Биомаркеры для ревматоидного артрита и их применение

Предложен способ определения вероятности ревматоидного артрита (РА) у пациента, предусматривающий получение доступных последовательностей ДНК, выделенных из образца, который отобран у пациента; расчет относительной распространённости биомаркера на основании последовательностей ДНК, где биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius; и определение вероятности РА у пациента на основании относительной распространённости, сравнением относительной распространённости с предварительно определенным пороговым значением для принятия решения, что пациент имеет риск РА, если относительная распространённость биомаркера выше, чем предварительно определенное пороговое значение. Предложены также варианты способа оценки лечения РА, основанные на расчете относительной распространённости биомаркера, содержащего последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius, и сравнении относительной распространенности до и после лечения, либо сравнении относительной распространенности с предварительно определенным пороговым значением. Изобретения обеспечивают эффективное прогнозирование риска РА и определение эффекта лечения РА. 3 н.п. ф-лы, 10 ил., 6 табл.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] По заявке на данный патент испрашивается приоритет на основании заявки на патент согласно PCT No. PCT/CN2014/088068, PCT/CN 2014/088069 и PCT/CN 2014/088060, каждая из которых была подана 30 сентября, 2014, и полностью включена в данное описание путем ссылки.

Область техники

[0002] Настоящее открытие относится к области биомедицины и, в особенности, к биомаркерам и способам прогнозирования риска заболевания, в частности ревматоидного артрита (РА).

Область техники

[0003] Ревматоидный артрит (РА) представляет собой истощающее аутоиммунное нарушение, поражающее десятки миллионов людей по всему миру, и оно увеличивает смертность у пациентов с его сердечно-сосудистыми и другими системными осложнениями. Несмотря на успех в облегчении состояния у многих пациентов с РА с применением модифицирующих течение болезни противоревматических лекарственных средств (DMARD), разработка специфических и более эффективных терапий была затруднена недостаточным пониманием факторов, которые запускают или стимулируют заболевание. Исследование микробиома может выявить пробиотики, которые предотвращают или смягчают РА. Кишечная микробиота представляет собой ключевой средовой фактор для человеческого здоровья, с установленной ролью в ожирении, диабете, раке толстой кишки и т.д. Оральная микробиота является относительно неизученной по сравнению с кишечной микробиотой. Имеет место недостаток метагеномного анализа роли орального микробиома в заболевании. Также неизвестно, до какой степени маркеры орального и кишечного микробного заболевания должны конвергировать по их идентичности или функции.

Краткая сущность изобретения

[0004] Настоящее открытие относится к области биомедицины, и в особенности к биомаркерам и способам прогнозирования риска заболевания, в частности ревматоидного артрита (РА).

[0005] В данном описании раскрыты системы для определения вероятности заболевания упациента, или оценки лечения от заболевания.

[0006] В одном примере раскрыта система для определения вероятности заболевания у пациента. Система содержит процессор и носитель информации, содержащий программные инструкции для исполнения процессором. Программные инструкции вызывают исполнение процессором следующих стадий. У пациента отбирают образец. Из образца выделяют ДНК. Получают последовательности ДНК. Затем рассчитывают относительную распространенность биомаркера на основании последовательностей ДНК. Биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Определяют вероятность заболевания пациента на основании относительной распространенности.

[0007] В другом примере раскрыта система для оценки лечения от заболевания или идентификации терапевтических средств. Система содержит процессор и носитель информации, содержащий программные инструкции для исполнения процессором. Программные инструкции вызывают исполнение процессором следующих стадий. Для каждого пациента из множества пациентов, имеющих заболевание, получены первые последовательности ДНК, выделенные из первого образца, и вторые последовательности ДНК, выделенные из второго образца. Первый образец отбирают у пациента перед тем, как пациент получил лечение. Второй образец отбирают у пациента после того, как пациент получил лечение. Для каждого пациента рассчитывают первую относительную распространенность биомаркера на основании первых последовательностей ДНК; и рассчитывают вторую относительную распространенность биомаркера на основании вторых последовательностей ДНК. Биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Затем лечение оценивают на основании первых относительных распространенностей и вторых относительных распространенностей, рассчитанных для множества пациентов.

