Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний



Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
Ми-рнк и их применение в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний
C12N2310/14 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)
C12N15/113 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2663100:

СИЛЕНТИС САУ (ES)

Предложено применение ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, для лечения сухих глаз и/или глазной боли, а также для получения лекарственного средства для лечения сухих глаз и/или глазной боли. При этом ми-РНК вводят местно в глаз в дозе от 0,3 до 0,9 мг в сутки. Также предложен способ лечения сухих глаз и/или глазной боли, характеризующийся введением местно в глаз указанной ми-РНК в указанном количестве. Предложен также медицинский набор для введения ми-РНК, содержащий указанную ми-РНК и дозатор с дозирующим клапаном для высвобождения конкретных доз соединения ми-РНК в капле, имеющей предварительно определяемый объем, и напечатанные инструкции по введению предложенной ми-РНК. Группа изобретений обеспечивает эффективное лечение глазных состояний, связанных с высокими уровнями экспрессии и/или активности рецептора ваниллоида-1 (TRPV). 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к получению ми-РНК-продуктов и их применению в способах и композициях для лечения и/или профилактики глазных состояний, связанных с высокими уровнями экспрессии и/или активностью ваниллоидного канала с транзиторным рецепторным потенциалом (TRPV1), с использованием РНК-интерференции. Наряду с прочим, необходимо облегчение глазных состояний, связанных с болью в глазах, таких как дискомфорт и измененная чувствительность роговицы после рефракционной операции, использования контактных линз, синдрома сухого глаза и синдрома Шегрена.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

РНК-интерференция (РНК-и) является природным механизмом регуляции в большинстве эукариотических клеток, в котором используются малые двунитевые молекулы РНК (дн-РНК) для управления зависимым от гомологии сайленсингом генов. За ее открытие у червя C. elegans (Fire, 1998) Fire и Mello получили Нобелевскую премию в 2006 году. Вскоре после первого описания РНК-и также было показано, что она происходит в клетках млекопитающих не за счет длинных дн-РНК, а с помощью малых интерферирующих РНК (ми-РНК) длиной 21 нуклеотид (Elbashir, 2001).

Полагают, что процесс РНК-интерференции является эволюционно консервативным механизмом защиты клеток, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов и обычно является общим для разных типов и флоры, в которых такой процесс называют посттранскрипционным сайленсингом генов. С момента открытия механизма РНК-и произошел взрыв исследований, направленных на обнаружение новых соединений, которые могут избирательно изменять экспрессию генов в качестве нового пути лечения заболеваний человека посредством адресного воздействия на мишени, которые в противном случае не поддаются медикаментозному лечению с использованием традиционных фармацевтических способов, в которых используют малые молекулы или белки.

Согласно современным представлениям механизм РНК-и инициируется в том случае, когда длинные двунитевые РНК процессируются белком, подобным РНКазе III, известным как Dicer. Белок Dicer обычно содержит N-концевой домен РНК-геликазы, РНК-связывающий так называемый Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) домен, два домена РНК-азы III и домен, связывающий двунитевую РНК (dsRBD) (Collins, 2005), и его активность приводит к процессингу длинных двунитевых РНК на 21-24-нуклеотидные двунитевые ми-РНК с состоящими из 2 оснований выступающими 3'-концами и 5'-фосфатом и 3'-гидроксильной группой. Получаемые в результате дуплексы ми-РНК затем включаются в эффекторный комплекс, известный как РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), где антисмысловая или ведущая нить ми-РНК позволяет RISC распознавать и расщеплять последовательности мРНК-мишени (Elbashir, 2001) после зависимого от аденозинтрифосфата (АТФ) раскручивания двунитевой молекулы ми-РНК в результате РНК-геликазной активности (Nykanen, 2001). Каталитическая активность RISC, которая приводит к распаду мРНК, опосредована эндонуклеазой Argonaute 2 (AGO2) (Liu, 2004; Song, 2004). AGO2 относится к высоко консервативному семейству белков Argonaute. Белки Argonaute представляют собой высоко основные белки с молекулярной массой ~100 кД, которые содержат два общих домена, а именно домены PIWI и PAZ (Cerutti, 2000). Домен PIWI является ключевым для взаимодействия с Dicer и обладает нуклеазной активностью, ответственной за расщепление мРНК (Song, 2004). AGO2 использует одну нить дуплекса ми-РНК в качестве ведущей при нахождении матричных РНК, содержащих комплементарные последовательности, и расщепляет фосфодиэфирный остов между основаниями 10 и 11 относительно 5'-конца ведущей нити (Elbashir, 2001). Важной стадией во время активации RISC является расщепление смысловой нити или «нити-пассажира» под действием AGO2, удаляющей такую нить из комплекса (Rand, 2005). Кристаллографические исследования, в которых анализировали взаимодействие между ведущей нитью ми-РНК и доменом PIWI, показали, что имеется только 2-8 нуклеотидов, которые составляют «затравочную последовательность», которая направляет распознавание мРНК-мишени комплексом RISC, и что несовпадение одного нуклеотида в такой последовательности может существенно влиять на способность молекулы к сайленсингу (Ma, 2005; Doench 2004; Lewis, 2003). После того как мРНК была расщеплена и вследствие присутствия незащищенных концов РНК во фрагментах мРНК далее расщепляется и распадается под действие внутриклеточных нуклеаз и больше не будет транслироваться в белки (Orban, 2005), тогда как RISC будет повторно использоваться в последующих раундах (Hutvagner, 2002). Указанный процесс представляет собой каталитический процесс, приводящий к избирательному уменьшению количества конкретных молекул мРНК и соответствующих белков. Можно использовать такой нативный механизм сайленсинга генов с целью регуляции любого выбранного гена(ов), непосредственно доставляя ми-РНК-эффекторы в клетки или ткани, где они буду активировать RISC и вызывать эффективный и специфичный сайленсинг целевой мРНК.

Было опубликовано множество исследований, описывающих, какие идеальные признаки должна иметь ми-РНК, чтобы достичь максимальной эффективности, касающиеся длины, структуры, химического состава и последовательности. Исходные параметры для конструирования ми-РНК были приведены Tuschl с соавторами в WO 02/44321, хотя с тех пор были опубликованы многие последующие исследования, алгоритмы и/или улучшения. Также значительные усилия были предприняты для повышения стабильности ми-РНК, поскольку это считается одним из основных препятствий для терапии на основе ми-РНК, учитывая повсеместное присутствие РНКаз в биологических жидкостях. Одной из основных стратегий, которой руководствовались для повышения стабильности, было использование модифицированных нуклеотидов, таких как 2'-O-метилнуклеотиды, 2'-аминонуклеотиды, нуклеотиды, содержащие 2'-O- или 4'-C-метиленовые мостики. Также была описана модификация рибонуклеотидного остова, связывающего соседние нуклеотиды, главным образом, за счет введения фосфоротиоатных модифицированных нуклеотидов. По-видимому, повышенная стабильность часто обратно пропорциональна эффективности (Parish, 2000), и только определенное количество, положения и/или сочетания модифицированных нуклеотидов могут приводит к стабильному соединению, необходимому для сайленсинга. Так как это является важным препятствием при основанном на ми-РНК лечении, были опубликованы разные исследования с описанием некоторых картин модификации, которые давали хорошие результаты, примеры таких публикаций включают EP1527176, WO 2008/050329, WO 2008/104978 или WO 2009/044392, хотя в литературе можно найти намного больше.

Ваниллоидный канал с транзиторным рецепторным потенциалом (TRPV1), также называемый ваниллоидным рецептором 1 (VR-1), является капсаицин-чувствительным лиганд-зависимым катионным каналом, который был впервые открыт в 1997 (Caterina, 1997). TRPV1, главным образом, экспрессируется на сенсорных нейронах и служит в качестве молекулярного детектора тепла, капсаицина, протонов и эндованиллоидов (Caterina, 2001; Montell, 2002; Baumann, 2000). Хотя авторы настоящего изобретения обнаружили экспрессию TRPV1 также и в тканях слезной железы и цилиарного тела.

Когда TRPV1 активируется агонистами, такими как капсаицин и другие факторы, такие как нагревание, ацидоз, продукты липоксигеназы или анандамид, кальций поступает в клетку и происходит инициация сигналов боли. Активация канала индуцирует высвобождение нейропептида из окончаний центральных и периферический сенсорных нейронов, приводя к ощущению боли, нейрогенному воспалению и иногда к сокращению гладкой мускулатуры и кашлю. В действительности, недавно полученные данные свидетельствуют о роли TRPV1 в случае боли, кашля, астмы и недержания мочи (Jia, 2005). На самом деле TRPV1 является известной мишенью для лечения посредством обезболивания в ответ на болевые стимулы. Кроме того, лечение, направленное на снижение уровня экспрессии TRPV1 с использованием разных методик, также было описано в WO 2004/042046 или в публикации (Schubert, 2005), при этом основное внимание было уделено лечению боли.

Полимодальные ноцицепторы являются наиболее широко распространенным типом ноцицепторов, находящихся в роговице. Имеются фармакологические данные о том, что такие рецепторные волокна экспрессируют рецептор TRPV1, так как они отвечают на капсаицин, нагревание и кислоту. Более того, высокие дозы капсаицина инактивируют ответ полимодальных ноцицепторов роговицы на нагревание и кислоту, хотя ответная реакция на механическое воздействия остается неизменной. Это свидетельствует о том, что рецепторы TRPV1, присутствующие в окончаниях полимодальных нервных волокон роговицы, избирательно инактивировались. Таким образом, по-видимому, важная часть острого ноцицептивного ответа на повреждение роговицы и длительные ощущения боли, которые сопровождают воспалительные процессы и процессы раздражения в такой ткани, опосредованы активацией TRPV1.

Кроме того, в WO 2007/045930 описано использование TRPV1-специфичных ми-РНК для лечений глазных патологий, связанных с глазной болью и синдромом сухого глаза. Однако настоящее изобретение относится к улучшенным продуктам для снижения экспрессии TRPV1 и возникающего в результате дискомфорта в глазах. Преимущество лечения таких состояний с использованием ми-РНК-продуктов по сравнению с лечением традиционными химическим ингибиторами состоит в том, что лечение, основанное на ми-РНК, может давать более длительный эффект. Такой результат является следствием того факта, что после того, как эффекторная молекула больше не будет присутствовать, клетка должна синтезировать новые рецепторы заново; тогда при традиционном лечении могут оставаться определенные уровни интактных рецепторов на клеточной мембране.

