Система для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами



Система для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами
Система для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами
Система для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами
G06F3/01 - Вводные устройства для передачи данных, подлежащих преобразованию в форму, пригодную для обработки в вычислительной машине; выводные устройства для передачи данных из устройств обработки в устройства вывода, например интерфейсы (пишущие машинки B41J; преобразование физических переменных величин F15B 5/00,G01; получение изображений G06T 1/00,G06T 9/00; кодирование, декодирование или преобразование кодов вообще H03M; передача цифровой информации H04L)

Владельцы патента RU 2639790:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) (RU)

Группа изобретений относится к медицине, биологии и включает систему и способ ее использования для адресного контроля нейронов мозга живых, свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами. Система включает лазерную систему возбуждения, систему регистрации оптического отклика, размыкаемый волоконно-оптический зонд (ВОЗ) на основе многоканального оптического волокна (МОВ) со световодами микронного размера, содержащий модуль, закрепляемый на черепе животного, и ответную размыкаемую часть, обеспечивающую его связь с оптическими системами возбуждения и регистрации оптического отклика, в соответствии с тем, как изложено в формуле изобретения. ВОЗ состоит из двух частей, где первая выполнена с возможностью закрепления на черепе животного и содержит керамическую цилиндрическую ферулу с закрепленным в ней коротким отрезком МОВ. Вторая часть зонда содержит коннектор с другой цилиндрической керамической ферулой и закрепленным в ней длинным отрезком МОВ. Вторая часть зонда соединена с лазерной системой оптического возбуждения и системой регистрации и контроля. Отрезки МОВ содержат не менее одной тысячи соосно расположенных световодов микронного размера. Дистальный конец первого отрезка оптического волокна имеет плоскую поверхность, скошенную на угол от 30 до 60 градусов относительно оси МОВ, а диаметр МОВ – от 250 мкм до 600 мкм. При реализации способа генерируют лазерное излучение выбранной длины волны и мощности, позволяющее достигнуть порога фотоактивации клеток, содержащих генетически встроенные светочувствительные белки. Фокусируют лазерное излучение посредством системы сканирования и модуля фокусировки в выбранные световоды длинного отрезка МОВ, находящегося внутри коннектора в оптическом контакте с коротким отрезком МОВ, закрепленным на черепе животного так, что его дистальный конец расположен в выбранной области мозга животного. Излучение генерирует измеряемый сигнал флуоресценции, его передают через зонд в оптическую систему регистрации и контроля с компьютером, где полученные сигналы подвергают соответствующему анализу. Группа изобретений позволяет получать информацию о функционировании отдельных клеток мозга и адресно воздействовать на них, проводя долговременный ряд экспериментов на одном и том же животном в любой структуре мозга, обеспечивая при этом получение оптического сигнала от одной и той же группы клеток. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил.

 

Область техники

Предлагаемое изобретение относится к волоконно-оптическим устройствам, предназначенным для получения оптических изображений глубоколежащих тканей головного мозга живых свободно движущихся лабораторных животных, с целью исследования функционально значимых нейрофизиологических процессов с клеточным разрешением и адресного воздействия на выделенные клетки.

Уровень техники

Оптические методы играют все более заметную роль в исследованиях нейрофизиологических и когнитивных функций, процессов формирования памяти, что связано с их эффективностью, высоким пространственным разрешением и малой инвазивностью. Оптическая микроскопия обеспечивает субклеточное разрешение, однако получение изображений возможно только для поверхностных тканей. Развитие современных методик конфокальной и нелинейно-оптической микроскопии позволяет увеличить глубину оптического контроля биологических тканей до величин порядка 1 мм, что является безусловно огромным достижением в области биовизуализации, однако не решает проблемы получение изображений более глубоко лежащих тканей, в частности, глубоко расположенных нейронных сетей в мозге живых животных. Одним из решений проблемы доставки возбуждающего оптического излучения и сбора оптического сигнала является применение волоконно-оптических эндоскопов, что позволяет ценой минимального вмешательства в морфологию и функциональные связи в мозге животных преодолеть проблемы исследований глубоко лежащих тканей.

Одним из наиболее перспективных методов получения изображений биологических объектов и живых тканей в эндоскопическом режиме является использование многоканальных оптических световодов. Получение изображений через пучки волокон является одним из ранних изобретений эпохи современных оптических технологий (US 1751584, "Picture transmission" (1927); H.Z. Lamm, Instrumentenkd, 50, 579 (1930)). Идея передачи изображений с помощью пучков оптических волокон нашла дальнейшее развитие и в более поздних работах, см. например, US 2825260 A "Optical image forming devices", US 3043179 A "Fiber optical image transfer devices" или "Fiber optical image transfer devices" US 3043910. Однако, широкое применение этих идей стало возможно гораздо позднее.

Волоконно-оптические флуоресцентные эндоскопы хорошо себя зарекомендовали как инструменты для минимально возмущающей визуализации глубоко лежащих структур биологических тканей, требуемых в задачах in vivo визуализации в живых свободноподвижных животных. Физический принцип оптического детектирования во всех описанных устройствах основывается на регистрации флуоресцентного отклика, что обычно предусматривает наличие биологических красителей или генетически встроенных маркеров, что накладывает условия на проведение экспериментов, в частности, связанных с выбором длин волн для возбуждения целевых биомаркеров. Настоящим прорывом в области использования волоконно-оптических зондов для исследования функциональных процессов в тканях головного мозга животных стали работы группы К. Диссерота (K. Deisseroth) из университета г. Стенфорда (США), которые фактически заложили новую дисциплину - оптогенетику. Суть оптогенетических методик заключается в целенаправленном генетическом маркировании нейронов головного мозга с целью изучения их функциональных свойств с помощью оптических и оптоволоконных методов, а также в возможности управления реакцией клеток на световое воздействие, что достигается за счет внедрения светочувствительных белков Channelrhodopsin в мембраны клеток. Группа К. Диссерота обладает рядом патентов в этой области, описывающих устройства и методы, которые позволяют не только измерять процессы, но и осуществлять обратную стимуляцию выбранных областей мозга оптическим излучением: US 9238150 «Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells», US 9458208 "Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto"; US 20160194624 "System for optical stimulation of targets cells"; US 9308392 Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system; US 9271674 "Optogenetic magnetic resonance imaging"; US 8401609 "System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics".

