Композиция пробиотиков и пребиотиков

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы молочнокислых бактерий, обладающие антимикробной активностью (варианты); применение одного или более штаммов бактерий; композиция для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком. Штаммы молочнокислых бактерий, депонированные в CECT под регистрационными номерами CECT 8163, CECT 8165, CECT 8164, CECT 8166, CECT 8347, CECT 8348, CECT 8349, CECT 8350, способны сохранять одинаковую жизнеспособность в течение 3 часов инкубации при рН 3,5 и в течение 4 часов инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи. Композиция содержит один или более штаммов бактерий в количестве 10⁷ КОЭ на дозу или больше. Изобретения позволяют ускорить рост и увеличить массу тела новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, и обеспечить предотвращение или лечение бактериальных инфекций. 10 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.

 

Уровень техники

Новорожденные животные и, в частности, новорожденные животные в (интенсивном) сельском хозяйстве склонны к бактериальным и другим инфекциям. Эти инфекции могут привести к диарее, связанной со снижением массы тела, и в тяжелых случаях даже к смерти новорожденного животного. Например, несколько лет назад были описаны случаи диареи у новорожденных поросят на свинофермах в различных географических областях Испании. Считается, что указанная диарея у этих животных является симптомом, тогда как причинный фактор указанного симптома иногда трудно обнаружить. Например, во многих случаях диареи у новорожденных свиней можно выделить возможно неблагоприятные/нежелательные бактериальные штаммы, такие как Escherichia coli отдельно или в комбинации с Clostridium perfringens или Clostridium difficile, но диарею обычно обнаруживают сразу после рождения, и стандартное лечение и профилактические процедуры зачастую не эффективны.

Без намерения связывать себя какой-либо определенной теорией, полагают, что причинным фактором может быть дисбиоз (также называемый дисбактериозом). Дисбиоз относят к состоянию с микробными дисбалансами на поверхности или внутри тела. У сельскохозяйственных животных, в частности свиней, дисбиоз может быть вызван беспорядочным применением антибиотиков в процессе ухода за свиноматками, и вызывать изменения в кишечной флоре новорожденного поросенка.

Ввиду указанных недостатков применения антибиотиков рекомендуется ограничивать применение антибиотиков в животноводческом хозяйстве. С другой стороны, тогда потребовались бы альтернативные способы для замещения обычно используемых антибиотиков.

Поскольку ЕС с 2005 года рекомендует сократить применение антибиотиков в качестве стимуляторов роста в свиноводстве (поправки, внесенные постановлением (ЕС) №378/2005 от 4 марта 2005 года), животноводы ждут альтернатив, которые могли бы улучшить общее состояние здоровья (сельскохозяйственных) животных, особенно в первые дни жизни. Авторы настоящего изобретения предлагают решение этой проблемы, указанное решение описано ниже. Таким образом, настоящее изобретение решает несколько проблем, вызванных способами существующего уровня техники, и ниже будут подробно описаны полезные эффекты изобретения.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, в более предпочтительном варианте по меньшей мере три, например, три, в более предпочтительном варианте по меньшей мере четыре, например, четыре, или же по меньшей мере пять, например пять, или же по меньшей мере шесть, например шесть, или же по меньшей мере семь, например семь, или же по меньшей мере восемь, например восемь, микроорганизм (-ов), предпочтительно бактерий и в более предпочтительном варианте молочнокислых бактерий. Молочнокислая бактерия в идеальном случае представляет собой бактерию, выбранную из следующих штаммов: СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164 (AqSyn09); СЕСТ 8166 (AqSyn10), СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), все из которых были депонированы в СЕСТ. В одном из вариантов реализации представлена композиция, содержащая один или более штаммов, где каждый штамм отвечает по меньшей мере следующему условию а. и предпочтительно и условию а., и условию b., и наив более предпочтительном варианте всем условиям a., b. и c:

a. проявляет антимикробную активность, о чем свидетельствует по меньшей мере одна из следующих зон ингибирования: (i) 10 мм или более, например 14 мм или более, для Salmonella, (ii) 9 мм или более, предпочтительно 10 мм или более, для Listeria monocytogenes, (iii) 9 мм или более, предпочтительно 10 мм или более, для Staphyloccocus aureus, (iv) 10 мм или более, например 18 мм или более, для Escherichia coli;

b. способен сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 3 ч инкубации при рН=3,5 или при рН=2,5;

c. способен сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 4 часов инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи предпочтительно при pH=8.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть предназначена для применения в способе лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, и/или увеличения массы тела новорожденного млекопитающего (предпочтительно поросенка). В этом способе композицию вводят млекопитающему.

Согласно изобретению также предложен микроорганизм, предпочтительно бактерия, и в более предпочтительном варианте молочнокислая бактерия. Молочнокислая бактерия в идеальном случае представляет собой бактерию, выбранную из следующих штаммов: СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164 (AqSyn09); СЕСТ 8166 (AqSyn10), СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), каждый из которых депонирован в СЕСТ (Испанская коллекция типовых культур) фирмой "AQUILON CYL S.L.". номера AqSyn в скобках, которые могут использоваться как синонимы для каждого штамма, были присвоены штаммам авторами настоящего изобретения.

СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164 (AqSyn09) и СЕСТ 8166 (AqSyn10) были депонированы 20 июня 2012. СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59) были депонированы 16 мая 2013.

В конкретном варианте реализации композиция содержит по меньшей мере один, например один, предпочтительно два, например два, в более предпочтительном варианте по меньшей мере три, например три, из следующих трех штаммов: СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8164 (AqSyn09) и СЕСТ 8166 (AqSyn10). В альтернативном варианте реализации композиция содержит все четыре штамма СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164(AqSyn09), и СЕСТ 8166 (AqSyn10).

В альтернативном варианте реализации композиция содержит один или более штаммов из СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164 (AqSyn09), СЕСТ 8166 (AqSyn10), СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), например один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь.

В альтернативном варианте реализации композиция содержит по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, в более предпочтительном варианте по меньшей мере три, например три, в более предпочтительном варианте по меньшей мере четыре, например четыре, штамма из СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59).

В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17) и СЕСТ 8349 (AqSynJ55). В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В предпочтительном варианте реализации композиция содержит все четыре штамма СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59).

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из штаммов, содержащихся в композиции, например один, и/или два, и/или три, и/или четыре и/или пять, и/или шесть, и/или семь и/или восемь, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, не обладают устойчивостью к антибиотикам, а именно: они не способны к выживанию после воздействия соответствующего стандартного лечения антибиотиками.

В любом случае слово "содержит" может необязательно означать, что присутствуют дополнительные бактериальные штаммы, или что дополнительные бактериальные штаммы не присутствуют. Даже если дополнительные бактериальные штаммы не присутствуют, слово "содержит" может необязательно означать, что присутствуют другие дополнительные ингредиенты, т.е. любые другие ингредиенты, отличные от бактерий.

Другой ингредиент (или другие ингредиенты) никак не ограничены. В предпочтительном аспекте в композиции согласно настоящему изобретению содержится по меньшей мере одно пребиотическое соединение включено, т.е. в качестве другого ингредиента.

Что касается композиций различных штаммов, возможно любое соотношение компонентов в смеси. Соотношение компонентов смеси указано в дальнейшем d колониеобразующих единицах (KOE), KOE определяют подходящим образом перед смешиванием отдельных штаммов. В одном из вариантов реализации соотношения штаммов могут быть равными или могут не быть равными, например 1:(0,1-10):(0,1-10) для композиции из трех штаммов, 1:1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) для композиции из четырех штаммов и так далее. В другом варианте реализации соотношение штаммов приблизительно или по существу равно, например, 1:1:1 для композиции из трех штаммов и 1:1:1:1 для композиции из четырех штаммов и так далее. Композиция может быть получена путем смешивания соответствующих количеств бактерий определенных путем подсчета колоний) каждого штамма для включения в композицию. Штаммы, которые будут включены, могут быть представлены в виде стоковых культур отдельных штаммов, причем каждая из них может иметь, например, форму лиофилизата. В случае, когда различные стоковые культуры обладают различными концентрациями (KOE/г), используют соответствующие количества (г) каждой стоковой культуры так, чтобы желаемая композиция содержала желаемое количество KOE каждого штамма. Примеры этого приведены ниже.

Пребиотики хорошо известны в технике, и при применении в настоящем изобретении нет определенных ограничений на пребиотик как таковой. В предпочтительных вариантах реализации, однако, по меньшей мере один пребиотический продукт в композиции выбран из следующих соединений и композиций: бета-глюканов, маннан-олигосахаридов, инулина, олигофруктозы, галактоолигосахаридов (ГОС, GOS), лактулозы, лактосахарозы, галактотриозы, фруктоолигосахарида (ФОС, FOS), целлобиозы, целлодекстринов, циклодекстринов, мальтитола, лактитола, гликозилсахарозы, витамина Е или его варианта (где варианты выбраны из альфа-, бета-, гамма-, дельта-токоферолов, токотриенолов и токомоноенолов). Необязательно маннан-олигосахариды и/или инулин могут быть предпочтительными.

