Коллагеновая губка



Коллагеновая губка
Коллагеновая губка

Владельцы патента RU 2672593:

ГАЙСТЛИХ ФАРМА АГ (CH)

Группа изобретений относится к хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, в частности к эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губке, предназначенной для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта. Губка содержит 60-96% (мас./мас.) коллагена и 4-40% (мас./мас.) эластина, которая по данным ртутной порометрии содержит взаимосвязанные поры, обладающие средним диаметром, равным от 50 до 90 мкм, и составляющей не менее 80% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм, температурой начала, равной от 45 до 57°С, и плотностью в сухом состоянии, равной от 50 до 65 мг/см3. Также раскрыт способ получения коллагеновой губки и её применение в качестве имплантата в полости рта. Группа изобретений обеспечивает регенеративное коллагеновое устройство, которое является биологически совместимым, рассасывающимся in vivo, хорошо встраивается в ткань, так чтобы обеспечивать неосложненное излечивание и способно выдерживать воздействие механических сил, действуя как каркас, который сохраняет объем ткани в течение достаточного времени во время заживления раны после имплантации. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 пр.

 

Настоящее изобретение относится к новой эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губке, предназначенной для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта, к способу получения этой эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки и к ее применению в качестве имплантата в полости рта для увеличения объема мягких тканей.

Увеличение объема мягких тканей стало одной их важных задач в хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Для улучшения и функциональных, и эстетических результатов с помощью увеличения объема мягких тканей трансплантаты аутогенной ткани, такие как трансплантат пришеечной части десны (ТПД) или трансплантат субэпителиальной соединительной ткани (ТССТ), несмотря на их недостатки, все еще широко используются при различных показаниях и считаются "золотым стандартом" (F. Cairo et al., 2008, J. Clin. Periodontol. 35 (Suppl. 8), 314-319; R. Jung et al., 2004, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 24(6), 545-553 и D. Thoma, 2009, Clin. Oral Implants Res. 20 (suppl. 4), 146-165). Однако процедура отбора аутогенной ткани со второго участка операции, обычно с неба, обладает недостатками с точки зрения пациента и ограничениями по качеству и количеству ткани, которую можно отобрать.

Таким образом, желательно регенеративное устройство, предназначенное для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта.

На десневые клетки соединительной ткани полости рта во время жевания, глотания, перемещения языка, разговора, движения зубов и ортодонтического лечения действуют сложные механические силы. В частности, во время заживления ран после хирургического вмешательства могут возникать внутренние и внешние силы, оказывающие давление на регенеративное устройство и вновь образовавшуюся ткань.

Для использования в полости рта с целью увеличения объема мягких тканей регенеративное устройство должно соответствовать некоторым требованиям: оно должно быть биологически совместимым, рассасывающимся in vivo, обеспечивать рост десен, хорошо встраиваться в ткань, так чтобы обеспечивать неосложненное излечивание (без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба), и способным выдерживать воздействие механических сил, действуя, как каркас, который сохраняет объем ткани в течение достаточного времени во время заживления раны после имплантации, обычно в течение не менее примерно 3 месяцев.

В предшествующем уровне техники не раскрыто такое регенеративное устройство.

В публикации Н. Mathes et al. в "A Bioreactor Test System to mimic the Biological and Mechanical Environment of Oral Soft Tissues and to Evaluate Substitutes for Connective Tissue Gafts", 2010, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 107, No. 6, страницы 1029-39, раскрыто, что такие характеристики регенеративного устройства, состоящего из коллагеновой губки, можно обеспечить путем придания жесткости матричному каркасу посредством сшивки коллагеновых волокон в такой степени, которая обеспечивает надлежащий баланс между механической стабильностью (высокая степень сшивки) и неосложненным заживлением мягких тканей (низкая степень сшивки), но совершенно не указано, как изготовить такую коллагеновую губку. В публикации раскрыто, что три разных прототипа коллагеновой губки, состоящие из коллагена свиньи типов I и III при среднем диаметре пор, равном 92 мкм, пористости в 93%, и различающиеся по степени сшивки (прототипы предоставлены фирмой Geistlich Pharma, Wolhusen, Switzerland) после выращивания в течение 14 дней при механическом стимулировании характеризовались хорошим сохранением объема при хорошей жизнеспособности фибробластов.

В публикации DS Thoma et al. в "Soft tissue volume augmentation by the use of collagen-based matrixes: a volumetric analysis", 2010, J. of Clin. Periodontology 37, 659-666, и "Soft tissue volume augmentation by the use of collagen-based matrixes in a dog mandible - a histological analysis", 2011, J. Clin. Periodontol.: 38:1063-1070, раскрыто, что один из прототипов коллагеновой губки, указанный в цитированной выше публикации Н. Mathes et al., после встраивания в течение 28 или 84 дне при хроническом поражении альвеолярного отростка нижней челюсти собаки характеризовался таким же сохранением объема, как в случае "золотого стандарта", ТССТ (трансплантат субэпителиальной соединительной ткани).

В публикации B. Hafemann et al. в Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 12 (2001) 437-446, раскрыто применение карбодиимида (ЭДК) (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) вместе с N-гидроксисукцинимидом для увеличения устойчивости против ферментативной деградации ксеногенной мембраны, состоящей из обработанного нативного коллагена и эластина свиного происхождения предназначенной для использования в качестве образца для образования новой кожи.

В предшествующем уровне техники не раскрыто или не высказано предположения о том, каковы характеристики такого прототипа химически сшитой коллагеновой губки или любого другого регенеративного коллагенового устройства, удовлетворяющего указанным выше требованиям для использования в полости рта для увеличения объема мягких тканей, или как можно изготовить такое устройство.

В ЕР-1561480 раскрыто рассасывающееся коллагеновое устройство, предназначенное для использования в качестве заменителя растущей менингеальной ткани, содержащее химически сшитый коллаген лист, большинство пор которого обладает диаметром, меньшим 10 мкм, и способ изготовления этого коллагенового устройства, включающий стадии смешивания коллагена с водой при таких условиях, чтобы смесь содержала в основном солюбилизированный коллаген, лиофилизации смеси с получением коллагенового устройства и химической сшивки коллагенового устройства с использованием формальдегида или глутарового альдегида в качестве сшивающего реагента. В отличие от регенеративного устройства, предназначенного для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта, на заменитель менингеальной ткани во время заживления раны не действует давление, оказываемое указанными выше сложными механическими силами.

В US-2004-0265785 описан способ изготовления коллаген-эластиновой мембраны, содержащей не менее 20% (мас./мас.) эластина, включающий стадии проводимого сначала химического удаления сопутствующих гидрофобных веществ из содержащего эластин коллагенового материала природного происхождения и последующего химического удаления негидрофобных веществ. Коллаген-эластиновый продукт не является химически сшитым.

В публикации Boekema B.K.L.H. et al., 2014, Journal of Material Sciences: Materials in Medicine, February 2014 25: 423-433, описано влияние на заживление раны размера пор и сшивки коллаген-эластинового каркаса, использующегося в качестве заменителей кожи. Раскрытые химически сшитые каркасы ЭДК-NHS содержат 10-15% эластина, обладают порами размером от 80 до 120 мкм и температурой денатурации, равной от 64 до 69°С (см. таблицу 1, стр. 425 в указанной публикации). Их стерилизуют путем обработки газообразным этиленоксидом. Авторы публикации пришли к выводу о том, что сшивка неблагоприятно влияет на некоторые важные характеристики заживления ран, в частности, посредством уменьшения способности фибробластов к пролиферации и замещения заменителя кожи новой тканью. На заменитель кожи, в отличие от регенеративного устройства, предназначенного для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта, во время заживления раны не действует давление, оказываемое указанными выше сложными механическими силами.

Задачей или целью настоящего изобретения является разработка регенеративного коллагенового устройства, предназначенного для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта, которое является биологически совместимым, рассасывающимся in vivo, обеспечивает врастание в десну, хорошо встраивается в ткань, так чтобы обеспечивать неосложненное излечивание (без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба) и способно выдерживать воздействие механических сил, действуя, как каркас, который сохраняет объем ткани в течение достаточного времени во время заживления раны после имплантации, обычно в течение не менее примерно 3 месяцев.

