Штамм бактерий halobacterium salinarum - продуцент бактериородопсина

Авторы патента:

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

Владельцы патента RU 2558230:

Тюрин Сергей Ананьевич (RU)
Погорелов Олег Вадимович (RU)

Получен штамм бактерий Halobacterium salinarum D96N ВКПМ В-11953 - продуцент бактериородопсина, значительно превосходящий по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) как ближайший аналог, так и другие, выбранные в качестве контролей штаммы в различных условиях культивирования. 3 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается получения белка, бактериородопсина, путем микробиологического синтеза.

Область возможного применения бактериородопсина поразительна по своему разнообразию. Она включает двухстороннюю голографическую память, ультрабыстрое оперативное запоминающее устройство, пространственную модуляцию света, нелинейные оптические фильтры, распознавательные системы, высококонтрастные дисплеи, оптические переключатели и пикосекундные детекторы. Бактериородопсин находит применение в производстве материалов, которые предохраняют ценные бумаги от подделок, а также в качестве антиоксиданта в медицине, фармацевтике, косметологии и сельском хозяйстве в качестве стимулятора роста растений [1].

Самым изученным и приближенным к практическому использованию является бактериородопсин - ретинальсодержащий трансмембранный белок пурпурных мембран галофильных бактерий рода Halobacterium [2].

Известен штамм Halobacterium salinarum D96N (ВКПМ В-9026) [5-13]. Он синтезирует бактериородопсин в количестве до 47 мг/л (2,3 мкмоль/л) культуральной жидкости и выбран нами в качестве родительского штамма [3].

Известен штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 - продуцент бактериородопсина, выбранный нами в качестве прототипа, значительно превосходящий по продуктивности бактериородопсина штаммы бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 и Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 [4].

Задача заявляемого изобретения - получить штамм Halobacterium salinarum с повышенным уровнем синтеза бактериородопсина.

Задача решена путем получения штамма бактерий Halobacterium salinarum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953.

Заявляемый штамм получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum D96N ВКПМ В-9026, без предварительной обработки химическими реагентами.

Штамм ВКПМ В-11953 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические признаки.

Величина клеток трехсуточной культуры 2-5×0,5-0,9 мкм, одиночные палочки, иногда объединены по 2-3 палочки.

Подвижен, максимум подвижности на 4 сутки роста. Спор не образует, газовых вакуолей не содержит.

Колонии полупрозрачные, гладкие с гладким краем, темно-красного цвета, в среду не врастают, легко снимаются петлей. Культура является экстремальным галофилом - требует присутствия в среде 25% NaCl. При содержании хлористого натрия ниже 20% клетки теряют свою окраску, а при попадании в среду с содержанием NaCl менее 15% клетки очень быстро лизируются.

Хорошо растет при 36-40°С, в солевой жидкой среде, имеющей состав (мас. %.): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, СаСl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4. а также солевой агаризованной среде, имеющей состав (мас. %.): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, СаСl₂ - 0,02, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4.

Отношение к температуре: хорошо растет при 36-40°С, оптимальная температура 38°С.

Отношение к рН среды: хорошо растет при 7,2-7,4, оптимум рН 7,3.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный аэроб, прототроф, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не подкисляет, не растет на картофеле. Желатину не разжижает. Антагонистических свойств не обнаружено.

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16 S рРНК, штамм наиболее близок к видам Halobacterium salinarum (98%).

Как и все представители рода Halobacterium заявляемый штамм непатогенен и может быть отнесен к группе безопасности №1 (на основании заключения Коллекции АТСС). Работа с ним не требует специальных мер предосторожности.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Хранение штамма: Хорошо хранится на агаризованной среде в бакпечатках и на косяках в условиях холодильника в течение года. Для длительного хранения штамма используется лиофилизация свежей биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в колбах

Заявляемый штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 300 мл при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», Germany) до стационарной стадии роста (6 суток) на круговой качалке при 37°С и встряхивании 100 об/мин. Для выращивания использовали среду следующего состава (мас. %): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, СаСl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4.

Осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и взвешивали полученную биомассу.

Затем к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, и инкубировали при встряхивании в условиях комнатной температуры в течение 3 часов.