Согласно настоящему изобретению также предложено применение композиции, описанной выше, в способе лечения человека или животного. Лечение животного, млекопитающего и/или домашнего животного, в частности, может быть предпочтительным. Предпочтительно животное не является человеком, и в более предпочтительном варианте животное из подотряда Нежвачные (Suina) (подотряд Нежвачные (также известный как Suiformes (свинообразные)) представляет собой группу млекопитающих, которые включают свиней и пекари семейств Suidae и Tayassuidae). Кабан или свинья, дикая или домашняя, могут быть особенно предпочтительными. В другом варианте реализации композицию вводят человеку.

Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая микроорганизмы, предпочтительно бактерии, и в более предпочтительном варианте молочнокислые бактерии, для применения в способе лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, и/или для увеличения массы тела новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. В альтернативном варианте композицию применяют в способе стимулирования роста новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка.

Указанная композиция для применения в способе лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, и/или для увеличения массы тела, и/или для стимуляции роста может содержать по меньшей мере один из бактериальных штаммов СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164(AqSyn09), СЕСТ 8166 (AqSyn10); СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В некоторых вариантах реализации указанная композиция для применения в способе лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, и/или для увеличения массы тела, и/или для стимулирования роста представляет собой описанную выше конкретную композицию (в любом описанном варианте реализации).

Композицию для применения в способе лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, и/или для увеличения массы тела, и/или для стимулирования роста можно вводить в течение первых 14 дней после рождения (в более предпочтительном варианте в первые 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 дня после рождения и в наиболее предпочтительном варианте в течение первых 2 дней после рождения или в течение первого 1 дня (24 часов) после рождения).

В этих целях композицию можно вводить, например, перорально. Композиция может быть в любой форме, например в лиофилизированной, жидкой или аэрозольной формах. Если, например, для получения композиции применяют лиофилизированные бактерии, то указанная предварительная композиция лиофилизированных бактерий может быть регидратирована, например, стерильным изотоническим солевым раствором, благодаря чему может быть получена конечная композиция с желаемой общей концентрацией (KOE /мл).

Для обеспечения простоты в использовании композиция может быть в дозированной форме. Например, каждая доза содержит 10⁷ или более, 10⁸ или более, 10⁹ или более, 10¹⁰ или более, 10¹¹ или более колониеобразующих единиц (KOE) бактерий (10⁹ или более может быть предпочтительным). Доза может иметь объем в диапазоне от 0,1 до 100 мл, предпочтительно от 0,2 до 50 мл, в более предпочтительном варианте от 0,5 до 20 мл, в более предпочтительном варианте от 1,0 до 10 мл, в более предпочтительном варианте от 1,5 до 5 мл, и еще в более предпочтительном варианте (по существу) 2 мл. Доза 2 мл с 10⁹ или более KOE может быть особенно предпочтительна.

Любое количество доз может быть введено, и специалист может выбрать продолжительность лечения в соответствии с потребностями на соответствующей ферме. В конкретном варианте реализации общее количество доз, вводимых в организм животного составляет 10 или менее, например любое количество, выбранное из следующих: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, или любой диапазон, объединяющий любое из этих чисел (за исключением 10) с любым из этих чисел при условии, что второе число больше (например, от 1 до 3 доз). Совокупность двух доз на одно животное может быть особенно предпочтительна.

В предпочтительном варианте реализации первую дозу вводят в первые 24 часа после рождения, и вторую дозу вводят в последующие 24 часа. Эти дозы могут быть единственными двумя дозами. В другом варианте в дальнейшем вводят дополнительные дозы.

Композиция по настоящему изобретению является особенно подходящей для лечения или предотвращения такого состояния млекопитающего, как бактериальная инфекция. В некоторых вариантах реализации состояние может быть выбрано из диареи, вызванной бактериальными инфекциями (включая колибациллез), Clostridium difficile-ассоциированной диареи новорожденных, диареи, вызванной Clostridium perfringens типов А и С. Кроме того, можно вводить композицию животным, страдающим от диареи, даже если (еще) не было подтверждено, что причинным фактором для упомянутой диареи является (бактериальная) инфекция.

Краткое описание фигур

Фиг. 1: Различные ПЦР-профили обычно относятся к различным видам бактерий видов бактерий, как описано в примере 1 (дорожки 1-5, 7: Lactobacillus reuteri, дорожки 8-11: Enterococcus faecium, дорожка 6: маркер молекулярной массы).

Фиг. 2: Зоны ингибирования, иллюстративный пример.

Подробное раскрытие изобретения

Следующее подробное описание раскрывает конкретные и/или предпочтительные варианты частных признаков указанного изобретения. Настоящее изобретение также предусматривает в качестве особенно предпочтительных вариантов реализации варианты, образующиеся путем комбинирования двух или более конкретных и/или предпочтительных вариантов, описанных для двух или более признаков согласно настоящему изобретению.

Если в явном виде не указано иное, термин "содержащий" используют в контексте настоящего документа для указания, что могут необязательно присутствовать дополнительные компоненты помимо компонентов из списка, перед которым стоит термин "содержащий". Однако в качестве конкретного варианта реализации настоящего изобретения предусмотрено, что термин "содержащий" включает возможность отсутствия дополнительных компонентов, то есть для целей этого варианта реализации термин «содержащий» следует понимать в значении "состоящий из".

Если прямо не указано обратное, все показатели относительных количеств в настоящей заявке рассчитаны на основе масс./масс. Указания относительных величин компонента, характеризующегося родовым понятием, предназначены для обозначения общего количества всех конкретных вариантов или компонентов, охватываемых указанным родовым понятием. Если указано, что определенный компонент, определенный родовым понятием, присутствует в определенном относительном количестве и, если указанный компонент дополнительно характеризуется как конкретный вариант или компонент, охватываемый указанным родовым понятием, это означает, что присутствие каких-либо других дополнительных вариантов или компонентов, охватываемых указанным родовым понятием, не приводит к тому, что общее относительное количество компонентов, охваченных указанным родовым понятием, превышает указанное относительное количество; в более предпочтительном варианте, что другие варианты или компоненты, охватываемые указанным родовым понятием, вообще не присутствуют.

Настоящее изобретение объединяет концепцию пробиотиков и пребиотиков, благодаря чему созданы синбиотики. Изобретатели разработали новый терапевтический диапазон бактерий и композиций, обладающих иммуномодуляторным действием. Микроорганизмы или композиции можно вводить на ранних стадиях жизни животного, например поросенка. Таким образом, указанное изобретение относится к продуктам и композициям, которые могут быть полезны в животноводстве. Очень важное замечание, о чем свидетельствуют примеры, состоит в том, что пробиотическое лечение по меньшей мере столь же эффективно и, вероятнее всего, лучше (по сравнению со стандартным лечением антибиотиками) с точки зрения эффективности, чем лечение антибиотиками. Вклад изобретателей обладает огромным значением для экономики как из-за общих затрат на лечение, так и ввиду правового давления и воздействия на окружающую среду.

Микроорганизмы, предпочтительно бактерии, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, представляют собой микроорганизмы с полезным эффектами. Они предпочтительно представляют собой молочнокислые бактерии. Даже небактериальные виды микроорганизмов могут применяться в соответствии с данным изобретением, поскольку они соответствуют критериям отбора а.-с., указанным ниже. Например, известно, что некоторые дрожжи также могут обладать пробиотическими свойствами.

Хотя функциональные параметры, описанные в настоящем документе, являются наиболее важными критериями отбора, когда речь идет о видах микроорганизмов, предпочтительными являются молочнокислые бактерии. Молочнокислые бактерии (МКБ) содержат кладу грамположительных, кислотоустойчивых бактерий, объединенных общими метаболическими и физиологическими характерными чертами. Эти бактерии, обычно присутствующие в гниющих растительных и молочнокислых продуктах, а также в фекалиях животных, производят молочную кислоту в качестве основного конечного метаболического продукта ферментации углеводов. Молочнокислые бактерии считаются безопасными (статус "считаются безопасными" (GRAS)) из-за их повсеместного присутствия в продуктах питания и их вклада в здоровую микрофлору слизистых поверхностей млекопитающих. Молочнокислые бактерии представляют собой бактерии, предпочтительно выбранные из родов Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus и Weisella. Род Lactobacillus и/или род Enterococcus могут быть предпочтительными. Предпочтителен род Lactobacillus. Бактерии, предпочтительные в данном документе, предпочтительно представляют собой грамположительные и каталазоотрицательные бактерии. Является ли бактерия грамположительной можно проверить в соответствии со стандартными технологиями, известными в данной области. Окрашивание по Граму состоит в последовательном окрашивании различными «красками» (красителями) и отмывке образца, для того чтобы проверить, является ли он положительным или отрицательным. Является ли бактерия каталазоотрицательной, проверяют следующим образом: тест на каталазу заключается в добавлении пероксида водорода в образец культуры или скошенный агар. Если исследуемые бактерии синтезируют каталазу, они будут разлагать пероксид водорода с выделением кислорода. Выделение газа вызывает образование пузырьков, и эти пузырьки указывают на то, что тест положительный (каталазоположительная бактерия).

Молочнокислые бактерии предпочтительные в данном документе предпочтительно способны расти на среде МРС (MRS) и в более предпочтительном варианте на подкисленном МРС-агаре, как описано ниже. Среда МРС была создана для способствования росту молочнокислых бактерий, особенно Lactobacillus sp. Полагают, что МРС среда неблагоприятна для роста подавляющего большинства грамотрицательных бактерий. Однако другие бактерии помимо молочнокислых бактерий иногда вырастать на среде МРС, и поэтому рекомендуется или даже необходимо проверять принадлежность колоний к грамположительным и каталазоотрицательным бактериям.

