Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения



Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения
Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения
Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения
Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения
Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения
Препарат антитела, обогащенного изоформами и способ его получения

 

C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2586515:

Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)

Изобретения относятся к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ получения обогащенного изоформами препарата антител (варианты). В одном варианте способ получения обогащенного изоформами препарата антител включает этапы: а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии, б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, и в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антител, где проводимость первого раствора составляет от 4 мСм/см до 5мСм/см, где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%. В другом варианте способ получения изоформами препарата антител включает этапы: а) культивирование клеток млекапитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антитела из клеток или культуральной среды, б) очистка антитела по меньшей мере одним этапом колоночной хроматографии. Изобретение расширяет арсенал способов получения препаратов антител. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл, 7 пр.

 

В данном документе описан способ получения препарата антител, включающий этап способа элюирования на материале катионообменной хроматографии.

Уровень техники.

Хорошо известны и широко используются различные способы очистки белка, такие как аффинная хроматография с микробными белками (например, протеин A или протеин G аффинная хроматография), ионообменная хроматография (например, катионообменная (карбоксиметиловые смолы), анионообменная (аминоэтиловые смолы) и смешанного режима обмена), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматическо-адсорбционная хроматография (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами, или м-аминофенилбороновой кислотой) металл-хелатная аффинная хроматография (например, с Ni (II) - и Cu (II) аффинным материалом), гельфильтрация и электрофоретические методы (например, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi, М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

Промышленная очистка фармацевтических антител, особенно развитие, эксплуатация и ратификация процессов хроматографии описаны у Fahrner, R.L., et al., in Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 18 (2001) 301-327. Follman, D.K. и Fahrner, R.L. (J. Chrom. A 1024 (2004) 79-85), описывают факториальный скрининг процессов очистки антител, используя три хроматографических этапа без протеина A. Захват человеческих моноклональных антител из супернатанта клеточной культуры ионообменной средой, имеющей высокую плотность заряда, описан Necina, R., et al. (Biotechnol. and Bioeng. 60 (1998) 689-698). Очистка белков с помощью ионообменной хроматографии описана в WO 99/057134. В WO 2004/076485 описана очистка антител путем протеин A и ионообменной хроматографии. В US 5,429,746 описана очистка антител. Очистка белков описана в WO 2003/066662.

WO 2006/125599 описывает способ очистки антител. Очистка антител путем протеин A и ионообменной хроматографии описывается в WO 2004/076485.

Краткое описание изобретения

Было обнаружено, что хроматографическое разделение и/или обогащение изоформами антител возможно при подходящем увеличении проводимости подвижной фазы материала катионообменной хроматографии. Требуемое увеличение проводимости составляет не более 50%, то есть второй раствор имеет проводимость от 101% до 150% от проводимости первого раствора.

Таким образом, одним аспектом, как описано в настоящем документе, является способ изготовления препарата антител, включающий следующие этапы:

а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,

б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также

в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антител,

где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 50%.

В одном варианте исполнения проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 20%.

В одном варианте исполнения проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 15%.

В одном варианте исполнения проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 10%.

В одном варианте исполнения раствор стадии а) имеет такую же проводимость, как раствор стадии б). В одном варианте исполнения буферный раствор, содержащий различные изоформы антител, имеет первую проводимость и первый раствор имеет ту же (первую) проводимость.

В одном варианте исполнения материал катионообменной хроматографии содержит набухающую матрицу. В одном варианте исполнения набухающей матрицей является агароза.

В одном варианте исполнения материал катионообменной хроматографии является сильным материалом катионообменной хроматографии. В одном варианте исполнения сильным материалом катионообменной хроматографии является материал сульфопропил-катионообменной хроматографии.

В одном варианте исполнения происходит одноступенчатая замена первого раствора на второй раствор. В одном варианте исполнения одна ступень является изменением от 100% по объему первого раствора до 100% по объему второго раствора.

В одном варианте исполнения первый раствор изменяется на второй раствор по линейному градиенту. В одном варианте исполнения линейный градиент составляет приблизительно 30 объемов колонки. В одном варианте исполнения линейный градиент составляет приблизительно 20 объемов колонки.

В одном варианте исполнения первый раствор содержит 20 мМ цитрат натрия.

В одном варианте исполнения второй раствор содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия.

В одном варианте исполнения первый раствор содержит 25 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометан и 10 мМ хлорид натрия.

В одном варианте исполнения второй раствор содержит 25 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометан и 70 мМ хлорид натрия.

В одном варианте исполнения второй раствор содержит 25 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометан и 45 мМ хлорид натрия.

В одном варианте исполнения первый и второй растворы являются водными растворами.

В одном варианте исполнения антитела представляют собой анти-HER2 антитела. В одном варианте анти-HER2 антитела являются анти-HER2 антителами Трастузумаб или анти-HER2 антителами Пертузумаб. В одном варианте анти-HER2 антитела являются гуманизированными анти-HER2 антителами.

В данном документе в качестве другого аспекта описан препарат антител, полученный способом, как описано в данном документе. В одном варианте исполнения антитела представляют собой анти-HER2 антитела.

Другим аспектом, как описано в данном документе, является способ получения препарата антитела, включающий следующие этапы:

а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антител из клеток или культуральной среды,

б) очистка антител по крайней мере одной стадией колоночной хроматографии, где по меньшей мере один этап колоночной хроматографии включает следующие этапы:

1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,

2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также

3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и, таким образом, получение препарата антител,

где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора, по крайней мере, на 1%, но не более чем на 10%.

В одном варианте исполнения всех аспектов, описанных в данном документе, первый раствор имеет проводимость от 4 мСм/см до 5 мСм/см.

Описание изобретения

В данном документе описан способ получения препарата антител, включающий этапы: 1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител, на материал катионообменной хроматографии; 2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии; 3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антител, где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 50%.

В общем, моноклональные антитела (mAb), полученные рекомбинантным способом, выделяют из супернатанта культивируемых продуцирующих клеток, таких как ВНК, или Sp2/0, или CHO, или HEK клетки. Одновременно также выделяют другие белковые соединения, а также различные изоформы антител. Изоформы антител различаются лишь незначительными структурными характеристиками, такими как паттерн гликозилирования, гетерогенность C-концевого лизина тяжелой цепи и частичное деамидирование аспарагиновых или глутаминовых аминокислотных остатков.

Антитело выделяют с колонки/материала катионообменной хроматографии, используя общие хроматографические методы, в одном (симметричном) пике (см., например, Пример 6 и Фиг.5).

Было обнаружено, что изоформы антител могут быть обогащены или частично разделены друг от друга с помощью способа катионообменной хроматографии. Разделение/обогащение достигается хроматографическим способом связывание-элюирование, используя градиент pH или градиент соли и используя градиент с особенно небольшим уклоном.

Было обнаружено, что обогащение препарата антител изоформами антител возможно с помощью колоночной хроматографии с подходящим увеличением проводимости подвижной фазы.

В одном варианте исполнения увеличение проводимости составляет 50% или менее, т.е. проводимость возрастает от 100% по крайней мере до 101% и не более чем до 150%, начиная с первого уровня до второго, более высокого уровня, для того чтобы осуществить элюирование антител.

В одном варианте исполнения увеличение проводимости составляет 10% или менее, т.е. проводимость возрастает от 100% по крайней мере до 101% и не более чем до 110%, начиная с первого уровня до второго, более высокого уровня, для того чтобы осуществить элюирование антител.

