Штамм гриба aspergillus foetidus - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полимеров растительного и микробного сырья


 


Владельцы патента RU 2549706:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен штамм микромицета Aspergillus foetidus 379-К-5-1 - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полисахаридов растительного и микробного сырья. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 01136. Преимуществом нового штамма является получение более активного комплекса ферментов, катализирующих гидролиз полисахаридов, а также эндополигалактуроназы и пектинэстеразы. Штамм Aspergillus foetidus RCAM 01136 получен с использованием эффективных методов селекции и мутагенеза с применением УФ-облучения и нитрозогуанидина из известного штамма. Изобретение позволяет расширить ассортимент получаемых ферментов, используемых для деструкции полисахаридов. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus foetidus 379-К-5-1 продуцирует комплекс гидролитических ферментов и депонирован в коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 01136. Изобретение обеспечивает активный синтез комплекса ферментов: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы, применяемых в пищевой промышленности для деструкции растительных субстратов и микробной биомассы, с целью получения биологически активных добавок с заданными функциональными свойствами.

Штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136) получен с использованием эффективных методов селекции и мутагенеза с применением УФ-облучения и нитрозогуанидина (концентрация 0,3%, экспозиция 20 минут) из известного штамма Aspergillus foetidus 379-К (ВКПМ-F-962), используемого для глубинного культивирования при производстве пектиназ.

Изобретение обеспечивает получение комплексного ферментного препарата с широкой субстратной специфичностью для глубокой деструкции растительного и микробного сырья на основе глубинного культивирования нового штамма - продуцента гидролитических ферментов.

Ферменты, катализирующие гидролиз полисахаридов, имеют большое промышленное значение в перерабатывающих отраслях пищевой промышленности для реализации биокаталитических процессов, обеспечивающих эффективную деструкцию полимеров растительного и микробного сырья в технологиях производства соков, морсов, экстрактов и биопрепаратов пищевого и кормового назначения. В связи с этим, селекция новых штаммов - продуцентов комплекса высокоактивных гидролаз: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы, весьма актуальна.

Известен штамм - продуцент комплекса гидролаз, содержащего ксиланазы, β-глюканазы, пектиназы и ксилоглюканазы из рода Aspergillus - Aspergillus aculeatus [1]. Недостатком этого продуцента является отсутствие секретируемых им хитинолитических, протеолитических и маннанолитических ферментов.

Известен штамм-продуцент целлюлаз, β-глюканаз и ксиланаз из рода - Trichoderma - Trichoderma longibrachiatum [2]. Недостатком этого продуцента является отсутствие секретируемых им пектолитических, хитинолитических и протеолитических ферментов.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus foetidus 379-К - один из наиболее активных продуцентов пектиназ, регистрационный номер ВКПМ-F-962 (Патент РФ №2393212, 2010) [3].

Недостатком этого штамма является низкий уровень активности β-глюканазы, хитиназы и маннаназы, необходимых для деструкции микробного сырья.

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма микромицета Aspergillus foetidus, обладающего высокой способностью к образованию комплекса гидролитических ферментов: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы.

Технический результат, получаемый от создания и использования нового штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136), заключается в получении более активного комплекса ферментов, катализирующих гидролиз полисахаридов, уровень активности которых в 2,0-4,0 раза превышает показатели аналога, а также эндополигалактуроназы и пектинэстеразы, уровень активности которых в культуральной жидкости превышает показатели аналога в 1,5 раза, и протеазы, превышающей показатели аналога в 1,2 раза.

Сущность настоящего изобретения - получение нового штамма - продуцента комплекса высокоактивных гидролаз: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы.

Задача решается созданием нового штамма - продуцента комплекса гидролаз путем селекции и комбинированного мутагенеза (химического и физического) из известного штамма Aspergillus foetidus 379-К, способного к синтезу комплекса гидролитических ферментов, необходимых для деструкции микробного и растительного сырья.