Молочнокислые бактерии предпочтительные в данном документе необязательно могут быть пробиотическими бактериями. Наиболее общепринятое определение "пробиотика" было дано в 1998 году Фуллером (Füller), который описал пробиотик как "живую микробную пищевую добавку, благотворно влияющую на животное-хозяина, улучшая его кишечный микробный баланс". В основном пробиотики представляют собой живые микроорганизмы. Полагают, что различные пробиотики оказывают различное действие в кишечнике, и поэтому различные пробиотики могут действовать вместе, обеспечивая благоприятный эффект. Другие источники определяют пробиотики как микроорганизмы, в отношении которых польза для здоровья человека или животного уже доказаня. Критерии отбора для пробиотиков опубликованы в: "Отчете объединенного экспертного консультирования ФАО/ВОЗ по оценке полезных и питательных свойств пробиотиков в продуктах питания, включающих сухое молоко, с живыми молочнокислыми бактериями", Организацией ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства и Всемирной организацией здравоохранения, 2001, Кордова, Аргентина. Преимущества применения живых бактерий подробно описаны.

В последние годы было введено понятие «пребиотики»; пребиотики представляют собой неперевариваемые компоненты пищи, которые увеличивают рост конкретных микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте. "Синбиотики" представляют собой композиции, содержащие по меньшей мере один пробиотик и по меньшей мере один пребиотик. Такие композиции, как полагают, стимулируют рост полезных бактерий (например, пробиотиков). В качестве иллюстративного примера: ферментированные молочные продукты часто рассматривают как синбиотики, потому что они содержат живые бактерии и источник пищи, необходимый для них. Хотя лечебно-профилактические эффекты, связанные с пребиотиками и пробиотиками, являются благоприятными, исследователи осторожно делают общие выводы, поскольку эффекты меняются в зависимости от типа и количества потребленных пре- и пробиотиков, а также конкретных комбинаций конкретных пробиотиков с конкретными пребиотиками. Таким образом, высокоэффективные синбиотики основаны на комбинации конкретных штаммов пробиотических бактерий с тщательно отобранными пребиотиками. Они могут принести существенную пользу для здоровья млекопитающего.

Конкретные пробиотики, пребиотики и синбиотики были предложены для применения у людей, и критерии отбора для пробиотиков раскрыты, например, в "Отчете объединенного экспертного консультирования ФАО/ВОЗ по оценке полезных и питательных свойств пробиотиков в продуктах питания, включающих сухое молоко, с живыми молочнокислыми бактериями", Организацией ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства и Всемирной организацией здравоохранения, 2001, Кордова, Аргентина.

В настоящем изобретении применяются микроорганизмы, в частности, бактерии, которые обладают потенциалом проявления пользы для здоровья животных, сельскохозяйственных животных в частности. В предпочтительном варианте животное представляет собой домашнее животное, одомашненное животное или животное, которое не является домашним или одомашненным (т.е. дикое), но которое принадлежит к тому же виду или роду, что и домашнее животное. Дикая свинья, например, включается в это определение, поскольку она принадлежит к тому же виду, что и домашняя свинья. Некоторые примеры домашних животных, которых можно лечить, включают, среди прочих, собак, кошек и других домашних животных, лошадей, крупный рогатый скот, кур и другую домашнюю птицу, свиней, овец, коз. В предпочтительном варианте животное представляет собой сельскохозяйственное животное, и сельскохозяйственные животные включают, среди прочих, лошадей, крупный рогатый скот, кур и другую домашнюю птицу, свиней, овец, коз. В более предпочтительном варианте животное представляет собой животное из подотряда Нежвачные (Suina). Подотряд Нежвачные (также известный как Suiformes) представляет по систематической принадлежности млекопитающих, которые включают свиней и пекари из семейств Suidae и Tayassuidae. Кабан или свинья, или дикая или домашняя, могут быть особенно предпочтительными.

Штаммы, подходящие для настоящего изобретения, могут быть определены следующим образом.

Первый этап для получения штаммов согласно настоящему изобретению: выделение отдельных штаммов

На первом этапе выделяют образец, содержащий микроорганизмы (предпочтительно бактерии). Любой источник микроорганизмов может быть подходящим, что в самом широком смысле означает любые нестерильные образцы из окружающей среды. Источником могут служить (домашние) животные, например молодые животные в первые 30 дней жизни или их матери. В альтернативном варианте источником могут служить дикие животные (например, дикие кабаны), например образцы могут быть отобраны из пойманных диких кабанов. Подходящие источники включают молозиво животных-матерей (например свиноматок), образцы мекония новорожденных животных (например поросят), смывы со стенки кишечника домашних или диких животных или естественные кишечные молочнокислые бактерии. Микроорганизмы (например бактерии), содержащиеся в образцах, можно выращивать на ростовых средах, хорошо известных в уровне техники, подходящих для выращивания кишечных микроорганизмов, например на среде МРС. Микроорганизмы можно посеять штрихом, что позволит изолировать отдельные колонии. Можно выбрать отдельные колонии и дополнительно размножить соответствующие штаммы в подходящей ростовой среде (например в такой же, как применявшаяся вначале).

Штаммы этих единичных колоний необязательно проверяют окрашиванием по Граму способами, известными в данной области (и выбирают, если они грамположительные), и/или проверяют на присутствие каталазной активности, как описано выше, (и выбирают, если они каталазоотрицательны).

Второй этап для получения штаммов согласно настоящему изобретению: тесты in vitro

В предпочтительном варианте реализации обязательным условием того, что штамм микроорганизма, полученный в предпочтительным варианте из первого этапа, может быть выбран в качестве подходящего для настоящего изобретения, является его соответствие по меньшей мере одному из следующих критериев, которые впервые перечислены здесь и подробно описаны ниже:

а. Активность против нежелательных бактерий;

b. Кислотоустойчивочть;

с. Устойчивость к солям желчных кислот;

Пункты а.-с. представляют приоритетность; то есть наиболее желательным является соблюдение критерия а., затем наиболее желательным является соблюдение критериев а. и b. и в наиболее предпочтительном варианте соблюдаются все критерии а.-с.. Критерии отбора подробно описываются следующим образом.

(i) Активность против нежелательных бактерий

Проводят скрининг против нежелательных бактерий in vitro. "Нежелательными" являются бактерии, выбранные из следующих одной или более: Salmonella sp., Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus и Escherichia coli. В предпочтительном варианты виды Salmonella представляют собой Salmonella enterica, более предпочтительна Salmonella enterica серотипа Typhimurium.

Активность против нежелательных бактерий исследуют по протоколу теста пятна на газоне, который описан в дальнейшем. Жидкие ночные культуры (МРС) каждого исследуемого штамма наносят в виде отдельных пятен по 10 мкл на агар МРС и инкубируют при 30°С в течение 24 ч в анаэробных условиях. После инкубации чашки заливают 7 мл полутвердого агара с сердечно-мозговой вытяжкой (0,7%), инокулированного одной из нежелательных бактерий (1%; 1 мл ночной культуры в 100 мл среды). Отдельные чашки, содержащие один конкретный штамм для проверки, покрывают одним из нежелательных видов бактерий соответственно. Каждый такой тест проводили в трех повторностях. После инкубации в течение 24 ч при оптимальной или близкой к оптимальной температуре роста нежелательной бактерии (оптимальная температура роста известна в уровне техники для каждой из нежелательных бактерий, указанных в данном документе) образцы исследуют на признаки ингибирования. С этой целью сначала проверяют присутствует ли зона ингибирования. Если она присутствует, то диаметр зоны ингибирования измеряют визуально. В случаях, когда зона ингибирования оказывается не строго округлой, измерение зоны ингибирования производят по правилу измерения наименьшего диаметра зоны ингибирования. Наконец, определяют среднее арифметическое трех повторностей эксперимента и проверяют соблюден ли следующий критерий.

КРИТЕРИЙ: Для отбора штамма в качестве положительного штамм должно выполняться по меньшей мере одно из следующих условий [(i), (ii), (iii), (iv)] должно быть выполнено для штамма:

(i) Для Salmonella, зона ингибирования 10 мм или более, например 14 мм или более.

(ii) Для Listeria monocytogenes, зона ингибирования 9 мм или более, предпочтительно 10 мм или более.

(iii) Для Staphyloccocus aureus, зона ингибирования 9 мм или более, предпочтительно 10 мм или более.

(iv) Для Escherichia coli, зона ингибирования 10 мм или более, например 18 мм или более.

9 мм или более включает 10 мм или более, 11 мм или более, 12 мм или более, 13 мм или более, 14 мм или более, 15 мм или более, 16 мм или более, 17 мм или более, 18 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 21 мм или более, 22 мм или более, 23 мм или более, 24 мм или более, 25 мм или более.

10 мм или более включает 11 мм или более, 12 мм или более, 13 мм или более, 14 мм или более, 15 мм или более, 16 мм или более, 17 мм или более, 18 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 21 мм или более, 22 мм или более, 23 мм или более, 24 мм или более, 25 мм или более, 26 мм или более, 27 мм или более, 28 мм или более, 29 мм или более, 30 мм или более, 35 или более.

