Способ получения комплексного шигеллезного препарата



Способ получения комплексного шигеллезного препарата
Способ получения комплексного шигеллезного препарата
Способ получения комплексного шигеллезного препарата
Способ получения комплексного шигеллезного препарата
Способ получения комплексного шигеллезного препарата

 


Владельцы патента RU 2614123:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (RU)

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа получения низкопирогенного комплексного шигеллезного препарата, обладающего протективной активностью против шигеллеза Флекснера 2а и шигеллеза Зонне. Способ включает перемешивание равных весовых количеств модифицированного липополисахарида Shigella flexneri 2а и экзополисахарида Shigella sonnei в буферном растворе следующего состава: 0,2 М NaCl, 0,05 М трис, 0,25% дезоксихолат натрия рН 8,3, при температуре 80°С с последующим диализом против того же буферного раствора без дезоксихолата натрия и далее против деионизованной воды с последующей лиофилизацией. При этом в модифицированном липополисахариде Shigella flexneri 2а липид А является частично О-дезацилированным. Получен указанный модифицированный липополисахарид Shigella flexneri 2а в результате избирательного щелочного гидролиза исходного липополисахарида Shigella flexneri 2а. Изобретение позволяет получить препарат с низкой токсичностью, высокой эффективностью и бимодальной специфичностью. 2 ил., 3 табл., 5 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и биотехнологии, и может быть использовано при создании комбинированных вакцинных препаратов против шигеллезов Флекснера и Зонне.

Предшествующий уровень техники

Бактериальная дизентерия является чрезвычайно широко распространенным в мире заболеванием, поражающим только человека. Дизентерия вызывается микроорганизмами рода Shigella. По данным ВОЗ, каждый год в мире регистрируется более 200 млн случаев дизентерии, от дизентерии ежегодно умирает до 1,1 миллиона человек. Проблема борьбы с этим заболеванием является актуальной как для развивающихся, так и для развитых стран.

Среди возбудителей дизентерии серьезную опасность представляют Shigella flexneri и Shigella sonnei вследствие их высокой вирулентности и способности вызывать летальные случаи инфекции как у детей, так и у взрослых.

Шигеллез Флекснера является одним из наиболее часто регистрируемых заболеваний в развивающихся странах, коммерческих вакцин для его профилактики к настоящему моменту не создано. Подгруппа S.flexneri включает 15 сероваров, среди которых S.flexneri 2а наиболее распространен, и поэтому его аттенуированные штаммы, а также конъюгированные препараты на основе выделенных из него антигенных полисахаридов входят в состав всех кандидатных протективных препаратов для профилактики шигеллеза Флекснера.

Шигеллез Зонне, в отличие от шигеллеза Флекснера, чаще встречается в развитых странах, причем центром вспышки заболевания является обычно предприятие общественного питания. Оба этих инфекционных агента вызывают тяжело текущую дизентерию, особенно опасную для детских контингентов. Ежегодно страдают от шигеллезов несколько сот миллионов человек в различных регионах мира.

Основным природным механизмом защиты против шигелл является индукция адаптивного гуморального и, в особенности, местного иммунного ответа в форме антител, направленных преимущественно против бактериального эндотоксина - липополисахарида (ЛПС) в случае S.flexneri, а в случае S.sonnei - против капсульного полисахарида (КПС), продуцируемого данным микробом.

В связи с этим в основе одной из современных разрабатываемых иммунофармакологических стратегий лежит активация протективного адаптивного иммунитета с помощью полисахарид-содержащих антигенов, вводимых парентерально, т.е. системно [Robbins, J.B., С. Chu, and R. Schneerson, Hypothesis for vaccine development: protective immunity to enteric diseases caused by nontyphoidal salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgG antibodies to the O-specific polysaccharide of their lipopolysaccharides. Clin Infect Dis, 1992. 15(2): p. 346-61].