Было обнаружено, что матрица материала катионообменной хроматографии должна быть набухающей матрицей.

В одном варианте исполнения матрица представляет собой поперечно-сшитый сахарид. В одном варианте исполнения сахарид представляет собой полисахарид. В одном варианте исполнения полисахарид представляет собой агарозу, т.е. полисахарид, состоящий из гликозидно связанных D-галактозы и 3,6-ангидро-L-галактозы.

Увеличение может быть одноступенчатым. Таким образом, увеличение может быть выполнено путем полной смены элюирующего раствора, то есть со 100% первого буферного раствора до 100% второго (= элюирующего) буферного раствора.

Увеличение может быть в виде линейного градиента. Таким образом, увеличение может быть выполнено с помощью линейной смены элюирующего раствора, то есть со 100% первого буферного раствора до от 50% до 100% второго (= элюирующего) буферного раствора.

В одном варианте исполнения первый раствор сменяется на второй раствор по линейному градиенту. В одном варианте исполнения линейный градиент осуществляется в течение приблизительно 50 объемов колонки. В одном варианте исполнения линейный градиент осуществляется в течение приблизительно 30 объемов колонки. В одном варианте исполнения линейный градиент осуществляется в течение приблизительно 20 объемов колонки.

Общие хроматографические методы и их применение известны специалисту в данной области. См., например, Heftmann, Е., (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Deyl, Z., (ed.) Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, vol. 60, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, (1982); Sambrook, J., et al., (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); или Ausubel, F.M., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, (1998).

В следующей Таблице проводимости некоторых буферных растворов, которые обычно используются, даны как референсные.

Таблица
Буфер NaCl [г/л] буферная соль [г/л] pH проводимость [мСм/см] изменение проводимости [%]
10 мМ цитрат натрия - 1.92 5.5 1.74 -
20 мМ цитрат натрия - 3.84 5.5 3.49 +101
30 мМ цитрат натрия - 5.76 5.5 5.05 +190
40 мМ цитрат натрия - 7.68 5.5 6.45 +271
50 мМ цитрат натрия - 9.60 5.5 8.04 +362
10 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 1.92 5.5 4.87 -
10 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 1.92 5.5 7.34 +51
10 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 1.92 5.5 12.21 +151
10 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 1.92 5.5 17.17 +253
10 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 1.92 5.5 21.70 +346
Буфер NaCl [г/л] буферная соль [г/л] pH проводимость [мСм/см] изменение проводимости [%]
20 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 3.84 5.5 6.65 -
20 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 3.84 5.5 9.12 +37
20 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 3.84 5.5 13.82 +108
20 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 3.84 5.5 18.37 +176
20 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 3.84 5.5 22.80 +243
30 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 5.76 5.5 8.37 -
30 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 5.76 5.5 10.65 +27
30 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 5.76 5.5 15.15 +81
30 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 5.76 5.5 19.69 +135
30 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 5.76 5.5 24.10 +188
40 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 7.68 5.5 9.78 -
40 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 7.68 5.5 12.12 +24
40 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 7.68 5.5 16.71 +71
40 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 7.68 5.5 21.20 +117
40 мМ цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 7.68 5.5 25.30 +159
Буфер NaCl [г/л] буферная соль [г/л] pH проводимость [мСм/см] изменение проводимости [%]
50 мМ цитрат натрия с 25 мМ NaCl 1.46 9.60 5.5 11.31 -
50 мМ цитрат натрия с 50 мМ NaCl 2.92 9.60 5.5 13.61 +20
50 мМ цитрат натрия с 100 мМ NaCl 5.84 9.60 5.5 18.19 +61
50 мМ цитрат натрия с 150 мМ NaCl 8.77 9.60 5.5 22.40 +98
50 мМ Цитрат натрия с 200 мМ NaCl 11.69 9.60 5.5 26.70 +136
25 мМ MES c 50 мМ NaCl 2.92 5.53 5.6 7.65 -
25 мМ MES c 95 мМ NaCl 5.55 5.53 5.6 12.15 +59
25 мМ MES с 50 мМ NaCl и 5 г/л Герцептин® - 7.48 5.53 7.66 -
25 мМ MES с 95 мМ NaCl и 5 г/л Герцептин® - 11.26 5.50 12.22 +60
25 мМ MES с 50 мМ NaCl и 15 г/л Герцептин® - 7.11 5.50 7.52 -
25 мМ MES с 95 мМ NaCl и 15 г/л Герцептин® - 9.22 5.50 11.97 +59
20 мМ цитрат натрия - 3.84 6.2 4.22 -
20 мМ цитрат натрия с 5 мМ NaCl 0.29 3.84 6.2 4.62 +9

Термин "нанесение на" означает частичный этап способа очистки, в котором раствор вносится в контакт с материалом хроматографии. Это означает что либо а) раствор добавляют в хроматографическое устройство, в котором содержится материал хроматографии, или б) материал хроматографии добавляют в раствор. В случае а) раствор проходит через устройство, позволяя осуществлять взаимодействие между материалом хроматографии и веществами, содержащимися в растворе. В зависимости от условий, таких как, например, pH, проводимость, концентрация соли, температура и/или скорость потока, некоторые вещества из раствора могут быть связаны с материалом хроматографии, а другие вещества могут быть извлечены с материала хроматографии. Вещества, остающиеся в растворе или извлеченные с материала хроматографии, могут быть найдены в протоке. "Проток" означает раствор, полученный после прохождения через устройство, который может быть либо раствором для нанесения или буферным раствором, который используется для промывки колонки или для элюирования веществ, связанных с материалом хроматографии. В одном варианте исполнения устройство представляет собой колонку или кассету. В случае б) материал хроматографии может быть добавлен, например, в виде твердого вещества к раствору, например, содержащему интересующее вещество, которое должно быть очищено, что позволяет осуществить взаимодействие между материалом хроматографии и веществом в растворе. После взаимодействия материал хроматографии удаляется, например, фильтрацией, и вещество, связанное с материалом хроматографии, также удаляется с ним из раствора, в то время как вещества, не связанные с материалом хроматографии, остаются в растворе.

Термин "режим связывание-элюирование" означает режим работы этапа хроматографии, в котором раствор, содержащий интересующее вещество, которое должно быть очищено, наносят на материал хроматографии, в результате чего интересующее вещество связывается с материалом хроматографии. Таким образом, интересующее вещество удерживается на материале хроматографии, тогда как вещества, не представляющие интереса, удаляются с протоком или супернатантом. Интересующее вещество впоследствии выделяется с материала хроматографии на втором этапе с элюирующим раствором. В одном из вариантов исполнения способ, как описано в данном документе, работает в режиме связывание-элюирование.

Растворы, используемые в способе, как описано в данном документе, являются неочищенными или буферными растворами. Термин "буферный раствор" обозначает раствор, в котором изменения pH в результате добавления или высвобождения кислотных или щелочных веществ выравниваются при помощи растворенного буферного вещества. Любое буферное вещество с такими свойствами может быть использовано. Как правило, используются буферные вещества, фармацевтически приемлемые. В одном варианте исполнения буферный раствор выбирают из фосфатного буферного раствора, состоящего из фосфорной кислоты и/или ее солей, или ацетатного буферного раствора, состоящего из уксусной кислоты и/или ее солей, или цитратного буферного раствора, состоящего из лимонной кислоты и/или ее солей, или морфолин буферного раствора, или 2-(N-морфолино) этансульфонового буферного раствора, или гистидинового буферного раствора, или глицинового буферного раствора, или трис (гидроксиметил) аминометанового (трис) буферного раствора. В другом варианте исполнения буферный раствор выбирают из фосфатного буферного раствора, или ацетатного буферного раствора, или цитратного буферного раствора, или гистидинового буферного раствора. При необходимости буферный раствор может содержать дополнительные соли, такие как, например, хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, цитрат натрия или цитрат калия.

