2,3 95,9
JNJ26150202 2,5 0,8231 0,7742 0,7987 0,0346 4,3 100,1
JNJ26158015 10 0,1352 0,1326 0,1339 0,0018 1,4 0,5
JNJ26158015 5 0,2632 0,2604 0,2618 0,0020 0,8 19,7
JNJ26158015 2,5 0,4160 0,5314 0,4737 0,0816 17,2 51,4
RWJ670804 10 0,4447 0,4791 0,4619 0,0243 5,3 49,7
RWJ670804 5 0,6902 0,6884 0,6893 0,0013 0,2 83,8
RWJ670804 2,5 0,7476 0,7483 0,7480 0,0005 0,1 92,5
JNJ26170833 10 0,6790 0,6704 0,6747 0,0061 0,9 81,6
JNJ26170833 5 0,7833 0,7924 0,7879 0,0064 0,8 98,5
JNJ26170833 2,5 0,8155 0,8389 0,8272 0,0165 2,0 104,4
JNJ26177086 10 0,6533 0,6884 0,6709 0,0248 3,7 81,0
JNJ26177086 5 0,7697 0,7738 0,7718 0,0029 0,4 96,1
JNJ26177086 2,5 0,8119 0,8219 0,8169 0,0071 0,9 102,9
JNJ26177762 10 0,1242 0,1323 0,1283 0,0057 4,5 -0,4
JNJ26177762 5 0,1263 0,1303 0,1283 0,0028 2,2 -0,3
JNJ26177762 2,5 0,8480 0,7725 0,8103 0,0534 6,6 101,9
RWJ673515 10 0,1695 0,1890 0,1793 0,0138 7,7 7,3
RWJ673515 5 0,7217 0,7435 0,7326 0,0154 2,1 90,2
RWJ673515 2,5 0,7812 0,7221 0,7517 0,0418 5,6 93,1
Среда EXPRES 01 0,6294 0,6363 0,6329 0,0049 0,8 70,3
Без обработки 0,7156 0,7356 0,7256 0,0141 1,9 83,3
Только AA 0,8732 0,9046 0,8889 0,0222 2,5 106,0
AA+Wnt3a 0,8415 0,8500 0,8458 0,0060 0,7 100,0
JNJ19370026 10 0,1403 0,1493 0,1448 0,0064 4,4 2,3
JNJ19370026 5 0,4434 0,3878 0,4156 0,0393 9,5 40,1
JNJ19370026 2,5 0,7734 0,8038 0,7886 0,0215 2,7 92,0
JNJ26483197 10 0,2993 0,3026 0,3010 0,0023 0,8 24,1
JNJ26483197 5 0,7023 0,6299 0,6661 0,0512 7,7 75,0
JNJ26483197 2,5 0,7835 0,8043 0,7939 0,0147 1,9 92,8
RWJ675605 10 0,7205 0,7369 0,7287 0,0116 1,6 83,7
RWJ675605 5 0,7769 0,8272 0,8021 0,0356 4,4 93,9
RWJ675605 2,5 0,8214 0,8640 0,8427 0,0301 3,6 99,6
RWJ675430 10 0,6275 0,5980 0,6128 0,0209 3,4 67,5
RWJ675430 5 0,7159 0,7222 0,7191 0,0045 0,6 82,3
RWJ675430 2,5 0,9245 0,9403 0,9324 0,0112 1,2 112,1
RWJ675948 10 0,7220 0,6670 0,6945 0,0389 5,6 78,9
RWJ675948 5 0,7526 0,7486 0,7506 0,0028 0,4 86,7
RWJ675948 2,5 0,7557 0,7390 0,7474 0,0118 1,6 86,3
JNJ26483249 10 0,8214 0,8636 0,8425 0,0298 3,5 99,5
JNJ26483249 5 0,7996 0,7873 0,7935 0,0087 1,1 92,7
JNJ26483249 2,5 0,8669 0,8195 0,8432 0,0335 4,0 99,6
RWJ67657 10 0,6195 0,5908 0,6052 0,0203 3,4 66,5
RWJ67657 5 0,8047 0,8319 0,8183 0,0192 2,4 96,2
RWJ67657 2,5 0,8041 0,7900 0,7971 0,0100 1,3 93,2
RWJ676639 10 0,1261 0,1520 0,1391 0,0183 13,2 1,5
RWJ676639 5 0,1303 0,1263 0,1283 0,0028 2,2 0,0
RWJ676639 2,5 0,4482 0,4051 0,4267 0,0305 7,1 41,6
Таблица IV
Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
Пролиферативный отклик Уровень экспрессии SOX-17 Пролиферативный отклик Уровень экспрессии HNF-3b
Название соединения Общее количество клеток Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Общая интенсивность Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Общее количество клеток Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Общая интенсивность Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA
JNJ26511966 1723 0,11244207 68870409 0,0708 1645 0,10460717 50143628 0,0453
JNJ26511979 1110 0,07245904 42978557 0,0442 94 0,00597755 0 0,0000
JNJ26512005 7990 0,52154188 339840000 0,3494 6833 0,43448539 231745000 0,2092
JNJ26533065 4914 0,32074548 238555000 0,2453 2907 0,18485899 82808745 0,0747
JNJ26533091 3056 0,19945819 153145000 0,1575 2643 0,16807097 122246784 0,1103
JNJ26533104 3960 0,25850251 47669463 0,0490 4641 0,29512575 210730000 0,1902
JNJ26533156 12243 0,79917096 699160000 0,7189 6536 0,41559887 248855000 0,2246
JNJ26714181 401 0,02614400 25580022 0,0263 27 0,00168516 0 0,0000
JNJ26714194 7958 0,51948561 351070000 0,3610 6992 0,44459636 288075000 0,2600
JNJ26714207 277 0,01808212 6558563 0,0067 12 0,00073130 535481 0,0005
JNJ26714220 1327 0,08662445 69037756 0,0710 1194 0,07589584 40478497 0,0365
JNJ26875563 791 0,05160259 24732475 0,0254 64 0,00406982 1092011 0,0010
JNJ22791671 0 0,00000000 0 0,0000 3 0,00019077 95784 0,0001
JNJ26893438 2 0,00013056 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
JNJ26941226 6 0,00035903 1092432 0,0011 2 0,00009539 150222 0,0001
JNJ28572128 2742 0,17899341 122926199 0,1264 3166 0,20132905 120729987 0,1090
JNJ28850601 33 0,00212155 3855900 0,0040 8 0,00050873 208129 0,0002
RWJ674817 2000 0,13055682 110080123 0,1132 116 0,00737655 4290889 0,0039
RWJ674855 3495 0,22814805 110559816 0,1137 438 0,02782105 24450647 0,0221
RWJ674855 3107 0,20278739 120998421 0,1244 6177 0,39276971 273965000 0,2473
RWJ675104 658 0,04295320 37841044 0,0389 646 0,04107977 31352380 0,0283
RWJ675260 5991 0,39108297 252690000 0,2598 8479 0,53915615 306520000 0,2767
RWJ675261 1953 0,12745610 88653625 0,0912 641 0,04076182 18162585 0,0164
RWJ675266 2024 0,13209087 128395000 0,1320 4923 0,31302661 232020000 0,2094
RWJ675366 2979 0,19446439 93454696 0,0961 3582 0,22775110 137054653 0,1237
RWJ675369 3703 0,24169332 138180000 0,1421 3980 0,25306032 139550000 0,1260
RWJ675430 21070 1,37538351 1089750000 1,1205 21203 1,34831961 1281000000 1,1562
RWJ675578 1297 0,08466610 47445962 0,0488 30 0,00190773 0 0,0000
RWJ675605 14529 0,94839741 1013360000 1,0419 9871 0,62767480 540725000 0,4881
RWJ675881 4063 0,26522619 207891758 0,2137 3973 0,25264697 177190000 0,1599
RWJ675946 1 0,00006528 0 0,0000 7 0,00041334 0 0,0000
RWJ675948 9716 0,63421242 572520000 0,5887 7650 0,48643922 329425000 0,2973
RWJ676061 916 0,05979503 0 0,0000 1076 0,06839210 40211776 0,0363
RWJ676085 738 0,04817547 30943000 0,0318 503 0,03198626 0 0,0000
RWJ676137 8367 0,54618448 373185000 0,3837 7976 0,50720168 260000000 0,2347
RWJ676139 20079 1,31069260 1104750000 1,1359 16884 1,07363836 1052345000 0,9499
RWJ676431 13789 0,90012403 789085000 0,8113 11369 0,72296588 547055000 0,4938
RWJ676432 16652 1,08698348 1045395000 1,0749 14950 0,95065340 854325000 0,7711
RWJ676657 6376 0,41618252 324450000 0,3336 6058 0,38523417 269025000 0,2428
RWJ676639 6470 0,42231869 327055000 0,3363 4357 0,27706591 109160000 0,0985
RWJ674817 2000 0,13055682 110080123 0,1132 116 0,00737655 4290889 0,0039
RWJ674855 3495 0,22814805 110559816 0,1137 438 0,02782105 24450647 0,0221
RWJ674855 3107 0,20278739 120998421 0,1244 6177 0,39276971 273965000 0,2473
RWJ675104 658 0,04295320 37841044 0,0389 646 0,04107977 31352380 0,0283
RWJ675260 5991 0,39108297 252690000 0,2598 8479 0,53915615 306520000 0,2767
RWJ675261 1953 0,12745610 88653625 0,0912 641 0,04076182 18162585 0,0164
