Способ ранней генетической диагностики риска развития генитального эндометриоза

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и позволяет прогнозировать риск развития генитального эндометриоза для индивидуумов славянской популяции Северо-Западного федерального округа. Способ включает экстракцию ДНК из крови с последующим проведением мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфных вариантов гена VEGFA: VEGFA_Forw SEQ ID N1, VEGFA_Rev SEQ ID N2, VEGFA_Wt SEQ ID N3, VEGFA_M SEQ ID N4. Прогнозируют повышенный риск развития генитального эндометриоза в случае выявления аллеля С и генотипа СС полиморфизма rs833061 460 С/Т SEQ ID N5 гена VEGFA. Способ прост в осуществлении, позволяет разрабатывать тактику лечения генитального эндометриоза с учетом индивидуальных (генетических) особенностей пациента.

 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и позволяет прогнозировать риск развития генитального эндометриоза у женщин репродуктивного возраста.

Эндометриоз является одной из наиболее острых проблем современной гинекологии и представляет собой гинекологическое заболевание, характеризующееся миграцией и пролиферацией клеток эндометрия за пределы полости матки, в первую очередь, в область тазовой брюшины и яичников [1]. Согласно данным научной периодики, окончательный диагноз эндометриоз часто верифицируют спустя 8 лет с момента появления первых симптомов болезни [4]. Одной из возможных причин диагностической задержки и/или ошибочного диагноза является неоптимальная первичная оценка тазовых болей пациенток [5]. Поздняя диагностика генитального эндометриоза проводит к ряду осложнений, в том числе к бесплодию и малигнизации очагов эндометриоза [1].

Клетки эндометрия переходят на интра-, ауто- и паракринный механизмы регуляции своего роста, что приводит к утрате контактного торможения и иммортализации [2]. Очаги эндометриоза становятся главными источниками цитокинов и факторов роста, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), что способствует дальнейшему распространению эндометрия, инициируя нарушения гомеостаза органов и тканей брюшной полости [2].

VEGF, обладая мощным ангиогенным эффектом за счет стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток, приводит к инициации ангиогенеза - одного из основных признаков развития генитального эндометриоза [3]. В результате анализа многочисленных популяционных исследований о наличии связи генных полиморфизмов с развитием эндометриоидных очагов, нами было выявлено, что функционально значимым является однонуклеотидный полиморфизм -460С/Т (rs833061) гена VEGFA.

Из уровня техники известен «Способ ранней диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин» (RU 2247391 С2, 13.05.2003 г.), согласно которому диагностику наружного генитального эндометриоза осуществляют путем определения в пробе ткани активности катепсина D. При его значении 0,1 Ед.ферм.акт/ч и менее - диагностируют наружный генитальный эндометриоз. Недостатками данного решения является инвазивный способ взятия материала, а также высокая вероятность ошибки оператора при биопсии ткани эндометриоидного очага.

Аналогом заявляемого изобретения является «Способ диагностики наружного генитального эндометриоза» (RU 99111032 А, 20.02.2001 г.), определяющий наличие заболевания с помощью спонтанного НСТ-теста (нитросиний тетразолий-тест), оценивающего активность нейтрофилов крови пациента после инкубации клеток с плацентарным α-2 микроглобулином фертильности (ПАМГ-2). Недостатками данного способа является отсутствие возможности спрогнозировать развитие эндометриоза до его клинических проявлений. Кроме того, метод неспецифичен, так как нейтрофилы являются ключевыми участниками воспалительных процессов различного генеза.

Также аналогом является «Способ диагностики наружного генитального эндометриоза» (RU 2526823 С1, 05.08.2013 г.), включающий исследование сыворотки крови. Предложенный способ отличается тем, что биохимическим методом определяют содержание липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). При величине 0,77 ммоль/л и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз. Недостатком данного метода является его неспецифичность и низкая точность, так как уровень ЛПВП, коррелирующий, по мнению авторов, с развитием эндометриоза, соответствует нормальным значениям; повышение уровня ЛПВП не является специфическим маркером эндометриоза и может наблюдаться при различных патологических состояниях, таких как хронический гепатит, цирроз печени [6, 7].

Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является «Способ прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом» (RU 2468367 С1, 12.08.2011 г.), основанный на получении данных о полиморфизме -308G/A гена фактора некроза опухолей - a (TNF-a). Недостатками данного способа является низкая специфичность детектируемого маркера для ранней диагностики генитального эндометриоза, в связи с ассоциацией указанного полиморфизма с рядом других заболеваний: остеомиелитом [8], раком молочной железы [9], хронической обструктивной болезнью легких [10], В-клеточными опухолями лимфатической системы [11].

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала способов прогнозирования развития генитального эндометриоза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени у индивидуумов славянской популяции Северо-Западного федерального округа.

Технический результат использования изобретения - возможность прогнозирования риска развития эндометриоза у индивидуумов славянской популяции Северо-Западного федерального округа с учетом генетического полиморфизма rs833061 гена VEGFA.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе ранней генетической диагностики риска развития генитального эндометриоза, включающим экстракцию ДНК из крови с последующим проведением мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, согласно изобретению, проводят анализ полиморфных вариантов гена VEGFA: VEGFA_Forw SEQ ID N1, VEGFA_ Rev SEQ ID N2, VEGFA_Wt SEQ ID N3, VEGFA_M SEQ ID N4, и прогнозируют повышенный риск развития генитального эндометриоза в случае выявления аллеля С полиморфизма rs833061 гена VEGF A SEQ ID N5.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники неизвестна возможность раннего прогнозирования риска развития генитального эндометриоза на основе детекции полиморфизма rs833061 гена VEGFA. Нами выявлены однонуклеотидные полиморфизмы в гене VEGFA, поддерживающие развитие эндометриоидных поражений. Специфический маркер риска развития генитального эндометриоза поможет выявить патологию задолго до ее клинических проявлений, что позволит сформировать группы риска, организовать их мониторинг, а в случае заболевания, прогнозировать характер течения и предложить индивидуально подобранную терапию.

Детекция однонуклеотидных полиморфизмов может быть осуществлена методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

Способ осуществляется следующим образом:

Выделить геномную ДНК из цельной крови пациента и генотипировать методом ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров, фланкирующих полиморфизм и конкурирующих TaqMan-зондов. На 3'-конце зонда находится флуоресцентная метка - флуорофор (FAM, HEX), а на 5'-конце «гаситель» флуоресценции (RTQ1; BHQ-1). При близком расположении «гасителя» и флуорофора энергия, которая поглощена флуорофором, по принципу флуоресцентно-резонансного переноса переходит на «гаситель». Вследствие этого сигнал флуоресценции отсутствует. В процессе ПЦР при повышении температуры до 95°С происходит плавление цепей ДНК, праймеры гибридизуются с комплементарным участком ДНК при 63°С. В процессе амплификации ДНК-полимераза расщепляет зонд, при этом расстояние между «гасителем» и флуорофором увеличивается, инициируя флуоресценцию. В этот момент можно зарегистрировать флуоресцентный сигнал от флюорофора. Зонд с меткой FAM соответствует аллелю Т, зонд с красителем HEX - аллелю С для полиморфизма rs833061 гена VEGFA. Анализ полиморфизмов производят с использованием наборов для определения полиморфизма rs833061 гена VEGFA (ЗАО «Синтол»). В эппендорф/лунку объемом 0,2 мкл вносят 20 мкл смеси, включающей 10 мкл реакционной смеси, 10 мкл разбавителя и 0,5 мкл (2,5 Ед) Taq-полимеразы и 5 мкл ДНК образца. Емкость помещают в блок амплификатора в котором проводят считывание результатов ПЦР. Протокол ПЦР состоит из следующих этапов: нагрев реакционной смеси при 95°С - 3 мин и амплификация в течение 40 циклов в следующем режиме: 95°С - 15 сек, 63°С - 40 сек.

Таким образом, образец считается положительным на наличие полиморфного аллеля rs833061 гена VEGFA:

- если в результате ПЦР зарегистрирована флуоресценция по каналу FAM, то генотип гомозиготен по аллелю Т, при этом регистрируют генотип ТТ в участке rs833061 гена VEGFA.

