Способ получения ферментного препарата с эндоинулиназной и сахаразной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба penicillium canescens sopp inua3



Способ получения ферментного препарата с эндоинулиназной и сахаразной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба penicillium canescens sopp inua3
Способ получения ферментного препарата с эндоинулиназной и сахаразной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба penicillium canescens sopp inua3
Способ получения ферментного препарата с эндоинулиназной и сахаразной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба penicillium canescens sopp inua3

 


Владельцы патента RU 2605635:

Синицын Аркадий Пантелеймонович (RU)

Изобретение относится к микробиологии. Описан способ получения ферментного препарата с эндоинулиназной и сахаразной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium canescens Sopp INUA3. Изобретение повышает сахаразную активность, достаточную для снижения уровня сахарозы при гидролизе клубней топинамбура, что частично решает проблему эффективного выделения ФОС после ферментативного гидролиза инулина, при сохранении эндоинулиназной активности рекомбинантного штамма. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения ферментных препаратов с эндоинулиназной и сахаразной активностью путем культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium canescens Sopp INUA3 (ВКМ F-4564D), полученного в результате генетической трансформации фрагментом ДНК, содержащим гетерологичный ген эндоинулиназы Aspergillus niger.

Функциональные продукты питания и напитки на сегодняшний день являются самым быстрорастущим сегментом пищевой отрасли на мировом рынке. Тенденция массового перехода на «здоровые» продукты имеет место и в России. Уже сегодня спрос на продукты здорового питания устойчиво растет. Одним из компонентов здорового питания являются пребиотики, вещества, которые селективно ферментируются микрофлорой толстой кишки, вызывая активный рост полезных микроорганизмов, что, в свою очередь, приводит к улучшению пищеварения и усвояемости питательных веществ в организме. К пребиотикам относят соединения углеводной группы - моносахариды, полисахариды и олигосахариды, в частности, фруктоолигосахариды (ФОС). Наиболее популярными в мировой практике пребиотиками являются инулин, биополимер-олигофруктан, состоящий из β-2,1-связанной фруктозы, с остатком глюкозы на невосстанавливающем конце цепи, и фруктоолигосахариды, получающиеся путем расщепления инулина на более короткие полимерные цепочки.

Долгое время считалось, что возможностей для производства инулина и ФОС в РФ нет. Ведущие мировые производители ФОС в качестве сырья используют цикорий. В России же полностью отсутствуют посадки цикория инулиносодержащих сортов в связи с климатическими условиями. В этой связи, особого внимания заслуживает многолетнее растение топинамбур (Heliantnus tuberosus), который, благодаря исключительному биополимерному составу (линейному, в отличии от цикория) становится одной из самых популярных сырьевых культур.

Существует ряд технических решений, связанных с экстракцией фруктоолигосахаридов из клубней топинамбура [RU 2489445]. Данное техническое решение характеризуется высокой энергозатратностью и, как следствие, экономической неэффективностью процесса получения ФОС. В мировой практике существуют и другие способы выделения ФОС из инулинсодержащего сырья, например, связанные с применением кислотного гидролиза инулосодержащего сырья. Однако такие способы экологически небезопасны.

В отличии от вышеуказанных технологий, ферментативный гидролиз инулосодержащего сырья является экологически чистым процессом и происходит под действием так называемого инулиназного комплекса ферментов - набора эндо- и экзоинулиназ, гидролизующих молекулы инулина - основного полисахарида топинамбура с получением ФОС и простых (фруктозы и глюкозы) сахаров, в зависимости от типа используемого фермента. Прототипом такого способа может являться технология получения инулина у компании Sudzucker AG (Mannheim/Ochsenfurt, DE) [Process for the preparation of long-chain inulin with inulinase, US 5478732] и получения ФОС у компании Raffinerie Tirlemontoise (BE) [Fructooligosaccharide composition, process for its production and use, US 20110081449 A1]. Однако оба процесса в данных патентах предполагают использование цикория - основной инулосодержащей культуры Европы.

Таким образом, получение ФОС путем ферментативного гидролиза линейного инулина клубней топинамбура является для современной пищевой индустрии в РФ актуальной и социально-значимой задачей.