Липополисахарид (ЛПС), расположенный на наружной поверхности внешней мембраны клеточный стенки, является основным полисахаридным антигеном грамотрицательных бактерий. ЛПС представляет собой семейство структурно родственных амфифильных макромолекул. Полисахаридный фрагмент ЛПС представлен О-специфическим полисахаридом (ОПС), построенным из олигосахаридных повторяющихся звеньев (ПЗ), количество которых может составлять от одного до нескольких десятков. ОПС присоединяется к олигосахариду кора, который, в свою очередь, связан с липидным компонентом - липидом А, который представляет собой гидрофобный фрагмент ЛПС. Липид А служит «якорем», удерживающим молекулу ЛПС в мембране микробной клетки, а полисахаридный фрагмент направлен вовне, в сторону окружающей среды.

В настоящее время можно считать доказанным, что структура ОПС уникальна для каждого микроорганизма, причем во многих случаях специфические антитела к ОПС, индуцируемые иммунной системой организма хозяина в ответ на появление ЛПС, играют ключевую роль в защите от соответствующей бактериальной инфекции.

Иммунизация бактериальным ЛПС обеспечивает индукцию как циркулирующих сывороточных, так и секреторных анти-ЛПС антител. Таким образом, вакцина на основе ЛПС должна обладать высоким протективным потенциалом. Однако хорошо известно, что помимо способности к активации адаптивного иммунитета ЛПС даже в минимальных дозах является мощным эндотоксином, в частности, в ответ на появление даже нанограммовых количеств ЛПС в макроорганизме может возникнуть состояние септического шока как следствие индукции значительных количеств цитокинов (фактор некроза опухолей-α, интерлейкин 1-β и интерферонов).

Следовательно, важной задачей при конструировании вакцинных препаратов на основе ЛПС является снижение их эндотоксических свойств при сохранении иммуногенности.

Наряду с ЛПС, еще одним важным в иммунологическом отношении полисахарид-содержащим биополимером, который продуцируют клетки некоторых грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, является капсульный полисахарид (КПС), который располагается вне бактериальной клетки, формируя обширный защитный слой, и способен индуцировать образование протективных антител.

Для профилактики шигеллезов, вызываемых микроорганизмами S.flexneri, серотип 2а и S.sonnei, нами недавно разработаны вакцинные препараты на основе полисахарид-содержащих антигенов, полученных из S.flexneri 2а [заявка PCT/RU 2013/000456 от 04 июня 2013 г., дата публикации 11 декабря 2014 г., Pub. No.: WO/2014/196887] и S.sonnei, фаза 1 [заявка WO 2012154072 A1, дата публикации 15 ноября 2012 г.].

В реальных полевых условиях, особенно в условиях био-техногенных катастроф, возникновение эпидемических вспышек дизентерии связано с сочетанным заражением S.sonnei и S. flexneri, поэтому необходим комплексный шигеллезный препарат (КШП) в виде комбинации полисахарид-содержащих антигенов обоих видов бактерий. Такой комплексный шигеллезный препарат, или комбинированная полисахаридная шигеллезная вакцина, может рассматриваться как важный потенциальный инструмент противоэпидемической защиты в случае индукции одновременного бимодального (двунаправленного) протективного иммунного ответа против шигелл Зонне и Флекснера.

Раскрытие изобретения

Разработан способ получения эффективного и безопасного комплексного шигеллезного препарата (КШП), представляющего собой комплексную бивалентную профилактическую вакцину против шигеллезов Флекснера и Зонне на основе модифицированного ЛПС (м-ЛПС) S.flexneri 2а и обладающего протективными свойствами низкоэндотоксичного капсульного экзополисахарида (ЭПС) S.sonnei, фаза 1, способную при парентеральном введении защитить человека от заболевания дизентерией (шигеллезом) при заражении как S.flexneri 2а, так и S.sonnei.