- если в результате ПЦР зарегистрирована флуоресценция по каналам FAM и HEX, генотип гетерозиготен (ТС), при этом регистрируют генотип ТС в участке rs833061 гена VEGFA.

- если в результате ПЦР зарегистрирована флуоресценция по каналу HEX, то генотип гомозиготен по аллелю С, при этом регистрируют генотип СС в участке rs833061 гена VEGFA, что соответствует повышенному риску развития генитального эндометриоза.

Оборудование: амплификатор LightCycler 480 Instrument II («Roche», Швейцария) со стандартным программным обеспечением, дозаторы на 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл («Biohit», Финляндия); эппендорфы на 0,2 мл, 1,5 мл. Реактивы: Набор для выделения ДНК «ДНК-Экстран-1»; набор реагентов для определения однонуклеотидного полиморфизма rs833061 rcHaVEGFA, состоящий из реагентов: 2,5× Разбавитель, 2,5× Реакционная смесь, Taq ДНК-полимераза, отрицательный контроль и положительный контроль для генотипов Т/Т, Т/С С/С.Реактивы хранят при температуре -20°С.

Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь, полученная от 136 женщин (средний возраст 35,3±8,8 лет). В контрольную группу были включены 76 условно здоровых женщины (средний возраст 29,6±9,7 лет), в группу исследования - 60 женщин с диагнозом генитальный эндометриоз (средний возраст 32,1±12,4 лет).

Диагноз эндометриоза во всех случаях был поставлен в результате тщательного обследования висцеральной и париетальной брюшины на наличие гетеротопических эндометриоидных очагов в ходе лапароскопии, а также после гистероскопического исследования матки. Диагноз подтверждался с помощью гистологического исследования.

При поступлении в клинику большинство пациенток (59,40%) предъявляли жалобы на бесплодие (97,3% - первичное, 2,7% - вторичное), 49,02% - на болевой синдром, 33,33% - на дисменорею, 31,37% - на диспареунию, 19,61% - на нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии. Наиболее часто во время лапароскопии диагностировались эндометриоидные кисты - в среднем в 83,7% (из них двусторонние в 30% случаев). Частота ретроцервикального эндометриоза не превышала 16,21%). Чаще встречался умеренно выраженный спаечный процесс органов малого таза: I-II степень составила 35,29%, III степень и IV степень - соответственно 9,81% и 3,92%.

За критерии включения принят возраст 18-45 лет, диагноз «генитальный эндометриоз» (подтвержденный лапароскопически и гистологически). Обе группы принадлежали к славянской популяции Северо-Западного федерального округа (г. Калининград и г. Санкт-Петербург). Со всеми пациентками было подписано информированное согласие на исследование.

На основании анамнеза и других полученных данных, проведена оценка взаимосвязи полиморфных вариантов гена VEGFA с повышенным риском развития генитального эндометриоза.

Генотипирование проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием амплификатора LightCycler 480 Instrument II («Roche», Швейцария) и наборов для определения полиморфизма rs833061 renaVEGFA с праймерами For: 5'-gagagtgaggacgtgt -3'; Rev 5'-gggagagggacacacagatc-3'; Probe1: (FAM)-tgagggTgttggagcg-(RTQ1); Probe2: (R6G)-ttgagggCgttggagc-(BHQ2) (ЗАО «Синтол»).

Статистическая обработка полученных результатов была осуществлена с помощью программы Statistica 10. Проверку на соответствие распределению частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга, а также сравнение частот аллелей и генотипов в выборках проводили с применением критерия χ2, принимая уровень статистической значимости за 95% (р<0,05). Об ассоциации аллелей или генотипов (частоты которых в группах обследуемых достоверно отличались) с риском развития эндометриоза судили по величине отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Значения OR рассчитывали с помощью программы «Калькулятор для расчета отношения шансов» (http://gen-exp.ru/calculator_or.php). Ассоциация с высоким риском определялась, если значение OR было больше (>) 1, при величине OR меньше (<) 1 аллель или генотип был ассоциирован с пониженным риском развития генитального эндометриоза.