14 мм или более включает 15 мм или более, 16 мм или более, 17 мм или более, 18 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 19 мм или более, 20 мм или более, 25 мм или более, 30 мм или более.

18 мм или более включает 19 или более, 20 мм или более, 21 мм или более, 22 мм или более, 23 мм или более, 24 мм или более, 25 мм или более, 26 мм или более, 27 мм или более, 28 мм или более, 29 мм или более, 30 мм или более, 35 или более.

Композицию, содержащую несколько штаммов, также может быть тестировать по вышеуказанным критериям, и чтобы такая композиция могла считаться подходящей для любых медицинских применений, описанных в настоящем документе, она должна соответствовать всем критериям [(i), (ii), (iii), (iv)]. Также можно ожидать, что такая композиция соответственно может быть получена путем объединения отдельных штаммов микроорганизмов, каждый из которых соответствует по меньшей мере одному из критериев (i), (ii), (iii), (iv); но будет ли это действительно так, необходимо проверить экспериментальным путем.

В качестве альтернативы для определения зон ингибирования можно применять метод диффузии в агар. Данный метод удаляет любые следы молочной кислоты, которые могли быть получены в бульоне МРС с низким содержанием глюкозы за счет нейтрализации бесклеточной надосадочной жидкости. Культуры исследуемых видов микроорганизмов в стационарной фазе, выращенные в анаэробных условиях, собирают центрифугированием (5000 g/20 мин/4°С), и pH в бесклеточной надосадочной жидкости доводят до 6,5 с помощью 1М NaOH. Супернатант стерилизуют фильтрацией (0,20 мм; Millipore Ltd., Хартфордшир, Англия). Бесклеточную надосадочную жидкость (30 мкл) добавляют в лунки диаметром 7 мм, вырезанные в чашках с агаровой средой, инокулированных [приблизительно] 10⁵ колониеобразующими единицами (KOE)/мл нежелательной бактерии, приведенной в пунктах (i), (ii), (iii), (iv). Чашки с агаровой средой затем инкубируют при 30°С в течение 24 часов. Измеряют диаметр зон ингибирования вокруг лунок, критерии отбора представляют собой критерии, указанные в пунктах (i), (ii), (iii), (iv) выше, из которых по меньшей мере один должен быть выполнен для отбора штамма в качестве положительного.

Для информации: вышеупомянутые испытания основаны на том, что было описано Kawai с соавт. (Kawai et al., 2004. Applied and Environmental Microbiology 70(5): 2906-2911); Dortu и др. (Dortu et al. 2008. Letters in Applied Microbiology, 47: 581-586); Hata с соавт. (Hata et al., 2009. International Journal of Food Microbiology, 137: 94-99, Awaisheh 2009. Food Pathogens and Disease 6 (9): 1125-1132.).

(ii) Кислотоустойчивость

Кислоту можно рассматривать в качестве имитации желудочного сока, и устойчивость к ней определяют следующим образом. 100 мкл первоначальной суспензии в среде МРС, содержащей 6-8×10⁸ KOE/мл каждого штамма, суспендируют в подкисленной среде МРС (рН=3,5 или же рН=2,5) подкисленной добавлением соответствующего количества 12 Н HCl) и инкубируют при 37°С при перемешивании на 110 оборотах в минуту. Образцы исследуют подсчетом колоний (KOE/мл) через 0,3 и 6 часов.

КРИТЕРИЙ: Штамм должен быть способен сохранять по существу после испытания по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 95% KOE по существу ту же жизнеспособность, что и до, и в наиболее предпочтительном варианте по меньшей мере 50% KOE после испытания по сравнению со значением до испытания) в течение 3 часов инкубации в указанной среде. Для информации: Аналогичный протокол кратко описали Хуанг с соавт.. (Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253- 260).

(iii) Устойчивость к солям желчных кислот

Моделирование естественных условий тонкой кишки млекопитающего

100 мкл первоначальной суспензии в среде МРС, содержащей 6-8×10⁸ KOE/мл бактериального штамма, суспендируют в имитированном растворе содержимого тонкой кишки (например, среде МРС с рН=8 (pH подводят добавлением NaOH) и 0,45% экстрактом желчи (Экстракт желчи, свиной (Bile extract, porcine. В8631-100G. Sigma-Aldrich)) и инкубируют при 37°С при перемешивании 110 оборотов в минуту. Образцы были проверены подсчетом колоний (KOE/мл) через 1, 2 и 4 часа.

КРИТЕРИЙ: Отсутствие потери жизнеспособности (или по существу отсутствие потери жизнеспособности, т.е. предпочтительно 50% или более KOE, например 50% или 60%, или 70%, или 75%, или 80%, или 95% или более KOE) после воздействия имитированных соков тонкой кишки (0,45% солей желчных кислот, необязательно при рН=8) в течение 4 часов. Аналогичный протокол кратко описали Хуанг с соавт. (Huang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253- 260).

Необязательно штаммы, которые были идентифицированы в качестве положительных по вышеуказанным критериям а.-с., также можно исследовать на предмет адгезии к эпителиальным поверхностям и персистенции в желудочно-кишечном тракте животного (например свиньи). Полагают, что штаммы с хорошими адгезивными свойствами будут давать наилучшие результаты.

Необязательно, штаммы, которые были идентифицированы в качестве положительных по вышеуказанным критериям а.-с., дополнительно исследуют для определения профиля устойчивости к антибиотикам, например с помощью теста минимальной концентрации антибиотика (микропланшетные тесты VetMIC) и/или с помощью теста генотипической устойчивости, выполняемого методом ПЦР для различных генов устойчивости (Egervarn et al., 2010. Antonie van Leeuwenhoek 97: 189-200). Считается, что бактерии, не имеющие устойчивости к антибиотикам (отсутствие или неактивное состояние/потеря функции генов устойчивости), являются наиболее подходящими для применения у сельскохозяйственных животных.

Молочнокислая бактерия согласно настоящему изобретению может быть бактерией, выбранной из следующих штаммов: СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164(AqSyn09), СЕСТ 8166 (AqSyn10), СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). Полагают, что все эти штаммы обладают пробиотическими свойствами, и поэтому они могут называться пробиотиками в настоящей заявке. Соответствующие штаммы были выделены авторами настоящего изобретения в соответствии с указанными выше критериями отбора. СЕСТ обозначает Испанскую коллекцию типовых культур, а номера AqSyn в скобках, которые можно использовать синономично для каждого из штаммов, были присвоены штаммам авторами настоящего изобретения. Каждая бактерия была исследована, и было обнаружено, что она соответствует по меньшей мере одному из критериев а.-с., указанных выше. При поиске дополнительных штаммов с полезными свойствами согласно данному изобретению может быть достаточно, чтобы любые такие штаммы, для того, чтобы быть выбранными в качестве подходящих для настоящего изобретения, соответствовали по меньшей мере одному из критериев а.-с., указанных выше. Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, в более предпочтительном варианте по меньшей мере три, например три, в более предпочтительном варианте по меньшей мере четыре, например четыре, или же по меньшей мере пять, например пять, или же по меньшей мере шесть, например шесть, или же по меньшей мере семь, например семь, или же по меньшей мере восемь, например восемь, данных штаммов. Считается, что различные штаммы оказывают различное действие в кишечнике, и поэтому различные штаммы могут действовать вместе для обеспечения полезного эффекта

В конкретном варианте реализации композиция содержит по меньшей мере один, например один, предпочтительно два, например два, в более предпочтительном варианте следующие три штамма: СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8164(AqSyn09) и СЕСТ 8166 (AqSyn10). В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие штаммы: СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164(AqSyn09) и СЕСТ 8166 (AqSyn10).

В альтернативном варианте реализации композиция содержит один или более штаммов из СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164(AqSyn09), СЕСТ 8166 (AqSyn10); СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), например один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь.

В альтернативном варианте реализации композиция содержит по меньшей мере один, например один, предпочтительно по меньшей мере два, например два, в более предпочтительном варианте по меньшей мере три, например три, в более предпочтительном варианте по меньшей мере четыре, например четыре, штамма из СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59).

В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17) и СЕСТ 8349 (AqSynJ55). В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В альтернативном варианте реализации композиция содержит следующие три штамма: СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В альтернативном варианте реализации композиция содержит все четыре штамма СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59).

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из штаммов, содержащихся в композиции, например один и/или два, и/или три, и/или четыре, и/или пять, и/или шесть, и/или семь, и/или восемь штаммов, содержащихся в композиции, и предпочтительно все штаммы, содержащиеся в композиции, не обладают устойчивостью к антибиотикам, то есть они не способны выжить после того как их подвергают соответствующей стандартной обработке антибиотиками.

In vitro тест на минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), направленный на оценку устойчивости к антибиотикам, может быть выполнен для всех предложенных штаммов. Оцениваемые антибиотики могут быть следующими:

ампициллин, ванкомицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, эритромицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол.

С целью различения устойчивых штаммов от чувствительных штаммов Комиссия по добавкам, продуктам или веществам, используемым в кормах для животных (FEEDAP) Европейского управления по безопасности пищевых продуктов (EFSA) определяет микробиологические пороговые величины. Микробиологические пороговые величины устанавливают посредством изучения распределения минимальных ингибирующих концентраций (MIC) выбранных антимикробных препаратов в бактериальных популяциях, принадлежащих к одной таксономической единице (виду или роду). Часть популяции, которая явно отличается от нормальных чувствительных популяций, классифицируют как устойчивую. Микробиологические пороговые величины, которые можно применить для оценки устойчивости штаммов к антибиотикам согласно настоящему изобретению, определены в «Рекомендациях EFSA по оценке чувствительности бактерий к антибиотикам, имеющим медицинское и ветеринарное значение» (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. EFSA Journal 2012; 10(6): 2740).