Эндотоксичность исходного ЛПС S.flexneri 2а обусловлена наличием в его составе липида А, который представляет собой, как правило, дисахарид, построенный из двух фосфорилированных остатков глюкозамина, каждый из которых N- и О-ацилирован (в положениях 3- и 3') четырьмя остатками 3-гидроксимиристиновой кислоты (ГМК), которые называют первичными. Два других остатка негидроксилированных высших жирных кислот (чаще всего лауриловой и миристиновой) О-ацилируют два из вышеуказанных остатков ГМК, которые называют вторичными. Таким образом, так называемый «классический» липид А содержит шесть остатков (четыре первичных и два вторичных) высших жирных кислот [Knirel Yu.A., Valvano М.A. Bacterial Lipopolysaccharides. Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction with Host Cells. Springer Wien New York, 2011, 440 pp.]. Известно, что частичное удаление О-связанных высших жирных кислот из липида А приводит к существенному снижению эндотоксичности ЛПС. Описано множество препаратов м-ЛПС, но ни один из них не обладал достаточным уровнем безопасности. Лишь недавно [заявка PCT/RU 2013/000456 от 04 июня 2013 г., опубликована 11 декабря 2014 г., Pub. No.: WO/2014/196887] нами было установлено, что препаративное получение клинически приемлемых м-ЛПС возможно с помощью парциального щелочного гидролиза исходного ЛПС, в результате чего происходит частичное О-дезацилирование липида А с сохранением лишь 3 из 5-6 остатков жирных кислот. Изучение способности полученного нами препарата м-ЛПС к индукции специфических протективных антител IgG класса показало, что в этом отношении он практически не уступает исходному ЛПС. При иммунизации низкоэндотоксичным м-ЛПС, как и в случае исходного ЛПС, реализуется механизм иммунной памяти, что указывает на возможность создания вакцин на основе низкоэндотоксичных м-ЛПС. Первым компонентом КШП против шигеллезов Флекснера и Зонне, получаемого в соответствии со способом, являющимся предметом настоящего изобретения, является обладающий протективными свойствами низкоэндотоксичный м-ЛПС, полученный из липополисахарида (ЛПС) S.flexneri 2а. Другим важным в иммунологическом отношении полисахарид-содержащим биополимером, который продуцируют клетки некоторых грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, является КПС. Разработанная нами вакцина на основе экзополисахарида (ЭПС) из S.sonnei, фаза 1 [заявка WO 2012154072 A1, дата публикации 15 ноября 2012 г.] используется в качестве коммерческого препарата.

Вторым компонентом КШП против шигеллезов Флекснера и Зонне, получаемого в соответствии со способом, являющимся предметом настоящего изобретения, является ЭПС из S. Sonnei.

Впервые разработан способ получения комплексного шигеллезного препарата против шигеллезов Флекснера и Зонне с учетом структурных и физико-химических характеристик каждого компонента.

Очевидно, что эффективность и безопасность препаратов для парентерального введения критически зависит как от природы иммуногенов - компонентов вакцины, так и от способа сборки конечного бивалентного препарата, который должен активировать системный иммунный ответ одновременно с индукцией местного иммунитета при низкой токсичности, обеспечивая при этом защиту от обоих патогенов.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа получения эффективного и безопасного КШП, представляющего собой молекулярную комбинированную полисахаридную профилактическую вакцину против шигеллезов как Флекснера, так и Зонне, полученную с учетом структурных и физико-химических характеристик каждого компонента.

Технический результат состоит в получении КШП, обладающего протективной активностью против шигеллеза Флекснера 2а и шигеллеза Зонне, обеспечивающего высокую эффективность и бимодальную (двунаправленную) специфичность. Иммунизация экспериментальных животных комплексным шигеллезным препаратом, полученным заявляемым способом, обеспечивает

- прямую защиту животных на моделях экспериментальных инфекций от заражения S.flexneri 2а и S.sonnei через слизистую оболочку;

- низкую пирогенность комплексного шигеллезного препарата, полученного заявляемым способом из индивидуальных м-ЛПС и их комбинаций.

Указанный технический результат достигается тем, что производится перемешивание равных весовых количеств м-ЛПС Shigella flexneri 2а с частично дезацилированным липидом А, полученным в результате щелочного гидролиза исходного ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС Shigella sonnei в буферном растворе следующего состава: 0,2 М NaCl, 0,05 М трис, 0,25% дезоксихолат натрия рН 8,3, при температуре 80°С с последующим диализом против того же буферного раствора без дезоксихолата натрия и далее против деионизованной воды с последующей лиофилизацией.

Еще одним аспектом изобретения является способ получения КШП против шигеллеза Флекснера 2а и шигеллеза Зонне, когда в качестве демицеллирующего агента используется дезоксихолат натрия в концентрации от 0,1% до 1%.

