Способ оптической и температурной валидации приборов для пцр-исследований в режиме реального времени

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ валидации температурных, фотометрических и спектральных характеристик приборов для ПЦР-исследований. Предложенный способ включает использование раствора с молекулярными зондами - двуцепочечными молекулами ДНК, одна из цепей которых ковалентно связана с флуорофором, а другая - с гасителем флуоресценции, которые помещают в пробирки или планшеты для ПЦР-исследований и устанавливают в прибор для ПЦР-исследований. В предложенном способе отсутствует необходимость проведения амплификации, проводится только плавление молекулярных зондов с разными температурами плавления и мониторинг зависимости сигнала флуоресценции для каждого молекулярного зонда от температуры с определением температурных характеристических точек, при этом кинетика изменения сигнала флуоресценции используется для расчета фотометрических и спектральных параметров. Предложенный способ может быть использован в биотехнологии для оптической и температурной валидации приборов для ПЦР-исследований в режиме реального времени.

 

1. Область техники

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики и может быть использовано для валидации характеристик приборов для ПЦР-исследований в режиме реального времени.

2. Уровень техники

Точность установки и поддержания заданной температуры является критической для ПЦР [1]. Исследование, проведенное среди 18 лабораторий на 33 амплификаторах, показало, что воспроизводимость результатов ПЦР (в модельной, высокочувствительной к температуре, системе) в лунках приборов, не прошедших температурную калибровку, составила 66%, в то время как для калиброванных приборов она составила 88% [2]. Особенно актуальной точность измерения температуры становится при необходимости анализа кривой плавления, где требуется высокое температурное разрешение прибора.

Разработано множество подходов к контролю температуры в ПЦР-смеси. В первую очередь это термопары и платиновые резисторы, обеспечивающие иногда недостаточную точность из-за невозможности погружения их непосредственно в ПЦР-смесь. К примеру, Driftcon или MTAS (Mobile Temperature Acquisition System)(CyclerTest, Landgraaf, The Netherlands), которая использует 15 температурных зондов для калибровки амлификаторов и, по описанию производителя, позволяет калибровать амплификаторы в соответствии с требованиями ISO 17025, регламентирующими поверочные процедуры для аккредитованных лабораторий. Этот же производитель предлагает MTAS optical - снабженная светодиодами плашка с терморезисторами, специально для RT-PCR, позволяющая проводить калибровку при закрытой крышке прибора, разогрев плашки вызывает свечение диодов с хорошо известными спектрами и интенсивностью. Свет улавливается детектором амлификатора, и на основе этого строится картина равномерности температуры по блоку и чувствительности каналов. Ошибки таких неконтактных методов, тем не менее, могут достигать внушительных значений, расхождение приборной и фактической температур в реакторе до выравнивания температур с датчиком может составлять 8°С в течение 5-10 секунд [3].

Поэтому многие исследования направлены на создание неконтактных сенсоров, к примеру, предлагалось использовать для этого анализатор рамановского рассеяния [4], ЯМР [5], термографию на жидких кристаллах [6], ИК-термографию [7] и пр.

Обширные исследования посвящены использованию флуоресцентных красителей для калибровки температуры. Тут также встречаются различные подходы. Один из них, [8], заключается в использовании меченного флуорофором олигонуклеотида, конформация которого (и, соответственно, степень гашения флуоресцении нуклеотидами) является температурозависимой. Авторы [3] предлагают использовать записанную с высокой точностью кривую температурного гашения флуоресценции сульфородамина Б для калибровки температуры, авторы же [9] считают, что температурное тушение флуоресценции - слишком слабоменяющаяся величина для точных измерений, и предлагают добавлять в смесь для ПЦР неспецифичную ДНК (~1000 п. о.) и интеркалирующий краситель, определяя температуру по степени его высвобождения. Авторы также описали возможность использования двух двуцепочечных ДНК для двух температурных точек. Аналогичный метод описан в [10], где в ПЦР-смесь добавляются двухцепочечные ДНК в качестве внутреннего температурного контроля. В целом данный метод позволяет значительно увеличить равномерность температуры по термоблоку (дисперсия определяемой температуры падает с 0,16°С до 0,06°С при использовании температурного контроля для двух температур).