В связи с современным образом жизни количество людей с патологиями глаз, связанными с измененной чувствительностью глаза, довольно высоко и, как ожидается, увеличится в связи с повышением возраста популяции. Рефракционная операция и контактные линзы часто приводят к измененной чувствительности роговицы и ощущению сухости в глазах у пациента. Это дополнительно усугубляется при длительной продолжительности рабочего времени за экраном компьютера и использованием систем кондиционирования воздуха, которые обычно дополнительно сушат атмосферный воздух. Также количество и качество слез снижается с возрастом. Симптомы, сопровождающие синдромы сухих глаз, включают зуд, жжение и раздражение тканей глаза. Более тяжелая форма синдрома сухих глаз встречается у пациентов с синдромом Шегрена. Наличие одного или разных сочетаний указанных ощущений называют глазной болью в используемом в настоящем описании значении. В настоящее время синдромом сухих глаз, судя по оценкам, страдают более 10 миллионом американцев.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой диаграмму, на которой показан временной профиль экспрессии TRPV1, полученный с использованием количественной ПЦР в реальном времени (Qrt-ПЦР) после трансфекции клеток HeLa разными ми-РНК, мишенью которых является TRPV1: соединением согласно настоящему изобретению (SEQ ID NO: 2), ранее описанным соединением, мишенью которого является другая область (SEQ ID NO: 7) и четырьмя другими ми-РНК (SEQ ID NO: 17-20), сконструированными для целенаправленного воздействия на TRPV1, и рандомизированной последовательностью, используемой в качестве негативного контроля. Для ясности показано два альтернативных представления одних и тех же результаты, A и B.

Фигура 2 представляет собой диаграмму, показывающую временной профиль экспрессии TRPV1, полученный с использованием Qrt-ПЦР, после трансфекции клеток HeLa разными ми-РНК согласно настоящему изобретению: SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 - SEQ ID NO: 16 и рандомизированной последовательностью, используемой в качестве негативного контроля.

На фигуре 3 показан временной график раскрытия глазной щели, измеряемого в мм, в случае глаз кроликов, обработанных соединением согласно настоящему изобретению (SEQ ID NO: 2), по сравнению с капсазепином, разрешенным анальгезирующим средством, специфичным для зависимой от TRPV1 боли, после стимуляции капсаицином.

Фигура 4 является графиком, показывающим отношения (%) к значениям раскрытия глазной щели до проведения тестирования после индукции боли капсаицином, полученные в результате обработки соединением согласно настоящему изобретению (SEQ ID NO: 2) и капсазепином.

Фигура 5 является графиком, показывающим количество интактного продукта (%), которое остается после воздействия 10% плазмы в течение 24 часов.

Фигура 6 является графиком, показывающим концентрацию последовательности SEQ ID NO: 2 в тканях глаза на основе 5-фосфорилированной интактной антисмысловой нити, что означает количество интактной не подвергнутой метаболизму антисмысловой нити SEQ ID NO: 2 (исходное соединение), которая присутствует в цитоплазматическом компартменте и активируется 5'-фосфорилированием. Левый столбик: 5 минут; правый столбик: 30 минут.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к разработке схемы дозирования для молекулы ми-РНК, при этом специфичной мишенью указанной молекулы является последовательность SEQ ID NO: 1 и молекула снижает экспрессию гена TRPV1 ври введении в клетку.

Ми-РНК согласно настоящему изобретению «целенаправленно воздействует на ген» когда, например, молекула ми-РНК избирательно снижает или ингибирует экспрессию гена. Фраза «избирательно снижает или ингибирует» в используемом в настоящем описании смысле охватывает ми-РНК, которые влияют на экспрессию одного гена, в данном случае TRPV1. Альтернативно ми-РНК целенаправленно действует на ген, когда ми-РНК гибридизуется в жестких условиях с транскриптом гена, т.е. с его мРНК. Способна гибридизоваться «в жестких условиях» означает отжиг с областью мРНК-мишени в стандартных условиях, например, при высокой температуре и/или в случае низкого содержания соли, которые, как правило, не способствуют гибридизации. Подходящий протокол (включающий использованием 0,1×SSC, 68°C в течение 2 часов) описан в публикации Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, например, на стр. 387-389.

Последовательности нуклеиновых кислот, указанные в настоящем описании, записаны в 5'-3'-направлении, если не указано иное. Термин «нуклеиновая кислота» относится к ДНК или РНК или их модифицированной форме, содержащей пуриновые или пиримидиновые основания, присутствующие в ДНК (аденин «A», цитозин «C», гуанин «G», тимин «T) или в РНК (аденин «A», цитозин «C», гуанин «G», урацил «U»). Интерферирующие РНК, предлагаемые в настоящем изобретении, могут содержать основания «T», например, на 3'-концах, даже хотя основания «T» и не встречаются в природе в РНК. В некоторых случаях такие основания могут быть указаны как «dT», чтобы отличить дезоксирибонуклеотиды, присутствующие в цепи рибонуклеотидов.

Последовательность-мишень, которая определена выше, описана как последовательность ДНК-мишень, которая использована для определения вариантов транскриптов в базах данных, используемых в целях конструирования ми-РНК, хотя конкретные соединения, которые необходимо использовать, будут представлять собой последовательности РНК, определяемые как таковые.

Были идентифицированы разные варианты транскриптов, соответствующие TRPV1. Номера доступа в GenBank, соответствующие четырем транскриптам TRPV1, продуцируемым в результате альтернативного сплайсинга: NM_080704 (NM_080704.3, GI: 117306161), NM_018727 (NM_018727.5, GI:117306160), NM_080706 (NM_080706.3, GI:117306163) и NM_080705 (NM_080705.3, GI:117306162). Кроме того, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute) имеет 5 дополнительных транскриптов TRPV1, опубликованных в: ENST00000174621, ENST00000310522, ENST00000344161, ENST00000399752, ENST00000399756, ENST00000399759, ENST00000425167.

Настоящее изобретение относится к схемам дозирования ми-РНК, которые ингибируют экспрессию гена TRPV1, при этом такие ми-РНК особенно эффективны по сравнению с ми-РНК, уже раскрытыми в известном уровне техники. «Особенно эффективны» означает, что они достигают более высоких степеней ингибирования и/или более длительного эффекта.

Такие ми-РНК направлены против последовательности-мишени, общей для всех вариантов транскриптов TRPV1, описанных в предыдущем параграфе, и таким образом опосредуют RISC-опосредованную деградацию всех возможных мРНК, присутствующих в клетке, кодирующих белок TRPV1. Указанная предпочтительная область-мишень, идентифицированная в настоящем изобретении, описана в виде последовательности SEQ ID NO:1 (5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3'). Ми-РНК описаны в WO 2011/148193.

Следовательно, ми-РНК согласно аспектам настоящего изобретения, предпочтительно, будут содержать двунитевую молекулу РНК, антисмысловая нить которой будет содержать или состоять из последовательности РНК, по существу комплементарной последовательности SEQ ID NO: 1, и ее смысловая нить будет содержать последовательность РНК, комплементарную антисмысловой нити, при этом обе нити гибридизуются посредством стандартного спаривания оснований между нуклеотидами.

Как используется в настоящем изобретении «по существу комплементарная» последовательности мРНК-мишени также можно понимать как «по существу идентичная» указанной последовательности-мишени. «Идентичность», как известно специалисту в данной области, означает степень родства последовательностей между нуклеотидными последовательностями, которую определяют на основе совпадения порядка и природы нуклеотидов в последовательностях. В одном из вариантов осуществления антисмысловая нить ми-РНК, имеющую комплементарность, составляющую 80% и от 80% вплоть до 100%, например, комплементарность 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью мРНК-мишени, считают по существу комплементарной, и ее можно применять в настоящем изобретении. Процент комплементарности описывает процент следующих друг за другом нуклеотидов в первой молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать пары оснований согласно правилу Уотсона-Крика с группой следующих друг за другом нуклеотидов во второй молекуле нуклеиновой кислоты.

Как известно из уровня техники, было предложено множество разных структур для достижения интерференции РНК. Обычно такие двунитевые молекулы имеют длину примерно от 19 до примерно 25 нуклеотидов и содержат структуры с тупыми концами, а также структуры с выступающими концами. Как было описано, выступающие концы имеют преимущества и могут присутствовать на 5'-концах или на 3'-концах любой нити, так как они снижают распознавание РНК-азами и имитируют природный субстрат Dicer. Некоторые авторы рекомендовали включение выступающих концов на обоих 3'-концах молекул, тогда как другие считают достаточным один выступающий конец. Другие авторы описали применение структур с тупыми концами со специфичными картинами модификации (EP 1527176, WO 2008/104978 и многие другие).

Выступающие концы могут содержать от 1 до 5 нуклеотидов, обычно выступающие концы состоят из динуклеотидов. Классические молекулы, используемые в данной области, содержат 19-нуклеотидную двунитевую молекулу, которая дополнительно содержит 3'-динуклеотидные выступающие концы, предпочтительно, содержащие дезоксинуклеотиды, как показано в ранних исследованиях Tuschl (WO 02/44321). Говорят, что такие выступающие концы дополнительно повышают резистентность к расщеплению нуклеазами (РНК-азами). Позднее Kim et al. (2005) описали, что 21-мерные продукты (содержащие динуклеотидные выступающие концы) необходимы для загрузки на RISC. Кроме того, Bramsen et al. (2009) описали введение возможных дестабилизирующих модификаций в выступающие концы, чтобы дополнительно повысить эффективность сайленсинга.

По существу предпочтительный вариант осуществления различных аспектов настоящего изобретения относится к молекулам ми-РНК, мишенью которых является последовательность SEQ ID NO: 1, которые содержат, по меньшей мере, один выступающий конец.