RWJ675266 2024 0,13209087 128395000 0,1320 4923 0,31302661 232020000 0,2094
RWJ675366 2979 0,19446439 93454696 0,0961 3582 0,22775110 137054653 0,1237
RWJ675369 3703 0,24169332 138180000 0,1421 3980 0,25306032 139550000 0,1260
RWJ675430 21070 1,37538351 1089750000 1,1205 21203 1,34831961 1281000000 1,1562
RWJ675578 1297 0,08466610 47445962 0,0488 30 0,00190773 0 0,0000
RWJ675605 14529 0,94839741 1013360000 1,0419 9871 0,62767480 540725000 0,4881
RWJ675881 4063 0,26522619 207891758 0,2137 3973 0,25264697 177190000 0,1599
RWJ675946 1 0,00006528 0 0,0000 7 0,00041334 0 0,0000
RWJ675948 9716 0,63421242 572520000 0,5887 7650 0,48643922 329425000 0,2973
RWJ676061 916 0,05979503 0 0,0000 1076 0,06839210 40211776 0,0363
RWJ676085 738 0,04817547 30943000 0,0318 503 0,03198626 0 0,0000
RWJ676137 8367 0,54618448 373185000 0,3837 7976 0,50720168 260000000 0,2347
RWJ676139 20079 1,31069260 1104750000 1,1359 16884 1,07363836 1052345000 0,9499
RWJ676431 13789 0,90012403 789085000 0,8113 11369 0,72296588 547055000 0,4938
RWJ676432 16652 1,08698348 1045395000 1,0749 14950 0,95065340 854325000 0,7711
RWJ67657 6376 0,41618252 324450000 0,3336 6058 0,38523417 269025000 0,2428
RWJ676639 6470 0,42231869 327055000 0,3363 4357 0,27706591 109160000 0,0985
Без обработки 3891 0,25396566 97657703 0,1004 6091 0,38733268 109336609 0,0987
AA 4348 0,28379790 104735084 0,1077 122 0,00775810 5341271 0,0048
AA/3a 15319 1,00000000 972595000 1,0000 15726 1,00000000 1107900000 1,0000
RWJ351001 738 0,44211577 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ351958 0 0,00000000 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
DMSO 56 0,03353293 454796 0,0148 211 0,16644754 4455058 0,1626
RWJ352190 1313 0,78642715 28506437 0,9266 5485 4,32684722 85245671 3,1115
RWJ352244 12 0,00738523 85949 0,0028 67 0,05259006 1300640 0,0475
RWJ352628 2899 1,73612774 32703235 1,0630 7460 5,88456482 149772525 5,4668
RWJ353258 562 0,33632735 11388240 0,3702 787 0,62108861 10743082 0,3921
RWJ355131 118 0,07045908 2574279 0,0837 57 0,04522745 2584708 0,0943
RWJ355923 136 0,08163673 410648 0,0133 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ356205 19 0,01137725 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ382867 3 0,00159681 431883 0,0140 31 0,02419143 847186 0,0309
RWJ395477 33 0,01976048 0 0,0000 225 0,17749145 5223879 0,1907
RWJ414342 16 0,00978044 0 0,0000 496 0,39127005 8966327 0,3273
RWJ414984 26 0,01556886 459801 0,0149 189 0,14935577 1819533 0,0664
RWJ425264 1 0,00039920 0 0,0000 42 0,03339469 1605538 0,0586
RWJ425268 22 0,01297405 82062 0,0027 311 0,24506968 5749996 0,2099
RWJ425271 0 0,00000000 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ425348 26 0,01556886 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ445224 202 0,12095808 627280 0,0204 1079 0,85143308 14326715 0,5229
RWJ447228 3 0,00179641 0 0,0000 4 0,00315540 101114 0,0037
RWJ553709 1310 0,78423154 24382455 0,7926 3249 2,56323955 75834631 2,7680
RWJ659780 20 0,01177645 0 0,0000 425 0,33526164 8880858 0,3242
RWJ663860 9 0,00538922 37140 0,0012 134 0,10570602 2144545 0,0783
RWJ662440 7 0,00419162 48154 0,0016 5 0,00420720 170177 0,0062
RWJ664545 70 0,04191617 589594 0,0192 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ665436 1215 0,72774451 7568849 0,2460 0 0,00000000 0 0,0000
Без обработки 1145 0,68542914 6979814 0,2269 не проводилось
AA 100 0,05988024 1264807 0,0411 51 0,04049435 923625 0,0337
AA/3a 1670 1,00000000 30764293 1,0000 1268 1,00000000 27396787 1,0000
RWJ665588 43 0,00510815 706614 0,0055 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ665862 7 0,00079815 102445 0,0008 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ666167 46 0,00546732 0 0,0000 46 0,00548446 818478 0,0044
RWJ666168 5 0,00059861 284777 0,0022 32 0,00385502 2309043 0,0124
RWJ666205 258 0,03092825 4009395 0,0312 391 0,04665766 14340307 0,0769
RWJ666213 62 0,00742278 782261 0,0061 112 0,01335347 2792473 0,0150
RWJ667045 36 0,00431000 312039 0,0024 2 0,00027820 1731575 0,0093
RWJ667046 59 0,00702371 397711 0,0031 103 0,01232017 3561761 0,0191
RWJ667069 22 0,00267380 770128 0,0060 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ669182 77 0,00925852 1631067 0,0127 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ669327 129 0,01540426 997629 0,0078 98 0,01164454 4138261 0,0222
RWJ670804 2386 0,28565728 20866647 0,1625 2594 0,30931563 61161468 0,3280
RWJ670908 172 0,02063213 625299 0,0049 133 0,01589699 3578458 0,0192
RWJ670984 8 0,00099769 394948 0,0031 530 0,06319053 16678849 0,0894
RWJ671232 17 0,00207519 0 0,0000 53 0,00627931 2270954 0,0122
RWJ672667 11 0,00127704 0 0,0000 36 0,00433193 2287281 0,0123
RWJ672932 2 0,00023944 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ672934 174 0,02087158 1451727 0,0113 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ673313 80 0,00961769 940367 0,0073 333 0,03970273 5586343 0,0300
RWJ673515 11886 1,42305850 223646667 1,7415 10331 1,23173834 309900000 1,6618
RWJ673829 545 0,06524862 5849381 0,0455 404 0,04820761 6738305 0,0361
RWJ673830 10 0,00115732 315367 0,0025 35 0,00421270 3072013 0,0165
RWJ674239 2473 0,29603320 80676667 0,6282 4209 0,50182815 143916667 0,7718
RWJ674240 8 0,00091787 233687 0,0018 6 0,00071536 0 0,0000
RWJ674241 1 0,00007981 1309298 0,0102 0 0,00000000 0 0,0000
RWJ674320 0 0,00003991 0 0,0000 0 0,00000000 0 0,0000
Без обработки 7653 0,91619443 26272707 0,2046 12050 1,43665050 74453588 0,3993
AA 15 0,00175593 0 0,0000 210 0,02503776 3777945 0,0203
AA/3a 8353 1,00000000 128424304 1,0000 8387 1,00000000 186480000 1,0000
RWJ355923 7319 0,91843393 387695000 1,0342 5436 1,07644321 437495000 0,9520
RWJ664545 6620 0,83065629 333205000 0,8889 4767 0,94395485 397435000 0,8649
RWJ353709 6217 0,78014807 337920000 0,9014 5013 0,99277156 437235000 0,9515
эталонное соед-ие 5934 0,74463546 363935000 0,9708 4122 0,81621943 348135000 0,7576
JNJ18157698 10447 1,31089221 382680000 1,0208 6908 1,36805624 560475000 1,2196
JNJ5226780 10963 1,37570586 296920000 0,7921 5679 1,12456679 463525000 1,0087
JNJ7830433 1766 0,22160873 162790000 0,4343 2184 0,43241905 189875000 0,4132
JNJ8706646 2914 0,36566696 230965000 0,6161 2776 0,54975740 125125000 0,2723
JNJ8710481 3600 0,45175053 276080000 0,7365 4121 0,81612041 294665000 0,6412