В статье [11] приводится сравнение чувствительности такого метода с данными, полученными с использованием физических методов детекции температуры (MTAS, Mobile Temperature Acquisition System, CyclerTest, Landgraaf, The Netherlands). Корреляция по абсолютной температуре составила r2=0,93; по охвату и «реалистичности» метода авторская методика определенно интересна тем, что аппроксимирует также влияние пластика, охватывает сразу весь термоблок и при этом весьма проста в использовании.

Также описывается использование молекулярных зондов типа «шпилька» для калибровки температуры в микрофлюидных устройствах [12, 13, 14].

В статье [13] описывается метод калибровки равномерности температуры по термоблоку с использованием олигонуклеотидного зонда типа «шпилька» и особой методики обсчета, использующей как данные по плавлению ампликона после ПЦР, так и данные плавления зонда. Плавление повторяется трижды, результаты аппроксимируются. Как итог - удалось снизить дисперсию температуры по плашке с 0,19°С до 0,06°С. Из минусов - разработанный ими температурный зонд «фонит» в канале FAM, ухудшая соотношение сигнал/шум.

В статье [14] приводят методику калибровки измерения абсолютной температуры в микрофлюидных устройствах с помощью аналогичного молекулярного зонда, предварительно промеренного на хорошем термостате и перенесенного на калибруемый прибор. То есть зонд используется как вторичный стандарт. Авторы утверждают, что добились почти полного соответствия точности измерения (±0,4°С - точность первого термостата).

На момент подачи заявки из открытых источников было известно о следующих наиболее близких аналогах.

Существующие коммерческие предложения направлены на аттестацию ПЦР-инструмента для проведения HRM (High resolution melting) анализа, используются различные подходы.

Продукт от Agilent «AriaMx HRM Calibration Plate Kit» предлагается для HRM калибровки AriaMx амплификатора производства Agilent с соответствующим ПО. Это предраскапанная 96-луночная плашка, содержащая модельную ДНК и краситель EvaGreen. По протоколу использования плашка не вскрывается и не термоциклируется, проводится непосредственно плавление.

Thermofisher предлагает предраскапанные плашки на 384 и 96 лунок, по их словам, «готовые для использования», в которых есть все реактивы для HMR и оптической Pure dye калибровки.

«MeltDoctor™ HRM Positive Control Kit» - также продукт от Thermofisher - набор для положительного контроля калибровки, содержит прямой и обратный праймеры, а также матрицу, имитирующую АА, АВ, ВВ аллели. Во всех случаях проводится ПЦР с данными реактивами. Представлены плашки 384, 96 лунок и «MeltDoctor™ HRM Calibration Standard», содержащий матрицу, праймеры, краски для смешивания с ПЦР-реагентами и раскапки по плашкам для оптической и термической калибровки.

Qiagen предлагает продукт для калибровки Rotor-Gene «Rotor-Gene Type-it HRM Discovery Kit», в набор входит модифицированная полимераза, буфер, матрица, краситель, праймеры, что также предполагает последующее проведение ПЦР.

Minerva Biolabs GmbH предлагает целый ряд наборов для калибровки различных характеристик термоциклеров. В том числе набор qPCR Cycler Check™, в который входят лиофилизированная матрица, праймеры, полимераза, нуклеотиды, зонды, меченные FAM и ROX, для различных температурных диапазонов и буфер для разведения.

Продукты от Agilent (здесь речь об поставляемом ими же наборе для HRM-анализа) и Qiagen основаны на плавлении матрицы с высвобождением красителя, отличительные черты - использование модифицированной Taq-полимеразы, способной долго сохранять активность (до 4 месяцев при +2°С, до 12 месяцев при -20°С), обеспечивать «химический» hot-start и высокую селективность без разделения смеси парафином. Также используется интеркалирующий краситель EvaGreen (описан как краситель 3-го поколения), способный образовывать комплексы как с А-Т, так и с G-C парами и не вызывать ингибирования ПЦР даже в высоких концентрациях.

Отличие продукта Thermofisher - использование другой краски «а stabilized form of the fluorescent SYTO® 9» и полимеразы «AmpliTaq Gold® 360 DNA Polymerase». Отличие полимеразы явно видно из сроков и условий хранения (60 дней при -20).

