Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для экспрессии нуклеазы Cas9 в клетках человека. Получают генетическую конструкцию pMitoCas9 с SEQ ID NО:1 на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, которая кодирует нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека. Изобретение обеспечивает эффективный синтез модифицированной нуклеазы Cas9 в клетках человека. 2 ил.

 

Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может, в комплексе с направляющей РНК, быть использовано для элиминирования патогенных мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК), ассоциированных с различными наследственными митохондриальными патологиями.

Известен «Способ лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии» (патент РФ №2375019 2003 г. A61F 9/007, A61K 35/28, A61P 27/02), обеспечивающий улучшение или стойкую стабилизацию зрительных функций на небольшом временном промежутке, поскольку не направлен на коррекцию наследственного материала митохондрий.

Известно изобретение «Митохондриальные таргетные антиоксиданты» (Mitochondrially targeted antioxidants) (патент US 6331532 1998 г., C07F 9/54, C07F 9/572, C07F 9/655, A61K 31/665, A61K 31/66), которое является технологией импорта функциональных молекул в митохондрии, с использованием липофильных агентов с иммобилизованными молекулами антиоксидантов, но не дает возможности осуществлять редактирование патогенных мутаций в митохондриальной ДНК.

Известно изобретение «Система доставки нуклеиновых кислот в митохондрии» (Mitochondrial nucleic acid delivery systems) (патент CA 2678572 2008 г., A61K 48/00D2, C12N15/864A, C12N15/90B4). Недостатками данной технологии является то, что она не подразумевает доставку в митохондрии белков, поэтому не может быть использована для импорта нуклеазы Cas9 в митохондрии, следовательно, не подходит для работы с системой CRISPR/Cas9.

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известно использование генетических конструкций на базе системы редактирования генома CRISPR/Cas9 для элиминирования патогенных мутаций мтДНК путем доставки нуклеазы Cas9 в митохондрии; генетическая конструкция отличается модификацией последовательности кодирующей Cas9, обеспечивающей доставку данной нуклеазы в митохондрии.

Отличительным признаком изобретения является модификация нуклеазы Cas9, обеспечивающая ее доставку в митохондрии для обеспечения универсального механизма для специфической элиминации дефектной мтДНК, несущей ту или иную мутацию. Новизну представляют нуклеотидные последовательность вектора, который кодирует модифицированный белок Cas9.

Задачей заявляемого изобретения является элиминирование митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями.

Поставленная задача решается тем, что генетическая конструкция заявляемого изобретения, после попадания в цитоплазму клеток, обеспечивает экспрессию кодируемой ею молекулы нуклеазы Cas9, которая, используя собственный аппарат клетки, транспортируется в митохондрии, где обеспечивает элиминирование мутантных молекул мтДНК путем распознавания специфического участка последовательности посредством взаимодействия со специфической направляющей РНК и последующей рестрикцией обеих цепей мтДНК. Поскольку в митохондриях отсутствуют системы репарации двухцепочечных разрывов, такие «разрезанные» мтДНК элиминируются экзонуклеазами. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет мтДНК, не имеющих мутации.

Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации мутантной мтДНК и способа ее доставки в органеллы.

Принцип функционирования предлагаемых веществ базируется на особенностях работы системы CRISPR/Cas9. Нуклеазы Cas9 взаимодействуют с особыми направляющими молекулами РНК, образуя комплекс, который специфически взаимодействует с участком двухцепочечной ДНК комплементарным участку направляющей РНК. В результате такого взаимодействия функциональный домен Cas9 вносит разрывы в обе цепи ДНК.

Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, кодирующая нуклеазу Cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека, представляет собой плазмидный вектор, разработанный на базе векторов pUC19 и pTurboGFP-mito. Конструкция обеспечивает возможность трансформации компетентных клеток E. coli с последующей наработкой большого количества копий. Позволяют отбирать трансформированные колонии на селективной среде содержащей антибиотик. Обеспечивают экспрессию нуклеазы Cas9 в клетках млекопитающих и человека, а также доставку продуктов трансляции в митохондрии. Проникая в митохондрии, нуклеаза Cas9 может быть использована для специфической элиминации мтДНК, содержащей любую из описанных мутаций, благодаря взаимодействию с определенной направляющей РНК.

Белок Cas9 обладает нуклеазной активностью и имеет два активных центра, каждый их которых участвует в расщеплении одной из цепей двухцепочечной ДНК. Нуклеаза Cas9 связывается с направляющей РНК, образуя комплекс. Данный комплекс сканирует молекулу ДНК и в случае обнаружения гомологичной последовательности формирует дуплекс с участком направляющей РНК. После образования дуплекса нуклеаза Cas9 вносит разрывы в обе цепи ДНК в определенной структуре дуплекса, названной РАМ (protospacer adjacent motif).