Указанная задача решена с помощью настоящего изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.

Настоящее изобретение относится к эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губке, предназначенной для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта, содержащей 60-96% (мас./мас.) коллагена и 4-40% (мас./мас.) эластина, которая по данным ртутной порометрии содержит взаимосвязанные поры, обладающие средним диаметром, равным от 50 до 90 мкм, и составляющей не менее 80% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм, температурой начала, равной от 45 до 57°С, и плотностью в сухом состоянии, равной от 50 до 65 мг/см3.

Химически сшитая коллагеновая губка содержит 60-96% (мас./мас.) коллагена и 4-40% (мас./мас.) эластина. Содержание эластина измеряют путем определения количества десмозина/изодесмозина по модификации известной методики, включающей гидролиз и исследование с помощью ОФ-ВЭЖХ (высокоэффективная хроматография с обращенной фазой) (см., например, Guida Е. et al. 1990 Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues in Journal of Chromatography или Rodriguqe P 2008 Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development в The Open Respiratory Medicine Journal). Для определения содержания десмозина/изодесмозина в сухом эластине эластин губки выделяют по методикам, описанным в публикации Starcher and Galione 1976 Purification and Comparison of Elastin from Different Animal Species в Analytical Biochemistry.

Эту губку предпочтительно образовывать из тканей природного происхождения, которые обладают такими относительными содержаниями коллагена и эластина. Примеры таких тканей включают взятые у млекопитающего (например, свиньи или крупного рогатого скота) брюшинную или перикардиальную мембрану, плацентарную мембрану, подслизистую основу тонкой кишки (ПТК) и дерму. Обычно коллаген преимущественно представляет собой коллаген типа I, коллаген типа III или их смесь. Коллаген также может включать заметную часть коллагена типа II, типа IV, типа VI или типа VIII или любую комбинацию этих или любых типов коллагена.

Термин "коллаген" при использовании в настоящей заявке обычно означает комбинацию, содержащую 60-96% (мас./мас.) коллагена и 4-40% (мас./мас.) эластина.

Предпочтительно, если химически сшитая коллагеновая губка содержит 70-90% (мас./мас.) коллагена и 10-30% (мас./мас.) эластина.

Примером исходного вещества, подходящего для изготовления такой химически сшитой коллагеновой губки является суспензия коллагеновых волокон из мембраны, полученной из брюшины свиньи или крупного рогатого скота, по методике, сходной с описанной в "примере" в ЕР-В1-1676592, или из мембраны Geistlich Bio-Gide® (выпускающейся фирмой Geistlich Pharma A.G., Switzerland), полученной из брюшины свиньи по очень сходной методике, и/или суспензия коллагеновых волокон, полученная из дермы свиньи по методике, сходной с описанной в примере 7 в WO 2012/084214.

Указанная выше эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка стимулирует увеличение объема мягких тканей в области рта путем содействия врастанию десневых клеток при сохранении объема после приложения или снятия механических нагрузок.

Для содействия врастанию десневых клеток химически сшитая коллагеновая губка должна обладать высокой пористостью (объемной долей пор) с диапазоном диаметров пор, подходящим для роста десневых фибробластов. Согласно изобретению было установлено, что это врастание эффективно стимулируется, когда губка по данным ртутной порометрии содержит взаимосвязанные поры, обладающие средним диаметром, равным от 50 до 90 мкм, и составляющей не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм. Химически сшитую губку с таким распределением пор по размерам предпочтительно изготавливают способом, включающим смешивание до сшивки в подходящих соотношениях суспензии коллагеновых волокон из мембраны, полученной из брюшины свиньи или крупного рогатого скота, раскрытой в предыдущем абзаце, и суспензии коллагеновых волокон, полученной из дермы свиньи, раскрытой в предыдущем абзаце.

Термин "эластичная" в настоящем изобретении означает, что химически сшитая коллагеновая губка устойчива к действию давления, т.е. способна восстанавливать значительную часть своего исходного объема после воздействия давления in vitro или in vivo.

Для сохранения объема в области рта эластичная рассасывающаяся химически сшитая губка должна быть способна выдерживать воздействие механических сил, вызванное жеванием, перемещением языка, разговором, движением зубов, действуя, как каркас, который сохраняет объем ткани в течение достаточного времени во время излечивания после имплантации, обычно в течение не менее примерно 3 месяцев. I Согласно изобретению было установлено, что это наблюдающееся in vivo эластичное поведение имплантата обеспечивается, когда по данным проводимого in vitro механического исследования путем циклического сжатия при температуре, равной 37°С, коллагеновой губки, увлажненной забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФФ), предназначенным для имитации жидкостей организма, восстановление толщины по сравнению с исходной толщиной составляет не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, или восстановление гистерезиса по сравнению наблюдающимся при первой нагрузке составляет менее 55%, предпочтительно менее 45%, после 49 циклов сжатия при давлении, равном 12,1 кПа.

Согласно изобретению было установлено, что указанное выше in vitro восстановление толщины, составляющее не менее 70%, и восстановление гистерезиса, составляющее менее 55%, в сочетании с излечиванием in vivo без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба обеспечивается, когда губка обладает температурой начала, равной от 45 до 57°С, и плотностью в сухом состоянии, равной от 50 до 65 мг/см3.

Температуру начала измеряют с помощью проводимого с помощью ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) коллагеновой губки, увлажненной буферным раствором, соответствующим стандарту USP (Фармакопея США): Ph. Eur. 2.2.34, USP <891> (состав буфера на 1 л воды: 8 г хлорида натрия, 0,2 г фосфата калия, 1,15 г фосфата натрия и 0,2 г хлорида калия; начальная температура 15°С, конечная температура 90°С, скорость нагрева 5°С/мин). Этот параметр характеризует степень сшивки губки. Температура начала тесно связана со стойкостью губки по отношению к циклическому сжатию in vitro (восстановление толщины или восстановление гистерезиса при механическом исследовании циклического сжатия), эластичностью in vivo (сохранение в течение достаточного времени объема ткани во время излечивания после имплантации) и хорошим встраиванием в окружающие ткани (без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба).

Необходимая стойкость по отношению к циклическому сжатию in vitro и эластичность in vivo в сочетании с излечиванием in vivo без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба можно обеспечить, когда температура начала равна от 45 до 57°С, предпочтительно от 46 до 53°С. Когда температура начала ниже 46°С, стойкость по отношению к циклическому сжатию in vitro и эластичность in vivo могут быть недостаточными. Когда температура начала выше 57°С, существует значительная опасность побочных эффектов, таких как чрезмерное воспаление и/или частичное обнажение пришеечного участка корня зуба, проявляющихся после имплантации.

Плотность в сухом состоянии, измеренная путем взвешивания и измерения объема коллагеновой губки после значительной лиофилизации (как подробно описано ниже), является другим важным параметром для обеспечения необходимой стойкости по отношению к циклическому сжатию in vitro и эластичности in vivo в сочетании с излечиванием in vivo без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба. Эти характеристики можно обеспечить, когда плотность в сухом состоянии равна от 50 до 65, предпочтительно от 50 до 60 мг/см3. Если плотность в сухом состоянии меньше 50 мг/см3, то стойкость по отношению к циклическому сжатию in vitro и эластичность in vivo могут быть недостаточными. Если плотность в сухом состоянии больше 65 мг/см, существует опасность побочных эффектов, таких как чрезмерное воспаление или частичное обнажение пришеечного участка корня зуба, проявляющихся после имплантации.

Термин "рассасывающаяся" в настоящем изобретении означает, что химически сшитая коллагеновая губка способна в значительной мере рассасываться in vivo вследствие воздействия коллагеназ и эластаз. Регулируемая in vivo способность к рассасыванию химически сшитой коллагеновой губки существенна для излечивания без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба. Исследование ферментативного разложения с использованием коллагеназы Clostridium histolicum, подробно описанное ниже, обеспечивает превосходное прогнозирование рассасывания in vivo.