JNJ8710481 1977 0,24808633 164760000 0,4395 2266 0,44865828 152060000 0,3309
JNJ10148307 9964,5 1,25040783 363855000 0,9706 9728 1,92642836 635655000 1,3832
JNJ10164830 2536,5 0,31829590 179185000 0,4780 2397 0,47460145 150600000 0,3277
JNJ10164895 5706,5 0,71608734 319930000 0,8534 5096 1,00920883 341360000 0,7428
JNJ10172058 4645,5 0,58294642 257295000 0,6864 4507 0,89256362 312605000 0,6803
JNJ10178727 2892,5 0,36296900 213165000 0,5686 3043 0,60253490 269570000 0,5866
JNJ10179026 2460,5 0,30875894 203350000 0,5425 2410 0,47727498 209795000 0,4565
JNJ10179130 4783 0,60020078 306085000 0,8165 4556 0,90226755 326475000 0,7104
JNJ10182562 6916,5 0,86792571 377885000 1,0080 4504 0,89196950 365090000 0,7945
JNJ10182562 7370,5 0,92489647 365075000 0,9739 5300 1,04950985 399265000 0,8688
JNJ10184655 10533 1,32174677 475250000 1,2678 5186 1,02693336 404710000 0,8807
JNJ10222784 3513 0,44083323 242750000 0,6476 2522 0,49945539 214575000 0,4669
Без обработки не проводилось не проводилось
AA не проводилось не проводилось
AA/3a 7969 1,00000000 374870000 1,0000 5050 1,00000000 459540000 1,0000
JNJ10222784 563 0,31250000 57351132 0,3295 1744 0,03386884 165365000 1,1010
JNJ10222927 158 0,08777778 14786632 0,0850 83 0,00161234 14201404 0,0946
JNJ10231273 3 0,00166667 0 0,0000 4 0,00007770 28439 0,0002
JNJ10259847 5 0,00277778 0 0,0000 10 0,00019426 0 0,0000
JNJ10259847 15 0,00805556 548982 0,0032 0 0,00000000 0 0,0000
JNJ17154215 24 0,01305556 689535 0,0040 11 0,00021368 0 0,0000
JNJ17154215 94 0,05194444 11142426 0,0640 12 0,00022340 1767033 0,0118
JNJ17157659 15 0,00805556 0 0,0000 21 0,00039823 4567590 0,0304
JNJ17163042 33 0,01805556 2188847 0,0126 69 0,00134038 13689421 0,0911
JNJ10166565 4 0,00194444 0 0,0000 3 0,00005828 291660 0,0019
JNJ17174664 88 0,04888889 7121122 0,0409 399 0,00774117 65100086 0,4335
JNJ17187027 11 0,00583333 1073763 0,0062 5 0,00008742 0 0,0000
JNJ17187053 8 0,00444444 0 0,0000 9 0,00016512 0 0,0000
JNJ17193774 109 0,06027778 15714170 0,0903 136 0,00263219 15725984 0,1047
JNJ17200976 5 0,00250000 125443 0,0007 5 0,00009713 0 0,0000
JNJ17205955 20 0,01083333 3135653 0,0180 8 0,00015541 0 0,0000
JNJ17205955 9 0,00472222 72387 0,0004 17 0,00033024 736311 0,0049
JNJ17205994 6 0,00305556 644015 0,0037 4 0,00007770 0 0,0000
JNJ17226703 77 0,04277778 12632849 0,0726 28 0,00054392 9312311 0,0620
JNJ17982133 14 0,00750000 887585 0,0051 1 0,00001943 52047 0,0003
JNJ17989049 23 0,01277778 2117429 0,0122 13 0,00024282 0 0,0000
Без обработки не проводилось 432 0,00838222 42987388 0,2862
AA 147 0,08138889 20330009 0,1168 8 0,00014569 87206 0,0006
AA/3a 1800 1,00000000 174052346 1,0000 1478 0,02870158 150190000 1,0000
Таблица V
Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцировку и пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
Пролиферативный отклик - Сильно положительные результаты Уровень экспрессии SOX-17 - Сильно положительные результаты Уровень экспрессии HNF-3в - Сильно положительные результаты
Название соединения Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Название соединения Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA Название соединения Относит. контрольного образца Wnt 3a/AA
RWJ352628 5,8846 RWJ673515 1,7415 RWJ352628 5,4668
RWJ352190 4,3268 JNJ10184655 1,2678 RWJ352190 3,1115
RWJ553709 2,5632 Уровень экспрессии SOX-17 - Умеренно положительные результаты RWJ553709 2,7680
JNJ10148307 1,9264 RWJ676139 1,1359 RWJ673515 1,6618
RWJ673515 1,4231 RWJ675430 1,1205 JNJ10148307 1,3832
JNJ5226780 1,3757 RWJ676432 1,0749 JNJ18157698 1,2196
RWJ675430 1,3754 RWJ352628 1,0630 Уровень экспрессии HNF-3b - Умеренно положительные результаты
JNJ18157698 1,3681 RWJ675605 1,0419 RWJ675430 1,1562
JNJ10184655 1,3217 RWJ355923 1,0342 JNJ10222784 1,1010
RWJ676139 1,3107 JNJ18157698 1,0208 JNJ5226780 1,0087
Пролиферативный отклик - Умеренно положительные результаты JNJ10182562 1,0080 RWJ355923 0,9520
JNJ5226780 1,1246 эталонное соед-ие 0,9708 RWJ353709 0,9515
RWJ676432 1,0870 JNJ10148307 0,9706 RWJ676139 0,9499
RWJ355923 1,0764 RWJ352190 0,9266 JNJ10184655 0,8807
RWJ676139 1,0736 RWJ353709 0,9014 JNJ10182562 0,8688
JNJ10182562 1,0495 RWJ664545 0,8889 RWJ664545 0,8649
JNJ10184655 1,0269 JNJ10164895 0,8534 RWJ674239 0,7718
JNJ10164895 1,0092 JNJ10179130 0,8165 RWJ676432 0,7711
RWJ353709 0,9928 RWJ676431 0,8113 эталонное соед-ие 0,7576
RWJ675605 0,9484 RWJ553709 0,7926 JNJ10164895 0,7428
RWJ664545 0,9440 JNJ5226780 0,7921 JNJ10179130 0,7104
JNJ10182562 0,9249 JNJ8710481 0,7365 JNJ10172058 0,6803
JNJ10179130 0,9023 JNJ26533156 0,7189 JNJ8710481 0,6412
RWJ676431 0,9001 JNJ10172058 0,6864 JNJ10178727 0,5866
JNJ10172058 0,8926 JNJ10222784 0,6476
RWJ445224 0,8514 RWJ674239 0,6282
эталонное соед-ие 0,8162 JNJ8706646 0,6161
JNJ8710481 0,8161 RWJ675948 0,5887
JNJ26533156 0,7992 JNJ10178727 0,5686
RWJ352190 0,7864
RWJ553709 0,7842
RWJ665436 0,7277
RWJ675948 0,6342
RWJ353258 0,6211
JNJ10178727 0,6025
Таблица VI
Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеквад-ратическое
отклонение
Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициони-рованная среда 1,1348 1,0099 1,1092 1,0846 0,0660 6,1 116,5
Без обработки 0,9344 0,5977 0,8454 0,7925 0,1745 22,0 85,2
AA/DMSO 0,3878 0,2434 0,2252 0,2855 0,0891 31,2 30,7
AA/Wnt3a/DMSO 0,6098 1,0804 0,7635 0,8179 0,2403 25,8 100,0
RWJ351001 0,3418 0,4276 0,5751 0,4482 0,1180 26,3 48,2
RWJ351958 0,1362 0,1531 0,1532 0,1475 0,0098 6,6 15,8
RWJ352190 1,3764 1,2753 1,3208 1,3242 0,0506 3,8 142,3
RWJ352244 0,6923 0,5994 0,6134 0,6350 0,0501 7,9 68,2
RWJ352628 1,7896 1,4721 2,1908 1,8175 0,3602 19,8 195,3
RWJ353258 1,7591 1,6274 1,6518 1,6794 0,0701 4,2 180,4
RWJ355131 0,3702 0,3193 0,3368 0,3421 0,0259 7,6 36,8
RWJ355923 0,5876 0,6384 0,9154 0,7138 0,1764 24,7 76,7
RWJ356205 0,3074 0,2328 0,2920 0,2774 0,0394 14,2 29,8
RWJ382867 0,1311 0,1245 0,1288 0,1281 0,0034 2,6 13,8
RWJ395477 0,1270 0,2778 0,1916 0,1988 0,0757 38,1 21,4
RWJ414342 0,2166 0,3062 0,2915 0,2714 0,0481 17,7 29,2
RWJ414984 0,4362 0,3728 0,2481 0,3524 0,0957 27,2 37,9
RWJ425264 0,1560 0,1481 0,1359 0,1467 0,0101 6,9 15,8
RWJ425268 0,2932 0,3883 0,6258 0,4358 0,1713 39,3 46,8
RWJ425271 0,1362 0,1479 0,1298 0,1380 0,0092 6,7 14,8
RWJ425348 0,2198 0,2159 0,2300 0,2219 0,0073 3,3 23,8