Развитие оптических технологий привело к стремительному совершенствованию технологий и росту областей применения специальных типов оптических световодов, включая многосердцевинные, для целей получения изображений тканей с высоким пространственным разрешением [см., например, Hecht, J. (1999) City of Light: the Story of Fiber Optics, Oxford University Press, Oxford; S. Yashvinder et. al. Applied Optics, 38, 7133-7144 (1999); J. Knittel, et. al. Optics Communication, 188, 267-273 (2001); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 5, 935 (2008); K.K. Ghosh, et. al. Nature Methods 8, 871 (2011), W. Gobel, et. al. Opt. Lett. 29, 2521 (2004); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 2, 941-950 (2005); D. Yelin, et. al. Nature 443, 765 (2006)] Анализ этих работ демонстрирует заманчивые перспективы для систем получения изображений на основе оптических многоканальных световодов в задачах биофотоники. Современные технологии обеспечивают производство многоканальных волокон с малым размером световодных каналов порядка нескольких микрометров и большой плотностью самих каналов, что обеспечивает возможность получения изображения биологических тканей вплоть до клеточного. Относительно малый размер внешнего диаметра волокна позволяет осуществить проникновения вглубь ткани с минимальными повреждениями.

В патентах RU 2327202 и RU 2333526 описана идея реализации нейроэлектронного многоканального интерфейса на основе многоканальных оптических волокон. Оптические световоды служат для точной доставки оптического излучения к исследуемой области. На конце оптического волновода имеются набор оптоэлектронных преобразователей, которые позволяют генерировать электрическое поле и воздействовать им на нейронные ткани. Оптоэлектронные преобразователи обеспечивают электрическое воздействия на нейроны и нейронный сетей, однако основной задачей биофотоники является осуществление прямых оптических методов измерения и контроля.

В заявке US 20080007733 "Volumetric endoscopic coherence microscopy using a coherent fiber bundle" рассматривается устройство с использованием многосердцевинного волокна для когерентной оптической томографии. Для заведения излучения в световодные каналы используется конфокальная сканирующая система. В качестве возбуждающего излучения используется либо перестраиваемый лазерный источник, либо источник слабокогерентного белого света, что необходимо для обеспечения методики когерентной оптической томографии.

В патентах KR 20140006464 и CN 102389288 представлены принципы конфокальной микроскопии с использованием многосердцевинного волокна для визуализации биологических тканей с улучшенным пространственным разрешением. В состав устройств входит оптическое многосердцевинное волокно, лазерный источник возбуждения, система заведения излучения в волокно на основе сканирующих гальванических зеркал и оптическая система регистрации. Эти устройства содержат основные принципиальные элементы оптической схемы, содержащиеся и в данной заявке, однако отсутствует элементы конструкции зонда, обеспечивающие непосредственный контакт волокна с исследуемыми тканями, что резко сокращает круг решаемых задач в области исследования мозга.

Компания Mauna Kea Technologies (Франция) производит и использует в своих устройствах многоканальные оптические световоды, содержащие большое количество световодных сердцевин с размерами порядка нескольких микрометров. Компания обладает рядом патентов в этой области, в частности, в заявке US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", описаны устройство и принципиальные особенности получения изображений органов и тканей с клеточным разрешением с помощью многосердцевинного волоконно-оптического зонда. В состав устройства входит оптическое многосердцевинное волокно, лазерный источник возбуждения, система заведения излучения в волокно на основе сканирующих гальванических зеркал и оптическая система регистрации. Оптическое излучение заводится в отдельные каналы многосердцевинного волокна, и далее из свободного (дистального) торца волокна "точечно" возбуждает флуоресценцию исследуемых объектов. Сигнал флуоресценции передается в направлении "назад" в систему регистрацию, где происходит формирование изображения. Также в заявках Mauna Kea Technologies (Франция) US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", US 20120184842 "Method, an optical probe and a confocal microscopy system for inspecting a solid organ" описываются схемы реализации подобных устройств и конструктивные особенности устройств для исследования различных органов и биологических тканей с помощью многоканальных зондов, и, в частности, описывается устройство и методы для получения изображений нейронов мозга в режиме in vivo. Также в патентах Mauna Kea Technologies содержатся описание различных методик обработки изображений, получаемых из многосердцевинных волоконных зондов. В патенте US 8237131 "System and method for carrying out fibre-type multiphoton microscopic imaging of a sample" рассматриваются нелинейно-оптические методы с применением сверхкоротких лазерных импульсов для получения изображений тканей.

Известен патент Mauna Kea Technologies US 9107575 "Apparatus and method for brain fiber bundle microscopy", описывающий устройство крепления на черепе животного имплантируемого отрезка оптического волокна, который можно рассматривать как прямой аналог настоящего изобретения. Устройство содержит отрезок оптического волокна, дистальных конец которого, располагаемый в мозге животного, имеет небольшой скос. Скос упрощает проникновение дистального конца волокна в мозг животного. Устройство позволяет отсоединять оптическое волокно в случае необходимости. Однако для наблюдения процессов в мозге животного оптическое волокно нужно вставить на выбранную глубину, причем сам процесс установки оптического волокна для наблюдения наблюдаемых ранее структур мозга должен производиться с точностью до 1 мкм, что трудно реализуемо на живых существах и травмирует клетки мозга при каждой установке волокна. Кроме того, в описанном изобретении предусмотрена возможность получения изображения клеток мозга, но отсутствует возможность обратного воздействия.

Подавляющее большинство устройств и методов в нейрофотонике использует флуоресценцию маркерных красителей или белков для получения оптических изображений тканей. Безмаркерные химически селективные методики на основе регистрации комбинационного (рамановского) отклика исследуемых тканей в эндоскопическом режиме являются одним из важных направлений визуализации функциональной активности мозга с клеточным разрешением. Известен патент заявителя RU 2584922 (заявка 2014150676 от 15.12.2014 "Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс для мультимодальной микроскопии мозга животных"), где описано устройство для получения мультиспектральных изображений на основе конфокального микроскопа и многоканального оптоволоконного зонда для исследования биологических тканей, в частности получения их изображений в эндоскопическом режиме. Основной особенностью устройств является наличие нескольких одночастотных лазерных источников возбуждения и спектрометра, обеспечивающих возможность мультиспектральных измерений сигналов различной природы (флуоресценции или спонтанного комбинационного рассеяния света). Основное отличие этого патента от предлагаемой заявки состоит в отсутствии размыкаемости зонда, внедряемого в мозг животного.