Очищенный препарат м-ЛПС S.flexneri 2а получают с использованием бактерий S.flexneri 2а [заявка PCT/RU 2013/000456 от 04 июня 2013 г., дата публикации 11 декабря 2014 г., Pub. No.: WO/2014/196887].

Очищенный препарат ЭПС получают с использованием бактерии S.sonnei, фаза 1 [Заявка WO 2012154072 A1, дата публикации 15 ноября 2012 г.].

Готовят КШП, для чего равные количества очищенных препаратов м-ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС S.sonnei, фаза 1, растворяют в буферном растворе следующего состава: 0,2 М NaCl, 0,05 М трис, содержащем детергент - дезоксихолат натрия (ДОХ) (рН 8,3) в диапазоне концентраций от 0,1 до 1%, с последующим диализом против того же буфера, не содержащего ДОХ, а затем против деионизованной воды.

Полученный таким образом КШП используют для иммунизации. В качестве фармакологически пригодного разбавителя используют любые подходящие растворы для парентерального применения.

Оценку протективного эффекта и пирогенности КШП проводят путем исследования реакции иммунной системы на экспериментальных животных.

Протективный эффект КШП оценивают по его способности осуществлять прямую защиту от заражения бактериями S.flexneri 2а и S.sonnei, которую анализируют с помощью керато-конъюнктивального теста на морских свинках.

Пирогенность КШП определяют в опытах на кроликах.

Анализ физико-химических характеристик КШП проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), гель-хроматографии на колонке с Сефарозой CL-4B и Н1-ЯМР-спектроскопии.

В состав КШП входят антигены с различающимися физико-химическими характеристиками. Различия обусловлены тем, что полисахаридные области этих антигенов обладают различной степенью гидрофильности, а их липидные фрагменты - различной степенью гидрофобности. Таким образом, с учетом общей архитектоники и особенностей первичной структуры обоих антигенов следует ожидать критических различий в их амфифильности.

Наиболее информативным методом изучения амфифильности является анализ молекулярно-массового распределения (ММР) с помощью гель-хроматографии. Сравнительный анализ КШП, смеси антигенов, а также отдельных антигенов, входящих в его состав, проводят с помощью гель-хроматографии на колонке с Сефарозой CL-4B с использованием в качестве элюента PBS.

Анализ ММР отдельных антигенов, входящих в состав комплексного шигеллезного препарата, показывает, что пик, соответствующий м-ЛПС S.flexneri 2а, элюируется вблизи свободного объема колонки, тогда как пик ЭПС S.sonnei, фаза 1, - в области полного объема колонки. Этот результат вполне ожидаем: амфифильные молекулы ЛПС образуют в водных растворах агрегаты огромной молекулярной массы, в состав которых входят сотни молекул ЛПС [Seltmann G, Hoist О. The bacterial cell wall, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2002], а полисахаридные цепи ЭПС S.sonnei таким свойством не обладают из-за низкой гидрофобности входящего в их состав липидного компонента.

При анализе с помощью гель-хроматографии ММР КШП на хроматограмме наблюдается три пика, первый из которых элюируется позже исходного м-ЛПС S.flexneri 2а, а более низкомолекулярные продукты (пики 2 и 3) элюируются раньше, чем исходный ЭПС S.sonnei, фаза 1.

Для идентификации каждого из продуктов материал, соответствующий каждому пику (1, 2 и 3), собирают, обессоливают, лиофилизируют и анализируют с помощью Н1-ЯМР-спектроскопии.

Сравнительное изучение индивидуальных исходных антигенов (м-ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС S.sonnei, фаза 1) и продуктов 1, 2 и 3 помощью Н1-ЯМР-спектроскопии дает следующий результат. Н1-ЯМР спектр каждого из выделенных с помощью гель-хроматографии продуктов 1, 2 и 3 представляет собой суперпозицию спектров двух исходных антигенов - м-ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС S.sonnei, фаза 1, причем из сопоставления интегральной интенсивности сигналов протонов метальных групп остатков 6-дезоксисахаров и N-ацетильных остатков аминосахаров, входящих в состав обоих (индивидуальных исходных антигенов) полисахарид-содержащих биополимеров, следовало, что соотношение этих компонентов близко к эквимолярному.