В качестве основного инулолитического фермента, используемого для деструкции инулина с получением ФОС применяется эндоинулиназа. Эндоинулиназа (2,1-β-D-фруктанфруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7) является эндодеполимеразой и гидролизует β-2,1-связи инулина преимущественно до ФОС. Данный тип ферментов функционирует в более мягких условиях по сравнению с кислотным гидролизом, широко использующимся на сегодняшний день для деструкции инулина и требующим значительной концентрации ионов водорода, высокой температуры и специального оборудования, устойчивого к агрессивным средам [Yi, Н., Zhang, Lanwei, Hua, С., Sun, K., & Zhang, L. Extraction and Enzymatic Hydrolysis of Inulin from Jerusalem artichoke and their Effects on Textural and Sensorial Characteristics of Yogurt // Food and Bioprocess Tech. - 2009. - V. 3. - N. 2. - P. 315-319].

Ранее, на основе рекомбинантного штамма Penicillium canescens Sopp INUA3 (BКM F-4564D) был получен экспериментальный образец нового ферментного препарата эндоинулиназы (ЭНДИН), характеризующийся высоким содержанием эндоинулиназы с высокой удельной активностью. Данный ферментный препарат осуществляет гидролиз олигофруктана-инулина с образованием более коротких цепочек - фруктоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2 до 8, что является оптимальным размером ФОС, использующихся в пищевой промышленности в качестве пребиотиков [Волков П.В. и др. Получение ферментных препаратов эндоинулиназы для высокоэффективного гидролиза клубней топинамбура, Хранение и переработка сельхозсырья 2012, №2, стр. 12-14; Волков П.В. и др. Получение ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Penicillium canescens с высокой способностью к гидролизу растительного сырья // Прикладная биохимия и микробиология, 2012, т. 48, N1, с. 66-73].

Стоит отметить, что ферментный препарат ЭНДИН, продуцентом которого является рекомбинантный штамм Penicillium canescens, является одним из ряда аналогичных ферментных препаратов инулиназ (2,1-β-D-фруктан-фруктаногидролазы эндо- и/или экзо-типа действия), используемых в мировой практике и предназначенных для гидролиза инулин-содержащего сырья с получением фруктоолигосахаридов и простых сахаров (фруктозы, глюкозы). К таким ферментным препаратам относятся: Novozym 230, Fructozyme SP 230, Fructozyme L (Novozymes) или, например, Oligofructase 3000 (Beldem/Puratos).

Однако, в технологическом процессе переработки топинамбура в ФОС существует стадия отделения фруктоолигосахаридов (ФОС) от низкомолекулярных продуктов (сахарозы и моносахаридов), где применяются мембранные или хроматографические методы разделения [Jerusalem artichoke/chicory comprehensive utilization method, CN 102504048, Continuous type nanofiltration purification and concentration device for inulin extraction, CN 202543120]. Присутствие сахарозы в разделяемой смеси значительно ухудшает параметры разделения, приводит к снижению степени чистоты ФОС на выходе процесса разделения и понижению качества конечной продукции.

Сахароза (a-D-глюкопиранозил-1,2-β-D-фруктофуранозид) под действием фермента сахаразы (α-β-(1,2)-глизозилгидролазы, сахарозо-α-глюкозидазы) расщепляется с образованием D-глюкозы и D-фруктозы. Наличие фермента сахаразы наряду с эндоинулиназной активностью, приведет к понижению уровня сахарозы в реакционной смеси, что приведет к улучшению технологических характеристик процесса биоконверсии топинамбура в ФОС.

Опытным путем было установлено, что штамм Penicillium canescens RN-3-11-7, который является реципиентом штамма Penicillium canescens Sopp INUA3 (ВКМ F-4564D), обладает ферментативной активностью по сахарозе на уровне 36±3 ед/мл культуральной жидкости при использовании стандартной ферментационной среды следующего состава, %: свекловичный жом - 3, пептон - 5, KH2PO4 - 2,5.

Таким образом, стоит задача в получении ферментного препарата, обладающего наряду с эндоинулиназной активностью, также и достаточной сахаразной активностью.

Поставленная задача решается путем модификации условий культивирования штамма P. canescens Sopp INUA3 с целью увеличения сахаразной активности в секретируемом комплексе рекомбинантного штамма.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение сахаразной активности, достаточной для снижения уровня сахарозы при гидролизе клубней топинамбура, что частично решает проблему эффективного выделения ФОС после ферментативного гидролиза инулина, при сохранении эндоинулиназной активности рекомбинантного штамма.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование рекомбинантного штамма Р. canescens Sopp INUA3 в 1-л ферментере на модифицированной ферментационной среде с целью получения сахаразной активности в секретируемом комплексе рекомбинантного штамма.