Термины "градиентное элюирование" и "способ градиентного элюирования", которые в этом приложении используются как взаимозаменяемые, означают способ, в котором проводимость раствора, вызывающего элюирование, т.е. высвобождение связанного соединения с материала хроматографии, изменяется, т.е. поднимается или опускается непрерывно, т.е. концентрация изменяется последовательными малыми ступенями, каждая из которых не больше, чем изменение на 2% или на 1% от концентрации вещества, вызывающего элюирование. В этом "непрерывном элюировании" одно или более условий, например pH, ионная сила, концентрация соли, и/или поток хроматографии, могут быть изменены линейно, или экспоненциально, или асимптотически. В одном варианте исполнения изменение является линейным.

Термин "ступенчатое элюирование" означает способ, в котором, например, концентрация вещества, вызывающего элюирование, т.е. высвобождение связанного вещества с материала хроматографии, поднимается или опускается сразу, т.е. непосредственно от одного значения/уровня к следующему значению/уровню. В этом "ступенчатом элюировании" одно или более условий, например, pH, ионная сила, концентрация соли, и/или поток хроматографии, могут быть изменены все сразу от первого, например, начального значения до второго, например, финального значения. Таким образом, условия изменяются постепенно, т.е. ступенчато, в отличие от линейного изменения.

Термин "материал ионообменной хроматографии" означает неподвижную матрицу с высоким молекулярным весом, которая несет ковалентно связанные заряженные замещающие группы, используемые в качестве неподвижной фазы в ионообменной хроматографии. Для полной зарядовой нейтральности не ковалентно связанные противоионы также присоединены к ней. "Материал ионообменной хроматографии" имеет способность обменивать свои не ковалентно связанные противоионы на одинаково заряженные ионы из окружающего раствора. В зависимости от заряда замещающих его противоионов "ионообменные смолы" относятся к катионообменным смолам или анионообменным смолам. В зависимости от характера заряженной группы (замещающей группы) "ионообменная смола" относится, например, в случае катионообменных смол к смолам сульфоновой кислоты (S), или к сульфопропиловым смолам (SP), или к карбоксиметиловым смолам (CM).

Различные типы ионообменных материалов, то есть неподвижных фаз, доступны под разными названиями и разного производства множества компаний, таких как, например, катионообменные материалы Bio-Rex® (например, тип 70), Chelex® (например, тип 100), Macro-Prep® (например, типа CM, High S, 25 S), AG® (например, типа 50W, MP) производства BioRad лаборатории, WCX 2 производства Ciphergen, Dowex® МАС-3 производства Dow chemical company, Mustang C и Mustang S производства Pall Corporation, Cellulose CM (например, типа 23, 52), hyper-D, partisphere производства Whatman pic, Amberlite® IRC (например, типа 76, 747, 748), Amberlite® GT 73, Toyopearl® (например, типа SP, CM, 650M) производства Tosoh Bioscience GmbH, CM 1500 и CM 3000 производства BioChrom Labs, SP-Sepharose™, CM-Sepharose™ производства GE Healthcare, смолы Poros производства PerSeptive Biosystems, Asahipak ES (например, типа 502C), CXpak P, IEC CM (например, тип 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (например, тип 420N, 825), IEC QA (например, типа LG, 825), производства Shoko America Inc., 50W катионообменная смола производства Eichrom Technologies Inc. В одном варианте исполнения катионообменный материал является сильным катионообменным материалом, таким как Macro-Prep® High S или 25S, или MacroCap SP, или Toyopearl® SP 650M, или Source S, или SP Sepharose, или POLYCAT A, или Mono S, или Highscreen SP.

Для специалиста в данной области техники хорошо известны процедуры и методы для преобразования аминокислотной последовательности, например полипептида, в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эту аминокислотную последовательность. Таким образом, нуклеиновая кислота характеризуется последовательностью ее нуклеиновой кислоты, состоящей из отдельных нуклеотидов, а также аминокислотной последовательностью полипептида, кодируемого ею.

Термин "в условиях, подходящих для связывания» и его грамматические эквиваленты, используемые в этом приложении, означает, что интересующее вещество, например, изоформы антител, связывается с неподвижной фазой при попадании в контакт с ней, например, с ионообменным материалом. Это не обязательно означает, что 100% интересующего вещества связывается, но существенным образом 100% интересующего вещества связывается, т.е. по крайней мере 50% интересующего вещества связывается, предпочтительно по меньшей мере 75% интересующего вещества связывается, предпочтительно по меньшей мере 85% интересующего вещества связывается, более предпочтительно более чем 95% интересующего вещества связывается с неподвижной фазой.

Термин "терапевтическое антитело" означает антитело, которое проходит клинические испытания для утверждения в качестве терапевтического для человека и которое можно вводить индивидууму для лечения заболевания. В одном варианте исполнения антитело является терапевтическим антителом. В другом варианте исполнения терапевтическое антитело представляет собой моноклональное антитело. В еще одном варианте исполнения терапевтическое антитело получено от обезьяны или животного, трансформированного человеческим локусом антитела, или человеческое моноклональное антитело, или гуманизированное моноклональное антитело. В одном варианте исполнения терапевтическое антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело. В еще одном варианте исполнения терапевтическое антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. Терапевтические антитела широко используются для лечения различных заболеваний, таких как онкологические заболевания (например, гематологические и солидные злокачественные опухоли, включая не-Ходжкинскую лимфому, рак молочной железы и колоректальный рак), иммунологические заболевания, заболевания центральной нервной системы, сосудистые заболевания или инфекционные заболевания. Такие антитела являются в одном варианте исполнения антителами против ALK, рецептора киназы, связанной с адгезией (adhesion related kinase receptor) (например, Axl), или ERBB рецепторов (например, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4), или эритропоэтин-продуцирующих гепатоцеллюлярных рецепторов (erythropoietin-producing hepatocellular (EPH) receptors) (например, EphA1; EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4, EphB5, EphB6), или рецепторов фактора роста фибробластов (FGF) (например, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5), или Fgr, или IGF1R, или инсулинового рецептора, или LTK, или M-CSFR, или MUSK, либо рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGF) (например, PDGFR-A, PDGFR-В), или RET, или ROR1, или ROR2, или ROS, или RYK, или рецепторов фактора роста эндотелия (VEGF) (например, VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1, VEGF3), или рецепторов тирозинкиназы с иммуноглобулин-подобным и EGF-подобным доменом (TIE)(например, TIE-1, TIE-2/TEK), или Тес, или TYRO10, или рецепторов инсулиноподобного фактора роста (IGF) (например, INS-R, IGF-IR, IR-R), или рецепторов дискоидин домена (DD) (например, DDR1, DDR2), либо рецептора c-Met (МЕТ), или recepteur d′origine nantais (RON, так же известный как рецептор, стимулирующий макрофаги-1), либо Flt3 (fins-related tyrosine kinase 3), или рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1), или рецептора C-kit (KIT, или SCFR), или рецепторов, связанных с инсулиновыми рецепторами (IRR), или CD19, или CD20, или HLA-DR, или CD33, или CD52, или G250, или GD3, или PSMA, или CD56, или СЕА, или антигена Lewis Y, или рецептора IL-6.