Необходимо, отметить другой альтернативный метод получения изображений с применением технологии GRIN линз (оптических устройств с градиентом показателя преломления перпендикулярного оси распространения излучения, что обеспечивает искривление его волнового фронта и возможность фокусировки). Компания Inscopix (США) обладает рядом патентов, в которых описывается принцип получения изображений объектов в эндоскопическом режиме с помощью оптических волокон и GRIN линзы на его дистальном конце: US 6760112 В2 "Grin-fiber lens based optical endoscopes, US 20140043462 "Systems and methods for distributed video microscopy"; или WO 2014071390 A1 "Miniaturized imaging devices, systems and methods". Качество изображений тканей, в том числе тканей головного мозга получается достаточно высоким, однако, для проведения измерений в мозге требуется серьезное хирургическое вмешательство, связанное с удалением значительной массы тканей, что ограничивает глубину и инвазивность данной методики.

Описанные выше методы получения изображений в глубоких слоях мозга обладают серьезными недостатками, связанными однократным и постоянным способом крепления зонда, что ограничивает их применение для исследования процессов формирования памяти и обучения живых свободноподвижных животных в ходе долговременных измерений. Также недостатком вышеприведенных технических решений является условие, что лабораторное животное должно постоянно содержаться в клетке в непосредственной близости от системы регистрации, а возможность проводить биологические эксперименты на протяжении длительного времени является ключевой для ряда методик исследований.

Эта проблема решается с помощью концепции размыкаемых устройств волоконных устройств (D.R. Sparta, A.M. Stamatakis, J.L. Phillips, N. , R. van Zessen, and G.D. Stuber, "Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits," Nature Protocols 7, 12-23 (2012). G.D. Stuber, D.R. Sparta, A.M. Stamatakis, W.A. van Leeuwen, J.E. Hardjopajinto, S. Cho, K.M. Tye, K.A. Kempadoo, F. Zhang, K. Deisseroth, and A. Bonci, "Excitatory transmission from the amygdale to nucleus accumbend facilitates reward seeking," Nature 475, 377-380 (2011). L.V. Doronina-Amitonova, I.V. Fedotov, О.I. Ivashkina, M.A. Zots, A.B. Fedotov, K.V. Anokhin, and A.M. Zheltikov, "Implantable fiber-optic interface for parallel multisite long-term optical dynamic brain interrogation in freely moving mice," Sci. Rep. 3, 3265.)

Концепция размыкаемых нейроинтрфейсов отражена в заявке на патент US 2011224554 A1 «Optogenetic Fiber Optic Cannula and Adapted Fiber Optic Connector», в которой представлена концепция размыкаемого коннектора. В основе коннектора имеется канула, которая крепится на черепе исследуемого животного, в канулу вставляется две ферулы содержащие отрезки оптического волокна, при этом дистальный конец волокна первой ферулы опускается в исследуемую ткань, а другой конец оптически соединен с длинным концом волокна, закрепленной в ответной феруле. Оптический контакт обеспечивается за счет внешней канули. Длинный конец оптического волокна соединен с системой регистрации. При этом в феруле может содержаться несколько оптических волокон. Компания Optomak, Inc. (Канада) является обладателем этого и ряда патентов в области волоконных устройств для оптогенетики. В частности, в заявке US 20140226932 «Independent dual path optical rotary joint» описывается устройство, позволяющее вращать две части коннектора друг относительно друга, а в заявке на патент US 20150366437 «Image relaying cannula with detachable self-aligning connector» описан коннектор, увеличивающий точность позиционирования канули на черепе животного и более точное оптическое соединение.

Таким образом, использование размыкаемых устройств является одним из магистральных направлений развития волоконных зондов для нейрофизиологии, однако, в описанных выше устройствах отсутствует возможность исследования тканей мозга с клеточным разрешением или они являются достаточно сильно инвазивными по отношению к живой ткани мозга животного.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание системы адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого зонда и многоканальных волокон и, позволяющей с минимальной инвазивностью получать оптические изображения тканей мозга с клеточным разрешением и воздействовать на отдельную адресно выбранную клетку.

Для решения поставленной задачи предлагается система для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами, содержащая лазерную систему оптического возбуждения, включающую, по крайней мере, два лазера с различными длинами волн и изменяемой мощностью, систему сканирования, модуль фокусировки, дихроичную делительную пластину, оптическую систему регистрации и контроля с управляющим компьютером, волоконно-оптический зонд, состоящий из двух частей с первой частью, выполненной с возможностью закрепления на черепе животного, содержащей первую керамическую цилиндрическую ферулу с закрепленным в ней первым коротким отрезком многоканального оптического волокна, второй частью, содержащей коннектор со второй цилиндрической керамической ферулой и закрепленным в ней вторым длинным отрезком многоканального оптического волокна, при этом вторая часть зонда соединена с лазерной системой оптического возбуждения и системой регистрации и контроля, контактные поверхности первой и второй ферул выполнены плоскими, первый и второй отрезки многоканального волокна, содержащего не менее одной тысячи соосно расположенных световодов микронного размера, при этом плоскость контакта первой и второй керамических ферул расположена в керамическом коннекторе, дистальный конец первого отрезка оптического волокна имеет плоскую поверхность, скошенную на угол от 30 до 60 градусов относительно оси оптического волокна, диаметр многоканального оптического волокна составляет от 250 мкм до 600 мкм. Скос дистального конца оптоволокна определяется необходимостью достижения эффекта «ножа», что необходимо для более плавного раздвижения клеток при проникновении волокна в ткани мозга, что уменьшает инвазивность воздействия. Однако, наклон дистального конца оптоволокна на угол от 30 до 60 градусов относительно оси волокна в случае многосердцевинного волокна с тысячами световодов микронного размера обеспечивает не только увеличение объема исследуемой области, но предоставляет возможность контроля процессов, происходящих в разных слоях тканей головного мозга, в том числе имеющих существенно разную функциональную значимость. Система позволяет селективно возбуждать отдельные группы клеток и/или отдельные клетки мозга и получать флуоресцентные изображения с микронным разрешением. Две части волоконно-оптического зонда соединяют между собой только во время проведения измерений и визуализации нейронов за счет регистрации флуоресцентного отклика генетически встроенных меток. Сохранение части зонда на черепе животного обеспечивает доступ к одной и той же группе клеток мозга в течение длительного времени, а при отсутствии измерений животные могут жить в своих домашних клетках без возможности повредить длинный отрезок оптоволокна.