Таким образом, обработка детергентом приводит к демицеллированию м-ЛПС, а в процессе удаления детергента в результате диализа происходит образование агрегатов различной молекулярной массы, включающих как молекулы м-ЛПС S.flexneri 2а, так и молекулы ЭПС S.sonnei, фаза 1. Аналитический хроматографический анализ ММР выделенных продуктов в описанных выше условиях показывает неизменность их времени удерживания, что указывает на их стабильность.

Изобретение проиллюстрировано 2 чертежами.

На фиг. 1 представлен профиль гель-хроматографии КШП, полученного при растворении равных количеств м-ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС S.sonnei, фаза 1, в буферном растворе 0,2 М NaCl, 0,05 М трис, содержащем 0,25% детергента - дезоксихолата натрия (ДОХ), рН 8,3, с последующим диализом против буферного раствора без ДОХ и деионизованной воды, на колонке с сефарозой CL-4B (элюент - PBS).

На фиг. 2 представлены спектры 1Н-ЯМР Фракций 1, 2 и 3, полученных при гель-хроматографии КШП.

Ниже представлены примеры реализации описываемого изобретения, где в примерах 1, 2 показаны этапы осуществления способа получения и анализ КШП (вакцины против шигеллезов Флекснера и Зонне), а в примерах 3-5 приведена экспериментальная оценка эффективности полученных препаратов.

Пример 1. Получение КШП

Раствор 10 мг м-ЛПС S.flexneri 2а и 10 мг ЭПС S.sonnei, фаза 1, в 5 мл буфера (0,2 М NaCl, 0,05 М трис, 0,25% ДОХ, рН 8,3) перемешивают 5 мин при 80°С, после охлаждения раствор диализуют против этого буфера, не содержащего ДОХ (смена буфера 6 раз), а затем 3 суток против деионизованной воды. Полученный раствор КШП лиофилизуют, анализируют и используют для иммунизации.

Пример 2. Анализ КШП

Препарат КШП, полученный заявляемым способом и представляющий собой композицию из препаратов м-ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС S.sonnei, а также препараты м-ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС S.sonnei, фаза 1, анализируют с помощью ВЭЖХ (колонка TSK G-5000 PWXL 7,8×300mm, PBS, скорость элюции 0,5 мл/мин, детектирование с помощью проточного рефрактометра Agilent 1260).

При этом профиль элюции комплексного шигеллезного препарата существенно отличается от картины совместной хроматографии исходных биополимеров: м-ЛПС S.flexneri 2а и ЭПС S.sonnei, фаза 1, элюируются в области 16-17 мин, тогда как уширенный пик комплексного продукта наблюдается в области 11-14 мин, а пики, соответствующие исходным антигенам, практически не наблюдаются. Это однозначно указывает на повышение молекулярной массы образующегося препарата по сравнению с исходными антигенами, что, по-видимому, связано с образованием надмолекулярных агрегатов, в состав которых входят амфифильные макромолекулы обоих типов, причем межмолекулярные связи образуются за счет имеющихся в них гидрофобных фрагментов - липида А (ЛПС) и фосфолипида (ЭПС). При этом при солиофилизации водных растворов обоих биополимеров образования продуктов с более высокой молекулярной массой, чем у исходных компонентов, не наблюдается.

КШП анализируют с помощью гель-хроматографии на колонке (1,0×90 см) с Сефарозой CL-4B в ФСБ (фиг. 1). Фракции 16-23, 24-28 и 29-34 (суммарные фракции обозначены на чертеже как Фракция 1, Фракция 2 и Фракция 3, соответственно) объединяют, диализуют против воды и лиофилизуют.

Фракции 1, 2 и 3 анализируют с помощью 1Н-ЯМР спектроскопии. Сравнительный анализ спектров 1H-ЯМР всех выделенных продуктов показывает, что каждый из спектров представляет собой суперпозицию спектров исходных биополимеров, Таким образом, все три продукта содержит оба исходных антигена, причем различие в молекулярных массах полученных продуктов обусловлено разным соотношением этих антигенов в образующихся агрегатных конструкциях. Это следует из сопоставления интегральных интенсивностей сигналов СН3-групп остатков 6-дезоксисахаров, входящих в состав обоих полисахаридов. В повторяющемся пентасахаридном звене О-специфического полисахарида м-ЛПС содержится 3 остатка L-рамнозы (химический сдвиг сигналов метальных групп при 1,28-1,32 м.д.), а в дисахаридном повторяющемся звене ЭПС - один остаток 4-амино- N-ацетил-L-фукозы (химический сдвиг метальной группы при 1,49 м.д.). Учитывая то, что приблизительное содержание 6-дезоксисахаров в обоих полисахаридньгх антигенах отличается незначительно (около 60 и 50%, соответственно), можно сделать вывод, что продукт Фракция 3 содержит их в приблизительно эквимолярных количествах (фиг. 2), тогда как Фракция 2 и Фракция 1 включают м-ЛПС и ЭПС в приблизительном соотношении 2:1 и 3:1, соответственно.