RWJ445224 0,7624 0,2705 0,2478 0,4269 0,2908 68,1 45,9
RWJ447228 0,1239 0,1233 0,1269 0,1247 0,0019 1,5 13,4
RWJ553709 0,1277 0,1254 0,6980 0,3170 0,3299 104,1 34,1
RWJ659780 0,2665 0,3215 0,2605 0,2828 0,0336 11,9 30,4
RWJ662440 0,2395 0,3235 0,1333 0,2321 0,0953 41,1 24,9
RWJ663860 0,2646 0,1873 0,1293 0,1937 0,0679 35,0 20,8
RWJ664545 0,3590 0,2790 0,1515 0,2632 0,1047 39,8 28,3
RWJ665436 0,4690 0,5805 0,3349 0,4615 0,1230 26,6 49,6
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициони-рованная среда 1,1525 1,1269 1,1140 1,1311 0,0196 1,7 71,0
Без обработки 1,2057 1,2358 1,3132 1,2516 0,0555 4,4 78,6
AA/DMSO 0,2622 0,2073 0,2830 0,2508 0,0391 15,6 15,8
AA/Wnt3a/DMSO 1,3943 1,7976 1,8000 1,5922 0,2136 13,4 100,0
RWJ665588 0,1930 0,2223 0,2167 0,2107 0,0156 7,4 13,2
RWJ665862 0,1757 0,1813 0,1835 0,1802 0,0040 2,2 11,3
RWJ666167 0,1473 0,1880 0,1732 0,1695 0,0206 12,2 10,6
RWJ666168 0,1330 0,1362 0,1867 0,1520 0,0301 19,8 9,5
RWJ666205 0,8191 0,5493 0,6526 0,6737 0,1361 20,2 42,3
RWJ666213 0,4008 0,2779 0,3869 0,3552 0,0673 18,9 22,3
RWJ667045 0,1220 0,1248 0,1251 0,1240 0,0017 1,4 7,8
RWJ667046 0,2883 0,3308 0,5503 0,3898 0,1406 36,1 24,5
RWJ667069 0,2835 0,4024 0,5698 0,4186 0,1438 34,4 26,3
RWJ669182 0,3704 0,6073 0,5280 0,5019 0,1206 24,0 31,5
RWJ669327 0,2266 0,1815 0,2289 0,2123 0,0267 12,6 13,3
RWJ670804 1,0820 1,1862 1,1076 1,1253 0,0543 4,8 70,7
RWJ670908 0,3590 0,5457 0,6123 0,5057 0,1313 26,0 31,8
RWJ670984 0,2198 0,3564 0,3202 0,2988 0,0708 23,7 18,8
RWJ671232 0,2928 0,2920 0,3659 0,3169 0,0424 13,4 19,9
RWJ672667 0,3349 0,3013 0,3507 0,3290 0,0252 7,7 20,7
RWJ672932 0,1852 0,1924 0,2349 0,2042 0,0269 13,2 12,8
RWJ672934 0,2170 0,3003 0,1877 0,2350 0,0584 24,9 14,8
RWJ673313 0,3094 0,2515 0,1881 0,2497 0,0607 24,3 15,7
RWJ673515 1,8452 1,7710 1,5591 1,7251 0,1485 8,6 108,3
RWJ673829 0,7305 0,7067 0,6250 0,6874 0,0553 8,0 43,2
RWJ673830 0,2113 0,1800 0,1547 0,1820 0,0284 15,6 11,4
RWJ674239 1,5225 1,5912 0,1081 1,0739 0,8371 78,0 67,4
RWJ674240 0,4006 1,2807 0,1162 0,5992 0,6071 101,3 37,6
RWJ674241 0,1972 0,1839 0,1162 0,1658 0,0434 26,2 10,4
RWJ674320 0,1351 0,1318 0,1169 0,1279 0,0097 7,6 8,0
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициони-рованная среда 1,0568 1,0604 1,0586 0,0025 0,2 71,9
Без обработки 1,1544 0,9576 1,0560 0,1392 13,2 71,7
Только AA+DMSO 0,6329 0,8434 0,7382 0,1488 20,2 47,1
AA+Wnt3a+
DMSO
1,2704 1,8669 1,4229 0,2960 20,8 100,0
RWJ674817 0,5617 0,2098 0,3858 0,2488 64,5 19,9
RWJ674855 0,6850 0,5853 0,6352 0,0705 11,1 39,2
RWJ674855 0,7496 0,9187 0,8342 0,1196 14,3 54,5
RWJ675104 0,2320 0,2124 0,2222 0,0139 6,2 7,3
RWJ675260 0,8079 1,4391 1,1235 0,4463 39,7 76,9
RWJ675261 0,8310 0,7318 0,7814 0,0701 9,0 50,5
RWJ675266 1,0646 1,1384 1,1015 0,0522 4,7 75,2
RWJ675366 0,6344 1,0400 0,8372 0,2868 34,3 54,8
без клеток 0,1335 0,2070 0,1703 0,0520 30,5 3,3
RWJ675369 0,8643 0,4060 0,6352 0,3241 51,0 39,2
RWJ675430 1,7922 1,8533 1,8228 0,0432 2,4 130,9
RWJ675578 0,1914 0,2371 0,2143 0,0323 15,1 6,7
RWJ675605 1,8401 1,7563 1,7982 0,0593 3,3 129,0
RWJ675881 1,0301 1,0356 1,0329 0,0039 0,4 69,9
RWJ675946 0,1306 0,1338 0,1322 0,0023 1,7 0,3
RWJ675948 1,7143 1,6506 1,6825 0,0450 2,7 120,0
RWJ676061 0,4170 0,4956 0,4563 0,0556 12,2 25,4
RWJ676085 0,1772 0,2348 0,2060 0,0407 19,8 6,0
RWJ676137 1,0231 1,2392 1,1312 0,1528 13,5 77,5
RWJ676139 1,9718 2,0997 2,0358 0,0904 4,4 147,3
RWJ676431 1,5168 1,6872 1,6020 0,1205 7,5 113,8
RWJ676432 1,6935 1,9710 1,8323 0,1962 10,7 131,6
RWJ67657 1,2655 1,1829 1,2242 0,0584 4,8 84,7
RWJ676639 1,3481 1,3168 1,3325 0,0221 1,7 93,0
JNJ26511966 0,6444 0,7239 0,6842 0,0562 8,2 43,0
JNJ26511979 0,2046 0,3076 0,2561 0,0728 28,4 9,9
JNJ26512005 1,3627 1,0693 1,2160 0,2075 17,1 84,0
JNJ26533065 0,8722 0,9660 0,9191 0,0663 7,2 61,1
JNJ26533091 1,0332 0,4554 0,7443 0,4086 54,9 47,6
JNJ26533104 0,8775 0,7347 0,8061 0,1010 12,5 52,4
JNJ26533156 1,7865 1,2008 1,4937 0,4142 27,7 105,5
JNJ26714181 0,2396 0,1584 0,1990 0,0574 28,9 5,5
JNJ26714194 0,8122 1,0827 0,9475 0,1913 20,2 63,3
JNJ26714207 0,1342 0,1363 0,1353 0,0015 1,1 0,6
JNJ26714220 1,0462 0,5838 0,8150 0,3270 40,1 53,1
JNJ26875563 0,4586 0,2903 0,3745 0,1190 31,8 19,0
JNJ22791671 0,1277 0,1402 0,1340 0,0088 6,6 0,5
JNJ26893438 0,1258 0,1324 0,1291 0,0047 3,6 0,1
JNJ26941226 0,1219 0,1216 0,1218 0,0002 0,2 -0,5
JNJ28572128 0,4223 0,4721 0,4472 0,0352 7,9 24,7
JNJ28850601 0,1514 0,1396 0,1455 0,0083 5,7 1,4
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициони-рованная среда 0,7423 0,7081 0,7252 0,0242 3,3 87,7
Без обработки 0,4936 0,5689 0,5313 0,0532 10,0 59,8
Только AA+DMSO 0,1433 0,1939 0,1686 0,0358 21,2 7,6
AA+Wnt3a+
DMSO
0,6808 0,9406 0,8107 0,1837 22,7 100,0
JNJ17994873 0,2447 0,1331 0,1889 0,0789 41,8 10,6
JNJ17994899 0,1537 0,1302 0,1420 0,0166 11,7 3,8
без клеток 0,1163 0,1147 0,1155 0,0011 1,0 0,0
JNJ17994912 0,2994 0,2592 0,2793 0,0284 10,2 23,6
JNJ17994925 0,1353 0,2121 0,1737 0,0543 31,3 8,4
JNJ180125 0,1267 0,1419 0,1343 0,0107 8,0 2,7
JNJ18014061 0,1376 0,1676 0,1526 0,0212 13,9 5,3
JNJ18014074 0,1134 0,1103 0,1119 0,0022 2,0 -0,5
JNJ18018338 0,1318 0,1478 0,1398 0,0113 8,1 3,5
JNJ18018351 0,2569 0,2124 0,2347 0,0315 13,4 17,1
JNJ18047991 0,2674 0,2636 0,2655 0,0027 1,0 21,6
JNJ18055726 0,4357 0,3467 0,3912 0,0629 16,1 39,7
JNJ18077800 0,1265 0,1588 0,1427 0,0228 16,0 3,9
JNJ18157074 0,1662 0,2521 0,2092 0,0607 29,0 13,5
JNJ18157087 0,1596 0,1566 0,1581 0,0021 1,3 6,1
JNJ18157646 0,2725 0,1636 0,2181 0,0770 35,3 14,8
JNJ18157711 1,2256 1,0636 1,1446 0,1146 10,0 148,0
JNJ18157711 0,1134 0,1070 0,1102 0,0045 4,1 -0,8
JNJ19363357 0,1469 0,1495 0,1482 0,0018 1,2 4,7
JNJ19369233 0,1169 0,1122 0,1146 0,0033 2,9 -0,1
JNJ19369246 0,1595 0,1422 0,1509 0,0122 8,1 5,1
JNJ19370026 1,0484 1,0749 1,0617 0,0187 1,8 136,1
JNJ19376240 0,3012 0,2347 0,2680 0,0470 17,5 21,9
JNJ19386042 0,1267 0,1510 0,1389 0,0172 12,4 3,4
JNJ19410833 1,1902 1,1487 1,1695 0,0293 2,5 151,6
JNJ19410859 0,6400 0,7076 0,6738 0,0478 7,1 80,3
JNJ19410872 0,1701 0,1752 0,1727 0,0036 2,1 8,2
JNJ19558929 0,3435 0,3488 0,3462 0,0037 1,1 33,2
JNJ19567314 0,4032 0,3548 0,3790 0,0342 9,0 37,9
JNJ19567327 0,1602 0,1502 0,1552 0,0071 4,6 5,7
JNJ19567340 0,1604 0,2079 0,1842 0,0336 18,2 9,9
JNJ19567405 0,1646 0,1592 0,1619 0,0038 2,4 6,7
JNJ19573541 0,1779 0,2273 0,2026 0,0349 17,2 12,5