Плоскость контакта первой и второй ферул с отрезками многоканальных волокон составляет угол от 0 до 30 градусов относительно оси, перпендикулярной оси многоканального оптического волокна, контактные поверхности первой и второй ферул и отрезков многоканальных волокон полированы с точностью порядка 300 нм, что обеспечивает качественный оптический контакт между двумя частями нейроинтерфейса. Скол и полировка осуществляется под углом 0-30 градусов относительно плоскости перпендикулярной оси волокна. Скос в данном случае обеспечивает воспроизводимость и соосность соединения между отдельными сердцевинами волокна при актах замыкания/размыкания двух частей зонда. Такая конструкция также уменьшает механическое возмущение и сдвиг отдельных каналов волокна друг относительно друга при движении животного, что в конечном счете приводит к существенному улучшению стабильности и повышает качество получаемых флуоресцентных изображений.

Масса первой части зонда не более 0,3 г, что не доставляет серьезных неудобств даже небольшим животным (таким как лабораторные мыши), что особенно важно, если зонд находится в разомкнутом состоянии, когда животные могут находиться в своих клетках.

Система регистрации и контроля содержит конфокальную систему фильтрации излучения из отдельных волокон многоканального оптического волокна, включает полосовые фильтры, спектрометр, фотоэлектронные умножители или фотодиоды, электронную систему управления, аналого-цифровой преобразователь. Обработка сигнала осуществляется конфокальной системой для фильтрации излучения от разных отдельных каналов волокон. Важной частью всей архитектуры является система контроля на основе компьютера, используемая для анализа регистрируемого сигнала, построения изображений исследуемой области мозга, а также управления мощностью лазерной системы накачки.

Способ адресного контроля и управления отдельной клеткой или отдельной группой клеток мозга животного с помощью описанной выше системы, при котором генерируют лазерное излучение выбранной длины волны и мощности, позволяющее достигнуть порога фотоактивации клеток, содержащих генетически встроенные светочувствительные белки, фокусируют лазерное излучение посредством системы сканирования и модуля фокусировки в выбранные световоды длинного отрезка многоканального оптического волокна, находящегося внутри коннектора в оптическом контакте с первым коротким отрезком многоканального оптического волокна, закрепленным на черепе животного таким образом, что его дистальный конец расположен в выбранной области мозга животного, где лазерное излучение генерирует измеряемый сигнал флуоресценции, который передают через зонд в оптическую систему регистрации и контроля с управляющим компьютером, где обрабатывают полученные сигналы и строят флуоресцентные изображения клеток с последующим их анализом. Представленное устройство обеспечивает хроническое (постоянное, растянутое во времени) получение флуоресцентных изображений нейронов определенной области мозга. Для обеспечения возможности «обратного» оптического воздействия, клетки помимо флуоресцентных меток должны содержать другой тип генетически встроенных белков, которые обычно встраиваются в мембраны клеток (например, наиболее часто в задачах оптогенетики применяется каналородопсин) и обеспечивают возможность открытия ионных каналов. Поскольку для активации светочувствительных белков в общем случае требуется другая длина волны излучения накачки и гораздо большая мощность, то лазерная система должна обладать как минимум двумя лазерными источниками с различными длинами волн и мощностью, варьируемой в широких пределах. На начальных этапах измерения система регистрирует и обрабатывает флуоресцентные изображений выбранного участка мозга. При этом важно подчеркнуть, что измерения носят принципиально долговременный хронический характер.

В процессе анализа флуоресцентных изображений определяют функциональную активность клеток, выбирают целевую клетку или группу клеток, после чего подбирают параметры лазерного излучения, необходимого для обеспечения фотоактивации целевых клеток, за счет фокусировки лазерного излучение только на выбранные световые каналы многокального оптического волокна, осуществляемое с помощью компьютерного контроля. После этого снова принимают и обрабатывают оптические сигналы, строят и анализируют изменения флуоресцентных изображений клеток выбранной области мозга. Необходимо отметить, что устройство позволяет следить за функциональными изменениями в отдельных клетках и нейронных сетях, что отражается на поведении животного, формировании его памяти и др., поэтому необходимой задачей является осуществление параллельных нейрофизиолгических измерений и контроля поведения животного.

Для фотоактивации клеток используют излучение или большей мощности, не менее чем на два порядка, и/или иной длины волны или импульсное лазерное излучение, достаточное для фотоактивации клеток, передают лазерное излучение к выбранной области мозга. В случае необходимости воздействия на определенную клетку в лазерной системе выбирают необходимую длину волну или гораздо большую мощность излучения накачки. Адресное воздействие на определенную область достигается за счет сканирования излучения только по определенным сердцевинам многоканального волокна, осуществляемого с помощью компьютерного контроля. Далее адресно передают лазерное излучение к выбранной клетке (или клеткам), при достижении порога срабатывания светочувствительного белка, он «открывает» канал в мембране клетки, позволяя катионам проникать внутрь нее, тем самым давая старт определенной функциональной активности клетки. Если в случае получения флуоресцентных изображений достаточно использовать мощности на уровне десятков и даже сотен микроватт (для уменьшения времени построения изображения), то для достижения порога активации светочувствительных белков требуется на два-три порядка большие мощности излучения, при этом длина волны лазера должна соответствовать спектру поглощения светочувствительного белка. Для этих целей также возможно использование импульсных лазерных источников, которые обеспечивают большую интенсивность света. Кроме того, использование больших мощностей или импульсных источников может привести к фоторазрушению выбранной области биологической ткани, что также может рассматриваться как аналог протокола хирургического вмешательства.

Техническим результатом изобретения является разработка системы и способа для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами, позволяющими с минимальной инвазивностью получать оптические изображения тканей мозга с клеточным разрешением и воздействовать на отдельную адресно выбранную клетку или группу клеток. Созданная конструкция дает возможность проводить долговременный ряд экспериментов на одном и том же животном в любой структуре мозга и при этом сохранять уверенность в получении сигнала от одной и той же группы клеток, а также осуществлять обратное воздействие на выбранные клетки.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена схема системы для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами.