Культивирование штамма P. canescens Sopp INUA3 ВКМ F-4564D в лабораторном ферментере объемом 1 л, оснащенном системой автоматического регулирования pH, pO2 и температуры, а также барботерами для подачи воздуха в аппарат и двухъярусной мешалкой. Получение инокулята в колбах для засева в ферментеры проводят на среде следующего состава, %: глюкоза - 2,0, KH2PO4 - 1,5, (NH4)2SO4 - 0,5, дрожжевой экстракт - 1,0, CaCl2 - 0,03, MgSO4 × 7H2O - 0,03. После суток культивирования при T=28±0,2°C и pH=6,2±0,2 инокулят переносят в ферментер и культивирование проводят на ферментационной среде следующего состава, масс. %: свекловичный жом - 3, пептон - 5, KH2PO4 - 2,5, пшеничные отруби - 1, вода - остальное. В качестве пеногасителя перед стерилизацией вносят 0,1% Лапрола. Ферментеры засевают 10% вегетативного посевного материала, выращенного в колбах. Температура культивирования - 28±0,2°C; pH в начале ферментации составляет 5,0-5,5, в течение ферментации поддерживается 4,5-5,0. На 3-и и 4-ые сутки культивирования рекомбинантного штамма P. canescens Sopp INUA3 проводят индукцию биосинтеза ферментов лактозой. Для этого 20 г лактозы растворяют в 100 мл стерильной воды и добавляют по 10 мл лактозы в ферментационную среду через 72 и 96 ч соответственно.

Через каждые 24 ч отбирают пробы культуральной жидкости и после удаления биомассы определяют активности целевых ферментов и концентрацию растворимого белка.

Ферментативные активности инулиназы, сахаразы и ксиланазы через 144 ч ферментации, а также концентрация растворимого белка в культуральной жидкости штамма P. canescens Sopp INUA3, выращенного на стандартной среде культивирования, включающей свекловичный жом - 3, пептон - 5, KH2PO4 - 2,5, вода - остальное, и модифицированной среде культивирования с добавками лактозы на 72 и 96 ч культивирования с финальной концентрацией 0,2% приведены в таблице 1.

Из культуральной жидкости штамма P. canescens Sopp INUA3, наработанного в соответствии с примером 1 на средах без добавок лактозы и с добавкой лактозы, получают концентрированные ферментные препараты (ФП) ЭНДИН и INUA-SAC, соответственно, методом лиофильного высушивания ультраконцентрата.

Пример 2. Определение качественного и количественного состава ФП и ЭНДИН и INUA-SAC.

Качественный и количественный состав ФП INUA-SAC определяли хроматографическим методом. Навеску ФП растворяли в 0,1 М Na-ацетатном буфере (pH 5,0), центрифугировали и обессоливали с заменой буфера при помощи гель-проникающей хроматографии на носителе Bio-Gel P-6 фирмы Bio-Rad (США) в 20 мМ буфере bis-Tris-HCl, pH 6,9. Подготовленный таким образом ФП фракционировали с помощью FPLC-системы фирмы «Pharmacia» (Швеция) на анионообменном носителе Source 15Q («Amersham Biosciences), (Швеция) объем колонки составил 1 мл. Образец наносили в стартовом буфере Bis-Tris/HCl при pH 6,9; связавшиеся белки элюировали в градиентой концентрации NaCl от 0 до 0,4М. В полученных в ходе элюирования фракциях, а также в несвязавшейся фракции, определяли инулиназную, ксиланазную и сахаразную активности, а также содержание белка. Ксиланазную активность определяли по начальной скорости образования BC при гидролизе березового ксилана, активность выражали в международных единицах (одна единица активности соответствует количеству фермента, гидролизующего 1 мкмоль гликозидных связей ксилана за 1 мин).

Инулиназную активность по отношению к инулину топинамбура и олигосахаридному субстрату - сахарозе определяли по начальным скоростям образования восстанавливающих сахаров (BC) модифицированным методом Шомоди-Нельсона.