И в том и в другом случае слово "содержит" может необязательно означать, что присутствуют дополнительные бактериальные штаммы, или, что дополнительные бактериальные штаммы не присутствуют. Даже если дополнительные бактериальные штаммы не присутствуют, слово "содержит" может необязательно означать, что присутствуют другие дополнительные ингредиенты, т.е. любые другие ингредиенты, отличные от бактерий.

Другой ингредиент (или другие ингредиенты) никаким образом не ограничены. В предпочтительном аспекте по меньшей мере одно пребиотическое соединение содержится в композиции согласно настоящему изобретению, а именно в качестве другого ингредиента. В очень общем понимании пребиотики представляют собой все те источники питания, которые могут метаболизироватья пробиотиками. В предпочтительном варианте пребиотики не усваиваются или плохо усваиваются организмом млекопитающего. Таким образом, после поглощения млекопитающим неусваиваемые пребиотики могут проходить через тонкий кишечник и попадать в толстую кишку, чтобы стимулировать рост пробиотиков в этом отделе кишечника. Пребиотики, таким образом, могут служить в качестве источника пищи для пробиотиков. Полагают, что пребиотики, многие из которых являются неусваиваемыми углеводами, способствуют росту пробиотиков в кишечнике. Пребиотики в природе встречаются, например, в различных видах лука, цельном зерне, бананах, чесноке, меде, луке-порее, артишоках, обогащенных продуктах питания и напитках, а также пищевых добавках. Пребиотики хорошо известны в данной области, и при применении в настоящем изобретении нет особых ограничений на пребиотик как таковой. Тем не менее, в предпочтительных вариантах реализации по меньшей мере один пребиотический продукт в композиции представляет собой продукт, выбранный из следующих соединений и композиций: неусваиваемых углеводов, бета-глюканов, маннан-олигосахаридов, инулина, олигофруктозы, галактоолигосахаридов (ГОС), лактулозы, лактосахарозы, галактотриозы, фруктоолигосахарида (ФОС), целлобиозы, целлодекстринов, циклодекстринов, мальтитола, лактитола, гликозилсахарозы, витамина Е или модифицированных вариантов (где модифицированные варианты выбраны из альфа-, бета-, гамма-, дельта-токоферолов, токотриенолов и токомоноенолов). Необязательно маннан-олигосахариды и/или инулин могут быть предпочтительными.

Что касается композиций различных штаммов, то возможно любое соотношение компонентов. Соотношение компонентов указано в колониеобразующих единицах (KOE), которые подходящим образом определены перед смешиванием отдельных штаммов. В одном из вариантов реализации соотношение штаммов может быть равным или может не быть равным, например, 1:(0,1-10):(0,1-10) для композиции из трех штаммов, 1:(0,1-10):(0,1-10):(0,1-10) для композиции из четырех штаммов и так далее. В другом варианте реализации соотношение штаммов примерно или по существу равно, например, 1:1.1 для композиции из трех штаммов, 1:1:1:1 для композиции из четырех штаммов и так далее. Композиция может быть получена путем смешивания соответствующих количеств бактерий (как определено подсчетом колоний) каждого штамма, которые должны быть включены в композицию.

Согласно настоящему изобретению также предложено применение композиции в способе лечения человека или животного. Может быть предпочтительным лечение животного, млекопитающего и/или домашнего животного в частности. Предпочтительно, животное принадлежит к подотряду Нежвачные (Suina) (подотряд Нежвачные представляет собой систематическую группу млекопитающих, которая включает свиней и пекари из семейств Suidae и Tayassuidae). Кабан или свинья, дикая или домашняя, могут быть особенно предпочтительными. Также к ним относятся свиньи, живущие в полудиких условиях, т.е. расы домашних свиней, которые живут большую часть года на открытом воздухе и самостоятельно находят себе пищу. Композиция может представлять собой композицию, содержащую по меньшей мере один из описанных выше депонированных штаммов.

Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая молочнокислые бактерии, для применения в способе для увеличения массы тела новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. В альтернативном варианте композицию применяют в способе для стимулирования роста новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. В альтернативном варианте композицию применяют в способе лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, у новорожденного млекопитающего, предпочтительно поросенка. В композиции содержится по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, в более предпочтительном варианте по меньшей мере три, например четыре или более четырех, различных штамма молочнокислых бактерий. В случае композиции для применения, описанного в данном абзаце, любая молочнокислая бактерия должна соответствовать по меньшей мере одному из критериев а.-с. (активность против нежелательных бактерий, кислотоустойчивость; устойчивость к солям желчных кислот), описанных выше. Что касается критерия а., указанная минимальная зона ингибирования в основном отмечена для всех нежелательных бактерий (i)-(iv). В предпочтительном варианте композиция должна соответствовать совокупности критериев (например, а. и b.) и в предпочтительном варианте всем критериям (а.-с.), указанным выше. Также возможно, что в указанном способе животному не вводят антибиотик. Либо в указанном способе можно применять пробиотическую композицию или синбиотическую композицию (т.е. композицию, содержащая по меньшей мере одно пребиотическое соединение).

Композиция согласно настоящему изобретению содержит живые микроорганизмы, предпочтительно бактерии. В частности, указанная композиция для применения в способе увеличения массы тела и/или стимуляции роста, и/или лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, может содержать по меньшей мере один, например, один и/или два, и/или три, и/или четыре, и/или пять, и/или шесть, и/или семь, и/или восемь бактериальных штаммов СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164 (AqSyn09); СЕСТ 8166 (AqSyn10); СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJI7), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59). В некоторых вариантах реализации указанная композиция для применения в способе увеличения массы тела и/или стимуляции роста, и/или лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, представляет собой описанную выше конкретную композицию (в любом описанном варианте реализации).

Композицию для применения в способе увеличения массы тела и/или стимуляции роста, и/или лечения или предотвращения диареи, вызванной бактериальной инфекцией, можно вводить в течение первых 14 дней после рождения (в более предпочтительном варианте в пределах первых 13 или 12, или 11, или 10, или 9, или 8, или 7, или 6, или 5, или 4, или 3, или 2 дней после рождения и в наиболее предпочтительном варианте в течение первых 2 дней после рождения или в течение первого 1 дня (24 часов) после рождения.

Подходит любой путь введения, но пероральное введение может быть предпочтительным. Наиболее часто дозу вводят каждому животному непосредственно в рот, чтобы гарантировать, что животное обязательно проглотит дозу. В альтернативном варианте композиция может также применяться в качестве пищевой добавки, т.е. ее добавляют к ежедневному корму животного.

Композиция может быть в любой форме, например в лиофилизированной, жидкой или аэрозольной формах. Если, например, для получения композиции применяют лиофилизированные бактерии, указанная предварительная композиция лиофилизированных бактерий может быть регидратирована, например, стерильным изотоническим солевым раствором или стерильной водой, или стерильной ростовой средой для получения конечной композиции с желаемой общей концентраций (KOE/мл).

Для обеспечения легкого применения композиция может быть в дозированной форме. Например, каждая доза может содержать 10⁷ или более, 10⁸ или более, 10⁹ или более, 10¹⁰ или более, 10¹¹ или более колониеобразующих единиц (KOE) микроорганизмов (бактерий); доза 10⁹ или более может быть предпочтительной. Объем дозы может составлять от 0,1 до 100 мл, предпочтительно от 0,2 до 50 мл, в более предпочтительном варианте от 0,5 до 20 мл, в более предпочтительном варианте от 1,0 до 10 мл, в более предпочтительном варианте от 1,5 до 5 мл и еще в более предпочтительном варианте (по существу) 2 мл. Доза объемом 2 мл с 10⁹ или более KOE может быть особенно предпочтительной.

Может вводиться любое количество дозо, и специалист может выбрать продолжительность лечения согласно потребностям на соответствующей ферме. В конкретном варианте реализации общее количество доз, вводимых в организм животного, составляет 10 или менее, например любое количество, выбранное из следующих значений: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, или находится в любом диапазоне комбинирования любого из этих чисел (за исключением 10) с любым из этих чисел при условии, что второе число больше (например, от 1 до 3 доз). Совокупность двух доз на одно животное может быть особенно предпочтительной.

Таким образом, авторы настоящего изобретения предложили новое применение для таких композиций посредством необязательного использования пробиотической или симбиотической композиции на ранней стадии жизни. В предпочтительном варианте реализации первую дозу вводят в первые 24 часа после рождения, и вторую дозу вводят в последующие 24 часа. Эти две дозы могут быть единственными, но не обязательно. В другом варианте в дальнейшем вводят дополнительные дозы.