Осадок отделяли центрифугированием, супернатант использовали для определения количества бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

С=D·M_r·V_p-pa·V_кюв./Е_бр·V_пробы

где D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм;

М_r - молекулярная масса бактериородопсина (26700);

V_p-pa - общий объем раствора бактериородопсина;

V_кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете;

E_бр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М^-1·см^-1);

V_пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1
Исследуемые штаммы	Вес биомассы (г/л)	Концентрация бактериородопсина (мг/л)
ВКПМ В-11953	17	55
ВКПМ В-9026	4	20
ВКПМ В-10425	10	35

Из приведенных в таблице 1 результатов видно, что заявляемый штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 по количеству биомассы и по концентрации бактериородопсина в культуральной среде.

ПРИМЕР 2. Продуктивность штамма Halobacterium sulinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в плоской кювете

Заявляемый штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 выращивали в плоских кюветах объемом 15 л с заполнением 10 литров при освещении люминесцентными лампами дневного света, непрерывной подачи воздуха в кюветы (скорость подачи воздуха 1,5 л/мин) для аэрации и перемешивания до стационарной стадии роста в среде выращивания как в примере 1.

Далее осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, инкубировали и определяли содержание бактериородопсина как в примере 1.

Данные, представленные в таблице 2, позволяют сделать вывод, что и при выращивании в плоских кюветах заявляемый штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 по концентрации бактериородопсина в культуральной среде и биомассе выращенной культуры.

Таблица 2
Исследуемые штаммы	Вес биомассы (г/л)	Концентрация бактериородопсина (мг/л)
ВКПМ В-11953	30	91
ВКПМ В-9026	13	33
ВКПМ В-10425	17	50

ПРИМЕР 3. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в ферментере

Заявляемый штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 выращивали в в ферментере Anglicon (Anglicon, USA) в объеме среды выращивания 1500 мл. В качестве среды выращивания использовали среду как в примере 1. В ферментере поддерживали постоянную температуру 37°С, перемешивание: первые 24 часа 400 об/мин, на вторые сутки 600 об/мин на 3 сутки 800 об/мин на 7 сутки 1000 об/мин. Аэрация во время ферментации - 0,75 л/л·мин. Исследуемые штаммы выращивали до стационарной стадии роста. Далее определяли вес биомассы и содержание бактериородопсина в среде выращивания ,как в примере 1. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3
Исследуемые штаммы	Вес биомассы (г/л)	Концентрация бактериородопсина (мг/л)
ВКПМ В-11953	40	115
ВКПМ В-9026	23	53
ВКПМ В-10425	14	65

Как следует из результатов, приведенных в таблицах 1, 2 и 3, заявляемый штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 по количеству синтезируемого при различных условиях культивирования бактериородопсина и биомассы.

Источники информации:

1. Заявка на патент РФ №2005129525 от 23 сентября 2005 года.

2. Rosa Margesin, Franz Schinner, Extremophiles, 5, (2001), pp.73-83

3. Миронова Ε.В. «Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина», автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, 2002.

4. Патент РФ №2416634.

5. Патент USA №16616964.

6. Miller Α., Oesterhelt D., BBA, 1020 (1990), pp.57-64.

7. Otto H., Marti Т., Holz M., Mogi Т., Lindau M., Khorana H.G. and Heyn M.P., http://Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 86(1989), pp.9228-9232.

8. Thorgeirsson Т.Е., Milder S.J., Milreke L.J.W., Betlach M.C., Shand R.F., Stroud R.M. and Kliger D.S., Biochemistry, 30 (1991), pp.9133-9142.

9. Патент USA №4927180

10. Патент USA №5518858

11. Патент USA №5807625

12. Патент USA №5872648

13. Патент USA №5920058

Штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 - продуцент бактериородопсина.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментационной среде и способу получения рекомбинатных белков с использованием данной среды. Ферментационная среда для получения рекомбинантных белков, выбранных из группы, включающей Г-КСФ, стрептокиназу и липазу, с использованием микроорганизмов, выбранных из группы, включающей: E.

Композиция и способ для контроля численности моллюсков // 2549697

Изобретения относятся к области биотехнологии. Предложены композиция и способ для контроля численности моллюсков классов Gastropoda и Bivalvia.

Соединение а-87774 или его соль, способ получения соединения и его соли и агрохимикат, содержащий соединение или его соль в качестве активного ингредиента // 2545403

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены соединения A-87774, представленные соединениями A-87774-1, A-87774-2, A-87774-3 или их солью, способ получения соединений A-87774, штамм Streptomyces sp.

Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, вовлеченный в биосинтез пирипиропена а, вектор и клетка-хозяин содержащие такой полинуклеотид и способ получения предшественника пирипиропена а (варианты) // 2540017

Представленные изобретения касаются выделенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, вовлеченный в биосинтез пирипиропена А, вектора и клетки-хозяина, включающих такой полипептид, и способов получения предшественников пирипиропена А, включающих культивирование клетки-хозяина.