На фиг. 2 представлен общий вид размыкаемого зонда, вживляемого в череп подопытного животного в замкнутом (а) и разомкнутом (б) состоянии.

На фиг. 3 представлены флуоресцентные изображения находящихся в водной среде тестовых полистироловых шариков размером порядка 7.5 мкм, полученные посредством предлагаемой системы.

На фиг. 4 представлены флуоресцентные изображения соматосенсорной коры головного мозга трансенгенных мышей линии Thy1-EGFP, полученные с помощью системы для адресного взаимодействия с нейронами мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами.

На фиг. 1 представлена схема устройства: 1 - лазерная система возбуждения, содержащая не менее двух лазерных источников с различными длинами волн и варьируемой мощностью (длины волн лазерных источников должны выбираться в соответствии со спектральными характеристиками генетически встроенных в нейроны биомаркеров и светочувствительных белков, а мощность излучения соответствующего источника должна быть достаточной для открытия ионных каналов в мембране клеток, в которую встроен светочувствительный белок); 2 - система сканирования на основе двух гальванозеркал для позиционирования излучения на отдельные сердцевины многоканального волокна, 3 - дихроичная делительная пластина, отделяющая излучение накачки от излучения флуоресценции, распространяющегося в обратном направлении; 4 - модуль фокусировки (объектив); 5 - длинный отрезок многоканального оптоволокна с ферулой 6 на конце; 7 - короткий отрезок многоканального оптоволокна, закрепляемый на черепе подопытного животного с ферулой 8 на конце; 9 - коннектор для жесткого соединения первой и второй частей размыкаемого зонда; 10 - конфокальная система, обеспечивающая точное выделение регистрируемого излучения флуоресценции от отдельных каналов оптоволокна; 11 - оптическая система регистрации (включающая полосовые фильтры и спектрометр, фотоэлектронные умножители (или фотодиоды), электронную систему управления, аналого-цифровой преобразователь); 12 - система контроля на основе компьютера для управления лазерной системой возбуждения, анализа регистрируемого сигнала, построения изображений исследуемой области мозга и управления мощностью лазеров.

На фиг. 2 представлен общий вид размыкаемого зонда в замкнутом (а) и разомкнутом (б) состоянии: первая часть зонда выполнена в виде керамической ферулы 8, закрепляемой с помощью специального клея на кости черепа подопытного животного 13, и короткого отрезка многоканального оптоволокна 7, при этом дистальный конец многоканального оптоволокна 7 выходит за пределы корпуса ферулы 8 в мозг подопытного животного, а второй конец многоканального оптоволокна 7 находится в феруле 8 и с помощью коннектора 9 механически и оптически присоединяется ко второй части зонда. Вторая часть зонда содержит длинный отрезок многоканального оптоволокна 5, который закреплен с одного конца в керамической феруле 6. Керамический коннектор 9 связывает ферулы 6 и 8, и обеспечивает жесткое механическое соединение и оптический контакт между длинным 5 и коротким 7 отрезками многоканального оптического волокна. Внутренний диаметр керамической ферулы 8 соответствует внешнему диаметру оптического волокна 7 для точного позиционирования и герметичного закрепления (вклеивания). Во время проведения исследований обе части зонда соединяются между собой с помощью коннектора 9, который в разомкнутом состоянии остается на феруле 6.

Осуществление изобретения

Рассмотрим пример применения заявленной системы для получения изображений тестовых объектов и тканей головного мозга свободно движущихся животных (работы проводились в МГУ имени М.В. Ломоносова, схема системы для адресного контроля представлена на фиг. 1). Отличительной особенностью представленных экспериментов является использование преимуществ системы для получения изображений мозга тканей с генетически встроенными флуоресцентными маркерами живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами. Размыкаемая конструкция зонда (также употребимым в данном случае является термин - нейроинтерфейс) является ключевым преимуществом при проведении экспериментов по долговременной регистрации нейронной активности, структурных и морфологических изменений внутри живого мозга с клеточным разрешением. При этом благодаря небольшому весу и компактному размеру вживляемой части зонда между измерениями животные могут жить в обычных условиях, не испытывая дополнительного стресса.

Используемый зонд состоит из двух отрезков многоканального оптического волокна, содержащего порядка 6000 тысяч световодных сердцевин (каналов). Диаметр каждого канала порядка 1.5 мкм. Расстояние между центрами каналов приблизительно Λ≈3.6±0.3 мкм. Общий диаметр волокна 300 мкм. Числовая апертура NA индивидуального канала на длине волны 473 нм составляет величину около NA≈0.27. Первая часть нейроинтерфейса, состоящая из ферулы 8 и короткого отрезка многоканального волокна 7, позиционируется и фиксируется на голове анестезированного животного с помощью стереотаксиса, при этом дистальный конец многоканального волокна 7 через отверстие в черепе опускается на определенную глубину в мозг животного. Вторая размыкаемая часть зонда состоит из длинного отрезка многоканального волокна 5 и керамической ферулы 6. Длинный 5 и короткий 7 отрезки многоканального волокна являются эквивалентными по структуре. Длина отрезка 5 выбирается таким образом, чтобы обеспечить проведение долговременных экспериментов на животном и обеспечить ему свободное перемещение в пределах как минимум одного квадратного метра. Вторая часть зонда соединена с первой с помощью керамического коннектора 9, который обеспечивает жесткое механическое соединение и оптический контакт между длинным 5 и коротким 7 отрезками многоканального оптического волокна и в разомкнутом состоянии остается прикрепленным к феруле 6. Все время между экспериментами животное может жить в нормальных условиях с первой частью зонда (вес не более 0.3 грамма), что не влияет на нормальную жизнь таких мелких подопытных животных как мыши. Дистальный торец многоканального волокна 7 был скошен под углом 30 градусов по отношению к оси волокна 7 с помощью скалывателя, а затем полировался с грубостью порядка 300 нм. Подобная архитектура скола помогает уменьшить механические повреждения при прохождении волокна вглубь слоев мозга, а также увеличивает площадь сбора флуоресцентного сигнала и позволяет одновременно контролировать отдельные нейроны в различных слоях тканей головного мозга животных. Для реализации функции размыкаемости и обеспечения качественного оптического контакта процедура изготовления обеих частей зонда заключалась в следующем: обе части многоканального волокна 5 и 7, закрепленные соответственно в ферулы 6 и 8, скалывались у основания ферул, а затем полировались вместе с ними для обеспечения заданного качества оптического контакта. Механическое соединение двух частей обеспечивалось керамическим коннектором 9.