Композиция согласно настоящему изобретению представляет собой композицию особенно подходящую для лечения или предотвращения такого состояния у млекопитающего, как бактериальная инфекция или дисбиоз. Инфекция может представлять собой или включать инфекцию желудочно-кишечного тракта. Такая инфекция может быть вызвана любой бактерией, такой как, например, только Escherichia coli или в комбинации с Clostridium perfringens или с Clostridium difficile. Другими причинными факторами могут быть Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphyloccocus aureus. В некоторых вариантах реализации состояние может быть выбрано из диареи, вызванной бактериальными инфекциями (включая колибациллез), Clostridium difficile-ассоциированной диареи новорожденных, диареи, вызванной Clostridium perfringens типов А и С. Также можно лечить стрептококковый менингит. Также возможно вводить композицию животным, страдающим от диареи или подверженным риску заболеть диареей, даже если (еще) не было доказано, что причинным фактором для указанной диареи является (бактериальная) инфекция. Животные, подверженные риску заражения диареей, могут быть определены как животные, живущие (или родившиеся) в помещениях, в которых диарея была отмечена в течение последних 12 месяцев, 6 месяцев, 3 месяцев или 1 месяца.

Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, подтверждают полезный эффект от применения продуктов и композиций согласно настоящему изобретению. Как показано в приведенных ниже примерах подтверждения концепции, процент смертности был значительно ниже, чем в другие недели только при стандартном лечении антибиотиками (см. примеры). Таким образом, предпочтительно композицию согласно настоящему изобретению вводят животным, которые в то же самое время не получают лечения антибиотиком (антибиотиками).

Согласно настоящему изобретению также предложен микроорганизм, предпочтительно бактерия, и в более предпочтительном варианте молочнокислая бактерия. Молочнокислая бактерия представляет собой бактерию, в идеальном случае выбранную из следующих штаммов: СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164 (AqSyn09); СЕСТ 8166 (AqSyn10), СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59), все из которых депонированы в СЕСТ.

Настоящая заявка содержит следующие объекты:

1. Композиция, содержащая один или более штаммов микроорганизмов, для применения в способе увеличения массы тела новорожденного млекопитающего (предпочтительно поросенка), где каждый штамм отвечает по меньшей мере приведенному ниже условию а, в предпочтительном варианте как условию а, так и условию b, и в наиболее предпочтительном варианте всем условиям а., b. и c.:

a. обладает по меньшей мере одной из следующих антимикробных активностей, о чем свидетельствуют зоны ингибирования, определенные в анализе пятна на газоне: (i) 14 мм или более зона ингибирования для Salmonella, (ii) 9 мм или более зона ингибирования для Listeria monocytogenes, (iii) 9 мм или более зона ингибирования для Staphylococcus aureus, (iv) 18 мм или более зона ингибирования для Escherichia coli;

b. способен сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 3 часов инкубации при pH 2,5;

c. способен сохранять по существу одинаковую жизнеспособность в течение 4 часов инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи и рН=8.

2. Молочнокислая бактерия, выбранная из следующих штаммов:

a. штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под депозитарным номером СЕСТ 8163 (AqSyn04);

b. штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под депозитарным номером СЕСТ 8165 (AqSyn06);

c. штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под депозитарным номером СЕСТ 8164(AqSyn09); и

d. штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под депозитарным номером СЕСТ 8166 (AqSyn10).

3. Композиция, содержащая по меньшей мере один, в предпочтительном варианте по меньшей мере два, в более предпочтительном варианте по меньшей мере три, в более предпочтительном варианте все бактериальные штаммы по п. 2.

4. Композиция по п. 3, содержащая или состоящая из следующих трех штаммов:

i. штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под депозитарным номером СЕСТ 8163 (AqSyn04);

ii. штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под депозитарным номером СЕСТ 8164(AqSyn09)

iii. штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур под депозитарным номером СЕСТ 8166 (AqSyn10).

5. Композиция по п. 4, содержащая или состоящая из всех четырех штаммов по п. 1.

6. Композиция по любому пункту из пп. 3-5, дополнительно содержащая по меньшей мере один пребиотический продукт.

7. Композиция по п. 6, где по меньшей мере один пребиотический продукт представляет собой продукт, выбранный из следующих соединений и композиций: бета-глюканов, маннан-олигосахаридов, инулина, олигофруктозы, галактоолигосахаридов (ГОС), лактулозы, лактосахарозы, галактотриозы, фруктоолигосахарида (ФОС), целлобиозы, целлодекстринов, циклодекстринов, мальтитола, лактитола, галактозилсахарозы, витамина Е или его варианта (где варианты выбраны из альфа-, бета-, гамма-, дельта-токоферолов, токотриенолов и токомоноенолов), при этом маннан-олигосахариды и/или инулин предпочтительны.

8. Композиция по любому из пп. 3-7 для применения в способе лечения человека или животного, которое предпочтительно представляет собой млекопитающее и/или домашнее животное, и в более предпочтительном варианте свинью.

9. Композиция для применения по п. 1, где композиция представляет собой композицию по пп. 3-7.

10. Композиция для применения по п. 1 или п. 9, где композицию вводят в течение первых 14 дней после рождения (в более предпочтительном варианте в течение первых 13, 12, 11, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 дней после рождения и в наиболее предпочтительном варианте в течение первых двух дней после рождения).

11. Композиция для применения по любому из пп. 1 или 9-10 для перорального введения.

12. Композиция для применения по любому из пп. 1 или 9-11, которая находится в лиофилизированной, жидкой или аэрозольной форме.

13. Композиция для применения по любому из пп. 1 или 9-12, где композиция представлена в лекарственной форме, и где каждая доза содержит 10⁹ или более колониеобразующих единиц (KOE).

14. Композиция для применения по п. 13 для введения в двух дозах.

15. Композиция для применения по п. 14, где первую дозу вводят в течение первых 24 часов после рождения, и вторую дозу вводят в последующие 24 часа.

16. Композиция для применения по любому из пп. 1 или 9-15 для лечения или предотвращения бактериальных инфекций, таких как диарея, вызванная бактериальными инфекциями (включая колибациллез), Clostridium difficile-ассоциированная диарея новорожденных, диарея, вызванная Clostridium perfringens типов А и С.

Материалы и методы

Среда МРС: пропись среды МРС была составлена согласно прописи, полученной из Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ; www.cect.org), следующим образом: пептон 10,0 г, говяжий экстракт 10,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, глюкоза 20,0 г, аммония цитрат 2,00 г, натрия ацетат 5,00 г, MgSO4.7H2O 0,20 г, MnSO4.H2O 0,05 г, K₂HPO₄ 2,00 г, [порошковый агар (только для твердых сред) 15 г], дистиллированная вода 1 л.

Пропись среды BHI (с сердечно-мозговым экстрактом) была составлена согласно прописи, полученной из Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ; www.cect.org), следующим образом: сухое вещество инфузии мозга телят 12,5 г, сухое вещество инфузии бычьего сердца 5,0 г, протеозопептон 10,0 г, глюкоза 2,0 г, NaCl 5,0 г, HNa2PO4 2,5 г, дистиллированная вода 1 л, [порошкообразный агар (только для твердых сред) 15 г].

Лечение антибиотиками: обычно на каждой свиноферме новорожденных поросят лечат антибиотиками и возможно железосодержащими добавками. Обычно на каждой свиноферме есть различные "стандартные" способы лечения своих животных (обычно вводят дозу антибиотиков и железосодержащие добавки при рождении). В приведенных ниже экспериментах использовали стандартное лечение на соответствующих фермах. Антибиотики обычно также применяют спорадически при диарее, хромоте, респираторных симптомах у поросят и во многих других случаях ежедневно без подробного установленного протокола.

Примеры

Пример 1 А: Источник штаммов

Бактериальные штаммы были выделены и идентифицированы следующим образом.

Бактериальные штаммы СЕСТ 8163 (AqSyn04), СЕСТ 8165 (AqSyn06), СЕСТ 8164 (AqSyn09) и СЕСТ 8166 (AqSyn10) были выделены из молозива свиноматок и образцов мекония новорожденных поросят. Отбор проб проходил на свинофермах с высоким санитарным качеством в Испании.

Образцы выращивали в аэробных и анаэробных условиях в чашках с агаром De Man, Rogosa, Sharpe (МРС) в течение 24 часов при 37°С, и выделяли грамположительные, каталазоотрицательные колонии различной морфологии. Все колонии принадлежали к бактериальным штаммам. Точнее говоря, был выделен 61 различный бактериальный штамм. Каждый бактериальный штамм амплифицировали путем ПЦР с использованием ПЦР-праймеров на спейсерную область 16S/23S рРНК, как описано у Бертье и Эрлиха, 1998 (Berthier and Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.)

После амплификации и электрофореза явно различимые полосы очищали и секвенировали. Различные ПЦР профили показаны на фигуре 1. Посредством секвенирования штаммов были определены несколько видов бактерий.

1.1 Характеристика штаммов

Не желая привязываться к конкретной теории, авторы утверждают, что могут существовать значительные штаммовые отличия. Для того, чтобы дифференцировать штаммы одного и того же вида был выполнен API 50 СН тест (BIOMERIEUX, REF 50 300) согласно инструкциям изготовителя для того, чтобы описать профили ферментации углеводных субстратов, данный тест подтверждает различия между штаммами одного и того же вида.

Среди 61 штамма обнаружили 10 различных групп по профилям ферментации углеводов, подтверждающих присутствие 10 различных штаммов. Один штамм из каждой группы брали в качестве образца и использовали в следующих способах in vitro.

10 штаммов принадлежали к видам Lactobacillus reuteri и Enterococcus faecium.