Способ получения бруцеллезного l-антигена // 2533811

Изобретение касается способа получения бруцеллезного L-антигена. Представленный способ включает стадии.

Штамм bacillus lentus - продуцент бактериоциноподобной субстанции антимикробного действия и способ получения бактериоциноподобной субстанции // 2530552

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Bacillus lentus «ГКПМ - Оболенск» B-7150 - продуцент бактериоциноподобной субстанции широкого спектра антимикробного действия, имеющей молекулярную массу по данным SDS-PAGE около 4 кДа.

Изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным // 2528859

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штамм Enterococcus faecium 8G-1 (NRRL В-50173), штамм Enterococcus faecium 8G-73 (NRRL B-50172) и штамм Bacillus pumilus 8G-134 (NRRL B-50174), обеспечивающие улучшение состояния здоровья жвачных животных.

Слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк // 2528251

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются слитого белка для специфического ингибирования свертывания крови, экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей такой слитый белок, бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной такой ДНК, и способу получения слитого белка.

Способ получения ферментированного натурального продукта // 2528017

Изобретение относится к способу получения ферментированного натурального продукта. Способ предусматривает получение первого ферментного экстракта в главном ферментере путем ферментирования сырья, выбранного из фруктов, овощей, бобовых, грибов, орехов, пшеницы, риса, трав, корней, листьев, цветов, по отдельности или в комбинации в присутствии микроорганизмов в количестве от 106 до 1012 клеток/мл, предпочтительно от 108 до 1010 клеток/мл.

Способ получения жидкой фракции, содержащей изолированные высокомолекулярные капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae, и жидкая фракция, полученная таким способом // 2524436

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения жидкой фракции, содержащей изолированные высокомолекулярные капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae.

Способ получения нанодисперсной добавки для бетона // 2557412

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения нанодисперсной добавки для бетона.

Питательная среда для культивирования консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов // 2557395

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, нановермикулит и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.

Питательная среда для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов // 2557393

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, нанобентонит и дистиллированную воду.

Питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов // 2557392

Изобретение относится биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, наносапропель и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов.

Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов // 2557391

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, наноцеолит и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.

Штамм bifidobacterium longum, пригодный для применения в иммуномодуляции, индукции продукции цитокинов, лечении аутоиммунного заболевания, контроле отношения il - 10:il - 12, и его использование // 2557310

Группа изобретений относится к штамму Bifidobacterium longum NCIMB 41675, составу, его содержащему, и продукту питанию, содержащему указанные штамм или состав. Предложенный штамм обладает способностью к индукции продукции цитокинов и контролю отношения IL-10:IL-12 и пригоден для применения в иммуномодуляции, лечении аутоиммунного заболевания.

Способ получения пробиотического препарата для кормлении крупного рогатого скота мясных пород // 2557302

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения пробиотического препарата иммобилизованных бифидобактерий для кормления крупного рогатого скота мясных пород.

Способ получения аргинина с использованием corynebacterium glutamicum атсс 21831 или corynebacterium glutamicum атсс 21493 в ферментационной среде, содержащей в качестве источника углерода жом маниока или семена джекфрута // 2557294

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены варианты способа получения аргинина посредством ферментации агропромышленных отходов, в том числе крахмалосодержащих, с получением ферментированной жидкости, содержащей аргинин, и выделения аргинина из ферментированной жидкости.

Живые аттенуированные вакцины // 2556813

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются cпособа предотвращения или лечения заболевания у субъекта, вызванного патогенным организмом, путем введения вакцинной композиции, вакцинной композиции и ее применения.

Lactobacillus johnsonii la1 nсс533 (cncm 1-1225) и иммунные нарушения // 2556124

Изобретение относится к композиции для лечения или предотвращения нарушений, связанных с пониженным уровнем дефензинов. Композиция содержит от 0,005 до 1000 мг Lactobacillus johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) на ежедневную дозу.

Штамм бактерий halobacterium salinarum - продуцент бактериородопсина // 2558232

Изобретение относится к биотехнологии. Описан штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 - продуцент бактериородопсина. Штамм Halobacterium salinarum ST 3 получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 без предварительной обработки химическими реагентами и депонирован в ВКПМ под номером В-11850. Штамм Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 превосходит по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) прототип ВКПМ В-10425. 2 табл., 2 пр.