Способ получения бруцеллезного l-антигена

Изобретение касается способа получения бруцеллезного L-антигена. Представленный способ включает стадии. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток. Полученную культуру смывают физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут. Взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость убирают, а осадок дважды промывают физиологическим раствором и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут. К бактериальной массе добавляют расплавленный фенол в соотношении 1:1. Физиологическим раствором доводят раствор фенола до 5%. Фенольную суспензию центрифугирую при 5000-10000 об/мин 30-40 минут. Надосадочную жидкость отстаивают и используют в качестве антигена. Предложенный способ может быть использован в комплексе серологических исследований на бруцеллез для выявления дополнительных хронически больных животных. 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза.

Известно, что бруцеллы, как и многие другие возбудители инфекционных болезней, могут существовать в природе в S-, R- и L-формах, отличающихся друг от друга по морфологическим и биологическим свойствам, степени патогенности и специфичности антигенных детерминант [1, 2, 3, 4, 7, 8, 9].

Существующие серологические методы диагностики позволяют выявить и идентифицировать бруцеллез, вызванный персистенцией возбудителя в типичной (S-) или диссоциированной (R-) форме, и при этом не выявляют животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен способ изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, включающий культивирование штамма 19, концентрирование и очистку выросшей бакмассы с использованием 0,5% фенолизированного физиологического раствора и инактивацию антигена [5]. Однако данный диагностикум также не позволяет выявлять животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Наиболее близким техническим решением является способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме, для получения которой использовали культуры из штамма В. abortus 19 в L-форме путем трансформации исходной типичной культуры вакцинного штамма Brucella abortus 19 (S-форма) культивированием на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) (MППГГА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, антиген получают путем инактивации полученное культуры нагреванием при температуре 85-90°С в течение 60 мин и трехкратно внутривенно вводят кроликам в возрастающих дозах с интервалом 72 часа [6]. Однако L-культура использовалась только для получения диагностической сыворотки против бруцелл для бактериологической диагностики бруцеллеза.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности и достоверности при диагностике бруцеллеза в комплексе серологических исследований при выявлении дополнительных хронически больных животных.

Заявленный технический результат достигается тем, что бруцеллезный антиген получают следующим образом: штамм Brucella abortus 19 в L-форме культивируют на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл, при 37-38°C в течение 4-5 суток, полученную L-форме культуру смывают физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут, взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость убирают, а осадок дважды промывают физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут. К бактериальной массе добавляют расплавленный фенол в соотношении 1:1 и растирают пестиком на водяной бане в течение 20-30 минут при температуре 55-60°C, физиологическим раствором доводят раствор фенола до 5%, фенольную суспензию центрифугирую при 5000-10000 об/мин 30-40 минут. Надосадочную жидкость отстаивают и используют в качестве антигена. Полученный антиген титруют в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:50, 1:75, 1:100, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции связывания комплемента в серологической диагностике бруцеллеза. Антиген для реакции связывания комплемента (РСК) признается пригодным для диагностических целей в разведении 1:75.

Отличительным признаком предложенного способа является то, что в основе приготовления антигена лежит использование культуры Bmcella abortus 19 в L-форме для серологической диагностики, а именно для реакции связывания комплемента.

Пример 1. Специфичность антигена для реакции связывания комплемента (РСК) проверяли в соответствующих серологических реакциях с применением S-, R- бруцеллезных сывороток, негативной сыворотки крови здорового животного и L-сыворотки. Антигены из бруцелл в L-форме должны давать положительную реакцию только с L-бруцеллезными сыворотками.

В перекрестных реакциях с бруцеллезными S- и R- сыворотками были получены отрицательные результаты, что свидетельствует о специфичности антигенов, изготовленных из L-форм бруцелл (табл.1).

Таблица 1
Результаты реакции связывания комплемента (РСК) антигена из L-форм бруцелл с сыворотками
Разведение L-бруцеллезного антигена Наименования и разведения бруцеллезных сывороток
S-(1:5) R-(1:5) N-(1:5) L-(1:5)
1:10 отр отр отр ++
1:20 отр отр отр ++
1:40 отр отр отр +++
1:50 отр отр отр ++++
1:75 отр отр отр ++++
1:100 отр отр отр ++
1:200 отр отр отр +

Примечание: (N) - негативная сыворотка крови здоровых животных.

L-бруцеллезные антигены обладают строгой специфичностью и диагностической активностью и могут использоваться в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Антигены, полученные из культур бруцелл в L-форме, обладают специфичностью и проявляют диагностическую активность в реакции связывания комплемента (РСК) 1:75 с гомологичными сыворотками.

Пример 2. Производственное испытание антигенов, изготовленных из L-форм бруцелл, на специфичность проводили на поголовье северных оленей благополучных по бруцеллезу (таб.2).