Другой альтернативный вариант осуществления различных аспектов настоящего изобретения относится к молекулам с тупыми концами.

Кроме того, предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к ми-РНК, содержащей или состоящей из 19-нуклеотидной двунитевой структуры, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1. Неожиданно, указанные 19-нуклеотидные двунитевые РНК оказались более резистентными к распаду, чем ранее описанные продукты, содержащие 21 нуклеотид и 3'-выступающие концы, как можно видеть на фигуре 5.

Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к 19-нуклеотидной двунитевой ми-РНК с тупыми концами, направленной против SEQ ID NO: 1. В следующем конкретном варианте такое соединение идентифицировано как последовательность SEQ ID NO: 2 (5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'). В следующем предпочтительном варианте осуществления антисмысловая нить такой ми-РНК по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, комплементарна последовательности SEQ ID NO: 1.

Кроме того, как описано в разделе, озаглавленном «Уровень техники», важной проблемой, связанной с молекулами ми-РНК, является их нестабильность в биологических жидкостях вследствие широкого распространения РНК-аз. Поэтому было описано применение многих разных химических модификации нуклеотидов с целью повышения стабильности соединений.

Другой проблемой, присущей молекулам ми-РНК, является их иммуногенность, при этом было обнаружено, что ми-РНК индуцируют неспецифичную активацию врожденной иммунной системы, включая повышающую регуляцию продукции некоторых цитокинов, например, интерферона типа I и/или типа II, а также IL-12, IL-6 и/или TNF-альфа. Считают, что источником таких эффектов является активация Toll-подобных рецепторов, таких как ТLR7, TLR8 и/или TLR3, под действием ми-РНК.

Оба указанных эффекта, распознавание РНК-азами и иммуногенность, также были описаны как зависимые от последовательности.

Некоторые химические модификации, которые повышают стабильность соединений за счет снижения чувствительности к РНК-азам, также способны снижать индукцию иммунного распознавания последующего ответа. Однако встраивание химически модифицированных нуклеотидов в ми-РНК также может приводить к пониженной эффективности сайленсинга, как описано в предыдущем разделе, и следовательно, к этому нужно подходить с осторожностью.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления различных аспектов настоящего изобретения ми-РНК дополнительно содержит по меньшей мере один нуклеотид с химической модификацией.

Предпочтительные химические модификации, которые повышают стабильность и снижают иммуногенные эффекты, включают 2'-O-метилнуклеотиды, 2'-фторнуклеотиды 2'-аминонуклеотиды, 2'-дезоксинуклеотиды, нуклеотиды, содержащие 2'-O или 4'-C-метиленовые мостики. Также возможна модификация рибонуклеотидного остова, связывающего соседние нуклеотиды, введением модифицированных фосфоротиоатом нуклеотидов. Следующая предпочтительная химическая модификация согласно настоящему изобретению относится к замене содержащих урацил рибонуклеотидов дезокситимидином (дезоксирибонуклеотидами). В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один химически модифицированный нуклеотид находится в смысловой нити, в антисмысловой нити или в обеих нитях ми-РНК.

Соответственно, в одном из вариантов осуществления ми-РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

Молекулы ми-РНК, которые описаны выше, могут быть доставлены внутрь клеток в своей нативной структуре с испошльзованием способов, известных в данной области. Например, при исследовании сайленсинга генов in vitro такие соединения вводили, используя стандартные реагенты для трансфекции. Чтобы достичь эффектов in vivo, такие соединения также могут быть введены голыми или с использованием средств, усиливающих доставку, таких как, например, липосомы, с использованием конъюгации с конкретным компонентом и т.д., хотя множество разных альтернатив известно в данной области, и их использовали по-разному, в зависимости от требуемого участка-мишени в организме.

Альтернативно, молекулы ми-РНК согласно различным аспектам изобретения могут быть экспрессированы в клетках с эукариотических промоторов. Рекомбинантные векторы, способные экспрессировать молекулы ми-РНК, могут быть доставлены и могут сохраняться в клетках-мишенях. Альтернативно могут быть использованы векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул нуклеиновой кислоты. Такие векторы при необходимости можно вводить многократно. После экспрессии молекула ми-РНК взаимодействует с мРНК-мишенью и генерирует ответ в виде РНК-интерференции. Молекулы ми-РНК, полученные таким образом, часто называют кш-РНК (короткими шпилечными РНК), так как их смысловая и антисмысловая нити связаны небольшой петлей нуклеотидов. Доставка векторов, экспрессирующих молекулу ми-РНК, может быть системной, такой как внутривенное или внутримышечное введение, путем введения в клетки-мишени, эксплантированные из организма индивида, с последующим повторным введение в организм индивида, или любыми другими способами, которые обеспечивают возможность введения в требуемую клетку-мишень.

Следующий аспект изобретения относится к применению ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1, для получения лекарственного средства, применимого в способе лечения глазного состояния, характеризуемого повышенной экспрессией и/или активностью TRPV1, при этом ми-РНК вводят в соответствии со схемой дозирования, раскрытой в настоящем описании. Способ включает ингибирование экспрессии TRPV1 у пациента. Термин ингибирование используют для того, чтобы указать снижение или понижающую регуляцию экспрессии или активности. Предпочтительно, глазным состоянием является боль в глазах. В одном из вариантов осуществления состояние глаз выбрано из группы, состоящей из дискомфорта в глазах и измененной чувствительности роговицы после рефракционной операции, использования контактных линз, синдрома сухих глаз, синдрома Шегрена и других патологий глаз.

Предполагается, что терапевтическое лечение с применением ми-РНК, направленных против мРНК TRPV1, более эффективно, чем применение местных глазных капель, содержащих малые молекулы, благодаря увеличению длительности наблюдаемого эффекта, что позволяет менее часто вводить дозы и лучше соблюдать пациентами режим лечения. Это особенно важно в таких случаях, как синдром сухих глаз и измененная чувствительность роговицы, так как они часто являются хроническими состояниями.

Имея в виду получение такого лекарственного средства, могут быть приготовлены препараты ми-РНК согласно различны аспектам настоящего изобретения. Предпочтительно, композиции и препараты указанных ми-РНК могут быть введены местно в представляющий интерес орган. В еще более предпочтительном варианте их можно приготовить для местного введения в глаз, предпочтительно, на поверхность роговицы глаза. Нанесение на поверхность роговицы может быть осуществлено, например, в форме глазных капель, геля, лосьона, крема или вкладышей в глаза. Другие формы введения в глаз могут включать инъекцию в глаз.

Следующий предпочтительный вариант различных аспектов настоящего изобретения относится к ми-РНК, специфично нацеленной на последовательность SEQ ID NO: 1, которая описана в предыдущих абзацах, для применения в качестве лекарственного средства для лечения состояния глаз, характеризуемого повышенной экспрессией и/или активностью TRPV1, при этом ми-РНК вводят согласно схеме дозирования, раскрытой в настоящем описании. Как описано выше, такая ми-РНК может представлять собой ми-РНК, содержащую или состоящую из 19-нуклеотидной двунитевой структуры, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1. Такая ми-РНК может иметь тупые концы. Предпочтительно, ми-РНК имеет последовательность SEQ ID NO: 2. Другая ми-РНК для применения согласно изобретению может быть выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16.

В контексте настоящего изобретения, чтобы «быть специфично нацеленной на мишень» последовательность ми-РНК согласно изобретению, предпочтительно, содержит по меньшей мере такую же затравочную последовательность. Таким образом, любая последовательность согласно изобретению, специфичной мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1, предпочтительно, является идентичной в положениях 2-8 антисмысловой нити.

Невзирая на сказанное выше, ми-РНК согласно различным аспектам настоящего изобретения можно применять для сайленсинга экспрессии TRPV1 в других тканях, отличных от глаза. Следовательно, указанные ми-РНК следует получать в виде препаратов соответствующим образом.

Например, молекула ми-РНК может содержать наполнитель для доставки, включая липосомы, для введения индивиду. Носители и разбавители и их соли могут присутствовать в фармацевтически приемлемых препаратах. Молекулы нуклеиновых кислот можно вводить в клетки различными способами, известными специалисту в данной области, включая без ограничения инкапсулирование в липосомы, ионтофорез или включение в другие наполнители, такие как биологически разрушаемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины, сополимеры (молочной-гликолевой кислот) (PLGA) и микросферы PLCA, биологически разрушаемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы, или белковые векторы. В другом варианте молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению также могут быть приготовлены в виде препарата или в комплексе с полиэтиленимином и его производными, такими как производные полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-GAL) или полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамин (PEI-PEG-triGAL). Предпочтительными композициями согласно изобретению являются водные растворы, в частности растворы солей, такие как фосфатно-солевой буфер (PBS) с диапазоном pH примерно от 7,0 до примерно 7,4, предпочтительно, с pH 7,2±0,5.

Молекула ми-РНК согласно изобретению может быть приготовлена в виде комплекса со средствами, разрушающими мембраны и/или с молекулой катионного липида или молекулой вспомогательного липида.

Системы доставки, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, например, водные и неводные гели, кремы, множественные эмульсии, микроэмульсии, липосомы, мази, водные и неводные растворы, лосьоны, аэрозоли, углеводородные основы и порошки и могут содержать эксципиенты, такие как солюбилизаторы, усилители проницаемости (например, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты и аминокислоты) и гидрофильные полимеры (например, поликарбофил и поливинилпирролидон). В одном из вариантов осуществления фармацевтически приемлемым носителем является липосома или усилитель трансдермальной доставки.

Фармацевтический препарат согласно изобретению имеет форму, подходящую для введения, например, системного или локального введения, в клетку или в организм индивида, включая, например, человека. Подходящие формы отчасти зависят от применения или пути введения, например, перорального, трансдермального или посредством инъекции. Другие факторы известны в данной области и включают такие учитываемые факторы, как токсичность и формы, которые предотвращают такой эффект композиции или препарата.

Настоящее изобретение также относится к композициям, приготовленным для хранения или введения, которые содержат фармацевтически эффективное количество требуемых соединений в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в фармацевтической области. Например, могут быть добавлены консерванты, стабилизаторы, красители и корригенты. К ним относятся бензоат натрия, сорбиновая кислота и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Кроме того, могут быть использованы антиоксиданты и суспендирующие средства.