Термин "антитело" охватывает различные формы структур антитела, включая целые антитела и фрагменты антител. Антитела, описанные в данном документе, в одном варианте исполнения являются человеческими антителами, гуманизированными антителами, химерными антителами, или обедненными антителами T-клеточных антигенов. Генная инженерия антител описана, например, в Morrison, S.L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 и US 5,204,244; Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи антитела разделены на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов делятся на подклассы (изотипы), т.е. IgG на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, или IgA на IgA1 и IgA2. В соответствии с классом иммуноглобулина, к которому принадлежит антитело, константные области тяжелой цепи иммуноглобулинов называются α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), and µ(IgM) соответственно. Термин "антитело человека класса IgG1" означает антитело, в котором аминокислотная последовательность константных доменов получена из аминокислотной последовательности человеческого IgG1. Этот термин включает человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и конъюгаты антител.

"Гуманизированные" формы не человеческих антител (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые частично содержат последовательности, полученные от не человеческого антитела и от антитела человека. По большей части, гуманизированные антитела получают из человеческих антител (реципиентные антитела), в которых остатки из гипервариабельной области заменены на остатки из гипервариабельной области не человеческого вида (донорские антитела), такого как мышь, крыса, кролик или не человеческие приматы, имеющие желаемую специфичность и аффинность. В некоторых случаях остатки из каркасной области (FR) антитела человека заменены соответствующими не человеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать дополнительные модификации, например аминокислотные остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорском антителе. Такие модификации в результате приводят к вариантам таких реципиентных или донорских антител, которые являются гомологичными, но не идентичными соответствующей последовательности родителя. Эти изменения сделаны для дальнейшего усовершенствования изготовления антител.

В общем, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, а обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым из не человеческих донорских антител, и все или в основном все из FR являются человеческими реципиентными антителами. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по меньшей мере, часть константной области антитела, обычно от человеческого антитела.

Способы гуманизации не человеческих антител описаны в литературе. В одном варианте исполнения гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти не человеческие аминокислотные остатки часто называют "импортированными" остатками, которые обычно берут из "импортного" вариабельного домена. Гуманизация может быть выполнена в соответствии со способом Winter и сотрудников, заменяя последовательности гипервариабельной области на соответствующие последовательности не человеческого антитела. Соответственно такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу меньше, чем интактный человеческий вариабельный домен заменен на соответствующую последовательность из не человеческого вида. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые остатки FR-регионов заменены остатками из аналогичных участков грызунов или антител не человеческих приматов.

Термин "моноклональное антитело", используемый в данном документе, означает антитело, полученное из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных антигенных сайтов (детерминантов или эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одного антигенного сайта на антигене. В дополнение к их специфичности моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Определение «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом.

Термин "химерное антитело" означает антитело, содержащее вариабельный домен, то есть связывающий участок, от первого вида и, по крайней мере, часть константной области, полученной из другого источника или второго вида, обычно полученное методами рекомбинантных ДНК.

Варианты аминокислотных последовательностей антител могут быть получены путем внесения соответствующих изменений в нуклеотидную последовательность, кодирующую цепи антитела, или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков аминокислотной последовательности интерферона. Любая комбинация делеции, инсерции и замены может быть сделана для достижения конечной конструкции, в том случае если конечная конструкция обладает антигенсвязывающими свойствами, как и родительское антитело.

Консервативные замены аминокислот приведены в Таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более существенные изменения приведены в последующей таблице под заголовком "примерные замены", и, как описано ниже, со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены могут быть введены в цепи антител и продукты, прошедшие скрининг на сохранение биологической активности родительского антитела.

Таблица 1
Исходный остаток Примерные замены Предпочтительные замены
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu

Аминокислоты могут быть разделены на группы в соответствии с общими свойствами боковых цепей:

(1) гидрофобные: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Неконсервативные замены повлекут за собой смену члена одного из этих классов на другой класс.

Hudziak, R.M., et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172 описывают генерацию панели HER2 антител, которые были охарактеризованы с использованием клеточной линии человеческой опухоли молочной железы SK-BR-3. Относительную пролиферацию клеток SK-BR-3 после воздействия антител определяли путем окрашивания монослоя кристаллическим фиолетовым через 72 часа. С помощью этого теста максимальное ингибирование было получено с антителом, называемым 4D5, которое ингибировало клеточную пролиферацию на 56%. В этом анализе другие антитела в панели уменьшали клеточную пролиферацию в меньшей степени. Было также обнаружено, что антитело 4D5 сенсибилизировало HER2-гиперэкспрессирующие клетки из линии опухоли молочной железы к цитотоксической активности TNF-α (см. также US 5,677,171). HER2 антитела обсуждаются в Hudziak, R.M., et al.. дополнительно охарактеризованы в Fendly, В.М., et al., Cancer Research 50 (1990) 1550-1558; Kotts, C.E., et al., In Vitro 26 (1990) 59A; Sarup, J.C., et al., Growth Regulation 1 (1991) 72-82; Shepard, H.M., et al., J. Clin. Immunol. 11 (1991) 117-127; Kumar, R., et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 979-986; Lewis, G.D., et al., Cancer Immunol. Immunother. 37 (1993) 255-263; Pietras, R.J., et al., Oncogene 9 (1994) 1829-1838; Vitetta, E.S., et al., Cancer Research 54 (1994) 5301-5309; Sliwkowski, M.X., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665; Scott, G.K., et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 14300-14305; D′souza, В., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994) 7202-7206; Lewis, G.D., et al., Cancer Research 56 (1996) 1457-1465; и Schaefer, G., et al., Oncogene 15 (1997) 1385-1394.

Рекомбинантная гуманизированная версия мышиного антитела против HER2 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMab HER2, трастузумаб или Герцептин®; см. US 5,821,337) является клинически активной у пациентов с оверэкспрессирующим HER2 метастатическим раком молочной железы, которые получили обширную предшествующую противораковую терапию (Baselga, J., et al., J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744). Трастузумаб получил предпродажное одобрение Food and Drug Administration (FDA) 25 сентября 1998 для лечения пациентов с метастатическим раком молочной железы, у которых опухоль оверрэкспрессировала белок HER2.

Гуманизированные анти-ErbB2 антитела включают huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 и huMAb4D5-8 (Герцептин®), как описано в Таблице 3 патента US 5,821,337, специально включенного в данный документ в качестве ссылки; гуманизированные 520C9 (WO 93/21319) и гуманизированные антитела 2C4, как описано в WO 01/000245, специально включены в данный документ в качестве ссылки.

Другие HER2 антитела с различными свойствами описаны в Tagliabue, Е., et al., Int. J. Cancer 47 (1991) 933-937; McKenzie, S.J., et al., Oncogene 4 (1989) 543-548; Maier, L.A., et al., Cancer Res. 51 (1991) 5361-5369; Bacus, S.S., et al., Molecular Carcinogenesis 3 (1990) 350-362; Stancovski, I., et al., PNAS USA 88 (1991) 8691-8695; Bacus, S.S., et al., Cancer Research 52 (1992) 2580-2589; Xu, F., et al., Int. J. Cancer 53 (1993) 401-408; WO 94/00136; Kasprzyk, P.G., et al., Cancer Research 52 (1992) 2771-2776; Hancock, M.C., et al., Cancer Res. 51 (1991) 4575-4580; Shawver, L.K., et al., Cancer Res. 54 (1994) 1367-1373; Arteaga, C.L., et al., Cancer Res. 54 (1994) 3758-3765; Harwerth, I.M., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 15160-15167; US 5,783,186; и Klapper, L.N., et al., Oncogene 14 (1997) 2099-2109.