[0008] В отличающемся примере раскрыта система для оценки лечения заболевания или идентификации терапевтических средств. Система содержит процессор и носитель информации, содержащий программные инструкции для исполнения процессором. Программные инструкции вызывают исполнение процессором следующих стадий. Для каждого пациента из множества пациентов, имеющих заболевание, получают последовательности ДНК, где ДНК может быть выделена из образца, который отбирают у пациента после того, как пациент получил лечение; и рассчитывают относительную распространенность биомаркера на основании последовательностей ДНК. Биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Затем лечение оценивают на основании относительных распространенностей, рассчитанных для множества пациентов.

[0009] Также в данном описании раскрыты способы определения вероятности заболевания у пациента или оценки лечения от заболевания или идентификации терапевтических средств.

[0010] В одном примере раскрыт способ. У пациента отбирают образец. Из образца выделяют ДНК. Получают последовательности ДНК. Затем рассчитывают относительную распространенность биомаркера на основании последовательностей ДНК. Биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Определяют вероятность заболевания у пациента на основании относительной распространенности.

[0011] В другом примере раскрыт способ для оценки лечения от заболевания или идентификации терапевтических средств. Для каждого пациента из множества пациентов, имеющих заболевание, получены первые последовательности ДНК, выделенные из первого образца, и вторые последовательности ДНК, выделенные из второго образца. Первый образец отбирают у пациента перед тем, как пациент получил лечение. Второй образец отбирают у пациента после того, как пациент получил лечение. Для каждого пациента рассчитывают первую относительную распространенность биомаркера на основании первых последовательностей ДНК; и рассчитывают вторую относительную распространенность биомаркера на основании вторых последовательностей ДНК. Биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Затем лечение оценивают на основании первых относительных распространенностей и вторых относительных распространенностей, рассчитанных для множества пациентов.

[0012] В отличающемся примере, раскрыт способ для оценки лечения заболевания или идентификации терапевтических средств. Для каждого пациента из множества пациентов, имеющих заболевание, получают последовательности ДНК, где ДНК может быть выделена из образца, который отбирают у пациента после того, как пациент получил лечение; и рассчитывают относительную распространенность биомаркера на основании последовательностей ДНК. Биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Затем лечение оценивают на основании относительных распространенностей, рассчитанных для множества пациентов.

[0013] Также в данном описании раскрыт компьютерный программный продукт для определения вероятности заболевания у пациента. Компьютерный программный продукт содержит машиночитаемый носитель информации с хранящейся на нем программой. Программный код является исполнимым процессором и содержит инструкции для вызывания того, чтобы процессор исполнил следующие стадии. У пациента отбирают образец. Из образца выделяют ДНК. Получают последовательности ДНК. Затем рассчитывают относительную распространенность биомаркера на основании последовательностей ДНК. Биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Определяют вероятность заболевания у пациента на основании относительной распространенности.

[0014] Также в данном описании раскрыт биомаркер для определения вероятности заболевания у пациента или оценки лечения от заболевания или идентификации терапевтических средств. Биомаркер содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius или по меньшей мере одну из следующих метагеномных групп сцепления (MLG): MLG, состоящая из MLG ID NO: 2169; MLG, состоящая из MLG ID NO: 16600; и MLG, состоящая из MLG ID NO: 4643.

[0015] Дополнительные новые особенности представлены далее в части следующего далее описания, и отчасти будут очевидны для специалиста в данной области при рассмотрении следующих и прилагаемых чертежей или могут быть изучены посредством создания и выполнения примеров. Новые особенности идей настоящего изобретения могут быть воплощены и достигнуты на практике или посредством использования различных аспектов методологий, средств и комбинаций, приведенных далее в подробных примерах, рассматриваемых ниже.