В этом исследовании во всех образцах эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки, предлагаемой в настоящем изобретении, которые in vivo характеризуются привлекательным сохранением объема и излечиванием без побочных эффектов, таких как чрезмерное воспаление или частичное обнажение пришеечного участка корня зуба, коллаген полностью разрушался за 3-5 ч.

Указанную выше эластичную рассасывающуюся химически сшитую коллагеновую губку предпочтительно изготавливать из тканей природного происхождения способом, включающим сушку вымораживанием и химическую сшивку. Подходящие ткани природного происхождения включают брюшинную или перикардиальную мембраны свиньи или крупного рогатого скота, плацентарную мембрану свиньи или крупного рогатого скота и ПТК или дерму свиньи или крупного рогатого скота. Предпочтительно, если ткани природного происхождения включают брюшинную мембрану свиньи или крупного рогатого скота и дерму свиньи. После указанного выше способа, включающего сушку вымораживанием и химическую сшивку обычно проводят стадию стерилизации, которая предпочтительно представляет собой стерилизацию γ-излучением или стерилизацию рентгеновским излучением.

Химическую сшивку можно провести с помощью любого фармацевтически приемлемого сшивающего реагента, способного обеспечить эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губке необходимое восстановление толщины по сравнению с начальной толщиной или восстановление гистерезиса по сравнению наблюдающимся при первой нагрузке при исследовании циклического сжатия. Такие подходящие сшивающие реагенты включают глутаровый альдегид, формальдегид, ацетальдегид, 1,4-бутандиглицидиловый эфир (БДДГЭ), N-сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат, гексаметилендиизоцианат (ГМДЦ), цианамид, дифенилфосфорилазид, генипин, ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) и смесь ЭДК и NHS (N-гидроксисукцинимид). В эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губке обычно можно обнаружить небольшие количества или следы непрореагировавшего сшивающего реагента или типичные продукты из прямой реакции.

Предпочтительно, если химическую сшивку проводят с использованием сшивающего реагента, выбранного из группы, включающей глутаровый альдегид, ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) и смесь ЭДК и NHS (N-гидроксисукцинимид). Привлекательные прототипы эластичных рассасывающихся химически сшитых коллагеновых губок, предлагаемых в настоящем изобретении, в действительности, были получены с использованием каждого из этих сшивающих реагентов.

Более 1000 различных прототипов коллагеновых губок были получены с использованием в качестве сшивающего реагента ЭДК или смеси ЭДК и NHS и изучены в различных исследованиях in vitro и/или исследованиях на животных in vivo, а именно на мышах, крысах, кроликах и собаках. Предпочтительно, если химическую сшивку проводят с использованием одного из этих двух сшивающих реагентов.

Эластичную рассасывающуюся коллагеновую губку, предлагаемую в настоящем изобретении, тщательно изучали с помощью следующих исследований:

- исследование на животных, включающее измерение увеличения объема слизистой оболочки путем имплантации при хроническом поражении нижней челюсти собаки по сравнению с "золотым стандартом" ТССТ (трансплантат субэпителиальной соединительной ткани), и

- клиническое исследование его функциональных характеристик и безопасности в процедурах увеличения объема тканей для увеличения толщины слизистой оболочки вокруг зубных имплантатов в полости рта по сравнению с "золотым стандартом" для увеличения объема мягких тканей ТССТ (трансплантат субэпителиальной соединительной ткани).

В обоих этих исследованиях эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка, предлагаемая в настоящем изобретении, через 3 месяца после имплантации характеризовалась превосходным встраиванием в окружающие ткани без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба, такой же безопасностью и таким же (т.е. статистически не отличающимся) сохранением объема мягких тканей, как ТССТ.

Указанную выше эластичную рассасывающуюся химически сшитую коллагеновую губку можно изготовить способом, включающим стадии: (а) проведение щелочной обработки брюшинной или перикардиальной мембраны свиньи или крупного рогатого скота в растворе гидроксида натрия при значении рН, превышающем 12, кислотной обработки в растворе хлористоводородной кислоты при значении рН, равном от 1 до 3, обезвоживающей обработки растворимым в воде органическим растворителем и обезжиривающей обработки органическим растворителем,

размол полученной сухой мембраны с помощью режущей мельницы, просеивание через сито с отверстиями размером 0,5-2 мм и суспендирование полученного порошка в подкисленном водном растворе, обладающем значением рН, равным от 2,5 до 3,5, с получением суспензии коллагеновых волокон, (b) проведение обезвоживающей обработки размолотой дермы свиньи или крупного рогатого скота растворимым в воде органическим растворителем, обезжиривающей обработки органическим растворителем, щелочной обработки сильным неорганическим основанием при значении рН, превышающем 12, кислотной обработки сильной неорганической кислотой при значении рН, равном от 0 до 1, промывки водой и суспендирования коллагеновых волокон, сушки вымораживанием, очистки высушенных коллагеновых волокон органическим растворителем и размола очищенных высушенных волокон в подкисленном растворе при значении рН, равном от 3 до 4, с получением суспензии коллагеновых волокон,

(c) смешивание от 3,5 до 4,5 частей суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (а), с 0,5-1,5 частями суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (b), с получением суспензии,

(d) сушку вымораживанием суспензии, полученной на стадии (с), и сшивку высушенного вымораживанием продукта в растворе, содержащем сшивающий реагент, промывку водой и сушку вымораживанием, и

(e) необязательно стерилизацию высушенного вымораживанием продукта, полученного на стадии (d), γ-излучением или рентгеновским излучением.

Стадию (а) можно провести способом, аналогичным описанному в "примере" в ЕР-В1-1676592 путем проведения для мембран брюшины молодых телят или поросят промывки водой, щелочной обработки 2% раствором гидроксида натрия, промывки водой, кислотной обработки в 0,5% растворе хлористоводородной кислоты, промывки водой до установления значения рН, равного 3,5, проведения усадки материала 7% солевым раствором, промывки водой, обезвоживания ацетоном и обезжиривания н-гексаном, размола полученной сухой мембраны с помощью режущей мельницы, просеивания через сито с отверстиями размером 0,5-2 мм и суспендирования полученного порошка в подкисленном водном растворе, обладающем значением рН, равным от 2,5 до 3,5, с получением суспензии коллагеновых волокон брюшины свиньи или крупного рогатого скота.

Стадию (а) обычно проводят путем размола стерильной мембраны Geistlich Bio-Gide® (полученной у фирмы Geistlich Pharma A.G., Switzerland) с помощью режущей мельницы, просеивания через сито с отверстиями размером 0,5-2 мм и суспендирования полученного порошка в подкисленном водном растворе, обладающем значением рН, равным от 2,5 до 3,5, с получением суспензии коллагеновых волокон брюшины свиньи.

Предпочтительно, если порошок, полученный после размола с помощью режущей мельницы, просеивают через сито с отверстиями размером 0,5-1 мм.

Стадию (b) можно провести способом, раскрытым в примере 7 в WO 2012/084214 путем проведения обезвоживающей обработки размолотой шкуры свиньи растворимым в воде органическим растворителем, таким как спирт или кетон, обезжиривающей обработки органическим растворителем, таким как дихлорэтан или метиленхлорид, щелочной обработки сильным неорганическим основанием при значении рН, превышающем 12, в течение от 6 до 24 ч, кислотной обработки сильной неорганической кислотой при значении рН, равном от 0 до 1, в течение от 1 до 12 ч, промывки водой и суспендирования коллагеновых волокон в присутствии регулятора набухания, сушки вымораживанием, очистки высушенных коллагеновых волокон различными органическими растворителями, такими как спирты, простые эфиры, кетоны и хлорированные углеводороды, и размола с помощью коллоидной мельницы очищенных высушенных волокон в подкисленном растворе при значении рН, равном от 3 до 4, с получением суспензии коллагеновых волокон дермы свиньи.

Содержание в (мас./мас.)% коллагена в суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (а), и содержание в (мас./мас.)% коллагена в суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (b), играет роль в установлении плотности в сухом состоянии эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки. В действительности, последняя может зависеть, с одной стороны, от содержания в (мас./мас.)% коллагена в приготовленной суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (с) путем смешивания от 1,5 до 4,5 частей суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (а), с 0,5-1,5 частями суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (b), и, с другой стороны, от условий проведения реакции сшивки на стадии (d).