JNJ19574867 0,1225 0,1443 0,1334 0,0154 11,6 2,6
JNJ19574880 0,1300 0,1291 0,1296 0,0006 0,5 2,0
JNJ20948798 0,1263 0,1336 0,1300 0,0052 4,0 2,1
JNJ21192730 0,2778 0,1326 0,2052 0,1027 50,0 12,9
JNJ21194667 0,2569 0,1219 0,1894 0,0955 50,4 10,6
JNJ21196227 0,1640 0,1158 0,1399 0,0341 24,4 3,5
JNJ24843611 1,1486 0,8970 1,0228 0,1779 17,4 130,5
JNJ24843611 0,1358 0,1201 0,1280 0,0111 8,7 1,8
JNJ24326185 0,1257 0,1257 0,1257 0,0000 0,0 1,5
JNJ24843572 0,4676 0,4803 0,4740 0,0090 1,9 51,6
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициони-рованная среда 0,6935 0,7803 0,7369 0,0614 8,3 104,8
Без обработки 0,4735 0,6069 0,5402 0,0943 17,5 71,5
Только AA+DMSO 0,1428 0,1656 0,1542 0,0161 10,5 6,3
AA+Wnt3a+
DMSO
0,5702 0,8468 0,7085 0,1956 27,6 100,0
JNJ24843585 0,1599 0,2380 0,1990 0,0552 27,8 13,8
JNJ25753520 0,1287 0,1244 0,1266 0,0030 2,4 1,6
без клеток 0,1241 0,1100 0,1171 0,0100 8,5 0,0
JNJ25753403 0,1235 0,1152 0,1194 0,0059 4,9 0,4
JNJ25757173 0,1199 0,1278 0,1239 0,0056 4,5 1,1
JNJ25757173 0,1174 0,1162 0,1168 0,0008 0,7 -0,1
JNJ25757238 1,1100 0,9464 1,0282 0,1157 11,3 154,1
JNJ25758707 0,1247 0,1115 0,1181 0,0093 7,9 0,2
JNJ25758785 0,2640 0,1688 0,2164 0,0673 31,1 16,8
JNJ25758850 0,2313 0,1307 0,1810 0,0711 39,3 10,8
JNJ25758863 0,8639 0,9218 0,8929 0,0409 4,6 131,2
JNJ25873419 0,2540 0,2320 0,2430 0,0156 6,4 21,3
JNJ25887537 0,1809 0,3077 0,2443 0,0897 36,7 21,5
JNJ25900641 0,1892 0,1872 0,1882 0,0014 0,8 12,0
JNJ25900654 0,1967 0,2492 0,2230 0,0371 16,7 17,9
JNJ25900706 0,3346 0,1619 0,2483 0,1221 49,2 22,2
JNJ26047723 0,1106 0,1138 0,1122 0,0023 2,0 -0,8
JNJ26054912 0,1224 0,1445 0,1335 0,0156 11,7 2,8
JNJ26064571 0,1312 0,1270 0,1291 0,0030 2,3 2,0
JNJ26067626 0,1653 0,2114 0,1884 0,0326 17,3 12,0
JNJ26067652 0,1732 0,1467 0,1600 0,0187 11,7 7,2
JNJ26069901 0,1618 0,2754 0,2186 0,0803 36,7 17,2
JNJ26077883 1,0006 0,9631 0,9819 0,0265 2,7 146,2
JNJ26116922 0,6472 0,4319 0,5396 0,1522 28,2 71,4
JNJ26120601 0,1539 0,1469 0,1504 0,0049 3,3 5,6
JNJ26120614 0,1127 0,1309 0,1218 0,0129 10,6 0,8
JNJ26128726 0,6887 0,5860 0,6374 0,0726 11,4 88,0
JNJ26130403 0,1141 0,1094 0,1118 0,0033 3,0 -0,9
JNJ26134771 0,2774 0,1690 0,2232 0,0767 34,3 17,9
JNJ26150202 0,9482 1,1150 1,0316 0,1179 11,4 154,6
JNJ26153647 0,7687 0,6804 0,7246 0,0624 8,6 102,7
JNJ26158015 0,7125 0,3347 0,5236 0,2671 51,0 68,7
JNJ26158054 0,1446 0,1221 0,1334 0,0159 11,9 2,7
JNJ26158093 1,0968 1,3108 1,2038 0,1513 12,6 183,8
JNJ26158106 0,3167 0,3415 0,3291 0,0175 5,3 35,8
JNJ26161343 0,1261 0,1144 0,1203 0,0083 6,9 0,5
JNJ26170794 0,2223 0,2930 0,2577 0,0500 19,4 23,8
JNJ26170820 0,1265 0,1236 0,1251 0,0021 1,6 1,3
JNJ26170833 1,1940 0,9431 1,0686 0,1774 16,6 160,9
JNJ26177086 1,0689 0,6879 0,8784 0,2694 30,7 128,7
JNJ26177762 1,0444 0,7603 0,9024 0,2009 22,3 132,8
JNJ26184457 0,1443 0,1209 0,1326 0,0165 12,5 2,6
JNJ26219050 0,1152 0,1309 0,1231 0,0111 9,0 1,0
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеква-дратическое отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициони-рованная среда 0,7590 0,7451 0,7521 0,0098 1,3 98,0
Без обработки 0,5687 0,4490 0,5089 0,0846 16,6 60,4
Только AA+DMSO 0,1988 0,1522 0,1755 0,0330 18,8 8,9
AA+Wnt3a+
DMSO
0,6837 0,8460 0,7649 0,1148 15,0 100,0
JNJ26219063 0,1911 0,1101 0,1506 0,0573 38,0 5,0
JNJ26220454 0,2772 0,1151 0,1962 0,1146 58,4 12,1
без клеток 0,1278 0,1084 0,1181 0,0137 11,6 0,0
JNJ26241774 0,1443 0,2120 0,1782 0,0479 26,9 9,3
JNJ26241917 0,4413 0,2238 0,3326 0,1538 46,2 33,2
JNJ26243204 0,1098 0,1085 0,1092 0,0009 0,8 -1,4
JNJ26247143 0,1389 0,2147 0,1768 0,0536 30,3 9,1
JNJ26248729 0,1852 0,1342 0,1597 0,0361 22,6 6,4
JNJ26261105 0,1114 0,1295 0,1205 0,0128 10,6 0,4
JNJ26361712 0,5375 0,6158 0,5767 0,0554 9,6 70,9
JNJ26361725 0,1259 0,1441 0,1350 0,0129 9,5 2,6
JNJ26366730 0,1206 0,1312 0,1259 0,0075 6,0 1,2
JNJ26367991 0,2269 0,2857 0,2563 0,0416 16,2 21,4
JNJ26367991 0,1140 0,1079 0,1110 0,0043 3,9 -1,1
JNJ26399906 0,9589 0,8868 0,9229 0,0510 5,5 124,4
JNJ26399906 1,0442 0,9622 1,0032 0,0580 5,8 136,8
JNJ26399945 0,1961 0,1735 0,1848 0,0160 8,6 10,3
JNJ26399971 0,5732 0,5216 0,5474 0,0365 6,7 66,4
JNJ26399984 0,1273 0,1217 0,1245 0,0040 3,2 1,0
JNJ26399997 0,5932 0,6671 0,6302 0,0523 8,3 79,2
JNJ26400049 0,1444 0,1368 0,1406 0,0054 3,8 3,5
JNJ26483197 1,0786 1,0891 1,0839 0,0074 0,7 149,3
JNJ26483310 0,5418 0,2338 0,3878 0,2178 56,2 41,7
JNJ26483223 0,1268 0,2052 0,1660 0,0554 33,4 7,4
JNJ26483236 0,1169 0,1184 0,1177 0,0011 0,9 -0,1
JNJ26483249 0,8618 1,0400 0,9509 0,1260 13,3 128,8
JNJ26483249 0,8430 1,0187 0,9309 0,1242 13,3 125,7
JNJ26483262 0,3659 0,3168 0,3414 0,0347 10,2 34,5
JNJ26511901 0,9184 0,8116 0,8650 0,0755 8,7 115,5
JNJ26511927 0,2384 0,3156 0,2770 0,0546 19,7 24,6
JNJ26511953 0,2297 0,1469 0,1883 0,0585 31,1 10,9
RWJ67694 0,1955 0,1256 0,1606 0,0494 30,8 6,6
RWJ676940 0,1658 0,1704 0,1681 0,0033 1,9 7,7
RWJ677545 0,1399 0,1303 0,1351 0,0068 5,0 2,6
RWJ678986 0,1234 0,1236 0,1235 0,0001 0,1 0,8
RWJ680665 0,1397 0,2147 0,1772 0,0530 29,9 9,1
RWJ680667 0,1218 0,1310 0,1264 0,0065 5,1 1,3
RWJ680668 0,1456 0,1981 0,1719 0,0371 21,6 8,3
RWJ680669 0,5412 0,1898 0,3655 0,2485 68,0 38,2
RWJ680858 0,1996 0,1245 0,1621 0,0531 32,8 6,8
RWJ680858 0,1418 0,2014 0,1716 0,0421 24,6 8,3
RWJ680879 0,1106 0,1197 0,1152 0,0064 5,6 -0,5
RWJ680885 0,1159 0,1272 0,1216 0,0080 6,6 0,5
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеквад-ратическое отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициониро-ванная среда 0,8077 0,7210 0,7644 0,0613 8,0 74,7
без обработки+DMSO 0,4638 0,4073 0,4356 0,0400 9,2 36,7
AA/Wnt3a 0,8466 0,9935 0,9830 0,2592 26,4 100,0
JNJ10222784 0,8095 0,9055 0,8575 0,0679 7,9 85,5
JNJ10222927 0,3519 0,4708 0,4114 0,0841 20,4 33,9
JNJ10231273 0,1609 0,1275 0,1442 0,0236 16,4 3,1
JNJ10259847 0,5020 0,2733 0,3877 0,1617 41,7 31,2
JNJ10259847 0,3413 0,4146 0,3780 0,0518 13,7 30,1
JNJ17154215 0,1176 0,1174 0,1175 0,0001 0,1 0,0
JNJ17154215 0,1148 0,1410 0,1279 0,0185 14,5 1,2
JNJ17157659 0,2394 0,2450 0,2422 0,0040 1,6 14,4
JNJ17163042 0,3672 0,3098 0,3385 0,0406 12,0 25,5
JNJ10166565 0,2722 0,1593 0,2158 0,0798 37,0 11,3
JNJ17174664 0,5079 0,4349 0,4714 0,0516 11,0 40,9
JNJ17187027 0,1076 0,1168 0,1122 0,0065 5,8 -0,6
JNJ17187053 0,2569 0,2151 0,2360 0,0296 12,5 13,7