Фармацевтически эффективной дозой является доза, необходимая для профилактики, ингибирования появления или лечения (ослабления симптома в определенной степени, предпочтительно, всех симптомов) патологического состояния. Фармацевтически эффективная доза обычно зависит от типа заболевания, используемой композиции, пути введения, вида млекопитающего, подвергаемого лечению, физических характеристики конкретного рассматриваемого млекопитающего, сопутствующей лекарственной терапии и других факторов, которые будут известны специалистам в области медицины.

В частности, известно, что кроме дозы схема введения является важной определяющей эффективной понижающей регуляции молекулами ми-РНК.

Авторы изобретения разработали эффективную схему дозирования для введения ми-РНК с целью лечения состояния глаз, характеризуемого повышенной экспрессией и/или активностью TRPV1, в частности, с целью лечения сухих глаз и/или глазной боли, при этом избегают побочных эффектов и средство можно безопасно вводить. Таким образом, введение молекулы ми-РНК в том случае, когда указанная молекула специфично нацелена на последовательность SEQ ID NO: 1 и снижает экспрессию гена TRPV1 при введении в клетку, согласно схеме дозирования, описанной в настоящее публикации, приводит к клиническому улучшению.

Как используется в настоящем описании «эффективная схема дозирования» относится к количеству ми-РНК согласно изобретению, достаточному для лечения или ослабления расстройства глаз, связанного со сверхэкспрессией TRPV1. Для лечения сухих глаз и/или глазной боли у человека, предпочтительно, снижение уровней глазной болезни, которые измеряют, используя различные параметры, известные специалистам в данной области, например, используя опросный лист OSDI (индекс заболевания глазной поверхности) (в случае сухих глаз) и/или VAS (визуальную аналоговую шкалу) в случае глазной боли. Любое снижение таких уровней по сравнению с уровнями до лечения дает преимущества, независимо от того доставляют ли соединения согласно изобретению отдельно или в сочетании с другим подходящим терапевтическим средством (например, в изобретении предполагается снижение OSDI и/или VAS более чем примерно на 5%, примерно на 10%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 35%, примерно на 40%, примерно на 50% или примерно на 60% по сравнению с IOP до обработки).

Терапевтически эффективное количество также может относиться к количеству ми-НК, достаточному для задержки или минимизации появления глазного расстройства, связанного с сухими глазами и/или глазной болью. Терапевтически эффективное количество также может относиться к количеству терапевтического средства, которое приносит терапевтическую пользу при лечении или контролировании глазного расстройства, связанного с сухими глазами и/или глазной болью. Кроме того, терапевтически эффективное количество по отношению к ми-НК согласно изобретению означает такое количество терапевтического средства отдельно или в сочетании с другими средствами терапии, которое приносит терапевтическую пользу при лечении или контролировании глазного расстройства, связанного с сухими глазами и/или глазной болью. При использовании в связи с количеством ми-НК согласно изобретению термин может охватывать количество, которое улучшает комплексную терапию, снижает или позволяет избегать нежелательных эффектов или повышает терапевтическую эффективность или оказывает синергетическое действие с другим терапевтическим средством.

Терапевтически полезным при лечении или контролировании глазного расстройства, такого как сухие глаза и/или глазная боль, является длительное снижение боли и/или нежелательных ощущений. Учитывая, что ми-РНК будет снижать уровни рецепторов TRPV1 в клетке, после прекращения лечения клетка должна вновь синтезировать новые рецепторы до того как появятся болевые ощущения. Как таковая терапия на основе лечения ми-РНК будет иметь более продолжительное действие. Это считается значимым повышением терапевтической эффективности.

Дополнительной пользой применения ми-РНК является минимальная вероятность побочных эффектов или проблем острой токсичности, возникающих вследствие присутствия в системе кровообращения, часто связанных с разными основанными на глазных каплях способами лечения. Это связано с тем, что когда соединение попадет в кровоток, оно будет быстро разрушаться РНК-азами, присутствующими в крови.

С другой стороны, тот факт, что препарат, описанный в настоящей публикации, может поставляться во флаконах, содержащих однократные дозы, означает включение противомикробных консервантов, присутствующих в большинстве препаратов, продаваемых в настоящее время на рынке, которые вызывают определенную непереносимость у некоторых пациентов, что приводит к необходимости прекратить лечение. Обе проблемы особенно важны с учетом того, что состояния, подобные сухим глазам и/или глазной боли, часто являются хроническими, и следовательно, хроническим является и лечение.

Одним из предпочтительных путей введения является местное введение, путем закапывания непосредственно в глаз, предпочтительно, с использованием глазных капель. Как описано выше, ожидается, что терапевтическое лечение с использованием ми-РНК, направленных против мРНК TRPV1, более полезно по сравнению с местными глазными каплями, содержащими малые молекулы, благодаря увеличению длительности наблюдаемого эффекта, что позволяет менее часто вводить дозы и лучше соблюдать пациентами режим лечения. Когда ми-РНК вводят непосредственно в глаз, обычно можно вводить количество, составляющее примерно от 0,01 мг до примерно 100 мг в сутки и на глаз. В одном из вариантов осуществления количество, вводимое в сутки и на один глаз составляет примерно от 0,1 мг до примерно 10 мг. В другом варианте осуществления вводят примерно от 0,04 мг до 80 мг, примерно от 0,04 мг до примерно 20 мг, примерно от 0,08 мг до примерно 10 мг, примерно от 0,08 мг до примерно 1,2 мг, примерно от 0,3 до примерно 0,9 мг или примерно от 0,08 мг до примерно 0,9 мг на один глаз в сутки ми-НК.

В одном из вариантов осуществления доза составляет примерно от 0,5 мг до примерно 1,5 мг. В одном из вариантов осуществления доза составляет примерно от 0,3 до 0,9 мг, предпочтительно, примерно от 0,6 мг до примерно 0,9 мг. Альтернативно предпочтительная доза составляет примерно 0,6 мг или примерно 0,9 мг на один глаз в сутки.

Одним из предпочтительных путей введения, как указано выше, является применение глазных капель. В одном из вариантов осуществления такие глазные капли имеют объем от 25 до 50 микролитров, содержащих данную дозу соединения, предпочтительно, от 26 до 40 микролитров. Предпочтительно, можно использовать коммерческие глазные пипетки последнего выпуска в области медицины, и получаемый объем может составлять примерно от 30 до примерно 33 микролитров на каплю. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления глазные капли доставляют в объеме примерно 40 мкл. В дополнительном варианте осуществления композиция согласно изобретению содержит ми-РНК, такую как ми-РНК с последовательностью SEQ ID NO:2, в приемлемом растворе, таком как фосфатно-солевой буфер, в концентрации примерно от 7,5 до примерно 22,5 мг/мл или альтернативно примерно от 15 мг/мл до примерно 22,5 мг/мл. Композиции согласно изобретению могут содержать указанные выше концентрации ми-РНК в PBS и необязательно фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как, например, хлорид бензалкония.

Лечение с введением указанных выше доз можно осуществлять в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или большего количества дней. Предпочтительно, введение осуществляют в течение 10-15 дней, наиболее предпочтительно, в течение 10 дней. После периода введения может следовать период отдыха, например, период отдыха продолжительностью 7 дней перед продолжением лечения. Альтернативно, учитывая, что сухие глаза и/или глазная боль часто являются хроническими состояниями, дозы можно вводить на ежедневной основе в течение длительного периода, в итоге осуществляя хроническое введение. Соответственно, введение может продолжаться в течение более чем 4 недель на ежедневной основе, или альтернативно введение может продолжаться в течение более 4 недель, но не на ежедневной основе. Точную схему можно определить в соответствии с тяжестью хронического состояния.

Однако, как объяснялось выше, также можно использовать другие пути введения, отличные от непосредственного введения в глаз. Точная доза и схема введения, которые необходимо использовать в случае препарата, также будет зависеть от пути введения, но можно использовать указанные выше дозы, и обычно можно вводить количество, составляющее примерно от 0,01 мг до примерно 100 мг в сутки на один глаз. Специалисту в данной области будет понятно, что используемая точная доза и схема введения также зависит от тяжести расстройства, и решение следует принимать в соответствии с решением лечащего врача и ситуации в случае каждого пациента. Также понятно, что конкретный уровень доз для любого конкретного индивида зависит от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, питание, время введения, путь введения и скорость экскреции, сочетание лекарственных средств и тяжесть конкретного заболевания, подвергаемого терапии.

Препараты или ми-РНК согласно изобретению, которые описаны в настоящей публикации, можно вводить в виде стандартных дозированных препаратов, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и/или наполнители. Препараты могут быть в форме, подходящей для перорального применения, например, в виде таблеток, пастилок, лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, могут быть получены согласно любому способу, известному в данной области для получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или несколько таких подсластителей, корригентов, красителей или консервантов, чтобы получить фармацевтически сбалансированные и приятные на вкус препараты. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые подходят для получения таблеток.

Такими эксципиентами могут быть, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие средства, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связывающие средства, например, крахмал, желатин или аравийская камедь; и скользящие вещества, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми оболочкой, или они могут быть покрыты известными способами. В некоторых случаях такие покрытия могут быть получены известными способами для того, чтобы замедлить распад и всасывание в желудочно-кишечном тракте и таким образом обеспечить продолжительное действие в течение более длительного периода времени. Например, можно использовать замедляющее вещество, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Препараты для перорального применения также могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Водные суспензии содержат активные вещества в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водных суспензий. Такими эксципиентами являются суспендирующие средства, например, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидропропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующими средствами или увлажнителями могут быть природные фосфатиды, например, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, стеарат полиоксиэтилена, или продукты конденсации этиленоксида с имеющими длинные цепи алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксиоктанолом, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии также могут содержать один или несколько консервантов, например, этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, один или несколько корригентов и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.