Конструкция pMitoCas9 содержит ориджин репликации, ген устойчивости к ампициллину, промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, последовательность, кодирующую модифицированную нуклеазу Cas9, Т2А, ген TurboGFP, 3' UTR гена SOD2.

Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.

Карта генетической конструкции pMitoCas9 была построена при помощи программного обеспечения SnapGene. Для сборки использовали фрагменты плазмид pTurboGFP-mito (# FP517, Evrogen), pUC19 и hCas9, а также синтезированные по заказу двухцепочечные фрагменты ДНК - gBloks (IDT, США). Амплификацию фрагментов ДНК проводили при помощи полимеразы Pfu Turbo Сх (Agilent Technologies, США) на амплификаторе С1000 Touch (Bio-Rad, США). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью фосфорамидитного метода на AMS-2000 («Биоссет», Россия), очищали методом обращено-фазовой хроматографии на OPS-1000 («Биоссет») с применением реагентов компании «Glen Research» (США). Сборку плазмид осуществляли с использованием ферментативной системы USER (NEB, США), а также классических методов молекулярного клонирования. «Бесшовное» соединение фрагментов ДНК проводили путем сборки по Гибсону (NEB, США) согласно инструкции фирмы производителя.

На фиг. 1 представлена карта плазмидного вектора pMitoCas9, кодирующего нуклеазу CAS9, импортируемую в митохондрию.

На фиг. 2 представлен снимок конфокального микроскопа препарата клеток Phoenix, трансфецированных плазмидами pMitoCas9 и другими контрольными

плазмидами, включая pMitoCas9-SV40, pEGFP-N1 и pTurboGFP-mito, экспрессирующих GFP с цитоплазматической и митохондриальной локализацией.

Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась на культуре клеток.

Культуру клеток линии Phoenix трансфецировали конструкцией pMitoCas9. Через 48 часов после трансфекции синтез нуклеазы Cas9 оценивали на живых клетках посредством конфокальной микроскопии по экспрессии GFP. Поскольку Cas9 и GFP разделены последовательностью Т2А, то в случае эффективной экспрессии GFP должен локализоваться в цитоплазме клетки. В качестве контроля внутриклеточной локализации GFP были использованы плазмидные векторы pTurboGFP-mito и pEGFP-N1 с митохондриальной и цитоплазматической локализацией GFP соответственно. Для прижизненного окрашивания митохондрий применяли краситель MitoTracker® Red CMXRos. Результаты прижизненной конфокальной микроскопии представлены на Фиг. 2.

Использование заявляемой генетической конструкции позволяет осуществлять терапию наследственных митохондриальных патологий.

Генетическая конструкция pMitoCas9 (SEQ ID N1) на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, кодирующая нуклеазу Cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека, которая обеспечивает синтез модифицированной нуклеазы Cas9 в клетках человека.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии и касается генетической конструкции для осуществления способа генетического контроля экзоцитоза. Представленная конструкция имеет последовательность SEQ ID NO:4 и получена с использованием лентивирусного вектора на основе ВИЧ-1 модифицированного последовательностями, кодирующими пост-транскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE), генетически кодируемый кальциевый индикатор (GCaMP3) и клеточно-специфический промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP).

Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики. Предложенная кассетная генетическая конструкция anti-HIV-4R-anti-HIV-5R-anti-CCR5-8 получена на основе вектора GeneClip-U1-neo и продуцирует три siPHK - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа и гена CCR5 человека.

Изобретения относятся к области медицины и вирусологии. Представлены аттенуированные вирусы гриппа А, векторы на их основе и содержащие их фармацевтические композиции.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к плазмидному лентивирусному вектору для гетерологичной экспрессии рекомбинантного человеческого белка CD47 в клетках млекопитающих.

Изобретения касаются рекомбинантного непатогенного вируса болезни Марека (rMDVnp), представляющего собой рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT), а также вакцины, содержащей такой вирус, и способа защиты кур против вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и вируса болезни Ньюкасла (NDV).

Изобретения касаются рекомбинантного непатогенного вируса болезни Марека (rMDVnp), представляющего собой рекомбинантный вирус герпеса индеек (rHVT), а также вакцины, содержащей такой вирус, и способа защиты кур против вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) и вируса болезни Ньюкасла (NDV).