Активность выражали в международных единицах на 1 мг белка (одна единица активности соответствует количеству фермента, гидролизующего 1 мкмоль гликозидных связей субстрата за 1 мин).

Аналогичным образом был определен состав контрольного ФП ЭНДИН.

Содержание целевых и других ферментов в ФП INUA-SAC и ЭНДИН приведено в табл. 2.

Таким образом, путем изменения ферментационной схемы культивирования рекомбинантного штамма P. canescens Sopp INUA3 (ВКМ F-4564D), продуцента гетерологичной эндонулиназы Aspergillus niger, удалось повысить уровень собственной секретируемой сахаразы, без изменения уровня содержания гетерологичной эндоинулиназы.

Пример 3. Применение ФП INUA-SAC и коммерческого препарата Oligofructase 3000 (Beldem/Puratos) при гидролизе клубней топинамбура.

Предварительно вымытые в проточной воде, измельченные на лабораторной мельнице клубни топинамбура подвергали гидролизу в естественных условиях pH среды (в воде) при 50°C, в течение 3 ч, при перемешивании 250 об/мин на орбитальной качалке. Концентрация клубней топинамбура составляет 100 г/л по сухому веществу. Дозировка ФП INUA-SAC и Oligoofructase 3000 - 10 ед/г сухого субстрата. Через 3 ч ферментативного гидролиза отбирают пробу объемом 0,5 мл и центрифурируют для осаждения непрогидролизованного субстрата. С помощью ВЭЖХ с амперометрической детекцией в супернатанте определяют качественный и количественный состав ФОС, содержащийся в клубнях топинамбура. В качестве неподвижной фазы используется сильный анионообменник (колонка типа Carbopak РА 100), подвижной фазы 100 мМ раствор NaOH, элюирование проводилось в градиенте от 0 до 500 мМ NaOAc в течение 20 мин. Результаты представлены на рисунке 1, где получаемые ФОС представлены инулоолигосахаридами со степенью полимеризации от 2 до 6. Из Рисунка 1 следует, что использование ФП INUA-SAC (в тех же условиях и в той же концентрации, что и ФП Oligofructase 3000) приводит к образованию существенно меньшего количества сахарозы при образовании сходного качества и количества ФОС.

1. Способ получения ферментного препарата, обладающего эндоинулиназной и сахаразной активностями, состоящий в культивировании рекомбинантного штамма Penicillium canescens Sopp INUA3 (ВКМ F-4564D) на среде следующего состава (масс. %): свекловичный жом - 3, пептон - 5, КН2РО4 - 2,5, пшеничные отруби - 1, вода-остальное, где через 72 и 96 часов после начала культивирования вносят лактозу в конечной концентрации 0,2%.

2. Ферментный препарат, полученный способом по п. 1 с последующим концентрированием культуральной жидкости и сушкой и обладающий эндоинулиназной и сахаразной активностью.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантные штамм гриба Penicillium verruculosum ВКМ F-4587D и штамм гриба Penicillium verruculosum ВКМ F-4586D, являющиеся продуцентами высокоактивного комплекса целлюлолитических ферментов гриба P.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. Способ получения ферментов целлюлазы и/или гемицеллюлазы микроорганизма Trichoderma ressei предусматривает по меньшей мере одну стадию роста в присутствии углеродного субстрата, который выбирают из глюкозы, ксилозы, лактозы, остатков, полученных после этанольной ферментации мономерных сахаров ферментативных гидролизатов целлюлозной биомассы и/или сырого экстракта водорастворимых пентоз и по меньшей мере одну стадию продуцирования в присутствии индуцирующего субстрата, в котором указанный индуцирующий субстрат представляет собой смесь, содержащую от 40 до 65 мас.% глюкозы или целлюлозных гидролизатов, от 21 до 25 мас.% лактозы и от 10 до 39 мас.% ксилозы или раствора гемицеллюлолозного лигноцеллюлозного гидролизата, причем сумма этих трех компонентов равна 100%.

Изобретение относится к способу разрыва подземной формации, имеющей температуру в скважине, составляющую свыше 160°F, включающий введение в формацию водной гелеобразующей жидкости разрыва с рН от 9,5 до 11, включающей гидратируемый полимер, выбранный из группы, состоящей из гуаровой камеди и из модифицированных гуаровых камедей; сшивающий агент для поперечной сшивки гидратируемого полимера с образованием полимерного геля; и фермент-разжижитель, включающий фермент маннаногидролазу, который имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен штамм микромицета Aspergillus foetidus 379-К-5-1 - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полисахаридов растительного и микробного сырья.