Масляные суспензии могут быть получены суспендированием активных ингредиентов в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Могут быть добавлены подсластители и корригенты, чтобы получить приятные на вкус пероральные препараты. Такие композиции могут быть защищены добавлением антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

Дисперсные порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии при добавлении воды, представляют собой активный ингредиент в смеси с диспергирующим средством или увлажнителем, суспендирующим средством и одним или несколькими консервантами. Примерами диспергирующих средств или увлажнителей или суспендирующих средств являются средства, уже указанные выше. Также могут присутствовать дополнительные эксципиенты, например, подсластители, корригенты и красители.

Фармацевтические композиции согласно изобретению также могут быть в форме эмульсий типа «масло-в-воде». Масляная фаза может быть представлена растительным маслом или минеральным маслом или их смесью. Подходящими эмульгаторами могут быть природные камеди, например, аравийская камедь или трагакантовая камедь, встречающиеся в природе фосфатиды, например, из соевых бобов, лецитин и сложные эфиры или неполные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и гексита, ангидриды, например, моноолеат сорбитана, и продукты конденсации указанных неполных сложных эфиры с этиленоксидом, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Эмульсии также могут содержать подсластители и корригенты.

Сиропы и эликсиры могут быть получены с подсластителями, например, глицерином, пропиленгликолем, сорбитом, глюкозой или сахарозой. Такие препараты также могут содержать средство, уменьшающее раздражение, консерванты и корригенты и красители. Фармацевтические композиции или ми-РНК согласно изобретению, описанные в настоящей публикации, могут быть в форме стерильной инъекционной водной или масляной суспензии.

Такая суспензия может быть приготовлена согласно известным в данной области способам с использованием подходящих диспергирующих средств или увлажнителей и суспендирующих средств, которые указаны выше.

Стерильный инъекционный препарат также может представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. К приемлемым носителям и растворителям, которые можно использовать, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспензионной среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для такой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, находят применение при получении инъекционных средств.

В предпочтительных вариантах осуществления композиции согласно изобретению получают в виде раствора, предпочтительно, в забуференном растворе, таком как PBS, или в виде геля для местного введения в глаз, например, в форме глазных капель. В таких вариантах осуществления препараты могут представлять собой катионные эмульсии и/или содержат биополимеры, включая без ограничения, сополимер лактида-гликолида, карбопол, гиалуроновую кислоту и полиакриловую ксилоту.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению также можно вводить в форме суппозиториев, например, для ректального введения лекарственного средства. Такие композиции могут быть получены смешиванием лекарственного средства с подходящим не раздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но становится жидким при ректальной температуре и поэтому будет плавиться в прямой кишке, высвобождая лекарственное средство. К таким веществам относятся масло какао и полиэтиленгликоли.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению можно вводить парентерально в стерильной среде. Лекарственное средство в зависимости от используемого наполнителя и концентрации может быть либо суспендировано, либо растворено в наполнителе. Предпочтительно, в наполнителе могут быть растворены адъюванты, такие как местные анестетики, консерванты и буферные средства.

Соответственно, следующий предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, при этом указанная композиция содержит по меньшей мере ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1, вводимой согласно конкретной схеме дозирования, которая была описана в предыдущих абзацах.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению также можно вводить индивиду в сочетании с другими терапевтическими соединениями, чтобы повысить общий терапевтический эффект. Применение нескольких соединений для лечения показания может увеличить положительный эффект, снижая при этом наличие побочных эффектов.

Соединения ми-НК согласно изобретению также могут поставляться в наборах, которые содержат дозатор с дозирующим клапаном для высвобождения конкретных доз соединения ми-НК в капле, имеющей предварительно определяемый объем. В предпочтительном варианте соединения ми-НК согласно изобретению представляют собой ми-РНК, нацеленные против последовательности SEQ ID NO: 1. В следующем варианте осуществления дозаторы в наборе согласно изобретению высвобождают композицию, содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления набор может содержать набор дозаторов однократного применения, например, для применения в течение одного месяца, в таком конкретном случае, контейнер может содержать 30 дозаторов однократного применения. Капля может иметь объем в диапазоне примерно от 50 мкл до примерно 100 мкл. Дозатор может представлять собой одноразовый дозатор и содержать примерно от 1 мг до примерно 2 мг соединений ми-НК согласно изобретению, и необязательно также содержат один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей, и необязательно один или несколько эксципиентов. Композиция, находящаяся в дозаторе, может содержать концентрацию примерно от 7,5 мг/мл до примерно 22,5 мг/мл соединения ми-НК согласно изобретению. Альтернативно дозатор может быть предназначен для использования в течение одного месяца или больше, и находящиеся в нем объемы будут соответственно увеличены, чтобы обеспечить эквивалентное количество доз. Наборы согласно изобретению также могут содержать инструкции, на которых указано, что дозу соединения ми-РНК, составляющую примерно от 0,3 мг до примерно 0,9 мг в 1 капле, необходимо внести в каждый глаз. В инструкциях может быть дополнительно указано, что капли закапывают в каждый глаз один раз в день, дважды в день, три раза в день или четыре раза в день, и что закапывание в каждый глаз необходимо осуществлять ежедневно, через день, один раз в неделю, дважды в неделю, три раза в неделю, через неделю или один раз в месяц.

Содержание всех опубликованных статей, книг, справочников и тезисов, цитированных в настоящей публикации, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, чтобы более полно описать состояние известного уровня техники в той области, к которой относится настоящее изобретение.

Так как могут быть осуществлены различные изменения в описанном выше предмете изобретения, не выходя за рамки объема и не отходя от сути настоящего изобретения, предполагается, что все предметы изобретения, входящие в приведенное выше описание или определенные в прилагаемой формуле изобретения, необходимо интерпретировать как описывающие и иллюстрирующие настоящее изобретение. Возможны модификации и вариации настоящего изобретения в свете приведенных выше инструкций.

Изобретение далее описано с помощью не ограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Анализ in vitro

Чтобы найти особенно эффективную последовательность-мишень для ми-РНК, чтобы осуществить сайленсинг TRPV1 (и при этом получить важное ингибирование экспрессии гена), тестировали шесть разных ми-РНК. Такие ми-РНК описаны в виде последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 17-20.

Последовательность SEQ ID NO: 2 представляет собой ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO: 1, согласно настоящему изобретению, имеющая следующую последовательность:

Смысловая: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'

Антисмысловая: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'

Последовательность SEQ ID NO:7 (5'-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3') соответствует классической молекуле ми-РНК (длиной 21 нуклеотид, содержащая 3'-выступающий конец, состоящей из дезокситимидина), ранее описанной в WO 2007/045930, которая эффективно нацелена на TRPV1 и снижает реакцию глаза на стимулы капсаицина. Последовательности SEQ ID NO: 17-19 соответствуют ми-РНК, сконструированным против TRPV1 в соответствии с разными алгоритмами, имеющимися в данной области, такими как алгоритмы, описанные Reynolds et al. (2004) или Ui-Tei et al. (2004) и другими. Последовательность SEQ ID NO: 20 является коммерчески доступной ми-РНК, поставляемой Ambion и сконструированной против TRPV1.

В качестве модели для тестирования эффективности описанных выше ми-РНК использовали культуры клеток HeLa (клетки аденокарциномы шейки матки человека). Клетки HeLa трансфицировали, используя 100 нМ разных соединений и липофектамин 2000 в качестве трансфицирующего средства. Все трансфектанты получали, следуя стандартным условиям, определенным производителем. В том же опыте по трансфекции использовали другую рандомизированную ми-РНК в качестве контроля. Осадки клеток собирали во временных точках 24, 48 и 72 часа, чтобы оценить возможные изменения уровней белка, и подвергали обработке с использованием ПЦР в реальном времени. Чтобы количественно оценить результаты, полученные в Qrt-ПЦР в реальном времени, авторы использовали способ сравнительного расчета значений порогового цикла.

Как показывают результаты (фигура 1), ми-РНК, направленная против последовательности-мишени SEQ ID NO: 1, намного более эффективна в отношении сайленсинга гена TRPV1, чем ранее описанные ми-РНК-продукты, направленные против другой области того же гена. Более того, такой эффект более продолжителен по времени, так как во временной точке 72 часа после трансфекции все еще имела место значимая понижающая регуляция уровней мРНК. Такая продолжительность эффекта не могла быть предсказана и является специфичной для последовательности.

С целью получения дополнительно улучшенных продуктов вводили разные химические модификации в указанный выше продукт согласно приведенному ниже описанию:

Где подчеркивание означает основания, содержащие 2'-O-метильную группу.

Где некоторые или все содержащие урацил нуклеотиды были заменены на нуклеотиды, содержащие дезокситимидин.

Такие соединения тестировали в анализах иммуногенности наряду с последовательностью SEQ ID NO: 2 (такое же соединение, но без каких-либо модифицированных нуклеотидов). Результаты показали, что все такие соединения значимо снижали индукцию иммунного ответа в мононуклеарных клетках периферической крови. Кроме того, большинство соединений индуцировали ответ, который был на самом высоком уровне ниже, чем уровень ответа, вызываемого ми-РНК, которые прошли клинические испытания на человеке (бевасираниб и Sirma-027), которые были включены в анализ в качестве контроля.

Так как различные степени модификации могут изменять способность ми-РНК к сайленсингу генов, такие соединения дополнительно тестировали в отношении их способности вызывать РНК-интерференцию при трансфекции в клетки HeLa, и получаемые в результате уровни мРНК TRPV1 измеряли способом, описанным в предшествующих абзацах.

Как можно видеть на фигуре 2, все соединения сохраняют способность эффективно снижать уровни мРНК TRPV1 в различной степени.

Следующим неожиданным полезным эффектом, получаемым при действии описанных выше соединений является их повышенная резистентность к разложению РНК-азами, как можно видеть на фигуре 5.