Краткое описание черетежей

[0016] Способы и системы, описанные в данном описании, дополнительно описаны посредством иллюстративных вариантов осуществления. Эти иллюстративные варианты осуществления подробно описаны со ссылками на черетежи. Эти иллюстративные варианты осуществления являются неограничивающими иллюстративными вариантами осуществления, в которых подобные номера позиций представляют схожие структуры в нескольких видах черетежей, и в которых:

[0017] фиг. 1 демонстрирует блок-схему иллюстративного процесса, в котором биомаркеры идентифицированы и подтверждены для оценки риска РА, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0018] фиг. 2 иллюстрирует анализ результатов влияния фенотипов на кишечные, зубные и слюнные метагеномные группы сцепления (MLG), в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0019] фиг. 3 демонстрирует график GC-смерть для Lactobacillus sp. после усовершенствованной сборки в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0020] фиг. 4 демонстрирует колинеарность между сборкой и Lactobacillus salivarius, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0021] фиг. 5 демонстрирует стратификацию пациентов на основании ассоциированной с РА бактерии, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0022] фиг. 6 демонстрирует корреляции между относительными распространенностями кишечных и зубных MLG, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0023] фиг. 7 демонстрирует корреляции между относительными распространенностями кишечных и слюнных MLG, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0024] фиг. 8 демонстрирует корреляции между относительными распространенностями кишечных и слюнных MLG, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

[0025] фиг. 9 демонстрирует блок-схему иллюстративного процесса, в котором использован биомаркер для оценки риска РА, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; и

[0026] фиг. 10 демонстрирует блок-схему иллюстративного процесса, в котором использован биомаркер для оценки лечения от РА, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Подробное описание

[0027] Термины, применяемые в данном описании, имеют значения, обычно понимаемые рядовым специалистом в областях, имеющих отношение к настоящему описанию. Термины в единственном числе не подразумеваются относящимися к объекту в единственном числе, но включают в себя общий класс, из которого возможно было примерить для иллюстрации специфический пример. Терминология в данном описании применена для описания одного или более иллюстративных вариантов осуществления настоящего описания, но их использование не ограничивает настоящее описание, за исключением случаев, когда это обозначено в формуле изобретения.

[0028] Настоящее открытие описывает биомаркеры и способы использования биомаркеров для предсказания риска заболевания и определения эффекта лечения на заболевание, в частности заболевание РА. Долгое время инфекционные агенты связывали непосредственно с РА. Однако, долгое время идентичность и патогенность ассоциированного с РА агента(ов) по большому счету была неясной, эта проблема была дополнительно осложнена недавним повторным воспроизведением идеи о том, что человеческий организм представляет собой суперорганизм, несущий триллионы благотворных, а также вредоносных микроорганизмов.

[0029] Считается, что РА начинается и притаивается в некоторой другой локализации(ях) в организме в течение нескольких лет перед началом воспаления сустава. Исследование микробиома может выявить пробиотики, которые предотвращают или смягчают РА. Кишечная микробиота представляет собой ключевой средовой фактор для человеческого здоровья, с установленными ролями в ожирении, диабете, раке толстой кишки и т.д. Помимо функционирования в метаболизме нутриентов и ксенобиотиков, микробы в дистальном кишечнике взаимодействуют с нейроиммуноэндокринной системой и кровотококом с оказанием воздействия на весь человеческий организм. Кишечная микробиота стабильно ассоциирована c определенным индивидом в добавление к ее значению в связанных с заболеванием исследованиях. Гетерогенность кишечного микробиома в человеческой популяции предполагает, что лечение заболевания должно быть индивидуализировано в соответствии с кишечным микробиомом, роль которого в активации или инактивации лекарственных средств, иммуномодуляции и т.д. остается по большому счету неясной. Оральная микробиота является относительно неизученной по сравнению с кишечной микробиотой, при этом в проекте «Микробиом человека» (HMP) насчитывает только ~100 здоровых индивидов для WGS (секвенирование полного генома). Метагеномный анализ роли орального микробиома в заболеваниях был недостаточным, несмотря на то, что зубные и слюнные образцы являются гораздо более легко доступными во время клинических приемов, чем фекальные образцы. Также неизвестно, до какой степени маркеры орального и кишечного микробного заболевания должны конвергировать по их идентичности или функции.