Известен патент WO 2014108446 A1 «Улучшенная калибровка плавления высокого разрешения», в котором в смесь для амплификации и дальнейшего плавления полученных ампликонов с высоким разрешением вносится один двуцепочечный зонд, одна цепь которого мечена флуорофором с максимумом эмиссии, отличающимся от максимума эмиссии интеркалирующего красителя, вторая цепь мечена гасителем флуоресценции. Полученные значения температуры плавления по 2 каналам детекции позволяют математически скорректировать наблюдаемые температуры плавления исследуемых амликонов относительно отклонения наблюдаемой температуры плавления калибровочного двуцепочечного зонда от истинной.

Известен патент РФ №145762 «Комплект мер флуоресценции», в котором Комплект позиционируется исключительно как мера флуоресценции, набор предназначен для всех приборов, мерящих флуоресценцию, в том числе ПЦР-амплификаторов с детекцией в реальном времени. Комплект представлен набором ампул с раствором натриевой соли флуоресцеина различной концентрации.

Основная отличие от других мер флуоресценции - жидкая форма изготовления, что позволяет использовать в нестандартных измерительных приборах.

Предлагаемый способ отличается от приведенного выше аналога тем, что:

1) отсутствует необходимость проведения ПЦР, а значит, использования полимеразы в комплектах, что снимает ограничения на условия хранения, а отсутствие амплификации снижает риск контаминации;

2) использование от 3 до 10 молекулярных зондов с разными (совпадающими, близкими и различающимися до 15°С) температурами плавления позволяет определять от 1 до 4 температурных характеристических точек;

3) использование от 2 до 5 каналов детекции (и соответственно флуорофоров) позволяет определять по 1 температурной характеристической точке в каждом канале.

3. Описание изобретения.

Предложен способ оптической и температурной валидации приборов для ПЦР-исследований в режиме реального времени.

Используются специфические молекулярные зонды - двуцепочечные синтетические молекулы ДНК, одна из цепей которой ковалентно связана с флуорофором, а другая - с гасителем флуоресценции, при этом флуорофор ковалентно связан с 3'-концом одной цепи двуцепочечного олигонуклеотида, а гаситель флуоресценции ковалентно связан с 5'-концом цепи двуцепочечного олигонуклеотида либо флуорофор ковалентно связан с 5'-концом одной цепи двуцепочечного олигонуклеотида, а гаситель флуоресценции ковалентно связан с 3'-концом цепи двуцепочечного олигонуклеотида.

Молекулярные зонды вносятся в каждую пробирку (лунку планшета) для ПЦР в равной концентрации. Равная концентрация флуорофоров позволяет при низкой температуре (20-45°С) детектировать фоновый, обусловленный неполным гашением флуорофора в составе молекулярного зонда, сигнал в каждой лунке термоциклера, при высокой температуре (60-96°С, конкретное значение зависит от температуры плавления каждого молекулярного зонда) наблюдать флуоресценцию зондов при полном расплавлении дуплексов. Полученные значения флуоресценции расплавленных зондов могут быть использованы для получения данных о соответствии оптических измерений и количества флуорофора для каждой пробирки в пределах термоблока и для каждого канала детекции.

Данные молекулярные зонды могут быть использованы для определения спектральных перекрестных наводок между каналами детекции (когда часть флуоресцентного сигнала из канала А попадает в соседний по спектральным характеристикам канал детекции канал Б). При этом значение коэффициента перекрестных наводок может быть получено с большой точностью.

Комбинируя зонды с различными температурами плавления и различными флуорофорами, возможно получение нескольких наборов данных за один эксперимент.

Использование нескольких (например, от 3 до 10) молекулярных зондов с разными температурами плавления позволяет определять несколько (от 3 до 10) температурных характеристических точек, что позволяет проводить валидацию температурных характеристик приборов для ПЦР-исследований в режиме реального времени.

Использование нескольких каналов детекции (и соответственно флуорофоров) позволяет определять одну и ту же характеристическую точку по 2 и более каналам детекции, повышая таким образом достоверность и точность определяемых значений.