Пертузумаб (см., например, WO 01/000245) является первым из нового класса агентов, известных как ингибиторы димеризации HER (HER dimerization inhibitors (HDIs)). Пертузумаб связывается с HER2 в его домене димеризации, тем самым препятствуя его способности образовывать активные димерные рецепторные комплексы и тем самым блокируя нижележащий сигнальный каскад, что в конечном итоге приводит к влиянию на рост и деление клеток (см. Franklin, М.С., Cancer Cell 5 (2004) 317-328). Пертузумаб является полностью гуманизированным рекомбинантным моноклональным антителом, направленным против внеклеточного домена HER2. Связывание Пертузумаба с HER2 на эпителиальных клетках человека предотвращает формирование комплексов HER2 с другими членами HER-семейства (в том числе EGFR, HER3, HER4) и, вероятно, HER2 гомодимеризацию. Блокируя образование комплексов, Пертузумаб предотвращает стимулирующий эффект на рост и сигналы выживания клеток, активируемые лигандами HER1, HER3 и HER4 (например, EGF, TGF-α амфирегулин и герегулины). Другим названием Пертузумаба является 2C4. Пертузумаб является полностью гуманизированным рекомбинантным моноклональным антителом, основаным на человеческой каркасной последовательности lgG1 (K). Структура Пертузумаба состоит из двух тяжелых цепей (449 остатков) и двух легких цепей (214 остатков). По сравнению с Трастузумабом (Герцептином®) Пертузумаб имеет 12 аминокислотных различий в легкой цепи и 29 аминокислотных различий в тяжелой цепи lgG1.

Термин "гидрофобный" означает соединения, которые преимущественно характеризуются ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями в качестве основных, или даже исключительно межмолекулярные взаимодействия должны быть рассмотрены. Термин "преимущественно" в данном контексте означает, что в принципе, гидрофильные соединения могут также и присутствовать, но они имеют лишь небольшое значение для общей характеристики химических и/или физических свойств соответствующего аналита. Противоположным термином для термина "гидрофобный" в контексте настоящего изобретения является термин "гидрофильный", который обозначает те соединения, которые характеризуются водородными связями и которые имеют сильный полярный и/или протонный характер. В одном варианте исполнения материал матрицы ионо-обменной хроматографии представляет собой гидрофобную матрицу.

Термин "протонный" означает свойство содержания или выделения протона(ов) и/или образования водородной связи(ей), такой как, например, вода, спирты, амины и т.п. Высвобождение протонов из молекулы также известно специалисту в области диссоциации. Простейшим протонным растворителем является вода, которая в упрощенном виде распадается на протон и гидроксилион. Известными протонными растворителями являются, например, спирты, в которых высвобождение протонов обычно происходит на гидроксильной группе, оставляя отрицательно заряженный атом кислорода бывшей гидроксильной группы, поскольку электроотрицательный атом кислорода способен стабилизировать полученный отрицательный заряд. Даже карбоновые кислоты можно рассматривать как протонные растворители, при условии, что выделение протонов с карбоксильной группы не приведет к химической реакции с конкретным веществом, которое, например, растворено в конкретном растворе. Еще одну группу протонных растворителей представляют амины, которые содержат "протоны", строго говоря, атомы водорода, в их аминогруппе, а также свободную пару электронов на соответствующем атоме азота для образования водородной связи.

Термин «подвижная фаза» означает любые смеси воды и/или водных буферов, и органических растворителей, пригодных для элюирования анализируемых веществ с хроматографической колонки. Термин "для элюирования" или "элюирование" соответственно в контексте настоящего изобретения используется, как известно специалисту в данной области техники, и означает растворение, при необходимости перемещение адсорбированного вещества (веществ) с тел или адсорбентов, которые пропитаны жидкостями, т.е. материал колонки, на который вещество (вещества) адсорбировано(ны).

Термин «адсорбция» означает накопление веществ из жидкости, например подвижной фазы на границе фазы, образованной жидкостью с веществом, причем последнее может адсорбировать вещества на своей поверхности. Эта адсорбция приводит к накоплению адсорбированного вещества на конкретной поверхности. Вещество, способное накапливать вещества на своей поверхности, часто называют адсорбентом и адсорбированный материал - адсорбатом. Термин адсорбция, как правило, отличается от термина "поглощение", который подразумевает, что за накоплением на поверхности также следует проникновение накопленных веществ внутрь адсорбирующего тела или жидкости. В общем, адсорбция является физическим процессом, в котором вещества, обычно молекулы, адгезируются на поверхности адсорбента и, таким образом, накапливаются на соответствующей поверхности. Силы, ответственные за это адгезирование, считаются физическими силами, а не химическими связями и, таким образом, адсорбция, как известно специалисту в данной области, является физической адсорбцией или физисорбцией, что не исключает химическое связывание вещества с поверхностью. Физические силы, участвующие в адсорбции веществ на поверхности, являются в большинстве случаев ван-дер-ваальсовыми силами, Лондонскими силами или диполь/дипольным взаимодействием, например, водородными связями, или диполь-индуцированным дипольным взаимодействием, причем эти термины используются либо как объяснено выше либо как обычно используются в контексте с адсорбцией.

В хроматографии (колоночной) обычно используются растворители в качестве элюента, т.е. элюирующего агента, в котором вещество (вещества), которые должны быть элюированы, по крайней мере, достаточно растворимы.

Термин "набухающая матрица" означает любой набухающий полимерный гель на основе мономеров, которые химически или физически связаны друг с другом с образованием трехмерной сети. Химическое соединение осуществляется путем образования связи, в то время как физическая конструкция набухающей матрицы может быть на основе электростатических, гидрофобных или диполь/дипольных взаимодействий между отдельными областями соответствующих сегментов полимера. Термин "набухающая матрица" в одном варианте исполнения означает полимерные гели, в которых трехмерная сеть получается путем образования химических связей. Сама сеть может состоять из одного или нескольких различных компонентов. В присутствии подходящего растворителя сеть набухает при одновременном включении соответствующего растворителя в свою трехмерную сеть до момента, пока равновесный объем включаемого объема не будет достигнут. В другой терминологии набухшее состояние сети известно как гель, и не набухшее состояние известно как гелеобразователь. В контексте настоящего изобретения термин набухающая матрица также включает в себя значение термина гелеобразователь.

Термин "набухающая матрица» означает только те гели, которые построены из гидрофильных, но водонерастворимых полимеров, которые разбухают в присутствии воды в качестве растворителя. Аффинность набухающих матриц к воде можно отнести к энергии взаимодействия с молекулами воды (сальвации) и энтропийным эффектам полимерной сети. Кроме воды чистые гидрофильные органические растворители, такие как, например, метанол, этанол и диметилформамид, а также их соответствующие водные растворы, содержащие органический растворитель в переменных количествах, оказывают эффект набухания на набухающую матрицу, где термин гидрофильный понимается как описано выше. Соответственно, термин «набухающая матрица» больше не ограничивается только теми гелями, которые набухают только при включении воды в их сети, но и ко включению гидрофильных органических растворителей, и/или их водных растворов, и/или смеси переменного состава.