[0030] Биомаркер обычно относится поддающемуся измерению индикатору некоторого биологического состояния. Термин “биомаркер”, как это применено в данном описании, относится к поддающемуся измерению веществу в организме, наличие которого служит признаком некоторого явления, такого как заболевание, инфекция или влияние окружающей среды. В частности, биомаркер в образце пациента с РА или нормального индивида может быть использован для оценки риска РА у индивида.

[0031] Фиг. 1 демонстрирует блок-схему иллюстративного процесса, в котором идентифицированы и подтверждены биомаркеры для оценки риска РА в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Во-первых, кишечный и/или оральный образцы отбирают в 102 как пациентов с РА, так и здоровых контрольных людей. Кишечные образцы могут включать в себя фекальные образцы, тогда как оральные образцы могут включать в себя зубные и слюнные образцы. Выполняют экстракцию ДНК для каждого образца в 104. Экстрагированную ДНК подвергают секвенированию, напр., посредством метагеномного секвенирования, в 106. Затем в 108 конструируют каталоги генов для кишечных и оральных образцов. Каталог генов для кишечных образцов может быть замещен или интегрирован с существующим каталогом генов, тогда как существует мало каталогов генов для оральных образцов.

[0032] На основании каталогов генов в 110 определяют относительные распространенности генов в образцах. Относительная распространенность определенного гена в образце может быть рассчитана, как приведено далее. Во-первых, рассчитывают количество копий каждого гена в секвенированных данных из образца как соотношение между временем, за которое ген может быть детектирован в образце, и длиной гена. Во-вторых, относительная распространенность определенного гена может быть рассчитана как соотношение между количеством копий определенного гена и суммой количеств копий всех генов в образце.

[0033] В 112 гены аннотированы на основании их идентичностей и функциональных свойств. Маркерные гены могут быть определены в 114 на основании их соответствующих относительных распространенностей, напр., когда маркерный ген демонстрирует различие в относительных распространенностях между контрольными и группами с РА. Эти маркерные гены выбирают и кластеризируют в 116 для конструирования MLG. Термин “MLG”, как это применено в данном описании, может относиться к группе генетического материала в метагеноме, который, вероятно, физически связан в виде компонента, а не является независимо распределенным. В 118 анализированы MLG как контрольной, так и группы с РА. Корреляции между каждым MLG и клиническими индексами определяют в 120. В 122, один или более биомаркеров идентифицируют из MLG на основании корреляций, напр., когда биомаркер демонстрирует позитивную корреляцию с преобладающим антителом иммунной системы слизистой оболочки или с главным сывороточным иммуноглобулином. В 124 биомаркеры подтверждены во всех образцах. Например, биомаркер может быть подтвержден, если он стабильно обнаружен обогащенным в кишечных и/или оральных образцах пациентов с РА.

[0034] В соответствии с вариантом осуществления настоящего открытия подтвержденый биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего открытия подтвержденный биомаркер может содержать по меньшей мере частичную последовательность SEQ ID NO: 1-593; SEQ ID NO: 594-1536; или SEQ ID NO: 1537-2594, как указано в таблице 2-2. Список последовательностей, представленный посредством настоящего, включает в себя нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, соответствующие вышеупомянутым SEQ ID.

[0035] Например, таблица 2-2, MLG ID NO: 2169 содержит по меньшей мере 593 ассоциированных с РА гена, идентифицированных из фекальных образцов. Эти 593 гена имеют полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1~593, соответственно. Как признает специалист в данной области MLG ID NO: 2169 может содержать другие гены в добавление к SEQ ID NO: 1~593. В варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере 80% (как по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100%) генов MLG ID NO: 2169 имеют по меньшей мере 85% (такую как по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100%) идентичности последовательности с полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1~593 и кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере 85% (такую как по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100%) идентичности последовательности с аминокислотными последовательностями, кодируемыми SEQ ID NO: 1~593. В другом варианте осуществления настоящего изобретения MLG ID NO: 2169 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1~593.