Для обеспечения для эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки необходимой плотности в сухом состоянии, равной от 50 до 65 мг/см3, суспензия коллагеновых волокон, полученная на стадии (а), обычно содержит от 2,0 до 4,5, предпочтительно от 2,5 до 3,75 (мас./мас.)% коллагена и суспензия коллагеновых волокон, полученная на стадии (b), обычно содержит от 3,0 до 7,0, предпочтительно от 4,0 до 6,0 (мас./мас.)% коллагена.

Стадия (с) включает смешивание от 3,5 до 4,5 мас. част, суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (а), с 0,5-1,5 мас. част, суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (b), с получением суспензии.

Эта стадия смешивания в подходящих соотношениях двух разных суспензий коллагеновых волокон, полученных из разных тканей свиньи или крупного рогатого скота и подвергнутых различным обработкам, включая различные методики размола (использование режущей мельницы на стадии (а) и коллоидной мельницы на стадии (b)), с получением частиц коллагеновых волокон разных размеров, является удобной методикой обеспечения желательного распределения по размерам или спектра пор эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки, а именно, взаимосвязанных пор, обладающих средним диаметром, равным от 50 до 90 мкм, и составляющей не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм, определенной с помощью ртутной порометрии.

Полученная суспензия обычно содержит от 3,0 до 6,5 (мас./мас.)%, предпочтительно от 3,5 до 6,0 (мас./мас.)% коллагена.

Стадия (d) включает сушку вымораживанием суспензии, полученной на стадии (с), сшивку высушенного вымораживанием продукта в растворе, содержащем сшивающий реагент, промывку водой и сушку вымораживанием.

Сушку вымораживанием до и после стадии сшивки обычно проводят при температуре ниже - 10°С.

Сшивающий реагент предпочтительно выбран из группы, включающей глутаровый альдегид, ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) и смесь ЭДК и NHS (N-гидроксисукцинимид). Также можно использовать другие сшивающие реагенты, применяющиеся для сшивки коллагена, такие как формальдегид, ацетальдегид, 1,4-бутандиглицидиловый эфир (БДДГЭ), N-сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат, гексаметилендиизоцианат (ГМДЦ), цианамид, дифенилфосфорилазид или генипин.

Если сшивающим реагентом является глутаровый альдегид, губку, полученную после сушки вымораживанием, предпочтительно химически сшивают в фосфатном буферном растворе при значении рН, равном от 7,0 до 7,5, содержащем от 0,01 до 0,10%, предпочтительно от 0,04 до 0,06% глутарового альдегида. Химически сшитую губку можно последовательно промыть водой, 1-3 М раствором NaCl, 0,05-0,15 М раствором Na2HPO4 и водой, и затем высушить вымораживанием.

Если сшивающим реагентом является ЭДК, губку, полученную после сушки вымораживанием, предпочтительно сначала подвергают гидротермической обработке при температуре выше 110°С, затем химически сшивают в буферном растворе, содержащем 0,05-0,15 М МЭС (2-(N-морфолино)-этансульфоновая кислота) или 0,05-0,15 М уксусную кислоту и 2-20% (мас./мас.) спирта, выбранного из группы, включающей метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол и бутанол, с добавлением 0,03-0,80, предпочтительно 0,2-0,4 г ЭДК на 1 г коллагена, в течение от 1 до 8 ч. Отношение (мас./мас.) количества коллагена к количеству реакционной среды (указанный выше буферный раствор) обычно составляет от 1/10 до 1/100, предпочтительно от 1/20 до 1/50. Если спиртом является этанол, то он предпочтительно содержится в буферном растворе в количестве, равном 3-7% (мас./мас.). Химически сшитую коллагеновую губку можно сначала промыть 0,05-0,15 М раствором Na2HPO4, 0,5-3 М раствором NaCl, затем водой и затем высушить вымораживанием.

Если сшивающим реагентом является смесь ЭДК и NHS, губку, полученную после сушки вымораживанием, предпочтительно химически сшивают в буферном растворе, содержащем 0,1-0,3 М МЭС (2-N-морфолино)-этансульфоновая кислота) или 0,1-0,3 М уксусную кислоту и 10-70% (мас./мас.) спирта, выбранного из группы, включающей метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол и бутанол, с добавлением 0,01-0,60, предпочтительно 0,05-0,2 г ЭДК и 0,01-0,6, предпочтительно 0,05-0,2 г NHS, на 1 г коллагена, в течение от 1 до 8 ч. Отношение количества молей ЭДК к количеству молей NHS обычно составляет от 4 до 0,5, предпочтительно от 2 до 1. Отношение (мас./мас.) количества коллагена к количеству реакционной среды (указанный выше буферный раствор) обычно составляет от 1/10 до 1/100, предпочтительно от 1/20 до 1/50. Если спиртом является этанол, то он предпочтительно содержится в буферном растворе в количестве, равном 40-60% (мас./мас.). Химически сшитую коллагеновую губку можно сначала промыть 0,05-0,15 М раствором Na2HPO4, затем водой и затем высушить вымораживанием.

Для каждой смеси суспензий коллагеновых волокон, полученной на стадии (с), специалист в данной области техники на основании данных, приведенных в настоящей заявке, с использованием только общедоступных сведении в известном уровне техники и стандартных экспериментов может определить сшивающий реагент и условия сшивки, чтобы изготовить эластичную рассасывающуюся химически сшитую коллагеновую губку, предлагаемую в настоящем изобретении, обладающую заданными температурой начала и плотностью в сухом состоянии.

Для суспензий коллаген, содержащих от 3,0 до 6,5 (мас./мас.)% коллагена, на основании стандартных экспериментов было установлено, например, следующее:

- Если сшивающим реагентом является ЭДК:

- температура начала повышается при увеличении концентрации ЭДК в буферном растворе, отношения количества ЭДК к количеству коллагена, отношения (мас./мас.) количества реакционной среды к количеству коллагена или содержания в % спирта в буферном растворе.

- плотность в сухом состоянии уменьшается (более значительная усадка коллагена) при увеличении содержания в % спирта в буферном растворе.

- Если сшивающим реагентом является смесь ЭДК и NHS:

- температура начала повышается при увеличении концентрации сшивающего реагента в буферном растворе, отношения количества (мас./мас.) сшивающего реагента (ЭДК+NHS) к количеству коллагена, отношения количества ЭДК к количеству NHS, (мас./мас.) отношения (мас./мас.) количества реакционной среды к количеству коллагена или содержания в % спирта в буферном растворе.

- плотность в сухом состоянии уменьшается (более значительная усадка коллагена) при увеличении содержания в % спирта в буферном растворе.

Высушенную вымораживанием эластичную рассасывающуюся химически сшитую коллагеновую губку, полученную в конце стадии (d) обычно направляют на стадию (е) стерилизации γ-излучением или рентгеновским излучением. Эта стадия может не быть необходимой, если смесь суспензий коллагена, полученная на стадии (с), уже является асептической и стадию (d) проводят в асептических условиях.

Исследование in vitro циклического сжатия и исследование ферментативного разложения с использованием коллагеназы Clostridium histolyticum, которые подробно описаны ниже, очень полезны для прогнозирования поведения in vivo химически сшитой губки после имплантации в полости рта, в частности, ее способности сохранять объем и излечивать без побочных эффектов, таких как чрезмерное воспаление и/или частичное обнажение пришеечного участка корня зуба.

Настоящее изобретение также относится к указанному выше способу изготовления эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки.

Настоящее изобретение также относится к указанной выше эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губке, предназначенной для применения в качестве имплантата в полости рта, к применению этой эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки для изготовления имплантата для полости рта и к способу увеличения объема мягких тканей в области рта, в значительной мере путем содействия врастанию десневых клеток при сохранении объема при механических нагрузках, который включает имплантацию в полость рта указанной выше эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки.

Описанные ниже экспериментальные методики, исследования и примеры иллюстрируют настоящее изобретение без ограничения его объема.