Изобретения относятся к вирусной частице, высвобождающейся после инфицирования клеток цитомегаловирусом человека (HCMV), ее применения для профилактики или лечения заболевания путем образования нейтрализующих антител к по меньшей мере одному антигенному гетерологичному пептиду или путем индукции CD8+ Т-лимфоцитарного ответа против такого гетерологичного пептида и вакцины, содержащей такую вирусную частицу.

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены рекомбинантный вирусный вектор из герпесвируса индейки (HVT), содержащий гетерологичный кодон-оптимизированный полинуклеотид, кодирующий полипептид F вируса болезни Ньюкасл (NDV-F), функционально связанный с промотором SV40, а также иммунологические композиции, для индукции иммунного ответа в животном, и способы индуцирования иммуногенной реакции и вакцинации животных против птичьих патогенов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для получения противоопухолевых ЦТЛ. Способ предусматривает антигенную активацию полученных зрелых ДК с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместное культивирование с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции всех клеток неприлипающей фракции МНК, с последующим выделением из совместной культуры ДК и МНК специфичных к указанным эпитопам ЦТЛ методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток.

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный бакуловирус для экспрессии рекомбинантного белка, вектор переноса, клонирующий вектор и последовательность нуклеиновой кислоты, подходящие для получения указанного бакуловируса, и их применение, а также клетка-хозяин и способ продукции рекомбинантного белка.

Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики. Предложенная кассетная генетическая конструкция anti-HIV-4R-anti-HIV-5R-anti-CCR5-8 получена на основе вектора GeneClip-U1-neo и продуцирует три siPHK - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа и гена CCR5 человека.

Изобретение относится к применению лиганда формулы (III) для получения конъюгатов олигонуклеотидов и композиций на их основе, которые могут быть использованы в медицине (III).Предложен новый эффективный лиганд формулы (III) для получения конъюгата, в котором лиганд для асиалогликопротеинового рецептора присоединен к антисмысловому олигонуклеотиду или миРНК посредством амидной связи для доставки в клетку указанных антисмыслового олигонуклеотида или миРНК соответственно, причем способ получения такого конъюгата включает конъюгирование лиганда формулы (III) и олигонуклеотида или миРНК с NHC-6 гексиламинолинкером по 5'-концу смысловой нити и удаление О-ацетатных групп.

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, которая подавляет экспрессию целевого гена. Указанная молекула в порядке от 5’-конца к 3’-концу содержит 5’-концевой участок Xc, линкерный участок Lx, внутренний участок Z, линкерный участок Ly и 3’-концевой участок Yc.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способы обнаружения патологии системы органов или органа у субъекта, способ идентификации соединения, пригодного для замедления прогрессирования или лечения патологии системы органов, и способ определения токсичности соединения или фактора окружающей среды для системы органов у субъекта.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий культивирование дифференцированной клетки в среде для перепрограммирования, содержащей альбумин, где альбумин обработан ионообменной смолой или древесным углем, трансфицирование клетки одной или более синтетических молекул РНК, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования, и где указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей один или более факторов перепрограммирования; и повторение стадии (b) по меньшей мере дважды в течение 5 последовательных дней с получением клетки, перепрограммированной в менее дифференцированное состояние.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены способы повышения экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) с использованием олигонуклеотида, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом для гена NEU4.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к соединению для снижения экспрессии mRNA аполипопротеина (а) и белка apo(a) у животного, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения оптимизированного твердого ген-активированного материала, включающего создание матрикса-носителя, связавшего как минимум одну молекулу нуклеиновой кислоты, с последующим размещением на его поверхности еще как минимум одной дополнительной молекулы нуклеиновой кислоты любым физическим методом, позволяющим осуществить такое размещение без образования химической связи между указанным матриксом-носителем и дополнительной нуклеиновой кислотой.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан синтетический, необязательно модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 нуклеотидов или длиной 19-30 нуклеотидов, где модификация выбрана из модифицированного сахарного фрагмента; модифицированной межнуклеотидной связи; модифицированного нуклеотида, а также из их сочетаний.

Изобретения касаются средства для направленной на ДНК РНК-интерференции (ddRNAi) (варианты) для ингибирования экспрессии РНК-зависимой ДНК полимеразы вируса гепатита В (HBV), кассеты экспрессии для экспрессии средства для ddRNAi, вектора экспрессии для ddRNAi, фармацевтической композиции, содержащей средство для ddRNAi и их применение для лечения инфекции, вызванной гепатитом B, у индивидов.
Наверх