Штамм базидиомицета trametes hirsuta - продуцент этилового спирта


 


Владельцы патента RU 2630997:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный университет нефти и газа (национальный исследовательский университет) имени И.М. Губкина" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм базидиального гриба Trametes hirsute, обладающий способностью продуцировать этиловый спирт, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-1287. Штамм Trametes hirsute ВКПМ F-1287 позволяет получать биоэтанол с высоким выходом, не содержащим такие примеси, как ацетон и изопропанол. 1 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма базидиомицета Trametes hirsuta, продуцирующего этанол из глюкозы целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья. Биоэтанол, получаемый с помощью базидиальных грибов, может быть использован в качестве компонента топлива для двигателей внутреннего сгорания, в медицине и пищевой промышленности.

Известен штамм базидиомицета Phlebia sp.MKFC40001, способный продуцировать этиловый спирт из древесных опилок с выходом, достигающим 43,9% от теоретически возможного, за 20 суток инкубирования в полуанаэробных условиях. Недостатком указанного штамма является необходимость предобработки лигноцеллюлозного субстрата в аэробных условиях в течение 8 недель (US 9145568, 2015).

Также известен штамм Phanerochaete chrysosporium, продуцирующий этиловый спирт из лигноцеллюлозных субстратов (дробленое зерно, кукурузная солома) путем их твердофазного сбраживания в полуанаэробных условиях. Недостатком указанного штамма является способность продуцировать также и примеси - ацетон и изопропанол (US 8309328, 2012).

Наиболее близким аналогом заявленного штамма является штамм Trametes hirsuta, способный продуцировать из углеводного сырья до 9,7 г/л этанола за 5 дней ферментации (JP 2012055307, 2012). При этом, однако, выход этилового спирта недостаточен. Кроме того, указанный штамм способен продуцировать спирт только из углеводного сырья, таким образом, спектр используемого сырья ограничен.

Техническая проблема заключается в получении нового эффективного штамма - продуцента этилового спирта из глюкозы, целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья.

Указанная техническая проблема достигается созданием штамма базидиомицета Trametes hirsuta ВКПМ F-1287 - продуцента этилового спирта из глюкозы, целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья.

Технический результат заключается в создании штамма, способного продуцировать этиловый спирт из расширенного спектра исходного сырья - глюкозы, целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья (субстратов) с высоким выходом целевого продукта высокого качества, не содержащего такие примеси, как ацетон и изопропанол.

Новый штамм Trametes hirsuta выделен из природного плодового тела, найденного на мертвой древесине Betula pendula. Кусочки гриба, выделенные из стерильной части плодового тела, в асептических условиях были перенесены на плотную питательную среду (сусловый агар), содержащую 30 мг/л цефотаксима. Принадлежность выделенного штамма к чистой базидиальной культуре определили по наличию пряжек на мицелии. Таксономическая принадлежность заявляемого штамма к виду Trametes hirsuta подтверждена молекулярно-генетическим методом. Штамм базидиального гриба T. hirsuta депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика и имеет регистрационный номер ВКПМ F-1287.

Характеристики штамма Trametes hirsuta.

Выделенный штамм относится к классу Basidiomicetes, подклассу Agaricomycetidae, порядку Polyporales, семейству Polyporaceae, роду Trametes, виду hirsuta. Вид T. hirsuta не патогенен для человека и не образует токсичные метаболиты ни на одной из стадий морфогенеза.

Условия культивирования: сусловый агар, температура +26°C.

Условия хранения: в пробирках с сусловым агаром при +4°C в течение 12-18 месяцев без пересева.

Макроморфологические признаки: На сусловом агаре колония округлая с ризоидным краем, пушится вокруг инокулюма, профиль приподнятый. Воздушный мицелий белого цвета, субстратный мицелий бесцветный. По мере старения мицелий становится плотным, кожистым.

Микроморфологические признаки:

Гифы воздушного мицелия до 4 мкм в диаметре, разветвленные, короткие. На мицелии имеются округлые медальонные пряжки стабильной формы.

Способностью продуцировать этиловый спирт обладает мицелий T. hirsuta, выращенный в условиях погруженного культивирования.

Вегетативный мицелий базидиомицета выращивают в погруженной культуре в асептических аэробных условиях. Культивирование осуществляют в качалочных колбах объемом 750 мл на орбитальной качалке при температуре 26°C. Среда для погруженного культивирования содержит: глюкозу - 20-30 г/л, соевую муку - 10-15 г/л, дигидрофосфат калия - 2,5-3,5 г/л, сульфат магния - 0,25-0,35 г/л и водопроводную воду. Значение рН среды доводят до 6,0-6,5. Питательную среду автоклавируют при температуре 121°C в течение 30 минут. Длительность процесса получения жидкого посевного мицелия составляет 4 суток, ферментации - 6 суток.