В контексте с набухающей матрицей поперечное сшивание имеет важное значение, поскольку оно приводит к образованию трехмерной структуры, а также к образованию полостей, что позволяет набухать матрице. Кроме того, степень поперечной сшивки обязательно влияет на размер пор, полученных набухшей матрицей.

Таким образом, одним аспектом, как описано в данном документе, является способ для обогащения изоформами антител препарата антител, включающий следующие этапы:

а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,

б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также

в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии, и тем самым получение препарата антител, обогащенного изоформами антител,

где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 50%.

Один вариант исполнения представляет собой способ обогащения изоформами антител препарата антител, содержащий следующие этапы:

а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,

б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также

в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии, и тем самым получение препарата антител, обогащенного изоформами антител,

где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%.

Раствор стадии а) в одном варианте исполнения имеет такую же проводимость, как раствор стадии б).

«Изоформы антител» означает версию антитела с небольшими отличиями по отношению к другой изоформе одного и того же антитела. "То же антитело" означает антитело с той же аминокислотной последовательностью, за исключением модификации(ций) конкретной изоформы. Различные формы антител могут получиться во время транскрипции или трансляции последовательности, кодирующей антитело, а также могут быть различия, возникающие при процессинге и секреции антитела клеткой, в результате очистки, в процессе изготовления препарата и деградации во время хранения. Изоформы антител могут варьироваться по аминокислотной последовательности, мультимеризации, гликозилировании и других посттрансляционных модификациях. "Гликоформа" является изоформой, когда различные версии гликопротеинов имеют различные полисахариды, привязанные к ним, посттрансляционными модификациями. Также процессинг остатков лизина C-конеца тяжелой цепи антитела может быть источником структурных вариаций антител.

Было обнаружено, что изоформы антител в препарате антител могут быть обогащены или даже частично отделены с использованием колоночного метода катионообменной хроматографии. Это может быть достигнуто способом связывание-элюирование с использованием градиента pH или соли, линейно либо ступенчато, для выделения антитела с материала хроматографии. Способ особенно эффективен при использовании градиента с небольшим уклоном, т.е. имеющего относительное изменение pH или увеличение проводимости 50% или менее от исходного значения, в частности 10% или менее от исходного значения. Поскольку различные изоформы антител видны, по крайней мере, как полуразделенные пики в соответствующих хроматограммах, состав изоформ препарата антител может быть скорректирован на основе выбранных и сочетанных элюированных фракций, охватывающих соответствующие пики на хроматограмме.

Более конкретно было обнаружено, что обогащение изоформами антител препарата антител может быть достигнуто с подходящим увеличением проводимости подвижной фазы, нанесенной на материал катионообменной хроматографии.

Термин "препарат антител" означает смесь, содержащую различные изоформы одного и того же антитела.

Фиг.1. Хроматограмма элюирования с использованием линейного градиента от 20% об элюирующего буфера до 60% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в одном пике. Можно увидеть небольшой пре-пик.

Фиг.2. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 24% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в виде полуразделенного пика.

Фиг.3. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 15% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 80 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в виде двух полуразделенных пиков, в котором первый пик показывает пре-пик.

Фиг.4. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 100% об элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия). Видно, что изоформы антител выделяются в трех полуразделенных пиках.

Фиг.5. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения, используя способ одноступенчатого элюирования, где проводимость была увеличена от 100% до 159%. Видно, что антитела выделяются в виде одного пика.

Фиг.6. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения, используя линейный градиент от 100% об первого буферного раствора до 60% об второго буферного раствора (первый буфер содержит 25 мМ Трис и 10 мМ хлорид натрия, второй буфер содержит 25 мМ Трис и 70 мМ хлорид натрия, оба буфера имеют значение pH 7,4). Видно, что изоформы антител выделяются в трех пиках.

В одном варианте осуществления увеличение проводимости составляет 50% или менее, т.е. проводимость возрастает до 150% или меньше. Таким образом, второй раствор имеет проводимость от 101% до 150% от проводимости первого раствора. Увеличение может быть в виде одноступенчатого или линейного градиента. Увеличение может быть выполнено в виде полной замены элюирующего раствора, то есть от 100% первого (= отмывочного) раствора до 100% второго (= элюирующего) раствора.

В одном варианте осуществления увеличение проводимости составляет 10% или менее, т.е. проводимость возрастает до 110% или меньше. Таким образом, второй раствор имеет проводимость от 101% до 110% от проводимости первого раствора. Увеличение может быть выполнено в виде полной замены элюирующего раствора, то есть от 100% первого (= отмывочного) раствора до 100% второго (= элюирующего) раствора.

В одном варианте осуществления линейный градиент включает в себя три линейных градиента, каждый их которых имеет разный уклон.

В одном варианте осуществления первый линейный градиент составляет от 18 до 20 объемов колонки, второй линейный градиент составляет от 2 до 4 объемов колонки, и третий линейный градиент составляет от 6 до 8 объемов колонки. В одном варианте осуществления первый линейный градиент составляет приблизительно до 115% проводимости первого раствора, второй линейный градиент приблизительно до 137% проводимости первого раствора, а третий линейный градиент составляет приблизительно до 150% проводимости первого раствора.

Кроме того, было обнаружено, что матрица материала катионообменной хроматографии должна быть набухающей матрицей. В одном варианте осуществления матрица представляет собой поперечно-сшитый сахарид. В еще одном варианте исполнения сахарид представляет собой полисахарид. В другом варианте осуществления полисахарид представляет собой агарозу, т.е. полисахарид, состоящий из гликозидно связанных D-галактозы и 3,6-ангидро-L-галактозы.

Таким образом, другой аспект, как описано в данном документе, представляет собой способ получения препарата антител, включающий следующие этапы:

а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антител из клеток или культуральной среды,

б) очистка антител по крайней мере одним этапом колоночной хроматографии, где по меньшей мере один хроматографический этап включает следующие этапы:

1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антител на материал катионообменной хроматографии,

2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антител остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также

3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии, и таким образом, получение препарата антител,

где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%.

В одном варианте осуществления способ представляет собой способ получения в больших масштабах. В другом варианте осуществления большие масштабы составляют 1 г или более препарата антител.

Следующие примеры и фигуры предназначены для облегчения понимания настоящего изобретения, полный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что могут быть сделаны модификации в изложенных процедурах, без отхода от сути настоящего изобретения.

Описание фигур

Фиг.1. Хроматограмма элюирования с использованием линейного градиента от 20% об. элюирующего буфера до 60% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия).

Фиг.2. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 24% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 100 мМ хлорид натрия).

Фиг.3. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 15% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 80 мМ хлорид натрия).

Фиг.4. Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения ступенчатым градиентом от 100% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 20 мМ цитрат натрия, элюирующий буфер содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия).

Фиг.5. Одноступенчатое элюирование анти-HER-2-антител с сильной катионообменной смолы SP-сефарозы; мономерные и агрегированные формы антител не разделены и элюированы в виде одного пика.

Фиг.6 Хроматограмма элюирования колоночно-хроматографического разделения, используя линейный градиент до 60% об. элюирующего буфера (отмывочный буфер содержит 25 мМ Трис и 10 мМ хлорид натрия, элюирующий буфер содержит 25 Трис и 70 мМ хлорид натрия).

Примеры

Материалы и методы

Анти-HER2 антитела, описанные в WO 92/022653, WO 99/057134, WO 97/04801, US 5,677,171 и US 5,821,337 (включенные в данный документ в качестве ссылки), являются иллюстрацией иммуноглобулинов, которые могут быть использованы в способе, как описано в данном документе.