[0036] Подобным образом в таблице 2-2 MLG ID NO: 16600 содержит по меньшей мере 943 ассоциированных с РА гена, идентифицированных из фекальных образцов. Эти 943 гена имеют полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 594~1536, соответственно. Как признает специалист в данной области, MLG ID NO: 16600 может содержать другие гены в добавление к SEQ ID NO: 594~1536. В варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 80% (как по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100%) генов MLG ID NO: 16600 имеют по меньшей мере 85% (такую как по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100%) идентичности последовательности с полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 594~1536 и кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере 85% (такую как по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100%) идентичности последовательности с аминокислотными последовательностями, кодируемыми SEQ ID NO: 594~1536. В другом варианте осуществления настоящего изобретения MLG ID NO: 16600 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 594~1536.

[0037] Подобным образом таблица 2-2 MLG ID NO: 4643 содержит по меньшей мере 1058 ассоциированных с РА генов, идентифицированных из фекальных образцов. Эти 1058 генов имеют полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1537~2594, соответственно. Как признает специалист в данной области, MLG ID NO: 4643 может содержать другие гены в добавление к SEQ ID NO: 1537~2594. В варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 80% (как по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 100%) генов MLG ID NO: 4643 имеют по меньшей мере 85% (такую как по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100%) идентичности последовательности с полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1537~2594 и кодируют полипептиды, имеющие по меньшей мере 85% (такую как по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100%) идентичности последовательности с аминокислотными последовательностями, кодируемыми SEQ ID NO: 1537~2594. В другом варианте осуществления настоящего изобретения MLG ID NO: 4643 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1537~2594.

[0038] Настоящее описание дополнительно проиллюстрировано в следующих неограничивающих примерах. Если особо не указано иное, части и проценты являются массовыми и градусы являются градусами по Цельсию. Как очевидно для рядового специалиста в данной области, эти примеры, несмотря на указание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, и все агенты являются коммерчески доступными.

[0039] Примеры относятся к способам идентификации и подтверждения биомаркеров для оценки риска РА. В одном примере, выполняли метагеномное шотган-секвенирование для 212 фекальных образцов (77 не получавших терапии случаев РА, 80 неродственных здоровых контролей; 17 не получавших терапии случаев РА и 17 родственных здоровых контролей; 21 обработанных DMARD случаев) (таблицы 1-1, 1-2, 1-3). Это может быть применено для исследования кишечного микробиома у пациента с РА. Данные затем интегрировали в существующий кишечный микробный референсный каталог генов для получения набора из 5,9 миллионов генов (из 481 образца), что позволило насыщающее картирование считываний секвенирования (80,3±2,3%, среднее ± s.d.) (Li, J. et al. An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome. Nat. Biotechnol. (2014), включенный в данное описание посредством ссылки).

[0040] Также отобирали образцы зубных налетов и слюны у не получавших терапии пациентов с РА и здоровых контролей, и выполняли метагеномное секвенирование на 105 зубных образцах и 98 образцах слюны (зубные /слюнные образцы 54/51 не получавших терапии случаев РА и 51/47 здоровых контролей; 69 пациентов, имеющих полный набор фекальных, зубных и слюнных образцов) (таблицы 1-1, 1-2, 1-3). Это может продемонстрировать, что дисбиоз также является очевидным в оральном микробиоме, после демонстрации дисбиоза в кишечном микробиоме РА. Сборка de novo этих последовательностей привела к каталогу генов из 3,2 миллиона генов, с 76,6±1,8% и 70,7±7,3% (среднее ± s.d.) картирований зубных и слюнных считываний секвенирования, соответственно.