Штамм T. hirsuta способен сбраживать углеводы (в частности, глюкозу) и целлюлозные и лигноцеллюлозные субстраты (в частности, карбоксиметилцеллюлозы натриевую соль, микрокристаллическую целлюлозу, солому) в анаэробных условиях.

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие изобретение, но не ограничивающие его.

Пример 1. Получение погруженного мицелия T. hirsuta.

Погруженное культивирование штамма T. hirsuta проводят на орбитальном шейкере со скоростью вращения 220 об/мин при температуре 26°C в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих 150 мл питательной среды следующего состава: глюкоза - 20 г/л, соевая мука -10 г/л, дигидрофосфат калия - 2,5 г/л и сульфат магния - 0,25 г/л. Уровень рН среды доводят до 6,0-6,5. Процесс погруженного культивирования проводят в два этапа. На первом этапе получают жидкий посевной материал, на втором этапе осуществляют ферментацию.

Для приготовления посевного материала используют культуру, выращенную в пробирках на сусловом агаре. Кусочки агара размером не более 3×3 мм в количестве 10-15 штук асептически вносят в качалочные колбы, содержащие 150 мл питательной среды, и культивируют в течение 4 суток. Затем 15 мл посевного материала в асептических условиях вносят в качалочные колбы, содержащие 150 мл питательной среды, и культивируют в течение 6 суток. Выход воздушно-сухой биомассы составляет 9,1 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации.

Пример 2. Получение погруженного мицелия T. hirsuta.

Получение погруженного мицелия T. hirsuta проводят, как описано в примере 1, но глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия и сульфат магния в питательную среду вносят в количестве 30 г/л, 15 г/л, 3,5 г/л и 0,35 г/л соответственно. Выход воздушно-сухой биомассы составляет 7,8 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации.

Пример 3. Получение погруженного мицелия T. hirsuta.

Получение погруженного мицелия T. hirsuta проводят, как описано в примере 1, но вместо глюкозы используют фруктозу. Выход воздушно высушенной биомассы составляет 6,3 г/л питательной среды на 6 сутки культивирования.

Пример 4. Получение этилового спирта из глюкозы.

Получают погруженную культуру T. hirsuta, как аналогично примеру 1. Определяют остаточную концентрацию глюкозы в культуральной жидкости DNS-методом. В качалочные колбы с погруженной культурой асептически вносят стерильный раствор глюкозы в концентрации 20 г/л. Колбы закрывают стерильными гидрозатворами и термостатируют при 25°C в темном месте. Отбор проб для определения концентрации этилового спирта и глюкозы в культуральной жидкости производится каждые 24 часа. Определение концентрации этилового спирта проводят методом газовой хроматографии. Максимальная концентрация этилового спирта в культуральной жидкости составляет 12,4 г/л на 4 сутки сбраживания. Полученные данные по исследованию динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата с использованием описываемого штамма Trametes hirsuta сведены в таблицу.

Таким образом, культивирование этилового спирта с использованием описываемого штамма в сравнении с использованием известного штамма позволяет получить целевой спирт с выходом более чем на 12% масс. выше за более короткий промежуток времени. При этом полученный спирт не содержит примесей.

Пример 5. Получение этилового спирта из лигноцеллюлозных субстратов.

В качестве субстратов используют: карбоксиметилцеллюлозы натриевую соль - 20 г/л, микрокристаллическую целлюлозу марки «Авицел» - 20 г/л, измельченную солому ржи с размером частиц 2-4 мм - 30 г/л. Субстраты помещают в качалочные колбы объемом 750 мл в указанных концентрациях, добавляют по 10 мл водопроводной воды. Колбы автоклавируют при температуре 121°C в течение 30 минут.

Получают погруженную культуру T. Hirsuta аналогично примеру 1. В стерильные колбы с субстратами помещают по 90 мл погруженной культуры, закрывают стериальными гидрозатворами, в качестве дополнительного стерилизующего вещества в гидрозатворах используют бледно-розовый раствор перманганата калия. Колбы термостатируют при 25°C в течение 6 суток.

Определение концентрации этилового спирта проводят методом газовой хроматографии. Концентрация этилового спирта в культуральной жидкости через 6 суток сбраживания карбоксиметилцеллюлозы натриевой соли составляет 2,4 г/л, микрокристаллической целлюлозы - 2,1 г/л, измельченной соломы ржи - 2,0 г/л.

Получаемый спирт не содержит таких примесей, как ацетон и изопропанол.

Таким образом, описываемый штамм позволяет продуцировать этиловый спирт повышенного выхода и качества из более широкого спектра используемого сырья.

Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta ВКПМ F-1287 - продуцент этилового спирта.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к получению ксилитола. Способ предусматривает обработку лигноцеллюлозного материала водным раствором, который содержит спирт, в частности C1-4 спирт или фенол, и имеет значение pH от 11,0 до 14,0, для расщепления лигноцеллюлозы.