Заявляемый штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136) получен путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза с использованием УФ-облучения и нитрозогуанидина.

Активности гемицеллюлолитических ферментов определяли методом Шомоди-Нельсона, основанном на измерении скорости образования восстанавливающих Сахаров при гидролизе субстрата, в результате действия ферментов (3). Активности эндополигалактуроназы и пектиэстеразы по ГОСТ 20264.3-81. Сравнительные показатели уровней активности ферментов в культуральной жидкости штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1 с прототипом представлены в таблице 1.

Таким образом, в результате селекции и комбинированного мутагенеза получен новый активный штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136), обладающий высоким уровнем синтеза комплекса гидролаз, в том числе пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы, что позволяет повысить эффективность технологических процессов при гидролизе растительного и микробного сырья с целью получения комплексных пищевых добавок.

Таблица 1
Сравнительные показатели уровня активности ферментов в культуральной жидкости грибов Aspergillus foetidus 379-К и Aspergillus foetidus 379-К-5-1
Активности ферментов Aspergillus foetidus
Шт.379-К Шт.379-К-5-1
β-Глюканазная, ед β-ГкС/см3 6,5 13,3
Целлюлазная, ед ЦС/с3 2,6 6,1
Ксиланазная, ед КС/см3 3,3 13,5
Маннаназная, ед МС/см3 0,27 0,64
Хитиназная, ед ХС/см3 0,024 0,05
Протеазная, ед ПС/см3 2,2 2,7
Эндополигалактуроназная, ед Эндо-ПгС/см3 2,01 3,7
Пектинэстеразная, ед ПэС/см3 2,1 3,3

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с сусло-агаром в отделе нанотехнологий ферментов, дрожжей, органических кислот и биологически активных добавок Государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии г. Москвы.

Штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 депонирован во Всероссийской Коллекции Полезных Микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) ГНУ ВНИИСХМ под коллекционным номером RCAM 01136.

Культурально-морфологические признаки штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1:

Культура представляет сильно ветвящийся мицелий, разделенный перегородками. Конидии, образуемые микромицетом, гладкие. Форма конидий круглая, редко встречается овальной формы. Цвет конидий черный, с обильным образованием воздушного мицелия. Колонии выпуклые с возвышенностью в центре. Обратная сторона колонии коричневая. Поверхность колонии складчатая.

На среде сусло-агар колонии круглые, к 5 суткам достигают 37-38 мм, имеют мозговидную складчатость. Центральная зона колонии - зона обильного спороношения - диаметром 12-14 мм черного цвета с темно-коричневым оттенком и обильным образованием воздушного мицелия. Край колонии ровный. Обратная сторона колонии коричневого цвета.

На среде с мальтозой колонии круглые, по краю колонии обильный мицелий, размер колонии на 5 сутки - 32-34 мм, край колонии гладкий и ровный, структура колоний крупнозернистая, колонии крупные. Поверхность колоний складчатая. Обратная сторона колонии темно-серого цвета.

На среде с экстрактом солодовых ростков и пшеничных отрубей колонии круглые, по всей колонии воздушный мицелий, край колонии ровный и гладкий, структура колонии мелкозернистая, колонии крупные размер колонии на 5 сутки - 38-40 мм. Поверхность колонии сильно складчатая.

На среде с крахмалом колонии черного цвета, форма колоний круглая, край колоний гладкий, структура колоний крупнозернистая, колонии крупные, размер колонии на 5 сутки - 30-32 мм. Обратная сторона колонии светло-коричневая.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1:

Штамм ассимилирует нитратные и аммонийные соли. Культура слабо усваивает глюкозу. Хорошо усваивает мальтозу, крахмал и сахарозу.

Дыхание аэробное. Оптимальная температура роста 28-30°С; оптимальное значение pH для роста и биосинтеза гриба 5,3-5,5. Рост продуцента имеет место в зоне pH от 2,7 до 3,0. Патогенными свойствами не обладает.