Исследование по определению плотности эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки в сухом состоянии

Образцы эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки помещали в тарированные пластмассовые пробирки, которые сушат в устройстве для сушки вымораживанием в течение не менее 2 ч при температуре, равной 20°С и давлении ниже 0,5 мбар. Пробирки с высушенными образцами взвешивали и рассчитывали массы нетто образцов в сухом состоянии.

Длину, ширину и высоту образцов эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки измеряли с помощью электрического штангенциркуля путем приложения достаточного давления по плоскости контактов, так чтобы образцы были слабо зафиксированы (т.е. зафиксированы, чтобы выдерживать силу, создаваемую их массой, но чтобы они могли двигаться, когда сила увеличивалась примерно в 10 раз). Рассчитывали объемы образцов в сухом состоянии.

Затем для каждого образца рассчитывали плотность эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки в сухом состоянии (массу единицы объема).

Исследование циклического сжатия

Выраженную в % от начальной толщину и гистерезис по сравнению наблюдающимися при первой нагрузке после 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа, определяли с помощью механической компрессионной машины, а именно компрессионной машины для исследования материалов Z2.5, выпускающейся фирмой Zwick Roell, с помощью программы Test Expert II.

Исследования проводили при погружении в ЗФФ при 37°С образцов стерильной, эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки, которые инкубировали в течение 2 ч при 37°С в растворе ЗФФ при рН 7,4 (приготовлен путем растворения 80,0 г NaCl, 2,0 г KCl, 17,7 г Na2HPO4 и 2,4 г KH2PO4 в 1000 мл воды, разбавления раствора водой в 10 раз и установления с помощью HCl значения рН, равного 7,4).

Образцы подвергали всего 49 циклам нагрузки от 0,5 до 12,1 кПа при скорости деформации, равной 33% от начальной высоты, за 1 мин, анализ начинали при предварительном давлении, равном 0,25 кПа.

Начальную высоту при давлении, равном 0,5 кПа, использовали для расчета восстановления начальной высоты после 49 циклов нагрузки и снятия нагрузки. "Гистерезис по сравнению наблюдающимся при первой нагрузке" означает выраженную в процентах работу, которая диссипировала во время снятия нагрузки при использовании работы (W1, снятие нагрузки в Нм) от 0,5 до 12,1 кПа при первой нагрузке и работы для 49-го цикла снятия нагрузки снятие нагрузки в Нм) в соответствии с уравнением XY:

С помощью программы Test Expert или Excel рассчитывают выраженное в % восстановление начальной высоты и выраженное в % восстановление начального гистерезиса после 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа.

На фиг. 1 приведены типичные результаты исследования циклического сжатия.

Для образцов эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки, предлагаемой в настоящем изобретении, для которой in vivo наблюдается привлекательное сохранение объема и излечивание без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба:

- восстановление высоты или толщины по сравнению с начальной высотой составляло не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, после 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа, и

- восстановление гистерезиса по сравнению наблюдающимся при первой нагрузке после 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа составляло менее 55%, предпочтительно менее 45%.

Исследование ферментативного разложения с использованием коллагеназы Clostridium histolyticum

В организме человека коллагены разрушаются матричными металлопротеиназами ткани человека (ММП), катепсинами и предположительно некоторыми серинпротеиназами. Лучше всего исследованы ММП, где коллагеназы (в частности, ММП-1, ММП-8, ММП-13 и ММП-18) являются наиболее важными ферментами для непосредственного разложения коллагена (Lauer-Fields et al. 2002 Matrix metalloproteinases and collagen catabolism в Biopolymers - Peptide Science Section и Song et al. 2006 Matrix metalloproteinase dependent and independent collagen degradation в Frontiers in Bioscience).

Способность коллагеназы разрушать коллагеновые ткани и мембраны зависит от эластичности субстрата и типа коллагена, активных центров ММП и экзосайтов ММП. Коллагеназы выстраиваются у трехспирального коллагена, раскручивают его и затем расщепляют его (Song et al. 2006, см. above).

С точки зрения преодоления различий в разрушении разных типов коллагена, разрушение коллагена коллагеназой часто оценивают с помощью коллагеназы Clostridium histolyticum, которая обладает высокой каталитической активностью (Kadler et al. 2007 Collagen at a glance in J Cell Sci). Обычно природный коллагеновый продукт разрушается быстрее, чем химически сшитый коллагеновый продукт.

При исследовании коллагеновых продуктов (образцов эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки, предлагаемой в настоящем изобретении, инкубированных при 37°С с 50 Ед/мл Clostridium histolyticum (одна Ед определяется, как выделяющая пептиды из коллагена крупного рогатого скота Achilles tendon, эквивалентные окраске нингидрином для воздействия 1,0 мкмоля лейцина в течение 5 ч при рН 7,4 при 37°С в присутствии ионов кальция)) в содержащем кальций буфере Tris и разрушение коллагеновой матрицы определяли визуально и с помощью набора "DC Protein Assay", выпускающегося фирмой Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA, Order Nr. 500-0116, с использованием коллагена типа I в качестве материала сравнения. Концентрацию коллагена определяли с помощью спектрометра для микропланшетов (Infinite М200, выпускающегося фирмой Tecan).

В образцах эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки, предлагаемой в настоящем изобретении, которые in vivo характеризуются излечиванием без чрезмерного воспаления или частичного обнажения пришеечного участка корня зуба, коллаген полностью разрушался (при осмотре не обнаруживались коллагеновые волокна) в течение от 3 до 5 ч.

Пример 1. Получение суспензии коллагеновых волокон, образованных из брюшины свиньи

Мембраны брюшины поросят полностью освобождали от мышечной ткани и жира механическими средствами, промывали проточной водой и обрабатывали 2% раствором NaOH в течение 12 ч. Затем мембраны промывали проточной водой и подкисляли с помощью 0,5% HCl. После подкисления материала по всей его толщине (примерно 15 мин) материал промывали до обеспечения рН, равного 3,5. Затем материал подвергали усадке 7% солевым раствором, нейтрализовывали 1% раствором NaHCO3 и промывали проточной водой. Затем материал обезвоживали ацетоном и обезжиривали н-гексаном.

Материал сушили с использованием этанола, эфира и размалывали с помощью режущей мельницы (например, Pulverisette 25, выпускающейся фирмой Fritsch: см. www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25, или SM300, выпускающейся фирмой Retsch: www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.htlm), которая включает трапециевидное сито с отверстиями размером от 0,5 до 1,0 мм.

4% (мас./мас.) Суспензию коллагеновых волокон и 6% (мас./мас.) суспензию коллагеновых волокон, готовили путем суспендирования соответствующих количество высушенного порошка в воде и установления значения рН, равного 2,6, с помощью 10 мМ хлористоводородной кислоты.

Пример 2. Получение суспензии коллагеновых волокон, образованных из стерильной мембраны Geistlich Bio-Gide®

Мембрану Geistlich Bio-Gide® (выпускающуюся фирмой Geistlich Pharma AG, CH-6110, Switzerland) сушили и размалывали с помощью режущей мельницы, которая включает трапециевидное сито с отверстиями размером от 0,5 до 1,0 мм. 4% (мас./мас.) Суспензию коллагеновых волокон и 6% (мас./мас.) суспензию коллагеновых волокон готовили путем суспендирования достаточных количеств высушенного порошка в воде и установления значения рН, равного 2,6, с помощью 10 мМ хлористоводородной кислоты.

Пример 3. Получение суспензии коллагеновых волокон, образованных из дермы свиньи.

Шкуры свиньи размалывали в мясорубке на куски размером от 1 до 20 мм. Воду удаляли с помощью растворимого в воде растворителя, такого как спирт или кетон. Коллагеновые волокна обезжиривали хлорированным углеводородом, таким как дихлорэтан или метиленхлорид, или нехлорированным углеводородом, таким как гексан или толуол. После удаления растворителя коллаген обрабатывали сильным неорганическим основанием при значении рН, превышающем 12, в течение от 6 до 24 ч и обрабатывали сильной неорганической кислотой при значении рН, равном от 0 до 1, в течение от 1 до 12 ч. Избыток кислоты удаляли путем промывки водой и суспензию гомогенизировали путем коллоидного размола до образования обладающей концентрацией, равной от 0,5 до 2%, однородной суспензии коллагеновых волокон в присутствии регулятора набухания, такого как неорганическая соль. Суспензию сушили вымораживанием и сухие коллагеновые волокна последовательно очищали разными органическими растворителями, такими как спирты, простые эфиры, кетоны и хлорированные углеводороды, затем растворители выпаривали в вакууме до содержания остаточных растворителей, равного менее 1% (мас./мас.).