JNJ17193774 0,2846 0,4376 0,3611 0,1082 30,0 28,1
JNJ17200976 0,1168 0,1136 0,1152 0,0023 2,0 -0,3
JNJ17205955 0,1168 0,1152 0,1160 0,0011 1,0 -0,2
JNJ17205955 0,1137 0,1195 0,1166 0,0041 3,5 -0,1
JNJ17205994 0,1154 0,1152 0,1153 0,0001 0,1 -0,3
JNJ17226703 0,2188 0,2353 0,2271 0,0117 5,1 12,6
JNJ17982133 0,4588 0,2521 0,3555 0,1462 41,1 27,5
JNJ17989049 0,3081 0,1961 0,2521 0,0792 31,4 15,5
JNJ № Исходные данные Среднее значение Среднеквадратическое отклонение Коэффициент вариации, % % контрольного образца
Кондициониро-ванная среда 0,7914 1,1189 0,9552 0,2316 24,2 93,3
Без обработки 0,4215 0,5259 0,4737 0,0738 15,6 39,8
без клеток 0,1152 0,1160 0,1156 0,0006 0,5 0,0
AA/Wnt3a 0,7168 0,8836 1,0151 0,2016 19,9 100,0
RWJ680991 0,2882 0,2308 0,2844 0,0499 17,6 18,8
RWJ680992 0,3049 0,2845 0,3127 0,0282 9,0 21,9
RWJ680993 0,5403 0,2570 0,3855 0,1332 34,6 30,0
RWJ681140 0,7323 0,3034 0,4388 0,2041 46,5 35,9
RWJ681142 0,1185 0,1216 0,1199 0,0018 1,5 0,5
RWJ681146 0,2496 0,2683 0,2302 0,0376 16,3 12,7
RWJ681945 0,1548 0,1356 0,1513 0,0134 8,8 4,0
RWJ68198 0,1555 0,1450 0,1581 0,0161 10,2 4,7
RWJ682205 0,2347 0,1920 0,3785 0,2589 68,4 29,2
RWJ447228 0,1842 0,2093 0,3793 0,2585 68,2 29,3
RWJ675430 0,7223 0,8707 0,4291 0,2452 57,2 34,8
RWJ355923 0,6268 0,3192 0,3354 0,1667 49,7 24,4
Таблица VII
Эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека
Сильно положительные результаты Умеренно положительные результаты
>=120% контрольного образца 60-120% контрольного образца
JNJ № % контрольного значения JNJ № % контрольного значения
RWJ352628 195,3 JNJ26511901 115,5
JNJ26158093 183,8 RWJ676431 113,8
RWJ353258 180,4 RWJ673515 108,3
JNJ26170833 160,9 JNJ26533156 105,5
JNJ26150202 154,6 JNJ26153647 102,7
JNJ25757238 154,1 RWJ676639 93,0
JNJ19410833 151,6 JNJ26128726 88,0
JNJ26483197 149,3 JNJ10222784 85,5
JNJ18157711 148,0 RWJ67657 84,7
RWJ676139 147,3 JNJ26512005 84,0
JNJ26077883 146,2 JNJ19410859 80,3
RWJ352190 142,3 JNJ26399997 79,2
JNJ26399906 136,8 RWJ676137 77,5
JNJ19370026 136,1 RWJ675260 76,9
JNJ26177762 132,8 RWJ355923 76,7
RWJ676432 131,6 RWJ675266 75,2
JNJ25758863 131,2 JNJ26116922 71,4
RWJ675430 130,9 JNJ26361712 70,9
JNJ24843611 130,5 RWJ670804 70,7
RWJ675605 129,0 RWJ675881 69,9
JNJ26483249 128,8 JNJ26158015 68,7
JNJ26177086 128,7 RWJ352244 68,2
JNJ26483249 125,7 RWJ674239 67,4
JNJ26399906 124,4 JNJ26399971 66,4
RWJ675948 120,0 JNJ26714194 63,3
JNJ26533065 61,1
Таблица VIII
Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека линии H1
Концентра-ция JNJ10220067 JNJ17163796 JNJ17189731 JNJ17223375 JNJ18157698
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число
клеток
SD Число клеток SD Число
клеток
SD
10 1,006 0,051 0,039 0,049 0,193 0,147 1,280 0,014 1,049 0,062
5 1,058 0,047 1,164 0,018 0,889 0,035 1,348 0,007 1,104 0,014
2,5 1,031 0,054 1,022 0,023 0,896 0,035 1,318 0,028 0,932 0,087
1,25 0,899 0,040 1,121 0,023 1,120 0,072 1,159 0,041 1,006 0,023
0,625 0,742 0,095 1,092 0,044 1,107 0,093 1,029 0,018 0,832 0,026
0,313 0,754 0,010 0,931 0,056 1,132 0,018 1,018 0,044 0,742 0,127
0,156 0,822 0,074 0,804 0,002 1,082 0,041 0,776 0,054 0,712 0,020
Концентра-ция JNJ26158015 JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871 JNJ17228458
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число
клеток
SD
10 0,001 0,001 0,096 0,103 0,058 0,074 0,290 0,307 0,000 0,000
5 0,034 0,035 0,262 0,268 0,173 0,207 0,458 0,263 0,089 0,067
2,5 0,566 0,461 0,592 0,019 0,428 0,326 0,640 0,104 0,438 0,050
1,25 0,897 0,103 1,124 0,101 0,850 0,238 0,739 0,129 0,636 0,016
0,625 0,921 0,122 1,106 0,056 0,910 0,061 0,805 0,036 0,736 0,025
0,313 1,028 0,069 0,888 0,213 0,868 0,131 0,785 0,094 0,791 0,038
0,156 1,027 0,067 0,890 0,079 0,742 0,051 0,774 0,027 0,832 0,005
Концентра-ция JNJ19370026 JNJ26150202 JNJ26170833 JNJ26177086 JNJ26177762
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число
клеток
SD
10 0,000 0,000 0,496 0,690 0,129 0,170 0,412 0,081 0,996 0,246
5 0,024 0,034 0,768 0,490 0,530 0,080 1,128 0,026 0,908 0,179
2,5 1,097 0,294 1,001 0,129 1,174 0,016 1,031 0,217 1,005 0,086
1,25 1,446 0,076 1,158 0,043 1,113 0,057 0,914 0,100 1,200 0,085
0,625 1,296 0,183 0,699 0,248 1,188 0,041 0,801 0,136 1,111 0,300
0,313 1,034 0,197 0,617 0,232 1,158 0,102 0,785 0,121 0,959 0,094
0,156 0,826 0,030 0,812 0,120 0,974 0,065 0,659 0,068 0,912 0,059
Концентра-ция JNJ26512005 JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ26714194 JNJ3026582
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число
клеток
SD
10 0,000 0,000 0,021 0,027 0,002 0,002 0,052 0,067 0,053 0,024
5 0,000 0,000 0,339 0,254 1,011 0,499 1,161 0,134 0,905 0,036
2,5 0,192 0,233 1,350 0,170 1,724 0,042 1,293 0,020 1,019 0,015
1,25 0,552 0,458 1,277 0,101 1,652 0,032 1,213 0,087 1,163 0,062
0,625 0,895 0,054 0,713 0,151 1,357 0,023 1,025 0,045 1,231 0,152
0,313 0,734 0,075 0,665 0,207 1,213 0,177 1,241 0,031 1,216 0,007
0,156 0,594 0,078 0,469 0,465 1,206 0,142 1,041 0,007 1,103 0,065
Таблица IX
Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека линии H1
Концентрация JNJ10220067 JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375 JNJ18157698
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность
Sox17
SD
10 0,889 0,144 0,029 0,034 0,140 0,095 1,183 0,044 0,969 0,040
5 1,004 0,021 0,824 0,035 0,785 0,077 1,171 0,010 1,013 0,002
2,5 1,023 0,092 0,849 0,003 0,842 0,032 1,169 0,031 0,838 0,068
1,25 0,954 0,100 0,985 0,082 1,028 0,043 1,106 0,006 0,940 0,071
0,625 0,793 0,135 0,986 0,059 1,016 0,000 0,931 0,033 0,767 0,014
0,313 0,803 0,048 0,916 0,028 1,058 0,017 0,943 0,056 0,692 0,167
0,156 0,941 0,106 0,822 0,036 1,039 0,015 0,789 0,074 0,651 0,032
Концентрация JNJ26158015 JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871 JNJ17228458
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD
10 0,001 0,001 0,034 0,027 0,054 0,063 0,267 0,280 0,000 0,001
5 0,017 0,020 0,071 0,054 0,141 0,169 0,402 0,229 0,056 0,035
2,5 0,200 0,157 0,497 0,076 0,373 0,326 0,605 0,041 0,286 0,034
1,25 0,792 0,066 0,993 0,144 0,783 0,282 0,686 0,185 0,587 0,023
0,625 0,624 0,118 1,061 0,066 0,887 0,062 0,786 0,061 0,695 0,001
0,313 0,934 0,127 0,937 0,136 0,859 0,176 0,780 0,132 0,753 0,098
0,156 0,986 0,055 0,888 0,062 0,666 0,015 0,782 0,061 0,816 0,043