В проведенном исследовании установлена ассоциация аллеля С и генотипа СС полиморфизма rs833061460 С/Т гена VEGFA с повышенным риском развития генитального эндометриоза в славянской популяции Северо-Западного федерального округа (OR=2,11, 95%CI: 1,12-3,98, р=0,02) и (OR=2,57, 95%CI: 1,03-6,41, р=0,002), соответственно. Обнаружена взаимосвязь генотипа ТТ полиморфизма rs833061460 С/Т гена VEGFA с пониженным риском развития генитального эндометриоза (OR=0,43, 95%CI: 0,14-1,29, р=0,024).

Учитывая полученные данные, полиморфизм может быть использован для эффективной диагностики выявления предрасположенности к генитальному эндометриозу.

Таким образом, установлена ассоциация аллеля С и генотипа СС полиморфизма - rs833061460C/T гена VEGFA с повышенным риском развития генитального эндометриоза в два раза в славянской популяции Северо-Западного федерального округа, что свидетельствует о его значимом вкладе в патогенез развития данного заболевания.

Современные клинические методы диагностики эндометриоза являются недостаточными для своевременного принятия терапевтических или профилактических мер, направленных на предотвращение негативных последствий заболевания. Сущность изобретения заключается в определении полиморфизма гена rs833061460C/T гена VEGFA и прогнозе повышенного риска развития генитального эндометриоза до его клинических проявлений в случае выявления аллелей С полиморфизма rs833061460C/T гена VEGFA. Так, наличие аллеля С и генотипа СС полиморфизма rs833061460C/T гена VEGFA ассоциировано с повышенным риском развития генитального эндометриоза в два раза.

Способ прост в осуществлении, в его основе лежит мультиплексный ПЦР анализ полиморфизмов гена VEGFA с последующим расчетом отношения шансов риска развития генитального эндометриоза, что позволяет разрабатывать тактику лечения генитального эндометриоза с учетом индивидуальных (генетических) особенностей пациента.

Список использованной литературы

1. Moradi М., Parker М., Sneddon A., Lopez V., Ellwood D.Impact of endometriosis on women's lives: a qualitative study // BMC Womens Health. - 2014. - V. 14. - P. 123.

2. Наследникова И.О., Ильяди Е.Б., Уразова О.И., Ткачев В.Н., Евтушенко И.Д., Новицкий В.В., Кублинский К.С. Полиморфизм гена Р53 при генитальном эндометриозе // Фундаментальные исследования. - 2013. - №3-1. - С. 134-137.

3. Bhanoori М, ArvindBabu К., Pavankumar Reddy N.G., Lakshmi Rao К., Zondervan К., Deenadayal M., Kennedy S., Shivaji S. The vascular endothelial growth factor (VEGF)+405G>C 5'-untranslated region polymorphism and increased risk of endometriosis in South Indian women: a case control study // Hum Reprod. - 2005. - V. 20 (7). - P. 1844-1849.

4. Ballard K., Lowton K., Wright J. What's the delay? A qualitative study of women's experiences of reaching a diagnosis of endometriosis // FertilSteril. - 2006. - V. 86 (5). - P. 1296-1301.

5. Hudelist G., Tuttlies F., Rauter G., Pucher S., Keckstein J. Can transvaginal sonography predict infiltration depth in patients with deep infiltrating endometriosis of the rectum? // Hum Reprod. - 2009. - V. 24 (5). - P. 1012-1017.

6. Рыжкина A.B. Оптимизация терапии хронического гепатита С с нарушениями липидного обмена: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук (14.00.10) / Анна Владимировна Рыжкина; ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии». - Москва, 2010. - 21 с.

7. Телепнева Е.Ю. Оценка эффективности транспорта холестерина при гипохолестеринемии // Вестник витебского государственного медицинского университета. - 2009. - Т. 8 (3). - С. 27-35.

8. Мироманов A.M., Миронова О.Б., Мироманова Н.А., Трубицын М.В. Влияние полиморфизма гена TNFA-308G > А на экспрессию TNF-A у больных с развитием хронического травматического остеомиелита в забайкальском крае // Фундаментальные исследования. - 2015. - №1 (4). - С. 783-788.