Набор, содержащий данные молекулярные зонды, может использоваться как инструмент для проверки равномерности распределения температуры по термоблоку прибора для ПЦР-исследований в режиме реального времени, фотометрических и спектральных характеристик оптического тракта, что может быть использовано при производстве, диагностике, в том числе удаленно, и валидации.

4. Реализация изобретения

Набор содержит данные молекулярные зонды в виде растворов в отдельных пробирках или в предраскапанном планшете для ПЦР. Используются комбинации молекулярных зондов с разной температурой плавления и с разными флуорофорами.

Набор помещается в прибор для ПЦР-исследований в режиме реального времени (набор в виде отдельных пробирок требует предварительной подготовки планшета или пробирок для ПЦР для переноса в них соответствующих смесей молекулярных зондов), и запускается программа, включающая измерение флуоресценции в зависимости от температуры (кривая плавления).

Результатом расчета полученных данных являются:

1. Измеренный сигнал флуоресценции (фотометрическая зависимость);

2. Рассчитанная температура плавления (температурные характеристики);

3. Взаимное проникновение сигналов между каналами (спектральные характеристики).

Полученные данные используются для валидации приборов (точность выставляемой температуры, неравномерность температуры по термоблоку, фотометрических и спектральных характеристик оптического тракта), ремонта и обслуживания.

Список литературы

1) Novel Approach for Assessing Performance of PCR Cyclers Used for Diagnostic Testing. / D. Schoder, A. Schmalwieser, G. Schauberger, J. Hoorfar et al. // Journal of clinical microbiology. - 2005. – pp. 2724-2728.

2) Interlaboratory Study on Thermal Cycle Performance in Controlled PCR and Random Amplified Polymorphic DNA Analyses. / G.C. Saunders, J. Dukes, H.C. Parkes, J.H. Cornett // Clinical Chemistry. - 2001. – vol. 47:1. – pp. 47-55.

3) Sanford L.N., Wittwer C.T. Monitoring temperature with fluorescence during real-time PCR and melting analysis // Analytical Biochemistry. - 2013. - vol. 434. – pp. 26-33.

4) Davis KL, Liu KLK, Lañan M, Morris MD. Spatially resolved temperature measurements in electrophoresis capillaries by Raman thermometry // Anal Chem. - 1993. - vol. 65: 293-8.

5) Lacey ME, Webb AG, Sweedler JV. Monitoring temperature changes in capillary electrophoresis with nanoliter-volume NMR thermometry // Anal Chem. - 2000. - vol. 72: 4991-8.

6) Т.Н. Fung, Shih-Hui Chao. J.E. Peach, D.R. Meldrum. Liquid Crystal Thermography of an On-Chip Polymerase Chain Reaction Micro-Thermocycler // ASME 4th International Conference on Nanochannels, Microchannels, and Minichannels, Parts A and B. - 2006. - Limerick, Ireland. - pp. 1039-1044.

7) The Use of Infrared Thermography as a Novel Approach for Real-Time Validation of PCR Thermocyclers. / H. A. Grønlund, C. Löfström, J.B. Helleskov, J. Hoorfar. - 2010. - vol. 3:2. – pp. 116-119.

8) Noncontact Temperature Measurement in Microliter-Sized Volumes Using Fluorescent-Labeled DNA Oligomers. / S. Jeon, J. Turner, S. Granick// J. Am. Chem. Soc. - 2005. - vol. 125(33). – pp. 9908-9909.

9) Novel fluorescence detection technique for non-contact temperature sensing in microchip PCR. / S. Mondai, V. Venkataraman // J. Biochem. Biophys. Methods. - 2007. - 70. – pp. 773-777.

10) Unlabeled Oligonucleotides as Internal Temperature Controls for Genotyping by Amplicon Melting. / M.T. Seipp, J.D. Durtschi, M.A. Liew, J.Williams et al. // Journal of Molecular Diagnostics. - 2007. - vol. 9:7.

11) The use of melting curves as a novel approach for validation of real-time PCR instruments. / Helmut Von Keyserling, T.Bergmann, M.Wiesel, A.M. Kaufmann // BioTechniques. - 2011. – vol. 51. - pp. 179-184.