1. Lactobacillus reuteri

2. Lactobacillus reuteri

3. Lactobacillus reuteri

4. Lactobacillus reuteri (AqSyn04)

5. Lactobacillus reuteri

6. Lactobacillus reuteri (AqSyn06)

7. Enterococcus faecium

8. Enterococcus faecium

9. Enterococcus faecium (AqSyn09)

10. Enterococcus faecium (AqSyn10)

Данные 10 штаммов дополнительно исследовали с целью проверки их возможного применения для улучшения здоровья животного (в частности свиньи), см. следующий раздел 1.2).

1.2 Отбор штаммов

Дополнительно тестировали 10 штаммов, определенных, как описано в разделе 1.1. Было высказано предположение, что комбинация антибактериальных критериев и критериев устойчивости могла бы помочь найти подходящие штаммы среди ранее указанных штаммов. Таким образом, каждый из штаммов отдельно был подвергнут каждому из тестов а.-с., описанных выше в разделе "In vitro тесты для отбора".

Усердная работа авторов настоящего изобретения показала, что критерии а.-с., описанные выше в разделе "In vitro тесты для отбора", являются подходящими для идентификации штаммов, подходящих для настоящего изобретения. Таким образом, штаммы были проверяли в соответствии с указанными критериями а.-с. С помощью тестов in vitro были обнаружены четыре штамма с особенно полезными свойствами. Результаты приведены ниже.

Как можно увидеть из таблицы выше, после указанных тестов in vitro были идентифицированы четыре штамма (два Lactobacillus reuteri (AqSyn04, AqSyn06) и два Enterococcus faecium (AqSyn09, AqSyn10). [Результаты для остальных 6 штаммов, т.е. для тех штаммов, которые не отвечают по меньшей мере одному из критериев а.-с., не показаны в приведенной выше таблице].

Композиция из этих штаммов была получена, как описано в примере 2А.

Пример 1В: Источник штаммов

Бактериальные штаммы были выделены и идентифицированы следующим образом.

Бактериальные штаммы СЕСТ 8347 (AqSynJ12), СЕСТ 8348 (AqSynJ17), СЕСТ 8349 (AqSynJ55) и СЕСТ 8350 (AqSynJ59) были получены из смывов со стенки кишечника дикого кабана.

Образцы выращивали в аэробных и анаэробных условиях в чашках с агаром De Man, Rogosa, Sharpe (МРС) в течение 24 часов при 37°С, и выделяли грамположительные, каталазоотрицательные колонии различной морфологии. Все колонии принадлежали к бактериальным штаммам. Точнее, выделили 61 различный бактериальный штамм. Каждый бактериальный штамм амплифицировали путем ПЦР с использованием ПЦР-праймеров на спейсерную область 16S/23S рРНК, как описано Бертье и Эрлих, 1998 (Berthier and Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106.)

После проведения амплификации и электрофореза хорошо дифференцированные полосы очищали и секвенировали. В результате секвенирования штаммы были отнесены к нескольким видам бактерий.

1.1 Характеристика и отбор штаммов

1. Lactobacillus fermentum (AqSynJ12)

2. Lactobacillus reuteri (AqSynJI7)

3. Lactobacillus mucosae (AqSynJ55)

4. Lactobacillus plantarum (AqSynJ59)

In vitro тесты по следующим критериям а.-с., описанным выше в разделе "In vitro тесты для отбора», выявили четыре штамма с особенно полезными свойствами. Результаты приведены ниже.

Как можно видеть из таблицы выше, штаммы, выделенные из диких кабанов, соответствуют критериям отбора. Кроме того, определенные выше штаммы не обладают устойчивостью к антибиотикам.

In vitro тест на минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), направленный на оценку устойчивости к антибиотикам, проводили для всех указанных штаммов. Оценивали следующие антибиотики:

ампициллин, ванкомицин, гентамицин, канамицин, стрептомицин, эритромицин, клиндамицин, тетрациклин и хлорамфеникол.

Микробиологические пороговые значения, которые применяли для оценки устойчивости штаммов к антибиотикам согласно настоящему изобретению, представляют собой микробиологические пороговые значения, определенные в «Рекомендациях EFSA по оценке чувствительности бактерий к антибиотикам, имеющим медицинское и ветеринарное значение» (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy. EFSA Journal 2012; 10(6): 2740).

Композицию из жэтих штаммов готовили из них как это описано в примере 2В (композиции D и Е).

Пример 2А: Получение пробиотической композиции согласно настоящему изобретению и синбиотической композиции согласно настоящему изобретению

Каждый из штаммов AqSyn04, AqSyn06, AqSyn09, AqSyn10 выращивали в культуре в жидкой среде МРС путем ферментации, собирали и лиофилизировали. Жизнеспособность конечного продукта проверяли путем подсчета колоний. Готовили композиции, содержащие все четыре этих штамма с необязательным добавлением пребиотических соединений. Готовили следующие композиции:

Композиция А: (2,5×10⁸ KOE каждого штамма в 2 мл)

Все штаммы использовал в лиофилизированной форме. Композицию А можно рассматривать как пробиотик.

Композиция В: (2,5×10⁸ KOE каждого штамма в 2 мл)

Все штаммы использовали в лиофилизированной форме. Композицию В можно рассматривать как синбиотик.

Затем готовили композицию С, которая содержала только три из четырех бактериальных штаммов (AqSyn04, AqSyn09, AqSyn10), следующим образом.

Композиция С: (3,3×10⁸ KOE каждого штамма в 2 мл)

Все штаммы использовали в лиофилизированной форме. Композицию С можно рассматривать как синбиотик.

Композиции готовили путем смешивания одинаковых количеств бактерий (как определенных путем подсчета колоний (соответствующие значения в г указаны выше) каждого штамма, включаемого в композицию, добавляли указанные дополнительные ингредиенты (например композиция В, композиция С) и полученную таким образом соответствующую композицию регидратировали изотоническим солевым раствором таким образом, чтобы полученная конечная композиция содержал 10⁹ KOE (совокупность всех штаммов, содержащихся в композиции) в 2 мл дозы.

Пример 2В: Получение пробиотической композиции согласно настоящему изобретению и синбиотической композиции согласно настоящему изобретению

Каждый из штаммов AqSynJ12, AqSynJ17, AqSynJ55, AqSynJ59 выращивали посредством ферментации в культуре в жидкой среде МРС, собирали и лиофилизировали. Жизнеспособность конечного продукта проверяли путем подсчета колоний Готовили композиции, содержащие все четыре данных штамма с необязательным добавлением пребиотических соединений. Были получены следующие композиции:

Композиция D: (2,5×10⁸ KOE каждого штамма в 2 мл)

Все штаммы использовали в лиофилизированной форме. Композицию D можно рассматривать как пробиотик.

Композиция Е: (2,5×10⁸ KOE каждого штамма в 2 мл)

Все штаммы использовали в лиофилизированной форме. Композицию Е можно рассматривать как синбиотик.

Пример 3: введение поросятам без применения антибиотиков (первое доказательство концепции)

Первую проверку концепции осуществляли на свиноводческой ферме рядом с фермой, расположенной в провинции Самора (Испания), с 2400 свиноматками и хроническими проблемами, связанными с диареей, у новорожденных поросят. Семь пометов (78 поросят) получали композицию А (см. пример 2А), и другие семь пометов (81 поросенок) держали в качестве контроля следующим образом.

Поросята, которым вводили композицию А, получали одну дозу (см. пример 2А) ежедневно с рождения до 14-го дня жизни без лечения антибиотиками.

Лечение в контрольной группе состояло во внутримышечном введении 1 мл коммерческого продукта, содержащего 150 мг амоксициллина и 40000 ME гентамицина. Поросята, страдающие диареей, в данной группе получали указанное лечение один раз в день в те дни, когда у них была диарея.

Результаты этой первой проверки концепции оказались весьма примечательными, демонстрируя неожиданную эффективность лечения согласно настоящему изобретению. Ввиду этих результатов изобретатели предположили, что имеет место не только ожидаемое воздействие на патогенную флору, но также стимуляция естественной иммунной системы поросят. Не желая быть связанными какой-либо теорией, можно предположить, что вводимая композиция оказывала прямое действие на патогены желудочно-кишечного тракта и возможно на естественный ответ поросят, направленный против этих пищеварительных инфекций.

Пример 4: введение поросятам в различных режимах дозирования (вторая проверка концепции)

Этот эксперимент проводили в Самора (Испания) на той же ферме, что и в примере 3. Вкратце, изобретатели стремились продемонстрировать влияние композиции А на врожденную иммунную систему новорожденных поросят. Также исследовали введение композиции на разных стадиях раннего периода жизни поросят. Полагают, что в раннем периоде жизни поросят флора у животных еще не созревает.

Композицию А давали семи пометам (65 поросят) в день рождения, вторая группа из семи пометов (84 поросенка) получала композицию А в первый и второй дни жизни (при любом применении антибиотиков), а третья группа из семи пометов (80 поросят) использовалась в качестве контроля, как в примере 3. Важно отметить, что только контрольная группа получала лечение антибиотиками, в то время как к группам, получавшим композицию А, не применяли никакого лечения антибиотиками. Изобретатели показали, что может быть достигнут набор веса, близкий к набору веса в контрольной группе.