Пример 3. Пирогенные свойства КШП

Пирогенность КШП, приготовленного по способу, являющемуся предметом настоящего изобретения, определяют на кроликах массой 2,80-3,05 кг по методике определения пирогенности в соответствии с ОФС 42-0061-07 [ГФ XII, Государственная фармакопея Российской Федерации. «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», ч. 1, Москва, 2007, с. 125] при внутривенном введении препарата в дозе 50 нг/мл на 1 кг веса животного. После введения препарата трижды измеряют ректальную температуру кроликов с интервалом через 1 час. Препарат считают апирогенным, если он не вызывает подъема температуры ни у одного из подопытных кроликов более чем на 0,5°С по сравнению с исходной температурой, а сумма подъемов температур у подопытных кроликов не превышает 1,2°С. Результаты представлены в Таблице 1.

Как видно из приводимых данных, КШП, приготовленный по способу, являющемуся предметом настоящего изобретения, не вызывает повышения температуры тела у кроликов больше, чем естественные среднесуточные колебания Δt>0,5°С. Суммарное изменение температуры (ΣΔ>t°C) у 3 кроликов не превышает норму для апирогенных препаратов, обозначенную в ГФХII и равную 1,2°С.

Пример 4. Определение протективной активности КШП по отношению к шигеллезу) Зонне

Протективную активность КШП, приготовленного по способу, являющемуся предметом настоящего изобретения, определяют с использованием керато-конъюнктивального теста на морских свинках (теста Серени) [Sereny В. A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines. Acta Microbiol. Acad. Sci Hung., 1962, v. 9, p. 55-60].

Определяют 50%-ную инфекционную дозу (ИД50) и 100%-ную инфекционную дозу (ИД100) вирулентного штамма S.sonnei 5063. Для этого интактных морских свинок заражают в конъюнктиву глаз указанным штаммом дозами по 1×108, 2×108, 4×108 микробных клеток и определяют количество и долю здоровых глаз.

Для определения протективной активности КШП по отношению к шигеллезу Зонне проводят двукратную иммунизацию морских свинок КШП, содержащим 50 мкг активного вещества (в соотношении антигенов S.sonnei и и S.flexneri 1:1, т.е. 25 мкг ЭПС S.sonnei 5063 и 25 мкг м-S-LPS S.flexneri 2a), подкожно в область спины. На 10-й день после повторной иммунизации морских свинок заражают в конъюнктиву глаза вирулентным штаммом S.sonnei.

Протективную активность оценивают на третьи сутки по количеству и % здоровых глаз (таблица 2).

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что при заражении ИД50 вирулентным штаммом S.sonnei морских свинок, иммунизированных КШП, протективная эффективность составила 80% (осталось здоровыми 8 из 10 глаз), тогда как в группе контроля осталось здоровыми 5 из 10 глаз, или 50%. При повышении дозы заражения до ИД100 протективная эффективность комплексного препарата составила 90% (осталось здоровыми 9 из 10 зараженных глаз), тогда как в контрольной группе неиммунизированных животных ни один из 10 зараженных глаз не остался здоровым.

Таким образом, КШП на основе антигенов S.sonnei и S.flexneri 2а в исследованной дозе (содержащий 25 мкг S.sonnei 5063 и 25 мкг м-S-LPS S.flexneri2a), полученный по способу, являющемуся предметом настоящего изобретения, обладает выраженной протективной эффективностью у морских свинок от шигеллеза Зонне (защищает иммунизированных этой дозой животных от развития кератоконъюнктивита при заражении вирулентным микроорганизмом в конъюнктиву глаза).