12) Chemical and physical processes for integrated temperature control in microfluidic devices. / R.M. Guijt, A. Dodge, G. W. K. van Dedem, N.F. de Rooij et al. // Lab on a Chip. - 2003. - issure 1.

13) Molecular Beacon-Based Temperature Control and Automated Analyses for Improved Resolution of Melting Temperature Analysis Using SYBR I Green Chemistry. / C. , U. , H. Karlsson // Clinical Chemistry. - 2007. – vol. 53:1. – pp. 98-103.

14) A Microfluidic Platform Using Molecular Beacon-Based Temperature Calibration for Thermal Dehybridization of Surface-Bound DNA. / A. Dodge, G. Turcatti, I. Lawrence, N.F. de Rooij, E. Verpoorte // Anal. Chem. - 2004. - vol. 76. – pp. 1778-1787.

Способ валидации температурных, фотометрических и спектральных характеристик приборов для ПЦР-исследований, включающий использование раствора с молекулярными зондами - двуцепочечными молекулами ДНК, одна из цепей которых ковалентно связана с флуорофором, а другая - с гасителем флуоресценции, при этом флуорофор ковалентно связан с 3'-концом одной цепи двуцепочечного олигонуклеотида, а гаситель флуоресценции ковалентно связан с 5'-концом цепи двуцепочечного олигонуклеотида либо флуорофор ковалентно связан с 5'-концом одной цепи двуцепочечного олигонуклеотида, а гаситель флуоресценции ковалентно связан с 3'-концом цепи двуцепочечного олигонуклеотида, которые помещают в пробирки или планшеты для ПЦР-исследований и устанавливают в прибор для ПЦР-исследований, отличающийся тем, что отсутствует необходимость проведения амплификации, проводится только плавление молекулярных зондов с разными температурами плавления и мониторинг зависимости сигнала флуоресценции для каждого молекулярного зонда от температуры с определением температурных характеристических точек, что позволяет проводить валидацию детектирующего амплификатора по температурным характеристикам, а полученный сигнал флуоресценции полностью денатурированных молекулярных зондов - проводить валидацию фотометрических характеристик, а также включающий использование растворов, по одному раствору на каждый флуорофор, с одним молекулярным зондом, при плавлении которого фиксируется сигнал флуоресценции во всех каналах детекции и используется для валидации спектральных характеристик прибора.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к генетике. Описан способ прогнозирования риска возникновения преэклампсии тяжелого течения у женщин русской национальности, уроженках Центрального Черноземья, относится к области медицинской диагностики.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*6 (1707delT) rs5030655.

Представленные изобретения касаются способа детектирования наличия аналита в жидком образце, способа детектирования наличия патогена в образце цельной крови, способа детектирования наличия вируса в образце цельной крови, способа детектирования присутствия нуклеиновой кислоты-мишени в образце цельной крови, способа детектирования наличия организмов, относящихся к видам Candida в жидком образце, системы для детектирования одного или более аналитов нуклеиновой кислоты в жидком образце и сменного картриджа для размещения реагентов для анализа и расходных материалов в указанной системе.

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ оценки биотропного проявления электромагнитного излучения сверхвысокой частоты, интегрированного под контроль гена dps, согласно которому регуляторная область гена dps интегрируется в плазмиду рЕТ28b-EGFP перед геном репортерного белка GFP, клетки Е.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ дифференциации пород медоносных пчел России на основе мутагенной ПЦР-ПДРФ.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен тестовый элемент для определения гидроксибутирата и глюкозы, содержащий первый коферментзависимый фермент или субстрат для первого фермента (гидроксибутиратдегидрогеназу), второй коферментзависимый фермент или субстрат для второго фермента (глюкозодегидрогеназу или глюкозооксидазу), кофермент, выбранный из тио-NAD, тио-NADP и соединения формулы (I).

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*4 (1846G>A) rs3892097.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*9 (2615-2617delAAG) rs5030656.

Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии и предназначено для определения генотипа человека по полиморфизму в гене цитохрома Р450 CYP2D6*3 (2549delA) rs35742686.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для ранней диагностики острого инфекционного эндокардита (ИЭ). Проводят забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию и генотипирование полиморфного локуса -455G-A гена FGB у лиц группы риска.