Для таких экспериментов соединения суспендировали в 10% плазме человека в PBS в конечной концентрации 2 мкМ и инкубировали в течение 24 часов при 37°C. Затем образцы анализировали, используя ВЭЖХ-УФ и определяли количество оставщегося интактного продукта. Как можно видеть на фигуре 5, 19-нуклеотидное двунитевое соединение с последовательностью SEQ ID NO: 2 (без какой-либо химической модификации) почти в 3 раза более резистентно к разложению, чем ранее описанная последовательность SEQ ID NO: 21: 5'-CAAGAUCGCACAGGAGAGCdTdT-3' (также описанная в WO 2007045930), которая содержит 3'-выступающие концы. Такой эффект дополнительно усиливается в случае соединения с последовательностью SEQ ID NO: 3, которое содержит несколько химически модифицированных нуклеотидов, как описано в предыдущих абзацах.

Анализ in vivo

В животных моделях сухих глаз и глазной боли часто используют кроликов, в данном случае Новозеландских белых кроликов. В связи с этим дополнительное преимущество ми-РНК согласно настоящему изобретению заключается в том, что последовательность-мишень SEQ ID NO: 1 является высоко консервативной областью гена TRPV1 среди разных последовательностей животных. Действительно, данная последовательность идентична у человека и кролика, что делает такую животную модель особенно подходящей для исследований указанных заболеваний.

Эксперимент, описанный ниже, осуществляли, используя стандартную модель глазной боли, известную специалисту в данной области (Gonzalez et al., 1993). Кратко, боль индуцировали, используя закапывание 30 мкл 1% раствора капсаицина (известного агониста TRPV1) в глаз с помощью подходящей микропипетки. В связи с этическими проблемами животные, которых обрабатывали капсаицином заранее получали дозу 5 мМ капсазепина, известного антагониста капсаицина или 40 мкл раствора, содержащего тестируемое соединение. Таким образом, эффект измеряли в сравнении с капсазепином в качестве эталонной обработки.

Тестируемые и эталонные соединения капали один раз в день с 1 дня по 3 день и два раза в день на 4 день (с интервалом 60 минут) в правые глаза. На 4 день через 15 минут после последнего закапывания индуцировали боль в роговице в правом глазу животных, однократно капая 1% капсаицин. В контралатеральный глаз капали PBS на протяжении исследования, и он служил контролем.

Чтобы измерить реакцию на боль, измеряли раскрытие глазной щели. Считается, что глаз закрывается в ответ на боль, и как только ощущения боли стихают, раскрытие глазной щели будет снова увеличиваться до нормальных уровней. Раскрытие глазной щели измеряли до лечения (исходный уровень), непосредственно перед индукцией боли и затем через 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 минут после индукции боли.

Как можно видеть на фигурах 3 и 4, тестировали соединение согласно настоящему изобретению, в частности, соединение с последовательностью SEQ ID NO: 2, и наблюдали, что оно индуцировало более высокий анальгезирующий эффект, чем капсазепин (восстановление глаза, которое измеряли по степени раскрытия глазной щели). Таким образом, такое соединение оказалось эффективным терапевтическим средством в случае дискомфорта в глазах.

Кроме того, осуществляли другой эксперимент in vivo, в котором соединения согласно настоящему изобретению (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5) вводили в глаза кроликов наряду с последовательностью SEQ ID NO: 21, ранее описанной в WO 2007045930. В данном случае кролики (6 животных на группу обработки) получали ежедневное введение соединения в течение 3 последовательных дней. На третий день через два часа после закапывания животных умерщвляли. Извлекали ткани глаза таких кроликов и анализировали присутствие TRPV1-специфичной мРНК, используя ОТ-ПЦР. В следующей таблице (таблице 1) показаны уровни сайленсинга гена TRPV1, достигаемые в данной ткани, выраженные в виде отношения к ингибированию в %, достигаемому в использованием эталонного соединения SEQ ID NO: 21.

Таблица 1
SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5
Слезная железа 3,06 3,15 1,92
Цилиарное тело 6,54 2,48 3,57

Как ясно из полученных результатов, соединения согласно настоящему изобретению намного более эффективны в отношении сайленсинга экспрессии гена TRPV1 в тканях глаза, чем ранее описанные соединения.

Более высокая эффективность наряду с более длительным действием соединений согласно изобретению должна обеспечивать обладающие преимущества схемы дозирования, так как возможность оставлять большие промежутки времени между дозами может значительно улучшать качество жизни пациента.

Осуществляли другой эксперимент, чтобы оценить распределение в тканях и воздействие плазмы у Новозеландских белых кроликов после введения в глаза последовательности SEQ ID NO: 2 в PBS. Используемые материалы и способы указаны в следующей таблице (таблица 2).

Таблица 2
Материалы и способы оценки распределения в ткани и воздействия плазмы у Новозеландских белых кроликов после введения в глаз последовательности SEQ ID NO: 2 в PBS
Тестируемые животные Вид: Новозеландский белый кролик
Количество животных/пол/путь введения: 6 животных/3 самца/3 самки/глазные капли в глаза
Тестируемое вещество Лекарственное средство: SEQ ID NO: 2
Лечение Доза: 0,9 мг/глаз/введение
Введение: в глаза (глазные капли)
Частота: однократно
Продолжительность: 30 минут
Препарат Описание: последовательность SEQ ID NO: 2 получена в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 22,5 мг/мл
Отбор образцов Временные точки: 5 и 30 минут после введения дозы (сбор ткани и плазмы).
Условия хранения: -80°C
Биоаналитический анализ Способ: Анионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (AEX-ВЭЖХ) с детекцией флуоресценции, разработанной для SEQ ID NO:2
Предел выявления: 0,25 нг/г в ткани и 0,15 нг/мл в плазме

Все вычисления осуществляли, используя молекулярную массу натриевой соли последовательности SEQ ID NO: 2. Вычисление концентраций для SEQ ID NO:2 осуществляли тремя разными путями:

1. На основе площади пика интактной не подвергнутой метаболизму антисмысловой нити SEQ ID NO: 2 (исходное соединение). Такое значение является показателем количества исходного соединения, которое осталось неизменным в ткани.

2. На основе площади пика интактной 5'-фосфорилированной антисмысловой нити SEQ ID NO: 2. Такое значение является показателем количества исходного соединения, которое присутствует в цитоплазматическом компартменте и активировано 5'-фосфорилированием.

3. На основе общей площади пиков. Такое значение представляет собой сумму всех интактных и метаболизированных последовательностей SEQ ID NO: 2, которые присутствуют в образце.

Образцы печени, коркового и мозгового вещества почек, легкого, цилиарного тела, сетчатки, радужной оболочки, слезной железы, роговицы, водянистой и витреальной влаги, ганглия, плазмы и мочи собирали через 5 и 30 минут после введения дозы. Показаны результаты после одного введения в глаза последовательности SEQ ID NO: 2 кроликам (n=6):

- Системное воздействие SEQ ID NO: 2 выявляли в образцах плазмы и тканей организма через 5 и 30 минут после введения дозы в глаз в концентрациях ниже 1 нг/г (см. таблицу 3).

Таблица 3
Средние концентрации исходного соединения SEQ ID NO: 2 после введения в глаза кроликов
Временная точка N Печень Мозговое вещество почки Корковое вещество почки Легкое Плазма
[мин] [нг/г] [нг/г] [нг/г] [нг/г] [нг/мл]
Средняя концентрация 5 6 0,42 0,16 0,34 0,04 0,34
Стандартное отклонение 0,48 0,25 0,56 0,13 0,32
Средняя концентрация 30 6 0,60 0,77 0,00 0,40 0,09
Стандартное отклонение 0,63 1,96 0,00 0,13 0,05

- Последовательность SEQ ID NO: 2 может быть выявлена во всех тканях и жидкостях глаза через 5 минут после введения дозы и в сильно сниженной концентрации через 30 минут после введения дозы (см. таблицу 4).

Таблица 4
Средние концентрации исходного соединения SEQ ID NO: 2 после введения кроликам в глаза
Временная точка N Цилиарное тело Сетчатка Радужная оболочка Слезная железа Роговица
[мин] [нг/г] [нг/г] [нг/г] [нг/г] [нг/г]
Средняя концентрация 5 6 431,6 840,8 317,0 1473,8 3684,2
Стандартное отклонение 318,3 667,0 193,2 2178,8 984,8
Средняя концентрация 30 6 4,3 3,7 2,1 132,4 59,3
Стандартное отклонение 4,8 3,7 2,3 394,6 71,0

- В сетчатке, радужной оболочке, цилиарном теле и слезной железе 5'-фосфорилированную антисмысловую нить выявляли через 5 и 30 минут после введения дозы, что свидетельствует о цитоплазматической доставке ми-РНК в такие ткани (активированной ми-РНК в компартменте клетки-мишени) (см. фигуру 6).

Полученные данные отражают, что после введения SEQ ID NO: 2 в глаза у животных присутствует активированная последовательность SEQ ID NO: 2, распределенная во всех тканях глаза, которая может быть выявлена через 5 минут после введения дозы.

Анализ у человека

Сначала оценивали переносимость глазом соединения, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 2 у 30 здоровых взрослых людей.

Исследование было разделено на два периода. В ходе первого периода осуществляли начальную оценку безопасности, используя однократную дозу исследуемого продукта, с последующим вторым периодом с использованием введения многократных доз.

Период 1, однократная доза: контролируемое без вмешательства, и рандомизация глаза, в который производили введение. Каждый доброволец имел свой собственный контроль, учитывая тот факт, что тестируемый продукт вводили только в один глаз, тогда как другой глаз не подвергался вмешательству, однако были проведены тесты по оценке безопасности. Офтальмолог, осуществлял оценку безопасности в слепую в отношении введения лекарственного средства. Определяли всасывание продуктов в кровоток.

Период 2, многократные дозы: открытое, параллельное и контролируемое. Рандомизировали глаза, подвергаемые обработке. Исследователь проводил оценку вслепую в отношении места введения исследуемого продукта. Глаз до введения лекарственного средства и другой глаз считали контролями. На данной стадии оценивали местную и системную безопасность в дополнение к всасыванию и, в соответствующих случаях, фармакокинетике исследуемого продукта.

Вторую стадию начинали после проведения оценки безопасности и фармакокинетики на первой стадии. Результаты, полученные на первой стадии, определяли необходимость в продолжении фармакокинетической оценки на второй стадии.