В тестовых экспериментах для проверки возможности и качества получаемых изображений через размыкаемый оптический зонд, лазерное излучение с длиной волны 473 нм заводилось в индивидуальные каналы длинного (80 см) отрезка 5 многоканального оптоволокна с помощью гальваносканера 2 и системы фокусировки 4, затем за счет оптического контакта, обеспечиваемого конструкцией размыкаемого оптического зонда (Фиг. 2), передавалось в каналы 10 мм отрезка волокна 7. Далее это излучение оптической накачки выходило из отдельных каналов дистального торца этого отрезка волокна 7 и возбуждало флуоресценцию находящихся в водном растворе 7.5 мкм полистироловых шариков, покрытых маркерным красителем. Излучение флуоресценции в зеленой области спектра (520-540 нм) собиралось тем же волокном 7, передавалось в обратном направлении через соединенные короткий 7 и длинный 5 отрезки многоканального волокна, далее отделялось дихроичным зеркалом 3 от излучения накачки и передавалось в систему регистрации, где строилось изображение полистироловых шариков (результаты представлены на Фиг. 3). Отметим, что размеры полистироловых шариков сопоставимы с размерами нейронов, т.е. в результате наши тестовые эксперименты продемонстрировали возможность получения изображений флуоресцирующих объектов с масштабами порядка размеров клеток и даже менее. Поскольку в данной реализации скос на конце волокон, закрепленных в керамические ферулы 6, 8 и соединяемых с помощью коннектора 9 отсутствовал (плоскости концов оптических волокна с ферулами полировались под углами 90 градусов относительно оси волокон), то сохранялась возможность поворота двух частей зонда (двух ферул с волокнами) друг относительно друга. Как видно из Фиг. 3, вращение длинного оптоволокна относительно короткого приводит к флуктуации качества изображения и его повороту. Очевидно, что при повороте соосность индивидуальных каналов может нарушаться относительно начальной, однако сохраняется достаточно хорошее оптичское качество соединения двух отрезков волокна, кроме того большое количество каналов в среднем компенсирует рассогласование начальной соосности индивидуальных каналов. Полировка торцов волокон с ферулами под определенным углом (наличие скоса) повышает сложность технологической обработки, однако позволяет реализовать большую точность механического соединения и соосность индивидуальных каналов в процессе размыкания/замыкания двух частей оптического зонда, что в результате повышает воспроизводимость получаемых изображений.

В условиях реальных экспериментов с живыми животными были использованы трансгенные мыши линии Thy1-EGFP. В соответствии с разработанной процедурой вживления первая часть нейроинтерфейса позиционировалась на определенной части черепа животного и дистальный конец оптоволокна опускался на определенную глубину исследуемой области мозга животного. Для возбуждения мы также использовали непрерывное излучение с длиной волны 473 нм, которое аналогично описанной выше процедуре измерений возбуждало флуоресценцию маркерного белка EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) в мозге бодрствующего свободноподвижного животного. Флуоресцентный сигнал от биомаркеров в зеленой области спектра собирался тем же самым волокном, передавался в обратном направлении, поступал в систему регистрации, где анализировался с помощью компьютера. На Фиг. 4 а, б представлены типичные фотографии соматосенсорной коры мозга трансгенной мыши линии Thy1-EGFP, полученные с помощью разработанной нами системы. На этих фотографиях видны индивидуальные клетки, при этом особенности расположения клеток восспроизводимы от реализации к реализации в масштабах нескольких дней. Таким образом, эксперименты продемонстрировали высокий потенциал применения размыкаемого зонда для визуализации с высоким пространственным разрешением нейронов генетически кодированных тканей головного мозга бодрствующих и свободно двигающихся животных.

Для реализации не только возможности получения изображений, но и оптического (оптогенетического) контроля индивидуальных клеток, эти клетки должны быть генетически кодированы не только флуоресцентными маркерами, но дополнительно содержать светочувствительные белки другого типа. Наиболее распространенным светочувствительным белком является каналородопсин-2 (Channelrhodopsin-2). Этот белок встраивается в мембрану клетки и при воздействии синего света достаточной мощности происходит реакция - в мембране клетки открывается канал для проникновения внутрь нее катионов. Проникновение катионов (например, Са+) в цитоплазму клетки приводит к запуску определенной функциональной активности клетки. Таким образом, свет является своеобразным триггером, запускающим ту или иную биохимическую реакцию в нейронах, что приводит к определенной функциональной реакции животного (как уже было отмечено, эта методика в узком смысле составляет определение оптогенетики). Светочувствительный белок Channelrhodopsin-2 и флуоресцентный маркер EGFP обладают перекрывающимися спектрами поглощения, поэтому для возбуждения флуоресценции и активации каналородопсина требуется применение лазерного источника в синей области спектра. В случае использования лазера на длине волны 473 нм его спектральные характеристики принципиально допускают возможность одновременного возбуждения обоих типов белков. Однако, для получения изображений с помощью флуоресцентных маркеров мощность используемого излучения на длине волны 473 нм не превышает величины 0.2-0.3 мВт, в то время как для достижения порога открытия ионных каналов требуются гораздо более высокие мощности. Учитывая, что клетка располагается на некотором расстоянии от поверхности дистального торца волокна, и также принимая во внимание дифракционную расходимость излучения и наличие рассеивающей ткани, мощность используемых источников для обеспечения достижения порога «срабатывания» каналородопсиновых клеток (приблизительно 1 мВт/мм2) должна быть высокой (в нашей системе предусмотрено наличие мощных лазерных источников до 200 мВт. (Принципиально мощность ограничивается пробоем оптических элементов, в частности, каналов оптоволокна, или нежелательным фоторазрушением биологической ткани.) Т.е. мощность излучения для флуоресцентной визуализации клеток и мощность излучения для инициирования функционального отклика клеток, содержащих каналородопсин, должна отличаться на 2-3 порядка. Это диктует использование лазерных источников достаточно высокой мощности с системой управления (возможно использование несколько источников). Необходимо отметить обязательное наличие обратной связи: анализируя полученные изображения, экспериментатор должен определить, какой определенную клетку (или группу клеток) он должен активировать и с помощью системы сканирования (гальваносканера), излучение заводится только в те сердцевины многоканального волокна, которые в результате адресно облучают выделенную целевую клетку (или клетки).