2,5% (мас./мас.) Суспензию коллагеновых волокон и 3,75% (мас./мас.) суспензию коллагеновых волокон готовили с помощью тонкого измельчения путем коллоидного размола достаточных количеств очищенных сухих волокон, полученных выше, водой при значении рН, равном 3,4.

Пример 4. Получение эластичной рассасывающейся коллагеновой губки, химически сшитой с помощью ЭДК.

4 Части 4% (мас./мас.) суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 1 или в примере 2, смешивали с 1 частью 2,5% (мас./мас.) суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 3, и выливали в формы размером 8×25×25 мм. Полученную 3,7% суспензию коллагеновых волокон сушили вымораживанием при -45°С.

Затем высушенные коллагеновые губки подвергали гидротермической обработке при 120°С в течение 24 ч при пониженном давлении (ниже 200 мбар).

Затем коллагеновые губки химически сшивали в буферном растворе, содержащем 0,1 М МЭС (2-(N-морфолино)-этансульфоновая кислота) и 5% этанола при значении рН, равном 5,5, с помощью 0,3 г ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) на 1 г коллагена при перемешивании при комнатной температуре в течение 120 мин.

Химически сшитые коллагеновые губки сначала промывали 0,10 М раствором Na2HPO4, 1М раствором NaCl, 2М раствором NaCl, затем водой и сушили вымораживанием при -45°С.

Высушенные химически сшитые коллагеновые губки стерилизовали гамма-излучением при поглощенной дозе, равной 30 кГр.

Измеренные температура начала и плотность в сухом состоянии стерилизованных химически сшитых коллагеновых губок равнялись 47°С и 64 мг/см3 соответственно.

После 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа, в ЗФФ при 37°С, стерилизованные химически сшитые коллагеновые губки характеризовались сохранением своей начальной толщины, составляющим 87%, и начального гистерезиса, составляющим 41%.

Ртутная порометрия показывает, что стерилизованные химически сшитые коллагеновые губки обладают средним диаметром пор, равным 88 мкм, и составляющей 95% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм.

Исследование ферментативного разложения с использованием коллагеназы Clostridium histolyticum указывало на полное разложение коллагена за 3,25 ч.

Пример 5. Получение эластичной рассасывающейся коллагеновой губки, химически сшитой с помощью смесь ЭДК и NHS.

4 Части 6% (мас./мас.) суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 1 или в примере 2, смешивали с 1 частью 3,75% (мас./мас.) суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 3, и выливали в формы высотой 6 мм. Полученную 5,55% (мас./мас.) суспензию коллагеновых волокон сушили вымораживанием при -10°С.

Эти губки химически сшивали в растворе, содержащем 0,2 М МЭС (2-(N-морфолино)-этансульфоновая кислота) и 50% мас./мас. этанола при значении рН, равном 5,5, с помощью 0,1 г ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) на 1 г коллагена и 0,1 г NHS (N-гидроксисукцинимид) на 1 г коллагена при перемешивании при комнатной температуре в течение 120 мин. Химически сшитые губки сначала промывали 0,1 М раствором Na2HPO4, 1М раствором NaCl, 2М раствором NaCl, затем водой и сушили вымораживанием при - 10°С.

Высушенные химически сшитые коллагеновые губки стерилизовали γ-излучением при поглощенной дозе, равной 26 кГр.

Измеренные температура начала и плотность в сухом состоянии стерилизованных химически сшитых коллагеновых губок равнялись 52°С и 59 мг/см3 соответственно.

После 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа в ЗФФ при 37°С, стерилизованные химически сшитые коллагеновые губки характеризовались сохранением своей начальной толщины, составляющим 90%, и начального гистерезиса, составляющим 38% по сравнению наблюдающимся при первой нагрузке.

Ртутная порометрия показывает, что стерилизованные химически сшитые коллагеновые губки обладают средним диаметром пор, равным 69,1 мкм, и составляющей 93,1% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм.

Исследование ферментативного разложения с использованием коллагеназы Clostridium histolyticum указывало на полное разложение коллагена за 3,5 ч.

Пример 6. Получение эластичной рассасывающейся коллагеновой губки, химически сшитой с помощью смесь ЭДК и NHS (без стадии стерилизации)

4 Части 6% (мас./мас.) суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 2, смешивали с 1 частью 3,75% (мас./мас.) суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 3, и выливали в формы высотой 6 мм. Полученную 5,55% (мас./мас.) суспензию коллагеновых волокон сушили вымораживанием при -10°С.

Эти губки химически сшивали в растворе, содержащем 0,2 М МЭС (2-(N-морфолино)-этансульфоновая кислота) и 50% мас./мас. этанола при значении рН, равном 5,5, с помощью 0,01 г ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) на 1 г коллагена и 0,01 г NHS (N-гидроксисукцинимид) на 1 г коллагена при перемешивании при комнатной температуре в течение 120 мин. Химически сшитые губки сначала промывали 0,1 М раствором Na2HPO4, 1М раствором NaCl, 2М раствором NaCl, затем водой и сушили вымораживанием при -10°С.

Измеренные температура начала и плотность в сухом состоянии химически сшитых коллагеновых губок равнялись 57°С и 57 мг/см3 соответственно.

После 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа в ЗФФ при 37°С, химически сшитые коллагеновые губки характеризовались сохранением своей начальной толщины, составляющим 80%.

Ртутная порометрия показывает, что химически сшитые коллагеновые губки обладают средним диаметром пор, равным 71,0 мкм, и составляющей 94,0% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм.

Пример 7. Получение эластичной рассасывающейся коллагеновой губки, химически сшитой глутаровым альдегидом.

4 Части суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 1, смешивали с 1 частью суспензии коллагеновых волокон, полученной в примере 3, и выливали в формы высотой 6 мм. Суспензию коллагена сушили вымораживанием при -45°С. Эти губки химически сшивали в буферном растворе фосфата натрия (рН 7,0-7,5), содержащем 0,05% (мас./мас.) глутарового альдегида, при 10°С в течение 60 мин. Химически сшитые коллагеновые губки последовательно промывали водой, 2 М раствором NaCl и 0,1 М раствором Na2HPO4. После заключительной промывки водой губки сушили вымораживанием при -45°С.

Химически сшитые коллагеновые губки стерилизовали γ-излучением при поглощенной дозе, равной 25 кГр.

Измеренные температура начала и плотность в сухом состоянии стерилизованных химически сшитых коллагеновых губок равнялись соответственно 51°С и 52 мг/см3.

После 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа при 37°С, стерилизованные химически сшитые коллагеновые губки в ЗФФ характеризовались сохранением своей начальной толщины, составляющим 74%, и начального гистерезиса, составляющим 48% по сравнению наблюдающимся при первой нагрузке.

Ртутная порометрия показывает, что стерилизованные химически сшитые коллагеновые губки обладают средним диаметром пор, равным 63,7 мкм, и составляющей 92,7% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм.

Исследование ферментативного разложения с использованием коллагеназы Clostridium histolyticum указывало на полное разложение коллагена за 4,5 ч.

1. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка, предназначенная для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта, содержащая 60-96% (мас./мас.) коллагена и 4-40% (мас./мас.) эластина, которая по данным ртутной порометрии содержит взаимосвязанные поры, обладающие средним диаметром, равным от 50 до 90 мкм, и составляющей не менее 80% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм, температурой начала, равной от 45 до 57°С, и плотностью в сухом состоянии, равной от 50 до 65 мг/см3.

2. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка по п. 1, которая обладает температурой начала, равной от 46 до 53°С.

3. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка по п. 1 или 2, которая обладает плотностью в сухом состоянии, равной от 50 до 60 мг/см3.

4. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая губка по любому из пп. 1-3, которая содержит 70-90% (мас./мас.) коллагена и 10-30% (мас./мас.) эластина.

5. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая губка по любому из пп. 1-4, , которая обладает составляющей не менее 90% пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм.

6. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая губка по любому из пп. 1-5, которая изготовлена с использованием сшивающего реагента, выбранного из группы, включающей глутаровый альдегид, ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) и смесь ЭДК и NHS (N-гидроксисукцинимид).

7. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка по любому из пп. 1-5, которая изготовлена из тканей природного происхождения способом, включающим сушку вымораживанием и химическую сшивку, необязательно с последующей стерилизацией γ-излучением или стерилизацией рентгеновским излучением, в которой ткани природного происхождения включают брюшинную или перикардиальную мембраны свиньи или крупного рогатого скота, плацентарную мембрану свиньи или крупного рогатого скота, или подслизистую основу тонкой кишки, или дерму свиньи или крупного рогатого скота.

8. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка по любому из пп. 1-7, которая при увлажнении забуференным фосфатом физиологическим раствором восстанавливает не менее 70% начальной толщины после 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа.

9. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка по любому из пп. 1-7, которая при увлажнении забуференным фосфатом физиологическим раствором восстанавливает менее 55% гистерезиса по сравнению с наблюдающимся при первой нагрузке после 49 циклов сжатия до давления, равного 12,1 кПа.

10. Эластичная рассасывающаяся химически сшитая коллагеновая губка по любому из пп. 1-7, которая после имплантации в области рта характеризуется таким же сохранением объема, как ТССТ (трансплантат субэпителиальной соединительной ткани).

11. Способ изготовления эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки по любому из пп. 1-10, который включает следующие стадии:

(а) проведение щелочной обработки брюшинной или перикардиальной мембраны свиньи или крупного рогатого скота в растворе гидроксида натрия при значении рН, превышающем 12, кислотной обработки в растворе хлористоводородной кислоты при значении рН, равном от 1 до 3, обезвоживающей обработки растворимым в воде органическим растворителем и обезжиривающей обработки органическим растворителем,

размол полученной сухой мембраны с помощью режущей мельницы,

просеивание через сито с отверстиями размером 0,5-2 мм и суспендирование полученного порошка в подкисленном водном растворе, обладающем значением рН, равным от 2,5 до 3,5, с получением суспензии коллагеновых волокон,

(b) проведение обезвоживающей обработки размолотой дермы свиньи или крупного рогатого скота растворимым в воде органическим растворителем, обезжиривающей обработки органическим растворителем, щелочной обработки сильным неорганическим основанием при значении рН, превышающем 12, кислотной обработки сильной неорганической кислотой при значении рН, равном от 0 до 1, промывки водой и суспендирования коллагеновых волокон, сушки вымораживанием, очистки высушенных коллагеновых волокон органическим растворителем и размола очищенных высушенных волокон в подкисленном растворе при значении рН, равном от 3 до 4, с получением суспензии коллагеновых волокон,

(c) смешивание от 3,5 до 4,5 частей суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (а), с 0,5-1,5 частями суспензии коллагеновых волокон, полученной на стадии (b), с получением суспензии,

(d) сушку вымораживанием суспензии, полученной на стадии (с), и сшивку высушенного вымораживанием продукта в растворе, содержащем сшивающий реагент, промывку водой и сушку вымораживанием, и

(e) необязательно стерилизацию высушенного вымораживанием продукта, полученного на стадии (d), γ-излучением или рентгеновским излучением.

12. Способ по п. 11, в котором сшивающий реагент, выбран из группы, включающей глутаровый альдегид, ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) и смесь ЭДК и NHS (N-гидроксисукцинимид).

13. Способ по п. 11 или 12, в котором суспензия коллагеновых волокон, полученная на стадии (а), содержит от 2,5 до 3,75 (мас./мас.)% коллагена и суспензия коллагеновых волокон, полученная на стадии (b), содержит от 4,0 до 6,0 (мас./мас.)% коллагена.

14. Применение эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губки по любому из пп. 1-10, в качестве имплантата в полости рта, которая изготовлена из тканей природного поисхождения, включающих брюшинную или перикардиальную мембраны свиньи или крупного рогатого скота, плацентарную мембрану свиньи или крупного рогатого скота, или подслизистую основу тонкой кишки, или дерму свиньи или крупного рогатого скота.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины. Описан способ получения микроволокнистого материала путем последовательного смешивания раствора человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в гексафторизопропаноле (ГФИП) и лекарственного средства (ЛС) в диметилсульфоксиде (ДМСО), после чего полученный раствор смешивают с раствором поликапролактона (ПКЛ) в ГФИП.

Изобретение относится к медицине. Описан биомиметический коллаген-гидроксиапатитный композитный материал, включающий частично волоконный коллагеновый каркас, включающий зрелые природные коллагеновые волокна, которые характеризуются тройной спиральностью по данным спектроскопии кругового дихроизма, причем эти зрелые природные волокна коллагена по крайней мере частично покрыты эпитаксиально выращенными кристаллами нанокристаллического гидроксиапатита и при этом эпитаксиально выращенные нанокристаллы характеризуются морфологией и размерами, аналогичными костному минералу человека, то есть длина составляет от 30 до 50 нм, а ширина от 14 до 25 нм.

Изобретение относится к медицине. Описан искусственный кровеносный сосуд, который представляет собой трубчатый материал, содержащий: волокнистый слой, содержащий ультратонкое волокно (волокна), и слой ультратонкого волокна на внутренней поверхности волокнистого слоя, причем слой ультратонкого волокна состоит из ультратонкого волокна (волокон) с диаметром (диаметрами) волокна не менее 10 нм и не более 3 мкм; в котором полимер, содержащий четвертичную аммониевую группу, содержащую алкильные группы, в каждой из которых число атомов углерода равно 4 или менее, ковалентно связан с ультратонким волокном (волокнами); гепарин ионно связан с полимером, содержащим четвертичную аммониевую группу; и остаточная активность гепарина после промывки физиологическим раствором при 37°C в течение 30 минут составляет 20 мМЕ/см2 или более.

Изобретение относится к области медицины, в частности к тканевой инженерии, и раскрывает тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант. Указанный имплант характеризуется тем, что изготовлен из биодеградируемых полимеров методом электроспиннинга с послойным введением в стенку сосуда биологически активных молекул: сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов (bFGF) и хемоаттрактантная молекула (SDF-1α), при этом полимерная композиция является смесью полигидроксибутирата-валерата и поликапролактона (PGBV/PCL), взятой в соотношении 1:2.

Группа изобретений относится к медицине. Описаны гидрофильный дегидратированный частично очищенный материал для замещения кости естественного происхождения, из которого практически полностью удален неколлагеновый органический материал, при этом практически сохранены неорганическая пористая костная структура и коллагеновая структура, присущие естественной кости, где материал для замещения кости содержит по меньшей мере один сахарид или сахарный спирт в количестве, составляющем от 0,05 до 1,5 мас.%, и фосфатную группу, выбранную из группы, состоящей из фосфата НРО42- и Н2РО4-, в количестве от 0,7 до 5,6 мас.%, где указанная фосфатная группа является компонентом физиологически приемлемой соли, и способ получения гидрофильного дегидратированного частично очищенного материала для замещения кости.