Аналитическая гель-фильтрация:

Смола: TSK 3000 (Tosohaas)
Колонка: 300×7,8 мм
Скорость потока: 0,5 мл/мин
Буферный раствор: 200 мМ фосфат калия, содержащий 250 мМ хлорид калия, подведенный pH 7,0
Длина волны: 220 нм

Аналитическая ИО-ВЭЖХ

Смола: Dionex ProPac™ WCX-10 Analytical Grade
Колонка: 4×250 мм
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Буфер А: 10 мМ фосфат натрия, подведенный pH 7,5
Буфер Б: 10 мМ фосфат натрия, подведенный pH 7,5, с добавлением 0,1 М хлорида натрия
Начальные условия: 85% об буфера А и 15% об. буфера Б
Градиент: до 55% об. буфера Б в 9 объемах колонки
Длина волны для детекции: 214 нм
Количество пробы: 50 мкг

Образец и карбоксипептидазу В разводили до конечной концентрации 1 мг/мл буфером для внесения. 1% (весовой процент) разбавленный раствор карбоксипептидазы добавляли в разбавленный раствор для внесения.

Пример 1

Хроматография с комбинированным градиентом элюирования до 60% об. буфера для элюирования на SP-сефарозе.

Условия хроматографии:

Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 100 мМ хлорида натрия

Способ элюирования:

Сочетание ступенчатого и линейного градиента.

Ступенчатый градиент до 20% элюирующего буфера, а затем линейный градиент до 60% элюирующего буфера.

Хроматограмма элюирования показана на Фиг 1. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в одном пике. Можно увидеть небольшой пре-пик.

Пример 2

Хроматография с элюированием ступенчатым градиентом до 24% об. элюирующего буфера на SP-сефарозе.

Условия хроматографии:

Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 100 мМ хлорида натрия

Способ элюирования:

одноступенчатый градиент

ступенчатый градиент до 24% элюирующего буфера и элюирование в более чем 20 объемах колонки.

Хроматограмма элюирования показана на Фиг 2. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в полуразделенном пике.

Пример 3

Хроматография с элюированием ступенчатым градиентом до 15% об элюирующего буфера на SP-сефарозе.

Условия хроматографии:

Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 80 мМ хлорида натрия

Способ элюирования:

одноступенчатый градиент

ступенчатый градиент до 15% элюирующего буфера и элюирование в более чем 20 объемах колонки.

Хроматограмма элюирования показана на Фиг 3. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в двух полуразделенных пиках, где первый пик показывает пре-пик.

Пример 4

Хроматография с элюированием ступенчатым градиентом до 100% об. элюирующего буфера на SP-сефарозе.

Условия хроматографии:

Смола: Highscreen SP-Sepharose
Скорость потока: 1,2 мл/мин
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Нагрузка: 1 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2
Элюирование: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 6,2, с добавлением 5 мМ хлорида натрия

Способ элюирования:

одноступенчатый

одноступенчатый градиент до 100% элюирующего буфера и элюирование в более чем 20 объемах колонки.

Хроматограмма элюирования показана на Фиг 4. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в трех полуразделенных пиках.

Пример 5

Хроматография элюирования с градиентом pH до 100% об элюирующего буфера на MonoS сильной катионообменной смоле.

Условия хроматографии:

Смола: MonoS
Уравновешивание: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 5,2
Отмывка: 20 мМ цитрат натрия, доведенный pH 5,2
Элюирование: 50 мМ фосфат натрия, доведенный pH 7,5

Способ элюирования:

градиентное элюирование

от 0% до 100% элюирующего буфера.

Изоформы могут быть получены в виде трех полуразделенных пиков.

Пример 6

Сравнительный пример - хроматографическое разделения моноклональных анти-HER-2-антител (WO 99/57134) на сильной катионообменной смоле (SP-сефарозе).

Была проведена очистка моноклональных анти-HER2 (Herceptin ®) антител на катионообменной хроматографии с SP-сефарозой, с сильной катионообменной смолой. При стандартных условиях, т.е. этап элюирования, например, с хлоридом натрия, не произошло разделения мономерных и агрегированных форм антител (Фиг 5).

Условия хроматографии:

Смола: SP-Sepharose
Скорость потока: 160 см/ч
Уравновешивание: 25 мМ 2-морфолиноэтансульфоновая кислота, 50 мМ хлорид натрия, доведенный pH 5,6
Нагрузка: максимум 20 г белка/л гелевой матрицы
Отмывка: 25 мМ 2-морфолиноэтансульфоновая кислота, 50 мМ хлорид натрия, доведенный pH 5,6
Элюирование: 25 мМ 2-морфолиноэтансульфоновая кислота, 95 мМ хлорид натрия, доведенный pH 5,6

Моноклональное анти-HER-2-антитела очищали на первом этапе на протеин A аффинной хроматографии. Элюирование с протеин A колонки осуществляли в кислых условиях (10 мМ натрий-цитратный буфер, pH 3,0±0,5). Перед этапом фильтрации значение pH фракции, содержащей антитела, подводили с помощью концентрированного трис-гидроксиметил-амино-метана (трис) буфера, pH 5,6. Элюат с протеина A представляет собой раствор с концентрацией белка в пределах от 5 мг/мл до 15 мг/мл, забуференный цитратом натрия.

Кондиционированный элюат с протеина A наносили на хроматографическую колонку, содержащую сильную катионообменную смолу (SP-сефарозу). После этапа прогона, при скорости потока 160 см/ч колонку промывали уравновешивающим буфером (10 объемов колонки). Связанные иммуноглобулины элюировали одним этапом способа элюирования, где значение pH поддерживали постоянным, и проводимость варьировали путем (ступенчатого) увеличения концентрации хлорида натрия. Хроматограмма элюирования отображена на Фиг 5.

Не было достигнуто разделения мономерных и агрегированных форм антител.

Пример 7

Хроматография с градиентным элюированием до 60% об. элюирующего буфера на Source™ 15S.

Условия хроматографии:

Смола: Source™ 15S
Объем колонки: 1,14 л
Скорость потока: 100 см/ч
Уравновешивание: 25 мМ Трис, 10 мМ хлорид натрия, доведенный pH 7,4 Нагрузка: 0,88 г белка/л материала хроматографии
Отмывка: 25 мМ Трис, 10 мМ хлорид натрия, доведенный pH 7,4
Элюирование: 25 мМ Трис, 70 мМ хлорид натрия, доведенный pH 7,4

Способ элюирования:

градиент

до 33% об. элюирующего буфера в 19 объемах колонки

до 50% об. элюирующего буфера в 3 объемах колонки

до 60% об. элюирующего буфера в 7 объемов колонки

Хроматограмма элюирования показана на Фиг 6. Видно, что изоформы антител могут быть выделены в выраженном пике.

1. Способ получения обогащенного изоформами препарата антител, включающий следующие этапы:
а) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антитела на материал катионообменной хроматографии,
б) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антитела остаются адсорбированными на материале катионообменной хроматографии,
в) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и тем самым получение препарата антитела,
где проводимость первого раствора составляет от 4 мСм/см до 5 мСм/см,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%,
где материал катионообменной хроматографии имеет набухающую матрицу, представляющую собой полимерный гель на основе мономеров, которые химически или физически связаны друг с другом с образованием трехмерной сети и которые в присутствии подходящего растворителя набухают при одновременном включении соответствующего растворителя в свою трехмерную сеть до момента, пока равновесный объем включаемого объема не будет достигнут, и где происходит одноступенчатая замена первого раствора на второй раствор.