Другой возможностью раздельной реализации процессов получения изображения и адресного воздействия на клетки нейронов является использование генетически встроенных белков, обладающих различными спектрами поглощения. Например, светочувствительный белок галородопсин может использоваться для ингибирования нейронов, и при этом он обладает максимумом светопоглощения в районе 590 нм, а маркерный белок EGFP в области 480 нм. Таким образом, лазерная система должна обладать как минимум двумя лазерными источниками с различными длинами волн. При этом необходимо отметить, что в общем случае длина волны источников лазерного излучения и мощность должны соответствовать свойствам используемых генетически встроенных маркеров и светочувствительных белков, т.е. подстраиваться под определенную задачу (или наоборот, надо подбирать и создавать определенную комбинацию генетически встроенных маркеров под имеющиеся возможности лазерной системы).

Реализуемая методика волоконно-оптической эндоскопии с помощью разработанного устройства и способа имеет важные преимущества по сравнению со стандартной оптической визуализацией, поскольку обеспечивает получение флуоресцентных изображений тканей с клеточным разрешением и позволяет проникать в исследуемую область головного мозга на практически неограниченную глубину. При этом сохраняется возможность движения животного и контроля его активности. Размыкаемая конструкция волоконно-оптического зонда обеспечивает проведение длительных экспериментов с сохранением доступа к одной и той же группе нейронов, лежащей в глубоких слоях мозга живого животного, что позволяет осуществлять хроническое оптическое зондирование геномной активности нейронов. В ходе представленных экспериментов мы демонстрируем возможность получения флуоресцентных изображений тканей головного мозга подопытных свободно двигающихся животных с клеточным разрешением с помощью реализованного устройства на основе волоконно-оптического размыкаемого зонда с многоканальными волокнами.

1. Система для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами, содержащая систему сканирования на основе двух гальванозеркал с возможностью позиционирования излучения на отдельные сердцевины многоканального волокна, связанную с дихроичной делительной пластиной, отделяющей излучение накачки от излучения флуоресценции, распространяющегося в обратном направлении, и с модулем фокусировки – объективом, с возможностью передачи лазерного излучения через оптические контакты; связанную с системой сканирования конфокальную систему, обеспечивающую точное выделение регистрируемого излучения флуоресценции от отдельных каналов оптоволокна; оптическую систему регистрации, которая включает полосовые фильтры и спектрометр, фотоэлектронные умножители или фотодиоды, электронную систему управления, аналого-цифровой преобразователь; и связанную с с ней систему контроля на основе компьютера с возможностью управления лазерной системой возбуждения, анализа регистрируемого сигнала, построения изображений исследуемой области мозга и управления мощностью лазеров, а также лазерную систему оптического возбуждения, включающую, по меньшей мере, два лазера с различными длинами волн и изменяемой мощностью; волоконно-оптический зонд, состоящий из двух частей с первой частью, выполненной с возможностью закрепления на черепе животного, содержащей первую керамическую цилиндрическую ферулу с закрепленным в ней первым коротким отрезком многоканального оптического волокна, второй частью, содержащей коннектор со второй цилиндрической керамической ферулой и закрепленным в ней вторым длинным отрезком многоканального оптического волокна, при этом вторая часть зонда соединена с лазерной системой оптического возбуждения и системой регистрации и контроля, контактные поверхности первой и второй ферул выполнены плоскими, первый и второй отрезки многоканального волокна содержат не менее одной тысячи соосно расположенных световодов микронного размера, плоскость контакта первой и второй керамических ферул расположена в керамическом коннекторе, дистальный конец первого отрезка оптического волокна имеет плоскую поверхность, скошенную на угол от 30 до 60 градусов относительно оси оптического волокна, диаметр многоканального оптического волокна составляет от 250 мкм до 600 мкм.

2. Система по п. 1, отличающаяся тем, что плоскость контакта первой и второй ферул с отрезками многоканальных волокон составляет угол от 0 до 30 градусов относительно оси, перпендикулярной оси многоканального оптического волокна, контактные поверхности первой и второй ферул и отрезков многоканальных волокон полированы с точностью порядка 300 нм.

3. Система по п. 1, отличающаяся тем, что масса первой части зонда не более 0,3 г.

4. Способ адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных с помощью системы по п. 1, при котором генерируют лазерное излучение выбранной длины волны и мощности, позволяющие достигнуть порога фотоактивации клеток, содержащих генетически встроенные светочувствительные белки, фокусируют лазерное излучение посредством системы сканирования и модуля фокусировки в выбранные световоды длинного отрезка многоканального оптического волокна, находящегося внутри коннектора в оптическом контакте с первым коротким отрезком многоканального оптического волокна, закрепленным на черепе животного таким образом, что его дистальный конец расположен в выбранной области мозга животного, где лазерное излучение генерирует измеряемый сигнал флуоресценции, который передают через зонд в оптическую систему регистрации и контроля с управляющим компьютером, где полученные сигналы обрабатывают и строят флуоресцентные изображения клеток с последующим их анализом.

5. Способ по п. 5, отличающийся тем, что в процессе анализа флуоресцентных изображений определяют функциональную активность клеток, выбирают целевую клетку или группу клеток, после чего подбирают параметры лазерного излучения, необходимого для обеспечения фотоактивации клеток, с последующим облучением целевых клеток, после чего принимают и обрабатывают оптические сигналы, с последующим анализом изменений флуоресцентных изображений клеток выбранной области мозга.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что для фотоактивации клеток используют излучение или большей мощности, не менее чем на два порядка, и/или иной длины волны или импульсное лазерное излучение, достаточное для фотоактивации клеток.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, неврологии и нейрохирургии. Вводят окклюдер в среднюю мозговую артерию со стороны моделирования фокальной ишемии.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для коррекции эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобной модели гестоза.

Изобретение относится к медицине и предназначено для восстановления регенерации лимфоидной ткани селезенки в эксперименте. Для этого лабораторным животным (мышам) через 20 мин после облучения проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных стромальных клеток (ММСК) и гемопоэтичных стволовых клеток (ГСК), полученных из хориона плаценты лабораторных животных.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в эксперименте на животных с перевивными опухолями для достижения выраженного противоопухолевого эффекта.