[0041] Группа исследования описана далее. РА был диагностирован в больнице при Пекинском объединенном медицинском колледже в соответствии с классификационными критериями 2010 ACR/EULAR (Американская коллегия ревматологии/Европейская антиревматическая лига). Всю фенотипическую информацию собирали во время первоначального приема пациентов в больницу после стандартных процедур. 21 фекальный образец из обработанных DMARD пациентов был только включен в 212 образцов, использованных для конструирования кишечного микробного каталога генов, и их не анализировали в этом примере. Пациенты с РА имели возраст между 18 и 65 годами, с продолжительностью заболевания по меньшей мере 6 недель, с затронутыми по меньшей мере 1 отекшим суставом и 3 болезненными суставами. Пациентов исключали, если они имели историю хронических серьезных инфекций, любую действующую инфекцию или любой тип рака. Исключали беременных или кормящих женщин. Все пациенты были информированы о риске бесплодия, и исключали пациентов с желанием иметь детей. Несмотря на то, что некоторые из пациентов страдали от РА в течение ряда лет, они являлись не получавшими DMARD потому, что у них не был диагностирован РА в местных больницах перед посещением Больницы при Пекинском объединенном медицинском колледже, и они принимали только болеутоляющие средства для облегчения симптомов РА.

[0042] Здоровая контрольная группа удовлетворяла следующим критериям включения: возраст 18-65 лет; имеющие нормальный уровень в недавней скрининге на функцию печени и почек, рутинное исследование крови, скорость оседания эритроцитов, уровень глюкозы в крови натощак, липиды крови и кровяное давление. Пациентов исключали, если они имели историю хронической тяжелой инфекции, какую-либо действующую инфекцию, любой тип рака или аутоиммунное заболевание. Исключали беременных или кормящих женщин. Пациентов, которые получали антибиотическое лечение менее чем за 1 месяц перед участием в этом исследовании, также исключали.

[0043] Лечение выполняли с основанным на метотрексате (MTX) DMARD. 97% пациентов получали MTX отдельно (первоначально 7,5 мг раз в неделю, 15 мг (максимально 0,3 мг/кг) раз в неделю с 4 недели и далее; дополненный с 10 мг фолата QW раз в неделю), T2 отдельно (20 мг три раза в сутки) или MTX плюс T2. Другие лекарственные средства, применяемые для оставшихся пациентов, содержали лефлуномид (LEF), преднизолон (pred), гидроксихлорохин (HCQ) и этанерцепт, которые не подвергались сравнению из-за малой численности выборки. Как применено в настоящем описании, “QW” означает один раз в неделю; “TID” означает три раза в сутки; и “T2” означает гликозиды Tripterygium wilfordii (thunder god vine). На основании уменьшения DAS28-ESR после лечения образцы пациентов разделяли на образцы с хорошим, с умеренным ответом и без улучшения, в соответствии с критериями ответа EULAR. Так как для посещения Больницы при Пекинском объединенном медицинском колледже прибыли пациенты со всего Китая, не все образцы пациентов были доступны после лечения.

[0044] Исследование было одобрено экспертным советом организации в Больнице при Пекинском объединенном медицинском колледже и (Beijing Genomics Institute) BGI-Shenzhen.

[0045] Отбор образцов описан далее. Фекальные образцы отбирали в Больнице при Пекинском объединенном медицинском колледже, транспортировали замороженными и экстрагировали в BGI-Shenzhen, как описано ранее (Qin, J. et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature 490, 55-60 (2012), включенном в данное описание посредством ссылки). Зубные налеты соскабливали с зубных поверхностей с применением офтальмологических щипцов до тех пор пока не был достигнут объем 3 мкл. Образец переносили в 200 мкл 1x буфера для лизиса, содержащего 10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,5% Tween 20 и 200 мкг/мл протеиназы K (Fermentas) и инкубировали в течение 2 часов при 55°C. Лизис завершали инкубированием при 95°C в течение 10 минут, и образцы замораживали при -80°C до транспортировки. Экстракцию ДНК выполняли в соответствии с протоколом для фекальных образцов. Для слюны 100 мкл слюны добавляли в 100 мкл 2x буфера для лизиса. Заднюю стенку глотки подвергали тампонированию и добавляли в ту же пробирку. Образцы затем лизировали и экстрагировали в качестве зубных образцов.

[0046] Все доступные образцы анализировали (таблицы 1-1, 1-2, 1-3). Некоторые из фекальных образцов исключали из-за засорения, или неприемлемой консервации образцов; некоторые из оральных образцов исключали из-за низкой концентрации микробной ДНК.