9. Маливанова Т.Ф., Юрченко В.А., Скоромыслова Е.В., Мазуренко Н.Н. Влияние полиморфизма -308(G/A)TNF на общую выживаемость больных раком молочной железы // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2012. - Т. 23 (1). - С. 40-44.

10. Сеитова Г.Н., Букреева Е.Б., Буйкин С.В., Бычкова О.Ю., Дементьева Е.А., Нестерович С.В., Пузырев В.П. Роль полиморфизма в промоторной области гена TNF в развитии хронической обструктивной болезни легких // Бюллетень сибирской медицины. - 2004. - №2. - С. 29-34.

11. Назарова Е.Л., Шардаков В.И., Демьянова В.Т., Загоскина Т.П., Зотина Е.Н. Об оценке полиморфизма генов цитокинов при В-клеточных опухолях лимфатической системы // Медицинская иммунология. - 2014. - Т. 16 (5). - С. 431-436.

Способ прогнозирования риска развития генитального эндометриоза для индивидуумов славянской популяции Северо-Западного федерального округа, включающий экстракцию ДНК из крови с последующим проведением мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфных вариантов гена VEGFA: VEGFA_Forw SEQ ID N1, VEGFA_Rev SEQ ID N2, VEGFA_Wt SEQ ID N3, VEGFA_M SEQ ID N4, и прогнозируют повышенный риск развития генитального эндометриоза в случае выявления аллеля С и генотипа СС полиморфизма rs833061 460 С/Т SEQ ID N5 гена VEGFA.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии. В дооперационном периоде проводят ультразвуковое доплеровское сканирование сосудов нижней конечности.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития послеоперационного воспаления после факоэмульсификации катаракты.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается нового штамма вируса африканской чумы свиней African swine fever virus генотипа 2 серотипа VIII сем. Asfarviridae, рода Asfivirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса африканской чумы свиней АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1 (Д).
Изобретение относится к прикладной биохимии и иммунологии и может быть использовано при конструировании гравиметрических иммуносенсоров на основе кварцевых резонаторов, а также при проведении опытно-конструкторских разработок.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и хирургии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики острого и подострого инфекционного эндокардита.

Группа изобретений относится к модуляции уровней белков сыворотки для лечения пациентов с синдромом хрупкой X-хромосомы (FXS) и нарушениями аутистического спектра (ASD).

Изобретение относится к медицине и касается способа иммуноферментного анализа с подавлением интерференции для определения противолекарственных антител к терапевтически активному антителу для лечения артрита.

Группа изобретений относится к устройству для тестирования на беременность и способу выполнения тестирования на беременность. Цифровое тестирующее устройство для обнаружения беременности содержит аналитические средства для измерения количества hCG, FSH и метаболита прогестерона в образце, взятом у субъекта; устройство отображения результата анализа пользователю; компьютеризованное средство управления, запрограммированное с верхним и нижним пороговыми значениями для hCG, с по меньшей мере одним пороговым значением для FSH и/или с по меньшей мере одним пороговым значением метаболита прогестерона и с алгоритмом для интерпретации результатов анализа.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к диагностике системного воспаления и прогнозирования тяжести течения и исхода заболевания у пациентов с хирургическим сепсисом.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для выявления предраковых изменений в молочной железе. В супернатанте пробы клеток крови пациента, инкубированных с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без РЭА, определяют концентрацию IL-1β.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и позволяет прогнозировать риск развития генитального эндометриоза для индивидуумов славянской популяции Северо-Западного федерального округа. Способ включает экстракцию ДНК из крови с последующим проведением мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфных вариантов гена VEGFA: VEGFA_Forw SEQ ID N1, VEGFA_Rev SEQ ID N2, VEGFA_Wt SEQ ID N3, VEGFA_M SEQ ID N4. Прогнозируют повышенный риск развития генитального эндометриоза в случае выявления аллеля С и генотипа СС полиморфизма rs833061 460 СТ SEQ ID N5 гена VEGFA. Способ прост в осуществлении, позволяет разрабатывать тактику лечения генитального эндометриоза с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Наверх