2. Способ получения обогащенного изоформами препарата антитела, включающий следующие этапы:
а) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, и выделение антитела из клеток или культуральной среды,
б) очистка антитела по меньшей мере одним этапом колоночной хроматографии, где этот по меньшей мере один хроматографический этап включает следующие этапы:
1) нанесение буферного раствора, содержащего различные изоформы антитела на материал катионообменной хроматографии,
2) нанесение первого раствора с первой проводимостью на материал катионообменной хроматографии, при этом изоформы антитела остаются связанными с материалом катионообменной хроматографии, а также
3) нанесение второго раствора со второй проводимостью на материал катионообменной хроматографии и, таким образом, получение препарата антитела,
где проводимость первого раствора составляет от 4 мСм/см до 5 мСм/см,
где проводимость второго раствора превышает проводимость первого раствора не более чем на 10%,
где материал катионообменной хроматографии имеет набухающую матрицу, представляющую собой полимерный гель на основе мономеров, которые химически или физически связаны друг с другом с образованием трехмерной сети, и которые в присутствии подходящего растворителя набухают при одновременном включении соответствующего растворителя в свою трехмерную сеть до момента, пока равновесный объем включаюемого объема не будет достигнут, и
где происходит одноступенчатая замена первого раствора на второй раствор.

3. Способ по любому из пп.1 или 2, где набухающая матрица является агарозой.

4. Способ по любому из пп.1 или 2, где материал катионообменной хроматографии является сильным материалом катионообменной хроматографии.

5. Способ по п.4, где сильным катионообменным материалом хроматографии является сульфопропил-катионообменный материал хроматографии.

6. Способ по любому из пп.1 или 2, где одна ступень является изменением от 100 об.% первого раствора до 100 об.% второго раствора.

7. Способ по любому из пп.1 или 2, где первый раствор содержит 20 мМ цитрат натрия, 10 мМ хлорид натрия или 25 мМ Трис и 10 мМ хлорид натрия.

8. Способ по любому из пп.1 или 2, где второй раствор содержит 20 мМ цитрат натрия и 5 мМ хлорид натрия или 25 мМ Трис и 70 мМ хлорид натрия.

9. Способ по любому из пп.1 или 2, где антителом является анти-HER2 антитело.

10. Способ по п.9, где анти-HER2 антитело является анти-HER2 антителом Трастузумаб или анти-HER2 антителом Пертузумаб.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Описан способ снижения иммуногенности фрагмента антитела scFv, где способ включает стадию замены одного или более аминокислотных остатков вариабельного домена легкой цепи в положениях 101 и/или 148 (нумерация АНо) и замены аминокислотных остатков в положениях 12, 103 и 144 (нумерация АНо) вариабельного домена тяжелой цепи.

Настоящее изобретение к биохимии, в частности к способу получения антитела. Указанный способ предусматривает культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, содержащий первую область инициации трансляции (TIR), функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим тяжелую цепь антитела, и вторую TIR, функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим лёгкую цепь антитела, и извлечение антитела из культуры клетки-хозяина.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению антител, и может быть использовано для снижения гетерогенности антител во время культивирования.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ повышения антагонистической активности моноклонального антитела, содержащего константную область IgG1 человека и направленного против специфической молекулы-мишени, включающий модификацию аминокислотной последовательности шарнирной области.

Изобретение относится к области иммунологии, биотехнологии и медицины. Предложено моноклональное антитело, специфичное к легумаину, характеризующееся тем, что тяжелая цепь охарактеризована а.о.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом для связывания с антителом, включающим стадии: 1) получение клеток; 2) культивирование клеток; 3) выделение гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом из клеток; 4) необязательную очистку выделенного гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделенному пептиду, который имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), а также к его применению. Предложенный пептид может использоваться в противораковой иммунотерапии, более конкретно, в противораковых вакцинах.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложена коллекция антител (или их функциональных фрагментов), содержащих эмбриональные каркасные участки.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложен конъюгат иммуноглобулина с уменьшенной склонностью к перекрестному сшиванию, включающий иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере одну мутацию по остатку, выбранному из группы, состоящей из 7(VH), 20(VL), 22(VL) и 125(CH1), причем по меньшей мере одна мутация представляет собой замену на остаток цистеина, и атом или молекулу, причем атом или молекула конъюгированы с остатком цистеина, где конъюгация атома или молекулы с остатком цистеина является прямой или опосредованной, а также рекомбинантный полинуклеотид, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин, фармацевтическая композиция, модифицированный иммуноглобулин, способ получения иммуноглобулина и способ получения конъюгата иммуноглобулина.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связывают диффундирующие лиганды, происходящие из β-амилоида, а также к его применению.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины. Способ очистки трипторелина, заключающийся в том, что растворяют трипторелин в 0,6% водном растворе уксусной кислоты, фильтруют методом ультрафильтрации, к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% по объему и перемешивают, проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя градиентное элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК), затем полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки типа СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 5% ИПС и 0,25% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской промышленности. Предложен способ получения террилитина.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу выделения очищенного концентрата тромбина. Способ получения концентрата тромбин, свободного от вирусов, заключающийся в криофракционировании свежезамороженной плазмы донорской крови человека, выделении протромбинового комплекса на анионообменном сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow, активации протромбина раствором СаСl2 в составе протромбинового комплекса с получением тромбина, вирусной инактивации сольвент-детергентным методом и очистке полученного тромбина на катионообменном сорбенте Fractogel EMD-SO3 с последующей стерильной фильтрацией и лиофилизацией.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению антител, и может быть использовано для снижения гетерогенности антител во время культивирования.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ производства лактоферрина, фракция, содержащая лактоферрин, и ее применения.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к сконструированным полипептидам со связывающей сывороточный альбумин аффинностью, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к однореакторному способу приготовления Микафунгина. Способ включает в себя ацилирование пептидного ядра Микафунгина без изолирования активированной боковой цепи Микафунгина из ее реакционной смеси.

Изобретение относится к области пептидной и фармацевтической химии, конкретно к способу получения HPyr-His-TrpOH (I), используемого в качестве ключевого полупродукта (1-3 фрагмента) при синтезе синтетических агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона, LH-RH (ЛГ-РГ).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Способ улучшения производительности вирусного фильтра во время очистки белков предусматривает обработку композиции, содержащей белок, подлежащий очистке, на стадии катионного обмена и на стадии удаления эндотоксинов, одновременно или в любом порядке, перед пропусканием через указанный вирусный фильтр.

Группа изобретений относится к способам синтеза гликопептида, имеющего сиалированную сахарную цепь. Путем реакции этерификации осуществляют связывание смолы, имеющей гидроксильную группу с аминокислотой, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой. Отсоединяют Вос-группу с образованием свободной аминогруппы. Осуществляют элонгацию аминокислоты, связанной со смолой, путем дополнительного связывания другой аминокислоты, у которой азот аминогруппы защищен Вос-группой. Отсоединяют Вос-группу с образованием свободной аминогруппы. Осуществляют гидролиз смолы с помощью кислоты. Указанные аминокислоты по меньшей мере единожды являются сиалированными, причем карбоксильная группа сиаловой кислоты защищена фенацильной группой. Также получают производное сиалилгликоаспарагина. Изобретения позволяют получать сиалированные гликопептиды, в которых присутствует лабильная к щелочам неприродная аминокислота, а также предотвратить деградацию сиаловой кислоты. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 пр.
Наверх