Таблица 2
Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей в благополучных стадах
Год исследования Район ЯНАО Исследовано животных (голов) Из них положительно реагирующих При этом с антигенами
S R L
гол %
2007 Ямальский 3211 0 0 - - -
2008 Ямальский 2543 0 0 - - -
2010 Ямальский 534 0 0 - - -
Итого 6288 0 0 - - -
% от общего числа исследуемых животных - - - - - -

Предлагаемый бруцеллезный L-антиген обладает строгой специфичностью в отношении S, R, N-сывороток, диагностической активностью, может найти применение в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Пример 3. В очагах бруцеллезной инфекции выявляются животные, реагирующие со стандартными (S-), бруцеллезными антигенами и также отмечены случаи положительных реакций с L-бруцеллезными антигенами (таб. 3).

Количество животных с хроническим течением бруцеллеза в L-форме составило от 0,6-15,0% от числа выявленных положительно реагирующих животных.

Таким образом, предполагаемый L-бруцеллезный антиген, используемый для реакции связывания комплемента (РСК), обладает строгой специфичностью в отношении S, R, N-сывороток, диагностической активностью, повышает эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза от 0,6-15,0%. Может быть использован в комплексе серологических исследований на бруцеллез для выявления дополнительных хронически больных животных.

Таблица 3
Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей из неблагополучных стад
Год исследования Район ЯНАО Исследовано животных (голов) Из них положительно реагирующих При этом с антигенами
S L
голов абс. % абс. %
2008 Тазовский 127 12 8 6,3 4 3,4
2009 Надымский 315 25 23 7,3 2 0,6
2011 Надымский (№2) 182 103 82 4,0 21 11,5
2011 Надымский (№5) 228 54 52 22,8 2 0,8
Итого 852 194 165 85,1 29 15,0

Литература:

1. Бочко Г.М. Сравнительная характеристика некоторых методов культивирования микоплазм и L-формы и серологических реакций, используемых для их диагностики // ЖМЭИ. - 1972. - №4. - С.61.

2. Белобаб В.И., Сарсенов М.С., Мукаев X. Биологические свойства и антигенная активность L-форм бруцелл, выделенных от животных// Инфекционные и незаразные болезни с.-х. животных в Казахстане. - Алма-Ата, 1983. - С.45-47.

3. Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю., Бронников В.С, Попова Т.Г. Изменчивость возбудителя бруцеллеза в организме крупного рогатого скота // Актуальные вопросы ветеринарной медицины в современных условиях: Матер. Всероссийской науч.-практич. конф. - Пенза, 2003. - С.15-17.

4. Косилов И.А. Изменчивость бруцелл и ее значение в проблеме бруцеллеза с.-х. животных //Ветеринарная профилактика болезней с.-х. животных в Сибири: Методические рекомендации. - Новосибирск, 1973.- 18 с.

5. Патент RU 2085212 C, A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20, опубл. 20.07.1999.

6. Патент RU №2268748 C2, A61K 39/40, C12N 1/20, G01N 33/531, опубл. 27.01.2006.

7. Ременцова М.М., Нифантьев В.М. Значение L-форм бруцелл в эпизоотическом процессе // Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация мед. помощи больным: тез. докл. Всесоюзной конференции. - Москва. 1989. - С.93-94.

8. Триленко П.А. МВБ и L-формы бруцелл // ЛВИ. - 1971. Вып.№32. С.35.

9. Хузин Д.А., Фомин A.M. Получение и изучение L-форм бруцелл // Актуальные вопросы эпизоотологии: Всесоюзн. науч. конф. - Казань, 1983. - С.74.

Способ получения бруцеллезного L-антигена, включающий культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, полученную в L-форме культуру смывают физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут, отличающийся тем, что взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость убирают, а осадок дважды промывают физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, к бактериальной массе добавляют расплавленный фенол в соотношении 1:1 и растирают пестиком на водяной бане в течение 20-30 минут при температуре 55-60°C, физиологическим раствором доводят раствор фенола до 5%, фенольную суспензию центрифугируют при 5000-10000 об/мин 30-40 минут, надосадочную жидкость отстаивают и используют в качестве антигена, полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции связывания комплемента в серологической диагностике бруцеллеза.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Bacillus lentus «ГКПМ - Оболенск» B-7150 - продуцент бактериоциноподобной субстанции широкого спектра антимикробного действия, имеющей молекулярную массу по данным SDS-PAGE около 4 кДа.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штамм Enterococcus faecium 8G-1 (NRRL В-50173), штамм Enterococcus faecium 8G-73 (NRRL B-50172) и штамм Bacillus pumilus 8G-134 (NRRL B-50174), обеспечивающие улучшение состояния здоровья жвачных животных.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются слитого белка для специфического ингибирования свертывания крови, экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей такой слитый белок, бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной такой ДНК, и способу получения слитого белка.