Результаты показывают, что введение двух доз полезно. В частности, двухкратное введение на очень ранних стадиях после рождения поросят может защитить животных от заболеваний органов пищеварения без применения антибиотиков, и смертность может быть снижена.

Кроме того, важным наблюдением на данном этапе является то, что введение исследуемого пробиотика по меньшей мере столь же эффективно, как и лечение антибиотиками с точки зрения продуктивности.

Пример 5: введение поросятам и влияние на иммунную систему (третья проверка концепции)

Третью проверку концепции проводили на ферме, расположенной в провинции Мурсия. На ферме было 2400 свиноматок, и проблемы с диареей у поросят сразу после рождения. Было установлено, что данные проблемы с пищеварением вызваны Escherichia coli и Clostridium difficile.

Обычное лечение поросят на этой ферме (контрольные поросята в данном эксперименте) состояло в инъекции 100 мг тулатромицина сразу после рождения. После этого поросят, у которых была диарея, в период лактации также лечили перорально спирамицином (25 мг/кг живой массы) и колистином (5 мг/кг живой массы) один раз в день в те дни, когда они страдали диареей.

В данном эксперименте композицию А вводили дважды 29 пометам, т.е. (1) сразу же после рождения и (2) на второй день жизни, без лечения антибиотиками. 34 помета содержали в соответствии с обычными процедурами на этой ферме.

Эта проверка концепции подтверждает возможность улучшения лечения ранних расстройств пищеварения у новорожденных поросят, в частности, без применения антибиотиков.

Пример 6: введение поросятам и влияние на иммунную систему (четвертая проверка концепции)

Следующая проверка концепции была направлено на проверку эффективности продукта при рутинном применении на ферме. Указанный эксперимент проводили в регионе Уэска на ферме с 5500 свиноматками. По логистическим причинам не было возможности вести контрольную группу. Композицию В давали всем поросятам, родившимся в определенную неделю (13-ая неделя 2012 года), сравнивая показатели продуктивности с показателями недели до и после эксперимента. На данной ферме обычное лечение поросят с диареей состояло во введении по 1 мл в день коммерческого продукта, содержащего 100 мг ампициллина и 250000 ME колистиметата натрия, в течение трех дней

(А) Случаи диареи наблюдали у 80% первородящих свиноматок (как обычно без лечения композицией В) и у некоторых повторнородящих свиноматок Поросятам было от 3 до 5 дней. Все случаи диареи прошли без лечения антибиотиками.

Результаты, полученные авторами изобретения, подтвердили полезный эффект от применения продуктов и композиций согласно настоящему изобретению. Процент смертности был заметно ниже, чем в другие недели при обычном лечении только антибиотиками.

Пример 7:

Эксперименты in vivo с композицией Е были проведены на ферме в Сарагосе (Испания) с 1200 многоплодными матками (в среднем по 14 поросят, родившихся живыми, на роды) и 56 опоросами за неделю (784 поросят в неделю), задачей которой является доращивать поросят до 20 кг, а затем поставлять их на другие фермы, причем на этой ферме периодически возникают проблемы с диареей в период лактационной фазы у поросят в возрасте меньше 1 недели жизни. Фермер содержал поросят стандартным образом и вводил продукт (указанную выше композицию Е) при рождении и на второй день жизни поросятам всех пометов. Результаты лечения композицией Е были сходны с полученными результатами для композиций А, В и С.

1. Применение одного или более штаммов бактерий, где каждый штамм бактерий выбран из группы, состоящей из:

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8163 (AqSyn04);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8165 (AqSyn06);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8164 (AqSyn09);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8166 (AqSyn10);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8347 (AqSynJ12);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8348 (AqSynJ17);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8349 (AqSynJ55); и

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59),

для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, путем введения композиции, содержащей один или более из указанных штаммов, указанному млекопитающему в течение первых 14 дней после рождения.

2. Применение по п. 1, где диарея вызвана бактериальной инфекцией.

3. Применение по п. 1, где млекопитающее представляет собой животное подотряда нежвачные (Suina), собак, кошек, лошадей, крупный рогатый скот, птицу, овец или коз, причем в предпочтительном варианте млекопитающее представляет собой поросенка или собаку.

4. Применение по п. 1, где каждый штамм способен сохранять, по существу, одинаковую жизнеспособность в течение 3 часов инкубации при рН 3,5.

5. Применение по п. 1, где каждый штамм способен сохранять, по существу, одинаковую жизнеспособность в течение 4 часов инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи.

6. Применение по любому из пп. 1-5, где композицию вводят в течение первых 7 дней после рождения, предпочтительно в течение первых 2 дней после рождения.

7. Применение по любому из пп. 1-5, где каждый штамм обладает по меньшей мере одной из следующих противомикробных активностей, о чем свидетельствуют зоны ингибирования, определенные в анализе «пятна на газоне»: (i) зона ингибирования 10 мм или более для Salmonella, (ii) зона ингибирования 10 мм или более для Listeria monocytogenes, (iii) зона ингибирования 10 мм или более для Staphyloccocus aureus, (iv) зона ингибирования 10 мм или более для Escherichia coli.

8. Применение по любому из пп. 1-5, где по меньшей мере один штамм и предпочтительно все штаммы не обладают устойчивостью к антибиотикам.

9. Применение по любому из пп. 1-5, где композиция содержит по меньшей мере два штамма молочнокислых бактерий, выбранные из следующих штаммов:

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8163 (AqSyn04);

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8165 (AqSyn06);

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8164 (AqSyn09); и

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8166 (AqSyn10);

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8347 (AqSynJ12);

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8348 (AqSynJ17);

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8349 (AqSynJ55); и

штамм, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59).

10. Применение по любому из пп. 1-5, где указанная композиция содержит по меньшей мере один пребиотический продукт, где по меньшей мере один пребиотический продукт представляет собой продукт, предпочтительно выбранный из следующих соединений и композиций: бета-глюканов, маннан-олигосахаридов, инулина, олигофруктозы, галактоолигосахаридов (ГОС), лактулозы, лактосахарозы, галактотриозы, фруктоолигосахарида (ФОС), целлобиозы, целлодекстринов, циклодекстринов, мальтитола, лактитола, гликозилсахарозы, витамина Е или его модификации (где модификации выбраны из альфа-, бета-, гамма-, дельта-токоферолов, токотриенолов и токомоноенолов), при этом маннан-олигосахариды и/или инулин предпочтительны.

11. Применение по любому из пп. 1-5, где композиция предназначена для перорального введения.

12. Применение по любому из пп. 1-5, где диарея вызвана бактериальной инфекцией, такая как диарея, вызванная бактериальными инфекциями (включая колибациллез), ассоциированная с Clostridium difficile диарея новорожденных, диарея, вызванная Clostridium perfringens типов А и С.

13. Применение по любому из пп. 1-5, где каждый штамм соответствует по меньшей мере одному из следующих условий:

обладает всеми из следующих антимикробных активностей, о чем свидетельствуют зоны ингибирования, определенные в анализе «пятна на газоне»: (i) зона ингибирования 10 мм или более для Salmonella, (ii) зона ингибирования 10 мм или более для Listeria monocytogenes, (iii) зона ингибирования 10 мм или более для Staphylococcus aureus, (iv) зона ингибирования 10 мм или более для Escherichia coli;

способен сохранять, по существу, одинаковую жизнеспособность в течение 3 часов инкубации при рН 3,5 и

способен сохранять, по существу, одинаковую жизнеспособность в течение 4 часов инкубации в присутствии 0,45% экстракта желчи.

14. Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8163 (AqSyn04).

15. Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8165 (AqSyn06).

16. Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8164 (AqSyn09).

17 Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8166 (AqSyn10).

18. Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8347 (AqSynJ12).

19. Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8348 (AqSynJ17).

20. Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8349 (AqSynJ55).

21. Штамм молочнокислой бактерии для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, депонированный в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59).

22. Композиция для лечения или предотвращения диареи у новорожденного млекопитающего, не являющегося человеком, причем указанная композиция содержит по меньшей мере один штамм бактерий в количестве 10⁷ КОЭ на дозу или больше, где каждый штамм бактерий выбран из группы, состоящей из:

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8163 (AqSyn04);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8165 (AqSyn06);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8164 (AqSyn09);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8166 (AqSyn10);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8347 (AqSynJ12);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8348 (AqSynJ17);

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8349 (AqSynJ55); и

штамма, депонированного в Испанской коллекции типовых культур с депозитарным номером СЕСТ 8350 (AqSynJ59).

23. Композиция по п. 22, дополнительно содержащая по меньшей мере один пребиотический продукт, где по меньшей мере один пребиотический продукт представляет собой продукт, предпочтительно выбранный из следующих соединений и композиций: бета-глюканов, маннан-олигосахаридов, инулина, олигофруктозы, галактоолигосахаридов (ГОС), лактулозы, лактосахарозы, галактотриозы, фруктоолигосахарида (ФОС), целлобиозы, целлодекстринов, циклодекстринов, мальтитола, лактитола, гликозилсахарозы, витамина Е или его модификации (где модификации выбраны из альфа-, бета-, гамма-, дельта-токоферолов, токотриенолов и токомоноенолов), при этом маннан-олигосахариды и/или инулин предпочтительны.

24. Композиция по любому из пп. 22-23, характеризующаяся тем, что млекопитающее представляет собой домашнее животное и более предпочтительно свинью.