Изобретение относится к медицинской технике и предназначено для обучения наложению сосудистого и сухожильного швов. Тренажер для наложения сосудистого и сухожильного швов содержит планшет и установленные на нем фиксаторы с винтовыми зажимами.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и касается оценки эффективности влияния химиотерапевтических препаратов на опухоль. Способ включает использование ксенотрансплантатной модели in vivo.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может найти применение в космонавтике для поддержания на высоком уровне операторской деятельности космонавтов в условиях не прогнозированного воздействия радиации, а также реабилитации пациентов после протонной терапии опухолей головного мозга.

Изобретение относится к нейрофизиологии, конкретно к направленному обучению биологической нейронной сети. Способ включает использование микроэлектродной матрицы для выращивания культуры диссоциированных нейрональных клеток, стимуляцию высокочастотными электрическими импульсами двух участков нейрональных клеток на основе правила зависящей от времени импульса синаптической пластичности и оценку эффективности обучения биологической нейронной сети.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается диагностики гипоксии плода в модели общей пренатальной гипоксической гипоксии. Моделируют общую пренатальную гипоксическую гипоксию у беременных крольчих породы Шиншилла на сроке 27-28 суток.

Группа изобретений относится к оборудованию для проведения исследований в области медицины и физиологии. Коннектор для хронической стимуляции электровозбудимых клеток содержит основание и крышку, выполненные с возможностью герметичного соединения друг с другом, микроэлектродную матрицу, выполненную в виде массива из металлических микроэлектродов, сформированных на подложке, с чашей для культуры клеток и с контактными площадками по периметру, соединенными посредством токопроводящих дорожек с микроэлектродами, и плату с отверстием, с выступом, с прижимными пружинными контактами, соединенными токопроводящими дорожками.

Изобретение относится к области обработки изображений. Технический результат – обеспечение сворачивания изображений для создания серий изображений, в соответствии с различными требованиями к сходству изображений различных пользователей.

Изобретение относится к компьютерной безопасности. Технический результат заключается в повышении безопасности во время аутентификации пользователя.

Изобретение относится к информационным дисплеям. Технический результат состоит в визуальном отображении на экране контента с применением тематических ассоциаций для эффективного сравнения различного информационного контента на одном дисплее.

Изобретение относится к калибровке инструментов, используемых для измерения поведения сигналов. Технический результат – получение характеристики сети и выполнение калибровки сети с неподдерживаемыми типами разъема, которые не отслеживают в соответствии с известными стандартами.

Группа изобретений относится к технологиям, раскрывающим устройства отображения пропускающего типа. Техническим результатом является обеспечение восприятия виртуального объекта в правильном местоположении относительно реального объекта за счет возможности регулировать угол конвергенции пользователя так, чтобы он соответствовал обнаруженному расстоянию между пользователем и реальным объектом.

Изобретение относится к области экранов дисплеев на жидких кристаллах, в частности к способу и устройству распознавания отпечатков пальцев. Технический результат заключается в сокращении расхода ресурсов, вызванном тем, что все датчики распознавания отпечатков пальцев, расположенные на всей поверхности экрана жидкокристаллического дисплея, имеют возможность распознавать отпечатки пальцев, что сберегает используемые ресурсы.

Группа изобретений относится к области компьютерной техники. Технический результат – обеспечение возможности точного выбора значения цветовой температуры.

Изобретение относится к средствам генерирования изображения. Технический результат заключается в уменьшении запаздывания от генерирования до отображения панорамного изображения.

Изобретение относится к средствам информационно-развлекательных систем для транспортных средств. Технический результат заключается в расширении арсенала технических средств.

Заявленное изобретение относится к области обработки данных, в частности к способу и системе управления электронными устройствами с помощью графического интерфейса пользователя.

Группа изобретений относится к области анализа биологических материалов, в частности медицинских тестов. В заявке описаны устройство, система, способ и машиночитаемый носитель для универсального анализа результатов иммунологических диагностических экспресс-тестов.

Группа изобретений относится к медицине, биологии и включает систему и способ ее использования для адресного контроля нейронов мозга живых, свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами. Система включает лазерную систему возбуждения, систему регистрации оптического отклика, размыкаемый волоконно-оптический зонд на основе многоканального оптического волокна со световодами микронного размера, содержащий модуль, закрепляемый на черепе животного, и ответную размыкаемую часть, обеспечивающую его связь с оптическими системами возбуждения и регистрации оптического отклика, в соответствии с тем, как изложено в формуле изобретения. ВОЗ состоит из двух частей, где первая выполнена с возможностью закрепления на черепе животного и содержит керамическую цилиндрическую ферулу с закрепленным в ней коротким отрезком МОВ. Вторая часть зонда содержит коннектор с другой цилиндрической керамической ферулой и закрепленным в ней длинным отрезком МОВ. Вторая часть зонда соединена с лазерной системой оптического возбуждения и системой регистрации и контроля. Отрезки МОВ содержат не менее одной тысячи соосно расположенных световодов микронного размера. Дистальный конец первого отрезка оптического волокна имеет плоскую поверхность, скошенную на угол от 30 до 60 градусов относительно оси МОВ, а диаметр МОВ – от 250 мкм до 600 мкм. При реализации способа генерируют лазерное излучение выбранной длины волны и мощности, позволяющее достигнуть порога фотоактивации клеток, содержащих генетически встроенные светочувствительные белки. Фокусируют лазерное излучение посредством системы сканирования и модуля фокусировки в выбранные световоды длинного отрезка МОВ, находящегося внутри коннектора в оптическом контакте с коротким отрезком МОВ, закрепленным на черепе животного так, что его дистальный конец расположен в выбранной области мозга животного. Излучение генерирует измеряемый сигнал флуоресценции, его передают через зонд в оптическую систему регистрации и контроля с компьютером, где полученные сигналы подвергают соответствующему анализу. Группа изобретений позволяет получать информацию о функционировании отдельных клеток мозга и адресно воздействовать на них, проводя долговременный ряд экспериментов на одном и том же животном в любой структуре мозга, обеспечивая при этом получение оптического сигнала от одной и той же группы клеток. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил.

Наверх