Группа изобретений относится к медицине. Описаны биоразлагаемые устройства, такие как имплантаты для контролируемой доставки терапевтических агентов, в частности больших молекул, таких как белки и антитела.
Изобретение относится к области косметологии и дерматологии и представляет собой способ получения композиции для использования в качестве дерматологического наполнителя в косметических и медицинских применениях в форме геля, включающей сшитый первый полимер, необязательно второй полимер, который может быть сшитым или несшитым, и воду, причем первый и второй полимеры выбирают из полисахарида, а способ включает по меньшей мере стадии (i), (ii) и (iv) и необязательно стадию (iii), где стадия (i) заключается в сшивание смеси, включающей в себя первый полимер и воду, стадия (ii) в завершение сшивания после сшивания на стадии (i), стадия (iii) необязательное смешивание продукта, полученного на стадии (ii), со вторым полимером, стадия (iv) заключается в диализе продукта, полученного на стадии (ii) или на стадии (iii), где стадия диализа (iv) включает стадии (iv.1)-(iv.3)(iv.1) экструдирование продукта, полученного на стадии (ii) или (iii), через первое сито и последующее экструдирование экструдированного через первое сито продукта через второе сито, в котором размер отверстий второго сита меньше, чем размер отверстий первого сита; или экструдирование продукта, полученного на стадии (ii) или (iii), через первое сито и последующее экструдирование экструдированного через первое сито продукта через второе сито, и последующее экструдирование экструдированного через второе сито продукта через третье сито, в котором размер отверстий второго сита меньше, чем размер отверстий первого сита, а размер отверстий третьего сита меньше, чем размер отверстий второго сита, где стадия (iv.2) представляет собой заполнение мембраны диализа продуктом, полученным на стадии (iv.1), стадия (iv.3) - обработку заполненной мембраны, полученной на стадии (iv.2), раствором для диализа.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу нанесения антиадгезивного антибактериального покрытия на ортопедические имплантаты из титана и нержавеющей стали, включающему нанесение покрытия на предварительно обработанную поверхность металлического имплантата, при этом поверхность металлических имплантатов из титана и нержавеющей стали подвергают очистке методом ионного травления в герметичной камере, которую предварительно вакуумируют до остаточного давления 9⋅10-5-1⋅10-6 Торр, с последующим заполнением камеры аргоном и вакуумированием камеры до остаточного давления 4⋅10-4-1⋅10-3 Торр, а ионное травление выполняют ионами аргона с энергией 0,7-3,0 кэВ в течение 4-8 мин, затем на поверхность ортопедических имплантатов из титана и из нержавеющей стали наносят дуальным распылением с двух магнетронных источников антиадгезивное антибактериальное покрытие в виде атомов серебра и углерода в виде тетраэдрического алмаза типа ta-C, причем используют магнетронный источник углеродной плазмы с мощностью 95-108 Вт, источник атомов серебра с мощностью 2-20 Вт и ионный источник стимулирования процесса нанесения покрытия ионами аргона с энергией ионов инертного газа аргона от 0,1 до 1,5 кэВ, а процесс нанесения антиадгезивного антибактериального покрытия продолжают в заполненной аргоном и вакуумированной до остаточного давления 4⋅10-4-1⋅10-3 Торр камере, при этом наносят на металлическую поверхность ортопедических имплантатов двухкомпонентное антиадгезивное антибактериальное биосовместимое нанопокрытие толщиной от 9 до 1180 нм, содержащее наногранулы шарообразной формы из высокочистого серебра не ниже 99,9% чистоты размером 4,5-9,5 нм со сформированным на их поверхности сплошным покрытием углерода в виде тетраэдрического алмаза типа ta-C толщиной 0,4-1,2 нм.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, и может быть использовано для восстановления у пациента связки или сухожилия. Для этого на связку или сухожилие накладывают лоскут, который является гибким и биосовместимым и содержит опорный слой, состоящий из листового коллагена и являющийся проницаемым для клеток, а также расположенный на опорном слое матриксный слой, проницаемый для клеток и представляющий собой коллагеновую прокладку с распределенными в ней коллагеновыми волокнами и природной гиалуроновой кислотой, диспергированной в свободных пространствах коллагеновых волокон.

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к составу эластичного антибактериального материала, включающему 100 масс. ч.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использована для получения биорезорбируемого биологического матрикса для замещения дефектов костной ткани из ксеногенной или аллогенной костной ткани.

Изобретение касается частиц биоактивного стекла для регенерации костей, имеющих форму сфер или сжатых сфер и имеющих бимодальное распределение размера частиц, включающее частицы между 90 мкм и 180 мкм и частицы между 355 мкм и 500 мкм, где биоактивное стекло представляет собой 45S5 стекло.

Изобретение относится к области регенеративной медицины. Предложен способ подготовки матрикса для создания биоинженерной конструкции пищевода в эксперименте.

Изобретение относится к медицине. Описан биомиметический коллаген-гидроксиапатитный композитный материал, включающий частично волоконный коллагеновый каркас, включающий зрелые природные коллагеновые волокна, которые характеризуются тройной спиральностью по данным спектроскопии кругового дихроизма, причем эти зрелые природные волокна коллагена по крайней мере частично покрыты эпитаксиально выращенными кристаллами нанокристаллического гидроксиапатита и при этом эпитаксиально выращенные нанокристаллы характеризуются морфологией и размерами, аналогичными костному минералу человека, то есть длина составляет от 30 до 50 нм, а ширина от 14 до 25 нм.
Изобретение относится к медицине. Описан композитный материал для пластики грыж передней брюшной стенки, содержащий полипропилен, синтетический сетчатый протез и коллагенсодержащий материал, где на поверхность синтетического сетчатого протеза, направленную к подкожно-жировой клетчатке, уложена мембрана препарата «Коллост», повторяющая контуры и равная площади протеза.

Группа изобретений относится к медицине. Описан способ получения имеющих высокую оптическую плотность растворов наночастиц, таких как нанопластины, серебряные нанопластины или серебряные пластинчатые наночастицы.
Изобретение относится к области медицины и раскрывает cпособ получения костно-пластического материала. Способ характеризуется тем, что кость очищают, распиливают на фрагменты с размером частиц 0,5-1,5 см, промывают водой, проводят делипидизацию, депротеинизацию, измельчение костных фрагментов и соединение полученной костной массы при температуре 38-40°C с коллагенсодержащим раствором в виде раствора химически чистого желатина, приготовленного на консервирующем растворе с добавлением антибактериального препарата, и стерилизацию.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к хирургии и трансплантологии, и предназначена для ферментативной обработки тканевых продуктов с получением бесклеточной тканевой матрицы.
Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения пористого гидроксиапатит-коллагенового композита, который характеризуется тем, что гидроксиапатит, полученный конденсационным способом с использованием гидроакустического преобразователя, смешивают с коллагеном, полученную гидроксиапатит-коллагеновую смесь гомогенизируют в ультразвуковом поле с частотой (22÷44) кГц, плотностью мощности (1÷10) Вт/см3 в течение (10÷400) с.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, и может быть использовано для восстановления у пациента связки или сухожилия. Для этого на связку или сухожилие накладывают лоскут, который является гибким и биосовместимым и содержит опорный слой, состоящий из листового коллагена и являющийся проницаемым для клеток, а также расположенный на опорном слое матриксный слой, проницаемый для клеток и представляющий собой коллагеновую прокладку с распределенными в ней коллагеновыми волокнами и природной гиалуроновой кислотой, диспергированной в свободных пространствах коллагеновых волокон.

Группа изобретений относится к охране здоровья жвачных животных и, более конкретно, к композициям и способам, позволяющим ослабить воздействие бактериальных инфекций, связанных с внутриутробным заболеванием.

Группа изобретений относится к хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, в частности к эластичной рассасывающейся химически сшитой коллагеновой губке, предназначенной для стимулирования увеличения объема мягких тканей в области рта. Губка содержит 60-96 коллагена и 4-40 эластина, которая по данным ртутной порометрии содержит взаимосвязанные поры, обладающие средним диаметром, равным от 50 до 90 мкм, и составляющей не менее 80 пористостью с порами диаметром, равным более 10 мкм, температурой начала, равной от 45 до 57°С, и плотностью в сухом состоянии, равной от 50 до 65 мгсм3. Также раскрыт способ получения коллагеновой губки и её применение в качестве имплантата в полости рта. Группа изобретений обеспечивает регенеративное коллагеновое устройство, которое является биологически совместимым, рассасывающимся in vivo, хорошо встраивается в ткань, так чтобы обеспечивать неосложненное излечивание и способно выдерживать воздействие механических сил, действуя как каркас, который сохраняет объем ткани в течение достаточного времени во время заживления раны после имплантации. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 пр.

Наверх