Изобретение относится к способу получения ферментированного натурального продукта. Способ предусматривает получение первого ферментного экстракта в главном ферментере путем ферментирования сырья, выбранного из фруктов, овощей, бобовых, грибов, орехов, пшеницы, риса, трав, корней, листьев, цветов, по отдельности или в комбинации в присутствии микроорганизмов в количестве от 106 до 1012 клеток/мл, предпочтительно от 108 до 1010 клеток/мл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения жидкой фракции, содержащей изолированные высокомолекулярные капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено устройство для получения наночастиц металлов путем восстановления металлов из исходных солей в присутствии культивируемых клеток микроорганизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способов получения раствора, содержащего высокомолекулярные изолированные капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae серотипа 19А.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения пирролохинолинохинона (PQQ) с использованием бактерии, принадлежащей к роду Methylobacterium или Hyphomicrobium.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, а именно к способу очистки бактериоцинов. .

Изобретение относится к биотехнологии. .
Представленная группа изобретений касается комбинированной вакцины, ее применения и способа получения. Охарактеризованная вакцина включает смесь антигенов для защиты от таких заболеваний, как дифтерия (D), столбняк (Т), ацеллюлярный коклюш (аР) и инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae (Hib b) и полиовирусами (IPV).
Представленная группа изобретений касается комбинированной вакцины, ее применения и способа получения. Охарактеризованная вакцина включает смесь антигенов для защиты от таких заболеваний, как дифтерия (D), столбняк (Т), ацеллюлярный коклюш (аР) и инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae (Hib b) и полиовирусами (IPV).
Группа изобретений относится к ветеринарии и медицине, в частности к получению и использованию биопрепаратов для иммунотерапии экопатологий. Группа изобретений включает получение белкового антигена из смеси анатоксинов из трех энтеропатогенных вирулентных штаммов возбудителя эшерихиоза телят E.
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к профилактике и лечению бруцеллезной инфекции. Способ экстренной профилактики и лечения бруцеллеза, включающий одновременное внутримышечное введение антибиотикорезистентного варианта вакцинного штамма бруцелл и противобруцеллезного препарата, отличающийся тем, что в качестве специфического препарата используют ципролетрезистентный вариант штамма бруцелл В.abortus 82 CR в дозе 1.109 м.к., а в качестве антибактериального препарата используют ципрофлоксацин (ципролет), который вводят в дозе 1 и 3 мл/кг 2 раза в день в течение 5-7 дней.
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для получения гипериммунной сыворотки против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней. Способ предусматривает исследование сыворотки крови в реакции агглютинации, реакции связывания комплемента с единым бруцеллезным антигеном, реакции иммунной диффузии с О-ПС антигеном и дополнительное исследование положительно реагирующих проб в реакции связывания комплемента с R-антигеном.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины и касается вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированной бактерии Salmonella enterica, которые содержат, по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное и относится к презентации, по меньшей мере, одного N-гликана из Campylobacter jejuni или производного этого N-гликана на их клеточной поверхности.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша. Для этого штаммы Bordetella pertussis выращивают на казеиново-угольном агаре с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды и устанавливают в полученной суспензии концентрацию микробных клеток 60-80 ME и рН 8,4±0,1.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к профилактике инфекционных болезней. Способ профилактики бруцеллеза животных осуществляют следующим образом.

Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и касается способа получения холерогена-анатоксина. Способ включает выделение холерогена-анатоксина методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 300 кДа, концентрирование методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа с последующей очисткой диафильтрацией трехкратным объемом стерильной очищенной водой методом тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембран с номинальной отсечкой по мол. массе 30 кДа. Изобретение обеспечивает увеличение выхода холерогена-анатоксина, сокращение времени и количества технологических стадий его получения. 1 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение касается способа получения бруцеллезного L-антигена. Представленный способ включает стадии. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара с добавлением 10-15 нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕДмл при 37-38°C в течение 4-5 суток. Полученную культуру смывают физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут. Взвесь центрифугируют при 3000-5000 обмин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость убирают, а осадок дважды промывают физиологическим раствором и центрифугируют при 3000-5000 обмин в течение 15-20 минут. К бактериальной массе добавляют расплавленный фенол в соотношении 1:1. Физиологическим раствором доводят раствор фенола до 5. Фенольную суспензию центрифугирую при 5000-10000 обмин 30-40 минут. Надосадочную жидкость отстаивают и используют в качестве антигена. Предложенный способ может быть использован в комплексе серологических исследований на бруцеллез для выявления дополнительных хронически больных животных. 3 табл., 3 пр.

Наверх