Пример 5. Определение протективной активности КШП по отношению к шигеллезу Флекснера

Протективную активность КШП, приготовленного по способу, являющемуся предметом настоящего изобретения, определяют с использованием керато-конъюнктивального теста на морских свинках (теста Серени) [Sereny В.A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines. Acta Microbiol. Acad. Sci Hung., 1962, v. 9, p. 55-60].

Определяют ИД50 и ИД100 вирулентного штамма S. flexneri 2а 1605. Для этого интактных морских свинок заражают в конъюнктиву глаз указанным штаммом дозами по 1×108, 2×108, 4×108 микробных клеток и определяют количество и долю здоровых глаз.

Для определения протективной активности КШП по отношению к шигеллезу Флекснера проводят двукратную иммунизацию морских свинок КШП, содержащим 50 мкг активного вещества (в соотношении антигенов S.sonnei и S.flexneri 1:1, т.е. 25 мкг ЭПС S.sonnei 5063 и 25 мкг m-S-ЛПС S.flexneri 2a), подкожно в область спины. На 10 день после повторной иммунизации, морских свинок заражают в конъюнктиву глаза вирулентным штаммом S.flexneri 2а.

Протективную активность оценивают на третьи сутки по количеству и % здоровых глаз (таблица 3).

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что при заражении ИД50 вирулентным штаммом S.flexneri 2а морских свинок, иммунизированных препаратом, протективная эффективность составила 100% (остались здоровыми 10 из 10 глаз), тогда как в контрольной группе остались здоровыми 5 из 10 глаз, или 50%. При повышении дозы заражения до ИД100 протективная эффективность комплексного препарата составила 80% (остались здоровыми 8 из 10 зараженных глаз), тогда как в контрольной группе признаки заболевания наблюдались во всех 10 из 10 зараженных глаз.

Таким образом, КШП на основе антигенов S.sonnei и S.flexneri 2а в исследованной дозе (содержащий 25 мкг ЭПС S.sonnei 5063 и 25 мкг м-S-LPS S.flexneri 2a), полученный по способу, являющемуся предметом настоящего изобретения, обладает выраженной протективной эффективностью у морских свинок от шигеллеза Флекснера (защищает иммунизированных этой дозой животных от развития кератоконъюнктивита при заражении в конъюнктиву глаза).

Способ получения низкопирогенного комплексного шигеллезного препарата, обладающего протективной активностью против шигеллеза Флекснера 2а и шигеллеза Зонне, включающий перемешивание равных весовых количеств модифицированного липополисахарида Shigella flexneri 2а с частично О-дезацилированным липидом А, полученного в результате избирательного щелочного гидролиза исходного липополисахарида Shigella flexneri 2а, и экзополисахарида Shigella sonnei в буферном растворе следующего состава: 0,2 М NaCl, 0,05 М трис, 0,25% дезоксихолат натрия рН 8,3, при температуре 80°С с последующим диализом против того же буферного раствора без дезоксихолата натрия и далее против деионизованной воды с последующей лиофилизацией.



 

Похожие патенты:
Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для защиты жвачных животных от пневмонии, вызываемой P. Multocida.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины и касается вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

Изобретение относится к области медицины. Предложена вакцина против пневмонии, вызываемой Streptococcus pneumoniae, на основе гибридного белка, соответствующего SEQ ID NO:1, включающего фрагменты белков Streptococcus pneumoniae PspA, Spr1895, PsaA, а также компоненты флагеллина в качестве адъюванта, соединенные гибкими мостиками.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированной бактерии Salmonella enterica, которые содержат, по меньшей мере, один оперон pgl из Campylobacter jejuni или его функциональное производное и относится к презентации, по меньшей мере, одного N-гликана из Campylobacter jejuni или производного этого N-гликана на их клеточной поверхности.
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает иммунизацию ассоциированной инактивированной вакциной из равных частей вакцины против сальмонеллезного аборта из штамма бактерий Sal.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины и касается способа изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается вакцины против сальмонеллеза свиней, способу ее изготовления и способу профилактики сальмонеллеза свиней.

Изобретение относится к медицине, а именно фармацевтике. .
Наверх