Предложены способ и устройство для детектирования хромосомных структурных аномалий. Представленный способ включает сегментирование хромосомного образца от целевого индивидуума, то есть множество пар прочтений, расположенных с двух концов исследуемых хромосомных фрагментов; выравнивание результата секвенирования с референсной последовательностью для получения набора аномальных соответствий, причем набор аномальных соответствий включает пары прочтений, которые имеют две последовательности прочтений, соответствующие, соответственно, различным хромосомам референсной последовательности; кластеризацию последовательностей прочтений в наборе аномальных соответствий на основании соответствующих им положений; и фильтрацию получаемых в результате кластеров с использованием, например, заранее заданных требований, связанных с компактностью, и других требований; и получение отфильтрованных итоговых кластеров для определения наличия хромосомной структурной аномалии транслокационного типа. Изобретения позволяют получить результат секвенирования всего генома индивидуума. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу предсказания исхода рака молочной железы в положительной по рецептору эстрогена и отрицательной по HER2 опухоли у пациента с раком молочной железы, предусматривающему определение в образце опухоли от указанного пациента величины уровня экспрессии РНК генов UBE2C, BIRC5, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST и MGP или генов UBE2C, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST и MGP, математическое комбинирование величин уровней экспрессии, где более высокий комбинированный показатель указывает на более худший прогноз у указанного пациента по сравнению с более низким комбинированным показателем. Изобретение позволяет эффективно предсказывать исход рака молочной железы. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 10 табл.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложена система и способ для сбора нуклеиновой кислоты из образца текучей среды организма, а также стерильная съемная крышка для приемника для сбора отходов. Система содержит приемник, съемную крышку для приемника с вентиляционным отверстием и отверстием для соединения с образцом текучей среды организма, фильтрационную колонку, контейнер для сбора образца текучей среды организма и выполненный с возможностью вмещения фильтрационной колонки транспортировочный контейнер. Способ включает обеспечения образца текучей среды организма в контейнере, присоединение контейнера к приемнику, пропускание данного образца из контейнера через фильтрационную колонку, помещение транспортировочного контейнера над фильтрационной колонкой, зацепление фильтрационной колонки с транспортировочным контейнером и отсоединение фильтрационной колонки от крышки приемника. Изобретения обеспечивают обработку большего объёма образца текучих сред организма и обнаружение низких концентраций внеклеточных нуклеиновых кислот в образце текучих сред организма. 3 н. и 36 з.п. ф-лы, 17 ил., 5 табл., 4 пр.

Изобретение относится к молекулярной биологии. Предложен способ разделения молекул ДНК, предусматривающий негативную селекцию целевых молекул ДНК в растворе от нецелевых молекул ДНК, предусматривающий взаимодействие нецелевых молекул ДНК, содержащих сайт узнавания рекомбиназы Cre бактериофага P1 LoxP, с рекомбиназой Cre бактериофага Р1, дефектной по способности ковалентно модифицировать ДНК, которое обеспечивает перевод нецелевых молекул ДНК из раствора на твердую фазу. Применение принципа негативной селекции позволяет исключить необходимость присутствия дополнительных нуклеотидных последовательностей в целевых молекулах ДНК. Кроме того, предложенный способ не требует наличия минимальных различий в длинах целевых и нецелевых молекул ДНК для их эффективного разделения. 14 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 пр.

Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ валидации температурных, фотометрических и спектральных характеристик приборов для ПЦР-исследований. Предложенный способ включает использование раствора с молекулярными зондами - двуцепочечными молекулами ДНК, одна из цепей которых ковалентно связана с флуорофором, а другая - с гасителем флуоресценции, которые помещают в пробирки или планшеты для ПЦР-исследований и устанавливают в прибор для ПЦР-исследований. В предложенном способе отсутствует необходимость проведения амплификации, проводится только плавление молекулярных зондов с разными температурами плавления и мониторинг зависимости сигнала флуоресценции для каждого молекулярного зонда от температуры с определением температурных характеристических точек, при этом кинетика изменения сигнала флуоресценции используется для расчета фотометрических и спектральных параметров. Предложенный способ может быть использован в биотехнологии для оптической и температурной валидации приборов для ПЦР-исследований в режиме реального времени.

Наверх