Описаны композиции ферментной смеси для гидролиза смеси целлюлозных и гемицеллюлозных материалов и способы гидролиза таких смесей. Представленные ферментные смеси включают три композиции, первая из которых содержит смесь цельной целлюлазы T.reesei, дополненную β-глюкозидазой Т.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен очищенный препарат рекомбинантного фермента N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза (GALNS) человека, где указанный фермент включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную аминокислотам 27-522 SEQ ID NO:4, пригодный для лечения субъекта, страдающего лизосомальной болезнью накопления, которая ассоциирована с GALNS, где: (a) указанный препарат фермента GALNS имеет чистоту, по меньшей мере, приблизительно 95% при определении окрашиванием кумасси синим при SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях; и (b) остаток цистеина в положении 79, по меньшей мере, приблизительно в 50% молекул фермента GALNS в указанном препарате фермента GALNS преобразован в Cα-формилглицин (FGly); где указанный фермент GALNS является гликозилированным N-связанным гликозилированием по остаткам аспарагина в положениях 204 и 423, где, по меньшей мере, приблизительно 50% олигоманнозных цепей, присоединенных к остатку аспарагина в положении 204, являются бис-фосфорилированными.

Изобретение относится к области биохимии. Описана альфа-D-галактозидаза, обладающая измененной региоспецифичностью по отношению к α1,4-связи и содержащая мутацию либо Pro402Asp, либо Phe328Ala в соответствующем положении аминокислотной последовательности исходного фермента дикого типа, выделенного из штамма Thermotoga maritima MSB8.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой различные варианты модифицированной ксиланазы Семейства 11. .

Изобретение относится к области биохимии и представляет собой способы разрушения целлюлозы и композиции, содержащие фермент, разрушающий целлюлозу, и усиливающий его белок.

Изобретение относится в области биотехнологии. Описан фермент сериновая протеаза грибов, имеющая аминокислотную последовательность зрелого фермента, которая по меньшей мере на 86% идентична аминокислотной последовательности зрелого фермента Fe_RF6318, представленной в описании.

Представленные изобретения касаются выделенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, вовлеченный в биосинтез пирипиропена А, вектора и клетки-хозяина, включающих такой полипептид, и способов получения предшественников пирипиропена А, включающих культивирование клетки-хозяина.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клетке-хозяину Trichoderma reesei для получения целлюлолитической белковой композиции, целлюлолитической белковой композиции, способам получения и применения композиции.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается вектора, предназначенного для получения стабильно трансформированных штаммов грибов Rhizopus oryzae.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантной плазмидной ДНК pZEN16 для переноса и гетерологичной экспрессии генов в Acremonium chrysogenum. .

Изобретение относится к пищевой промышленности и биотехнологии и представляет собой полипептид, обладающий ксиланазной активностью, который может разлагать целлюлозные экстракты и растительные материалы.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при промышленном получении промежуточных продуктов для синтеза цефалоспориновых антибиотиков.

Изобретение относится к фитопатологии, в частности к способу определения грибковых патогенов с использованием специфических праймеров в реакции полимеризации. .

Изобретение относится к области генетической инженерии и биотехнологии. Предложен способ оценки биоактивности химических соединений, где на первой стадии проводят транзиентную трансфекцию клеток линии HEK 293 плазмидным вектором pX-Y-neo (X - любой транскрипционный фактор эукариот, Y - протеотипический пептид, соответствующий данному транскрипционному фактору), содержащим минимальный промотор аденовируса человека типа 5; ген зеленого флуоресцирующего белка; последовательность нуклеотидов, кодирующих сайт связывания транскрипционного фактора; последовательность нуклеотидов, кодирующих протеотипический пептид; ген устойчивости к неомицину, затем на второй стадии определяют активность транскрипционного фактора путем флуоресцентного анализа и хромато-масс-спектрометрического измерения содержания протеотипического пептида в трансфицированной культуре клеток в присутствии тестируемого вещества в сравнении с трансфицированной интактной культурой клеток.
Наверх