30 взрослых людей распределяли по разным группам лечения и либо однократно получали глазную каплю объемом 26,6 мкл, содержащую дозу соединения 600 мкг, в один глаз (период 1), либо получали ежедневные дозы в течение одной недели по 600 или 900 мкг соединения на глаз (период 2), которое вводили в объеме 26,6 мкл или 40 мкл, соответственно. В периоде 1 участвовали 6 добровольцев, а в периоде 2 принимали участие 24 добровольца, которых делили на две когорты с разными уровнями доз, которые использовали в каждой половине группы. В периоде 1 вводили однократную дозу, а в периоде 2 вводили всего 7 доз (одно введение в сутки).

Оценка местной переносимости была основана на частоте изменений (местные нежелательные эффекты), выявляемых на поверхности глаза во время исследования, осуществляемого через 24 часа после введения последней дозы в период 2 и через 72 часа после закапывания одной дозы в период 1. Хорошую переносимость определяли как отсутствие токсичности 3 степени или выше по шкале CTCAEv3 (общая терминология критериев неблагоприятных событий).

Использовали критерий хи-квадрат, чтобы определить взаимосвязь между локальными неблагоприятными эффектами и лекарственным средством, учитывая появлялись или не появлялись симптомы или локальные признаки в каждом глазу (независимо от количества симптомов) в связи с лечением. В анализе считали наличие нежелательного эффекта в каждом глазу, если имел место по меньшей мере один эффект (см. таблицу 5).

Что касается развития локальных изменений (локальных неблагоприятных эффектов), то не наблюдали различий между обработанным глазом и необработанным глазом, получая хи-квадрат Пирсона 1,002 (p=0,317).

Не наблюдали связанных с лекарственным средством изменений глазной поверхности ни в одном из периодов испытания; следовательно, местная переносимость была превосходной при введении как однократной, так и многократных доз в виде глазных капель в течение до семи дней.

Следующей целью настоящего испытания была оценка системной переносимости соединения посредством контроля последствий по аналитическим параметрам, данным физикального обследования, показателям жизненно важных функций и электрокардиограмме после лечения.

Анализы крови и мочи осуществляли в ходе отбора, перед введением лекарственного средства и в ходе конечного обследования в дни после последнего введения последовательности SEQ ID NO: 2. Осуществляли исследование изменения аналитических параметров, полученных в период отбора и при конечном обследовании, используя критерий Стьюдента для соответствующих данных. В следующей далее таблице показано среднее значение, стандартное отклонение и статистическая значимость различия между указанными параметрами (см. таблицу 6).

Наблюдали различия по некоторым параметрам между обследованием при отборе и конечным обследованием, однако все значения считались нормальными, не имеющими клинического значения.

Как указано выше, во время исследования показатели жизненно важных функций (кровяное давление и частоту сердечных сокращений) оценивали во время отбора и в разных временных точках во время фазы лечения и в конечном обследовании (см. таблицы 7 и 8).

Средние значения в случае достижения временной точки измерения и статистический анализ с использованием ANOVA с повторными измерениями для шести добровольцев, принимающих участие в периоде 1, показаны ниже (см. таблицу 7).

Показатели жизненно важных функций в период 2 получали при обследовании, которое проводили в 1 день, и при обследовании, проводимом на 7 день, до введения и через час после введения первой и последней дозы исследуемого продукта. Показатели жизненно важных функций также получали во время обследования при отборе и при конечном обследовании. Принимая значения при отборе в качестве исходного уровня, оценивали изменение показателей жизненно важных функций у 24 добровольцев в ходе исследования в течение периода 2, используя ANOVA с повторными измерениями (см. таблицу 8).

Электрокардиограмму получали в ходе обследовании при отборе и следующую электрокардиограмму получали при конечном обследовании. Сравнение осуществляли между обследованием при отборе и конечным обследованием, используя критерий Стьюдента для соответствующих образцов. В следующей таблице суммированы средние значения и стандартные отклонения для каждого параметра и результата анализа (см. таблицу 9).

Статистически значимые изменения наблюдали в случае некоторых измерений кровяного давления, показанных в таблицах 7 и 8, и некоторых измерений частоты сердечных сокращений, показанных в таблице 9, хотя все значения попадали в нормальные пределы и, следовательно, такие различия были клинически незначимыми.

Системная переносимость была хорошей без изменений в анализах крови и мочи, в электрокардиограмме или при обследовании, проводимом при последней оценке.

Анализ крови осуществляли для определения концентраций последовательности SEQ ID NO: 2 в образцах плазмы, полученных после введения лекарственного средства. Во время первого периода отбор образцов осуществляли на протяжении 4 часов после введения, при этом кровь брали через 5, 15, 30 минут и 4 часа после введения продукта. Во время второго периода образцы крови собирали через 5 минут после введения в 1 день, и еще раз на 7 день, как до введения соединения, так и через 5 минут после введения продукта.

Фармакокинетический профиль невозможно было определить ни для какого периода, так как соединение не выявляли ни в одном из собранных образцов крови с использованием валидированного способа биологического анализа (нижний предел количественного определения: 10 нг/мл). Отсутствие регистрируемых количеств соединения в крови согласуется с ожидаемым быстрым распадом РНК при поступлении в кровоток вследствие присутствия РНК-аз.

Все указанные факты подтверждают вывод о том, что последовательность SEQ ID NO: 2 хорошо переносима при использовании раствора для глаз у здоровых людей.

Затем, учитывая положительные результаты, полученные на животных моделях, и отсутствие токсичности у здоровых людей, соединения тестировали на пациентах, страдающих глазной болью и синдромом сухих глаз.

Индивиды

Было набрано шестьдесят взрослых пациентов, у которых диагностировали боль в глазах от слабой до умеренной и синдром сухих глаз. Из них половина была в возрасте более 65 лет. Уровни глазной болезни устанавливали, используя опросник OSDI© (индекс заболевания глазной поверхности), разработанный в Allergan Inc. и оценку согласно VAS (визуальная аналоговая шкала). Критериями включения были оценка 13-30 по OSDI© в случае сухих глаз и оценка 2-7 VAS в случае боли. Всестороннее физикальное обследование и обследование глаз осуществляли до приема в исследование, чтобы гарантировать соответствие индивидов требованиям, предъявляемым к участникам исследования.

Дизайн исследования

Проектировали параллельное, плацебо-контролируемое, двойное слепое клиническое исследование, чтобы оценить анальгезирующее действие и переносимость соединения SEQ ID NO: 2, вводимого ежедневно в виде глазных капель в течение 10 дней лечения.

Дополнительной целью была оценка локальной переносимости после каждой дозы, системной переносимости (влияние на лабораторные параметры, физикальное обследование и показатели жизненно важных функций) и изменений (если таковые имели место) остроты зрения, внутриглазного давления, пробы Ширмера и времени разрыва слезной пленки, вероятно связанных с исследуемым продуктом.

Во всех случаях лекарственное средство или плацебо закапывали в оба глаза. Наблюдали за обоими глазами в слепом исследовании.

Исходный период

Вплоть до 5 дней перед первым введением исследуемого продукта набирали индивидов, оценивая их возможность принимать участие в периоде лечения в клиническом испытании.

Период лечения

В 1 день индивидов рандомизировали в соотношении 2:1 для введения соединения или плацебо местно в глаза в виде глазных капель. Индивиды получали конечный объем 40 мкл соединения или наполнителя (плацебо) в каждый глаз. Вводимая доза составляла 900 мкг соединения на глаз.

Индивиды приходили каждый день (включая праздничные и выходные дни) в пункт введения и оценки исследуемого продукта. Индивиды получали 1 дозу соединения один раз в сутки в оба глаза в течение 10 дней.

На 10 день пациенты снова проходили тщательное обследование, эквивалентное обследованию, проводимому исходно.

Визит для последующего наблюдения

Конечную оценку осуществляли при визите для последующего контрольного наблюдения, который имел место через 14-20 дней после первого введения (от 4 до 10 дней после последнего введения), чтобы определить изменения у пациентов после завершения периода лечения.

Чтобы определить влияние последовательности SEQ ID NO:2 на уровень синдрома сухих глаз и глазной боли у пациентов, каждую отдельную оценку согласно OSDI© и VAS регистрировали за день до начала лечения и сравнивали с оценкой на 10 день. Результат измеряют, в частности, в виде изменений медианной оценки, получаемой на основании опросника OSDI©, и изменений медианной интенсивности оценки VAS.

Также сравнивали результаты исследований глаз, осуществляемых до начала лечения и через 10 дней, чтобы подтвердить переносимость.

Результаты

Опросник OSDI© оценивается по шкале от 0 до 100, при этом более высокие оценки означают большее нарушение здоровья. Индекс демонстрирует чувствительность и специфичность в отношении возможности отличать здоровых индивидов и пациентов с болезнью сухих глаз. OSDI© состоит из двенадцати вопросов и предназначен для обеспечения быстрого определения симптомов, которые соответствуют болезни сухих глаз. OSDI© является достоверным и надежным инструментом измерения тяжести болезни сухих глаз (нормальное, от слабого до умеренного и тяжелой) и был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами для применения в клинических испытаниях. Оценивали достоверность и надежность OSDI©, и было обнаружено, что он обеспечивает хорошую или превосходную надежность, достоверность, чувствительность и специфичность в случае сухих глаз. Общая рассчитанная оценка OSDI© позволяет определять поверхность глаза как нормальную (0-12 пунктов) или имеющую слабое (13-22 пунктов), умеренное (23-32 пунктов) или тяжелое (33-100 пунктов) заболевание.

Опросник боли VAS является линейной мерой интенсивности боли, которую широко использовали для разнообразных популяций взрослых людей. VAS позволяет измерять боль, которая находится в диапазоне непрерывных значений и которую невозможно легко оценить непосредственным измерением, подобную глазной боли. В случае оценки интенсивности боли согласно VAS шкала обычно закреплена точками «нет боли» (оценка 0) и «худшая возможная боль» (оценка 10).