Пример 1. Штаммы Aspergillus foetidus 379-К-5-1 и 379-К культивируют на питательной среде следующего состава: солодовые ростки - 5,0%, пшеничные отруби - 10,0%, (NH4)2SO4 - 1,1%, KH2PO4 - 0,5%, MgSO4 - 0,5%; остальное - водопроводная вода, pH - естественный. Ферментационную питательную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 100 см3, на круговой качалке 220 об/мин при температуре 30°С в течение 72 часов. Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммами 379-К-5-1 и 379-К, составлял: по β-глюканазе - 12,4 ед/см3 и 5,7 ед/см3, по ксиланазе - 8,7 ед/см3 и 5,9 ед/см3, по целлюлазе - 6,0 ед/см3 и 4,8 ед/см3, по хитиназе - 0,039 ед/см3 и 0,018 ед/см3, по маннаназе - 0,57 ед/см3 и 0,19 ед/см3, по протеазе - 2,4 ед/см3 и 1,7 ед/см3, по эндополигалактуроназе - 3,2 ед/см3 и 1,85 ед/см3, по пектинэстеразе - 2,9 ед/см3 и 1,73 ед/см3 соответственно.

Пример 2. Штаммы Aspergillus foetidus 379-К-5-1 и 379-К культивируют на питательной среде следующего состава: солодовые ростки - 5,0%, пшеничные отруби - 10,0%; (NH4)2SO4 - 1,1%; KH2PO4 - 0,5%; MgSO4 - 0,5%; остальное - водопроводная вода, pH - естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 100 см3 питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 48 часов.

Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммами 379-К-5-1 и 379-К, составляет: по β-ГкС - 9,0 ед/см3 и 5,2 ед/см3; по КС - 13,5 ед/см3 и 7,6 ед/см3; по КМЦ - 6,1 ед/см3 и 5,0 ед/см3, по ХС - 0,035 ед/см3 и 0,012 ед/см3, по МС - 0,34 ед/см3 и 0,10 ед/см3, по ПС-1,5 ед/см3 и 1,2 ед/см3, по Эндо-ПгС - 3,7 ед/см3 и 2,01 ед/см3, по ПэС - 1,8 ед/см3 и 1,02 ед/см3 соответственно.

Пример 3. Штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 и 379-К культивируют на питательной среде следующего состава: солодовые ростки - 5,0%, пшеничные отруби - 10,0%; (NH4)2SO4 - 1,1%; KH2PO4 - 0,5%; MgSO4 - 0,5%; остальное - водопроводная вода, pH - естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 100 см3 питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 96 часов.

Максимальное накопление по β-глюканазе наблюдалось у штамма А. foetidus 379-К-5-1 к 96 часам культивирования. Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммами 379-К-5-1 и 379-К, составлял: по β-глюканазе - 13,3 ед/см3 и 6,5 ед/см3, по ксиланазе - 3,6 ед/см3 и 1,56 ед/см3, по целлюлазе - 2,4 ед/см3 и 0,89 ед/см3, по хитиназе - 0,05 ед/см3 и 0,024 ед/см3, по маннаназе - 0,64 ед/см3 и 0,27 ед/см3, по протеазе - 2,7 ед/см3 и 2,2 ед/см3, по эндополигалактуроназе - 2,6 ед/см3 и 1,3 ед/см3, по пектинэстеразе - 3,3 ед/см3 и 2,1 ед/см3 соответственно (табл.2).

Таблица 2
Влияние длительности культивирования на физиологическую активность микромицетов Aspergillus foetidus продуцентов гидролаз
Штамм гриба Длительность культивирования, ч Ферментативная активность, ед./см3
β-ГкС ХС МС Эндо-ПгС ПэС
379-К 48 5,2 0,012 0,1 2,01 1,02
72 5,7 0,018 0,19 1,85 1,73
96 6,5 0,024 0,27 1,3 2,1
379-К-5-1 48 9,0 0,035 0,34 3,7 1,8
72 12,4 0,039 0,45 3,2 2,5
96 13,3 0,05 0,64 2,6 3,3

Источники информации

1. Микробные ферменты и биотехнология. Под редакцией В.М. Фогарти. - Москва: Агропромиздат, 1986.

2. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - Москва: Издательство «Элевар», 2000.

3. ГОСТ Р 53973-2010 Препараты ферментные. Методы определения β-глюканазной активности.

4. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156.

Аналогичные патенты РФ

1. Патент РФ №2303057 С1, C12N 1/14, C12N 9/42. Штамм мицелиального гриба Aspergillus aculeatus - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего ксиланазы, бета-глюканазы, пектиназы и ксилоглюканазы.

2. Патент РФ №2303065 C1, C12N 9/42, C12N 1/14. Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum - продуцент целлюлаз, бета-глюканаз и ксиланаз.

3. Патент РФ №2393212 C1, C12N 1/20, C12N 9/24. Штамм гриба Aspergillus foetidus 379-К - продуцент пектолитических ферментов.

Штамм гриба Aspergillus foetidus 379-К-5-1, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM 01136 - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полимеров растительного и микробного сырья.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к штамму Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и к молочному пищевому продукту, содержащему указанный штамм. Предложенный штамм обладает специфичными в отношении маннозы адгезионными свойствами.

Изобретения относятся к области биотехнологии. Предложены композиция и способ для контроля численности моллюсков классов Gastropoda и Bivalvia.
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены штаммы Cryptococcus flavescens 3C NRRL Y-50378 и Cryptococcus flavescens 4С NRRL Y-50379 для подавления и контроля фузариоза злаков, обладающие устойчивостью к протиоконазолу.
Изобретение относится к молочной промышленности, а именно к способу приготовления кисломолочного продукта. Для получения кисломолочного продукта обезжиренное коровье молоко после пастеризации и охлаждения заквашивают путем добавления суспензии, взятых в равных соотношениях штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП в 1%-ном растворе хлористого натрия в концентрации 5 млрд КОЕ/мл, сквашивают при температуре 38-42°C в течение 6-8 часов до кислотности 100-120°T, вымешивают в течение 30 мин, разливают и направляют на созревание.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения лизогликолипида, способ биоконверсии гликолипидов и способ получения пищевого продукта.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается фармацевтической композиции. Представленная композиция содержит рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Р.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях.

Изобретение относится к области медицины, фтизиатрии и медицинской микробиологии и касается способа генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis. Охарактеризованный способ основан на однонуклеотидном полиморфизме генов систем токсин-антитоксин II типа суперсемейств VapBC, HigAB и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора олигонуклеотидных праймеров для 10 генов систем токсин-анатоксин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности веществ, обладающих способностью встраиваться в биологические мембраны клеточных стенок с нарушением функционирования клеток.

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены соединения A-87774, представленные соединениями A-87774-1, A-87774-2, A-87774-3 или их солью, способ получения соединений A-87774, штамм Streptomyces sp.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения протеиназы - активатора протеина С плазмы крови предусматривает твердофазное культивирование штамма гриба Aspergillus ochraceus BKM F-4104D на питательной среде.

Изобретение относится к применению питательной добавки, используемой на стадии одновременного осахаривания-ферментации при производстве этанола из крахмалистого сырья.
Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека. .

Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека. .
Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека. .

Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека. .

Изобретение относится к пищевым продуктам, содержащим специфичную к пролину протеазу, способам их производства и применению специфичной к пролину протеазы при производстве пищевых продуктов.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения фермента - комплекса кислых и слабокислых протеаз. .

Изобретение относится к биохимии. Описаны варианты ксилоглюканазы, имеющие ряд замен, а также полинуклеотиды, кодирующие указанные варианты ксилоглюканазы.
Наверх