Изобретение относится к производству спирта из целлюлозы. Способ включает ферментативное осахаривание, сбраживание с вакуумированием среды, отбором водно-спиртовых паров и их конденсацией.

Изобретение относится к устройству и способу обработки биомассы, включающему сепарацию твердых частиц/текучей среды. Сепарационный модуль содержит сборную камеру и фильтрующий узел для отделения текучей среды от массы, находящейся под давлением.

Способ производства биоэтанола из лигнин-целлюлозного растительного сырья включает предобработку указанного сырья, ферментативный гидролиз и спиртовую ферментацию продуктов, полученных после гидролиза, способных к ферментации с получением биоэтанола.
Изобретение относится к способу получения биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья. Способ предусматривает предварительную обработку сырья, такого как солома, или плодовые оболочки злаков, или отходы масличных культур, или мискантус, или жом сельскохозяйственных культур разбавленным раствором кислоты с концентрацией 1-14% при температуре 85-98°C и атмосферном давлении в течение 3-18 часов, совмещенные стадии ферментативного гидролиза и спиртового брожения, которое осуществляют с помощью любых видов непатогенных этанолсинтезирующих дрожжей, выделение биоэтанола из бражки.
Способ получения биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья предусматривает предварительную обработку сырья при атмосферном давлении, совмещение стадий ферментативного гидролиза и спиртового брожения, выделение биоэтанола из бражки.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. Способ получения ферментов целлюлазы и/или гемицеллюлазы микроорганизма Trichoderma ressei предусматривает по меньшей мере одну стадию роста в присутствии углеродного субстрата, который выбирают из глюкозы, ксилозы, лактозы, остатков, полученных после этанольной ферментации мономерных сахаров ферментативных гидролизатов целлюлозной биомассы и/или сырого экстракта водорастворимых пентоз и по меньшей мере одну стадию продуцирования в присутствии индуцирующего субстрата, в котором указанный индуцирующий субстрат представляет собой смесь, содержащую от 40 до 65 мас.% глюкозы или целлюлозных гидролизатов, от 21 до 25 мас.% лактозы и от 10 до 39 мас.% ксилозы или раствора гемицеллюлолозного лигноцеллюлозного гидролизата, причем сумма этих трех компонентов равна 100%.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способ обработки лигноцеллюлозного материала, способ разжижения лигноцеллюлозного материала и система разжижения лигноцеллюлозного материала.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ обработки лигноцеллюлозной биомассы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ гидролиза лигноцеллюлозной биомассы.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахаридов, а именно бактериальной целлюлозы. Предложен способ получения бактериальной целлюлозы, включающий культивирование симбиотической культуры Medusomyces gisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ превращения лигноцеллюлозы в органическую кислоту.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения гидролизата для приготовления питательной среды для выращивания микроорганизмов.
Изобретение относится к гидролизной промышленности, в частности к способам очистки гидролизатов лигноцеллюлозного сырья от ингибиторов ацетонобутилового брожения, и может быть использовано при подготовке питательных сред для получения биоэтанола, биобутанола, ацетона.
Предложены варианты способа переработки биомассы растительного происхождения в переработанную биомассу, которая является подходящей для использования в качестве топлива.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, бентонит и воду.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении питательных сред для выращивания дрожжей. Способ предусматривает измельчение соломы и отрубей.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ повышения активности полипептида GH61, обладающего усиливающей целлюлолитическую активность деятельностью, предусматривающий добавление растворимого активирующего катиона двухвалентного металла, выбранного из Mn++, Co++, Mg++, Ca++ и их сочетания, к композиции, содержащей полипептид GH61 и целлюлолитический фермент, где наличие указанного растворимого активирующего катиона двухвалентного металла повышает уровень разложения или преобразования содержащего целлюлозу сырья.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Изобретение представляет собой способ определения относительной устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков Bipolaris sorokiniana Shoem путем обработки растительных образцов культуральными фильтратами возбудителя, содержащими токсины гриба, отличающийся тем, что в качестве растительных образцов используют проростки, выращенные в рулонной культуре на водопроводной воде до фазы 2-3 листьев, опытные образцы проростков выдерживают в культуральном фильтрате возбудителя болезни в разведении 1:1 в течение 24 часов, контрольные образцы - в дистиллированной воде то же время, готовят нарезки из средней части вторых листьев проростков контрольных и опытных образцов, помещают их в дистиллированную воду в соотношении 1:4 на 1,5 часа в условия освещения, фильтруют вытяжки, определяют их электропроводность при переменном напряжении на частоте 1 кГц и оценивают относительную устойчивость сорта по отношению где Gк - электропроводность водных вытяжек листьев контрольных образцов;Go - электропроводность водных вытяжек листьев опытных образцов, чем меньше вычисленное отношение, тем устойчивее сорт среди группы оцениваемых сортов мягкой яровой пшеницы.
Наверх