Таблица 11
VAS для глазной боли, n=23. V0 соответствует VAS за день до начала лечения, и VD10 соответствует VAS на 10 день. % показывает изменения медианной оценки уровня глазной боли у пациентов в правом и левом глазу.
N Глаз V0 VD10 %
1 Правый глаз
Левый глаз
24
30
2
2
-91,67
-93,33
2 Правый глаз
Левый глаз
38
50
13
10
-65,79
-80,00
3 Правый глаз
Левый глаз
40
30
33
20
-17,50
-33,33
4 Правый глаз
Левый глаз
20
20
4
5
-80,0
-75,00
5 Правый глаз
Левый глаз
60
70
60
70
0,00
0,00
6 Правый глаз
Левый глаз
50
70
40
40
-20,00
-42,86
7 Правый глаз
Левый глаз
53
67
37,5
46,5
-29,25
-30,60
8 Правый глаз
Левый глаз
70
70
42
46
-40,00
-34,29
9 Правый глаз
Левый глаз
7
5
5,5
4,5
-21,43
-10,00
10 Правый глаз
Левый глаз
3,5
3,5
0,5
1,1
-85,71
-68,57
11 Правый глаз
Левый глаз
5
4
2
1,1
-60,00
-72,50
12 Правый глаз
Левый глаз
5
4
6,4
3,3
28,00
-17,50
13 Правый глаз
Левый глаз
7
7
6
6,5
-14,29
-7,14
14 Правый глаз
Левый глаз
4
5
6,8
6,8
70,00
36,00
15 Правый глаз 7 8 14,29
Левый глаз 7 7 0,00
16 Правый глаз
Левый глаз
7
4
6
7
-14,29
75,00
17 Правый глаз
Левый глаз
3,7
6
2,5
2
-32,43
-66,67
18 Правый глаз
Левый глаз
7
6
4
5
-42,86
-16,67
19 Правый глаз
Левый глаз
4,9
5,5
5,7
5,5
16,33
0,00
20 Правый глаз
Левый глаз
3
7
7
3
133,33
-57,14
21 Правый глаз
Левый глаз
2
7
4,4
6,7
120,00
-4,29
22 Правый глаз
Левый глаз
2
2
2,4
1,3
20,00
-35,00
23 Правый глаз
Левый глаз
6
7
3
5
-50,00
-28,57

Заключение

Принимая во внимание соотношение соединение:плацебо 2:1 в клиническом испытании и тот факт, что отношение сохраняется независимо от количества анализируемых пациентов, можно сделать вывод, что эффект последовательности SEQ ID NO:2, ежедневно вводимой пациенту, способен снижать тяжесть болезни сухих глаз и снижать глазную боль при местном введении в глаз.

ССЫЛКИ

1. Применение ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, для получения лекарственного средства для лечения сухих глаз и/или глазной боли, при этом ми-РНК вводят местно в глаз в дозе от 0,3 до 0,9 мг в сутки.

2. Применение по п.1, при котором ми-РНК вводят в дозе 0,6 мг или 0,9 мг на глаз в сутки.

3. Применение по по.2, при котором указанную ми-РНК вводят в течение 5-15 дней.

4. Применение по п.3, при котором указанную ми-РНК вводят в течение 10 дней.

5. Применение по п.4, при котором указанную ми-РНК вводят постоянно.

6. Применение по п.5, где указанная ми-РНК содержит по меньшей мере один химически модифицированный нуклеотид.

7. Применение ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, для лечения сухих глаз и/или глазной боли, при этом ми-РНК вводят местно в глаз в дозе от 0,3 до 0,9 мг в сутки.

8. Способ лечения сухих глаз и/или глазной боли, характеризующийся тем, что ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, вводят местно в глаз в дозе от 0,3 до 0,9 мг в сутки.

9. Медицинский набор для введения ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, содержащий предлагаемую ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, и дозатор с дозирующим клапаном для высвобождения конкретных доз соединения ми-РНК в капле, имеющей предварительно определяемый объем, при этом указанная доза содержит от 0,3 до 0,9 мг для ежедневного введения местно в глаз и напечатанные инструкции по введению ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, по п.7.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения мутантного белка VP2 вируса ящура (FMDV), отличающийся тем, что мутантный белок VP2 получают путем замены по меньшей мере одной аминокислоты парентеральной αА-спирали белка VP2 на аминокислоту, выбранную из группы, включающей в себя: Q, N, V, I, F, Y, W и Н, с получением αА-спирали, отличной от αА-спирали дикого типа, где мутанты выбирают из группы, состоящей из: 1) мутантов H87V, V90N, Y91F, S93H, S93Y, S93F, S93W, S93Q, L94V, S97V, S97I, S97Q и Y98F серотипа O; 2) мутантов H93F и H93Q серотипа A; 3) мутантов S93H, S93Y, S93W, S93F и Y98F серотипа SAT-2, где все номера положений указаны в соответствии с нумерацией аминокислот, используемой в SEQ ID NO: 1.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ лечения или предотвращения миотонической дистрофии типа 1 (DM1) у индивидуума.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmpA - продуценту поверхностного протеина OmpA/MotB с молекулярной массой 36,9 кДа.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к штамму бактерии Escherichia coli BL21(DE3) BpsOmp39 - продуценту поверхностного протеина Оmр39 с молекулярной массой 40,6 кДа.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению общей формулы I или его стереоизомеру, где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и R10 независимо представляют собой атом водорода или галогена и R11 представляет собой атом водорода или группу гидрокси.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются поксвирусного вектора, композиции, включающей такой вектор, способу десенсибилизации, индукции переносимости или подавления аллергической реакции, способу вакцинации субъекта и набору.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются живого аттенуированного рекомбинантного герпесвируса кои (KHV), вектора экспрессии, включающего геном такого вируса, выделенной клетки, вакцины, способа профилактики у рыбы заболевания, вызываемого KHV, и иммуногенной композиции.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вакцинной композиции, способа иммунизации при использовании указанной композиции и набора для осуществления такого способа.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточной терапии, и может быть использовано в медицине для восстановления поврежденного миокарда.

Предложенная группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены применение специфического ингибитора ApoCIII, включающего антисмысловое соединение, нацеленное на ApoCIII, подавляющее экспрессию ApoCIII, для i) лечения, замедления или облегчения FCS у животного или ii) замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с FCS, также применения соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 3, для лечения, замедления или облечения FCS у животного и для замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с FCS.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к двухцепочечной РНК (дцРНК) для подавления экспрессии гена-мишени у Leptinotarsa или Lygus. Также раскрыты ДНК-конструкция, кодирующая указанную дцРНК, прокариотическая клетка-хозяин, дрожжевая или растительная клетка-хозяин, содержащие указанную ДНК-конструкцию, композиция, содержащая дцРНК, трансгенное растение, модифицированное указанной дцРНК, и семя, полученное из указанного трансгенного растения.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярно-генетической диагностики. Раскрыт способ проведения ПЦР с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1.

Изобретение относится к биотехнологии и предусматривает способы тестирования образца на наличие одной или нескольких мишеней. Способы включают приведение образца в контакт с одним или несколькими специфичными для мишени партнерами по связыванию, где каждый специфичный для мишени партнер по связыванию соединен с докинг-цепью и где специфичные для мишени партнеры по связыванию с разной специфичностью соединены с разными докинг-цепями, приведение образца в контакт с мечеными визуализирующими цепями с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна докинг-цепям, с получением меченых визуализирующих цепей, стабильно связанных с докинг-цепями, визуализацию образца и тушение сигнала от связанной меченой визуализирующей цепи или удаление связанных меченых визуализирующих цепей от докинг-цепей путем ферментативного расщепления, модификации или разрушения меченых визуализирующих цепей.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ лечения или предотвращения миотонической дистрофии типа 1 (DM1) у индивидуума.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к синтетическому слитому белку активатора транскрипции, который увеличивает экспрессию представляющей интерес полинуклеотидной последовательности, содержащему ДНК-связывающий полипептид и полипептид мотива взаимодействия домена трансактивации, а также к молекуле нуклеиновой кислоты, его кодирующему, и вектору, содержащему вышеуказанную молекулу нуклеиновой кислоты.

Предложенная группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены применение специфического ингибитора ApoCIII, включающего антисмысловое соединение, нацеленное на ApoCIII, подавляющее экспрессию ApoCIII, для i) лечения, замедления или облегчения FCS у животного или ii) замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с FCS, также применения соединения, включающего модифицированный олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 3, для лечения, замедления или облечения FCS у животного и для замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с FCS.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения наличия/отсутствия мутации fl2 с применением растительной ткани кукурузы, а также к генетически сконструированному растению кукурузы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному грызуну, экспрессирующему гуманизированный Т-клеточный рецептор (TCR) и содержащему в геноме своей зародышевой линии: нереаранжированную последовательность вариабельной области TCRα, и/или нереаранжированную последовательность вариабельной области TCRβ, к способу его получения, а также к его выделенной эмбриональной клетке и ткани.

Настоящее изобретение относится к биохимии. Описан способ повышающей регуляции экспрессии полинуклеотида нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) в биологической системе.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения конъюгата рекомбинантного аналога интерферона бета 1b с полимером олигосахаридной природы.
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для проведения обезболивания при выполнении витреоретинальных операций. Для этого за 10-15 минут до операции проводят премедикацию: внутривенно вводят 5-10 мг сибазона, 0,05-0,1 мг фентанила и 0,5-1,0 мг атропина.

Предложено применение ми-РНК, мишенью которой является последовательность SEQ ID NO:1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, для лечения сухих глаз иили глазной боли, а также для получения лекарственного средства для лечения сухих глаз иили глазной боли. При этом ми-РНК вводят местно в глаз в дозе от 0,3 до 0,9 мг в сутки. Также предложен способ лечения сухих глаз иили глазной боли, характеризующийся введением местно в глаз указанной ми-РНК в указанном количестве. Предложен также медицинский набор для введения ми-РНК, содержащий указанную ми-РНК и дозатор с дозирующим клапаном для высвобождения конкретных доз соединения ми-РНК в капле, имеющей предварительно определяемый объем, и напечатанные инструкции по введению предложенной ми-РНК. Группа изобретений обеспечивает эффективное лечение глазных состояний, связанных с высокими уровнями экспрессии иили активности рецептора ваниллоида-1. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл.

Наверх