Концентрация JNJ19370026 JNJ26150202 JNJ26170833 JNJ2G177086 JNJ26177762
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD
10 0,000 0,000 0,491 0,681 0,281 0,358 0,330 0,059 0,701 0,307
5 0,035 0,049 0,158 0,224 0,460 0,189 0,846 0,036 0,728 0,146
2,5 1,336 0,192 0,800 0,201 1,018 0,139 0,887 0,191 0,928 0,019
1,25 1,238 0,030 0,910 0,045 0,960 0,106 0,819 0,179 1,159 0,093
0,625 0,997 0,095 0,567 0,190 1,050 0,038 0,755 0,126 1,136 0,186
0,313 0,791 0,172 0,515 0,276 1,032 0,063 0,667 0,125 1,006 0,009
0,156 0,669 0,037 0,708 0,148 0,950 0,087 0,628 0,053 0,922 0,096
Концентрация JNJ26512005 JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194 JNJ302G582
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD
10 0,000 0,000 0,018 0,021 0,002 0,001 0,054 0,062 0,074 0,048
5 0,000 0,000 0,235 0,174 1,052 0,281 1,250 0,177 1,006 0,070
2,5 0,270 0,382 1,153 0,223 1,459 0,074 1,186 0,069 1,120 0,038
1,25 0,678 0,434 1,055 0,046 1,322 0,078 1,112 0,038 1,122 0,009
0,625 0,978 0,021 0,569 0,124 1,173 0,015 0,913 0,005 1,241 0,230
0,313 0,742 0,048 0,555 0,118 1,102 0,165 1,140 0,036 1,231 0,012
0,156 0,508 0,049 0,451 0,443 1,060 0,126 0,998 0,006 1,034 0,008
Таблица X
Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток человека линии H9
Концентрация JNJ10220067 JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375 JNJ18157698
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD
10 0,164 0,209 0,001 0,000 0,049 0,028 0,123 0,106 0,770 0,077
5 0,147 0,141 0,616 0,497 0,583 0,155 0,954 0,146 0,496 0,011
2,5 0,140 0,112 1,295 0,402 1,108 0,170 0,795 0,101 0,384 0,247
1,25 0,307 0,198 1,233 0,058 1,195 0,147 0,541 0,851 0,395 0,002
0,625 0,138 0,071 0,606 0,121 1,108 0,014 0,332 0,849 0,221 0,009
0,313 0,063 0,008 0,397 0,020 0,887 0,078 0,206 0,085 0,172 0,071
0,156 0,069 0,001 0,214 0,025 0,699 0,109 0,142 0,039 0,138 0,048
Концентрация JNJ26158015 JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871 JNJ17228458
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD
10 0,001 0,000 0,785 0,192 0,208 0,134 0,377 0,040 0,000 0,000
5 0,023 0,024 1,067 0,236 0,320 0,087 0,336 0,081 0,052 0,009
2,5 0,681 0,223 1,368 0,025 0,388 0,019 0,296 0,016 0,089 0,003
1,25 1,011 0,461 1,477 0,147 0,334 0,113 0,222 0,035 0,106 0,003
0,625 0,927 0,108 0,899 0,108 0,267 0,148 0,282 0,096 0,169 0,041
0,313 0,686 0,022 0,540 0,094 0,192 0,056 0,208 0,003 0,119 0,026
0,156 0,458 0,001 0,206 0,089 0,147 0,067 0,174 0,051 0,067 0,015
Концентрация JNJ19370026 JNJ26150202 JNJ26170B33 JNJ26177086 JNJ26177762
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD
10 0,000 0,000 0,452 0,094 0,002 0,001 1,117 0,043 1,022 0,422
5 0,002 0,000 0,433 0,050 1,325 0,015 0,793 0,030 1,281 0,109
2,5 0,668 0,059 0,521 0,229 1,355 0,026 0,600 0,122 1,197 0,068
1,25 0,988 0,032 0,293 0,038 1,182 0,076 0,442 0,018 1,039 0,213
0,625 0,390 0,032 0,200 0,122 0,928 0,127 0,371 0,072 0,686 0,014
0,313 0,250 0,090 0,072 0,025 0,772 0,050 0,100 0,015 0,437 0,066
0,156 0,095 0,020 0,057 0,044 0,336 0,056 0,072 0,015 0,276 0,043
Концентрация JNJ26512005 JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194 JNJ3026582
[мкМ] Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD Число клеток SD
10 0,007 0,002 0,000 0,000 0,000 0,000 0,044 0,038 0,004 0,001
5 0,002 0,001 0,127 0,069 0,415 0,023 0,382 0,110 0,017 0,003
2,5 0,001 0,001 0,151 0,059 0,425 0,082 0,345 0,001 0,033 0,037
1,25 0,090 0,097 0,108 0,051 0,325 0,042 0,284 0,076 0,044 0,028
0,625 0,248 0,058 0,230 0,168 0,314 0,062 0,266 0,021 0,100 0,099
0,313 0,264 0,048 0,086 0,033 0,267 0,098 0,347 0,084 0,057 0,032
0,156 0,133 0,069 0,063 0,004 0,218 0,012 0,192 0,014 0,070 0,048
Таблица XI
Зависящие от дозы эффекты ингибиторов активности фермента GSK-3B на дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека линии H9
Концентрация JNJ10220067 JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375 JNJ18157698
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD
0,157 0,051 0,003 0,132 0,003 0,678 0,093 0,116 0,047 0,095 0,025
0,313 0,052 0,008 0,311 0,005 0,951 0,010 0,155 0,071 0,110 0,030
0,625 0,103 0,058 0,453 0,076 1,160 0,013 0,277 0,061 0,154 0,013
1,25 0,312 0,255 1,012 0,051 1,042 0,134 0,459 0,066 0,317 0,062
2,5 0,100 0,062 0,986 0,269 0,869 0,158 0,726 0,079 0,297 0,235
5 0,105 0,089 0,480 0,423 0,432 0,111 1,114 0,066 0,353 0,080
10 0,121 0,141 0,002 0,002 0,022 0,005 0,140 0,110 0,694 0,123
Концентрация JNJ26158015 JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871 JNJ17228458
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD
0,157 0,364 0,044 0,149 0,058 0,125 0,051 0,132 0,063 0,039 0,010
0,313 0,577 0,062 0,398 0,166 0,129 0,018 0,146 0,005 0,070 0,027
0,625 0,985 0,072 0,678 0,197 0,212 0,134 0,196 0,084 0,137 0,049
1,25 0,943 0,419 1,110 0,042 0,202 0,103 0,129 0,029 0,075 0,017
2,5 0,559 0,238 0,857 0,012 0,209 0,045 0,177 0,030 0,053 0,005
5 0,019 0,019 0,194 0,007 0,154 0,023 0,174 0,070 0,038 0,001
10 0,001 0,001 0,129 0,037 0,129 0,067 0,200 0,022 0,000 0,000
Концентрация JNJ19370026 JNJ26150202 JNJ26170B33 JNJ26177086 JNJ26177762
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD
0,157 0,074 0,024 0,040 0,030 0,291 0,086 0,054 0,014 0,186 0,040
0,313 0,170 0,046 0,051 0,016 0,746 0,088 0,080 0,006 0,342 0,068
0,625 0,246 0,036 0,150 0,095 0,941 0,111 0,268 0,050 0,563 0,019
1,25 0,981 0,075 0,155 0,010 1,119 0,045 0,332 0,006 0,936 0,186
2,5 0,914 0,038 0,408 0,279 1,305 0,066 0,432 0,154 1,146 0,137
5 0,001 0,001 0,251 0,092 1,185 0,012 0,543 0,004 1,127 0,121
10 0,000 0,000 0,262 0,068 0,000 0,000 0,822 0,024 0,759 0,328
Концентрация JNJ26512005 JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194 JNJ3026582
[мкМ] Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD Интенсивность Sox17 SD
0,157 0,085 0,041 0,049 0,011 0,173 0,009 0,146 0,041 0,059 0,051
0,313 0,240 0,030 0,068 0,010 0,203 0,061 0,282 0,135 0,054 0,040
0,625 0,165 0,043 0,222 0,201 0,220 0,070 0,202 0,013 0,073 0,066
1,25 0,114 0,134 0,076 0,034 0,202 0,002 0,165 0,030 0,053 0,035
2,5 0,001 0,001 0,120 0,066 0,299 0,019 0,205 0,002 0,042 0,049
5 0,001 0,001 0,087 0,036 0,300 0,095 0,234 0,078 0,016 0,001
10 0,009 0,003 0,000 0,000 0,000 0,000 0,042 0,028 0,004 0,003

1. Способ размножения и дифференцирования плюрипотентных клеток, представляющих клеточную линию человека, включающий стадии:
a. культивирования плюрипотентных клеток, и
b. обработки плюрипотентных клеток ингибитором активности фермента GSK-3B, где указанный ингибитор представляет собой 3-[1-(2-гидроксиэтил)-1H-индол-3-ил]-4-(1-пиридин-3-ил-1H-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион.

2. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки представляют собой клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток.

3. Способ по п.2, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют по меньшей мере один из маркеров, выбранных из группы, состоящей из: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tral-60 и Tral-81.

4. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.

5. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от 1 до 72 часов.

6. Способ по п.1, в котором плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение от 12 до 48 часов.

7. Способ по п.1, где плюрипотентные клетки обрабатываются ингибитором активности фермента GSK-3B в течение 48 часов.

8. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации от 100 нМ до 100 мкМ.

9. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации от 1 мкМ до 10 мкМ.

10. Способ по п.1, в котором ингибитор GSK-3B используется в концентрации 10 мкМ.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области генетической инженерии, тканевых технологий и медицины. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных линий стволовых клеток человека включает получение эмбриоидных телец из плюрипотентных стволовых клеток человека, прикрепление эмбриоидных телец к чашке Петри для индукции спонтанной дифференцировки эмбриоидных телец в мезенхимальные стволовые клетки, культивирование с пролиферацией мезенхимальных стволовых клеток при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток, и где индукция спонтанной дифференцировки стадии происходит путем формирования петель аутологичного цитокина без добавления внешнего цитокина, также соответствующие клетки, их применение, набор и способ культивирования.
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) клетками костного мозга, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста.
Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использована для восстановления кожного покрова с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей.
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Предложен способ повышения иммуносупрессивных свойств мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, включающий культивирование мезенхимальных стромальных клеток человека в среде DMEM/F12, содержащей 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки, в присутствии провоспалительных факторов TNF-α в концентрации 20 нг/мл и IFN-γ в концентрации 30 нг/мл, характеризующийся тем, что культивирование проводят в атмосфере, состоящей из 5% CO2 и 95% воздуха, при температуре 37°С в течение 48 часов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к лизостафину. Предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к лизостафину, ингибирующих его литическую активность и пригодных для его количественного определения.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипатентных мезенхимальных клеток (ММСК), включающий культивирование ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани до достижения монослоя при концентрации O2 в среде 5%, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 часов при концентрации O2 в среде 5%, отбор неприкрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации O2 в среде 5%.

Группа изобретений относится к области лекарственных средств и контроля их воздействия. Устройство для определения кардиотоксичности химического соединения содержит подложку (10), несущую деформируемый блок (34), причем блок (34) частично отделен от подложки полостью (32), обеспечивающей внеплоскостную деформацию блока.

Группа изобретений относится к области медицины и касается способов создания зуба, обладающего требуемым размером, и восстановления утраченной части зубов ротовой полости путем трансплантации созданного зуба в область утраты зубов.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложена композиция, содержащая стволовые клетки из амниотической жидкости человека с фенотипом CD73+/CD90+/CD105+/CK19+, питательную среду, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и коллаген, взятые в эффективном количестве.

Изобретение относится к области генетической инженерии, тканевых технологий и медицины. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных линий стволовых клеток человека включает получение эмбриоидных телец из плюрипотентных стволовых клеток человека, прикрепление эмбриоидных телец к чашке Петри для индукции спонтанной дифференцировки эмбриоидных телец в мезенхимальные стволовые клетки, культивирование с пролиферацией мезенхимальных стволовых клеток при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток, и где индукция спонтанной дифференцировки стадии происходит путем формирования петель аутологичного цитокина без добавления внешнего цитокина, также соответствующие клетки, их применение, набор и способ культивирования.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипатентных мезенхимальных клеток (ММСК), включающий культивирование ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани до достижения монослоя при концентрации O2 в среде 5%, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 часов при концентрации O2 в среде 5%, отбор неприкрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации O2 в среде 5%.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложена композиция, содержащая стволовые клетки из амниотической жидкости человека с фенотипом CD73+/CD90+/CD105+/CK19+, питательную среду, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и коллаген, взятые в эффективном количестве.
Изобретение относится к области медицины и клеточных технологий. Предложен клеточный продукт, содержащий популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, характеризующихся фенотипом CD49f+/EpCAM+ и после обработки вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивирования в коллагеновом геле меняющих профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретающих способность синтезировать мочевину и альбумин.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии. Описан способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего, экспрессирующих поверхностные маркеры c-kit, и/или sca-1, и/или MDR1, в ходе которого выделяют образцы ткани миокарда, измельчают их, обрабатывают коллагеназой и трипсином, проводят культивирование на культуральной чашке с покрытием из фибронектина методом эксплантной культуры измельченных образцов с последующей иммуноселекцией.

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины. Предложен N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, позволяющий стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов, а также способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов N-концевым фрагментом растворимого супрессора иммунного ответа с Seq ID NО: 1, при введении его в концентрации 0,1-50 мкг/мл.

Изобретение относится к области медицины, более конкретно - тканевой и клеточной трансплантологии, экспериментальной медицине и биологии развития человека. Изобретение включает разработанные прописи сред для культивирования фибробластов человека в присутствие малой (2%) концентрации сыворотки ксеногенного, аллогенного и аутогенного (аутологичного) происхождения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. .
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической гематологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточным технологиям и тканевой хирургии. Способ получения культуры гладкомышечных клеток заключается в том, что вырезают фрагмент кровеносного сосуда, измельчают его на кусочки до размеров не более 2 мм в любом измерении и инкубируют кусочки в культуральном флаконе с предварительно нанесенными на дно флакона царапинами, содержащем среду для культивирования, содержащую 10% эмбриональной фетальной сыворотки, в течение по меньшей мере 10 дней, но не более 24 дней, при температуре 37°С в условиях СО2-инкубатора, отличающийся тем, что упомянутым фрагментом кровеносного сосуда является фрагмент восходящего отдела грудной аорты, вырезаемый в ходе процедуры аортокоронарного шунтирования, а упомянутые кусочки фрагмента восходящего отдела грудной аорты перед инкубированием выдерживают в среде для культивирования, содержащей 0,1% коллагеназы, в течение по меньшей мере 30 минут, но не более 60 минут, при температуре 37°С, после чего промывают средой для культивирования клеток. Изобретение позволяет получить клетки из тканей аорты для целей трансплантологии непосредственно из прижизненных тканей пациента. 3 ил.
Наверх