[0047] Метагеномное секвенирование и сборка описаны далее. Далее выполняли метагеномное секвенирование со спаренными концами на Illumina platform (размер вставки 350 п.о., длина считывания 100 п.о.), и контролировали качество считываний секвенирования и собирали в контиги de novo с применением SOAPdenovo v2.04 (Luo, R. et al. SOAPdenovo2: an empirically improved memory-efficient short-read de novo assembler. Gigascience 1, 18 (2012), включенным в данное описание посредством ссылки), как описано ранее (Qin et al. 2012, supra). Средняя степень контаминации хозяина составляла 0,37% для фекальных, 5,55% для зубных и 40,85% для образцов слюны.

[0048] Конструирование каталога генов описано далее. Прогнозирование генов из собранных контигов выполняли с применением GeneMark v2.7d. Избыточные гены удаляли с примением BLAT с порогом 90% перекрывания и 95% идентичности (гэпы не разрешены), с получением в результате неизбыточного каталога генов из 3800011 генов для 212 фекальных образцов (содержащих 21 обработанных с DMARD образцов) и каталога из 3234997 генов для 203 не получавших терапии оральных образцов (105 образцов зубных налетов и 98 образцов слюны). Каталог генов из фекальных образцов дополнительно интегрировали в существующий кишечный микробный референсный каталог из 4,3 миллиона генов с применением BLAT (95% идентичности, 90% перекрывания) (Qin et al. 2012, supra), с получением в результате итогового каталога из 5,9 миллионов генов. Относительные распространенности генов определяют выравниванием считывания секвенирования с высоким качеством кишечным или оральными референсным каталогом генов. Подробная процедура для выравнивания представлена в Qin et al. 2012, supra.

[0049] Таксономическая аннотация и расчет распространенности описаны далее. Таксономическое присвоение предсказанных генов выполняли в соответствии с базой данных IMG (v400) на основании внутреннего процесса, подробно описанного ранее (Qin et al. 2012, supra), с 70% перекрывания и 65% идентичности для присвоения типа, 85% идентичности для рода и 95% идентичности для видов. Относительную распространенность таксона рассчитывали из относительной распространенности его генов.

[0050] В одном примере относительная распространенность определенного гена в образце может быть рассчитана, как приведено далее. Во-первых, рассчитывали количество копий каждого гена в секвенированных данных из образца как соотношение между временем, за которое ген может быть детектирован в образце (т.е., количество картированных считываний), и длиной гена. Во-вторых, относительная распространенность определенного гена могла быть рассчитана как соотношение между количеством копий определенного гена и суммой количеств копий всех генов в образце.

[0051] Значительные различия в относительной распространенности таксона между пациентами и здоровыми контролями идентифицировали посредством критерия суммы рангов Уилкоксона с p<0,05.

[0052] Метагеномное исследование с широкой ассоциацией (MGWAS) описано далее. Для сравнения случая с контролем фекального микробиома удаление генов, детектированное в менее чем 10% образцов, привело к набору из 2007643 генов. 117219 генов демонстрировали различия в относительной распространенности между контролями и случаями (Критерий суммы рангов Уилкоксона, FDR < 0,3). Эти маркерные гены затем кластеризовали в MLG в соответствии с их варьированием распространенности по всем образцам (Qin et al. 2012, supra). MLG представляет собой обобщенную концепцию вместо концепции видов для метагенома. Термин “MLG”, как это применено в данном описании, может относиться к группе генетического материала в метагеноме, который, более вероятно, физически связан в виде компонента, чем является независимо распределенным. Это может помочь избежать потребность в полном определении специфических микробных видов, представленных в метагеноме, что является важным, учитывая, что существует большое количество неизвестных организмов и существует часто встречающийся латеральный перенос генов (LGT) между бактериями. MLG может быть использована для уменьшения и структурной организации избыточных метагеномных данных и для содействия таксономическому описанию. На основании генного профиля MLG может быть идентифицирована как группа генов, которая совместно существует среди различных индивидуальных образцов и имеет соответствующий уровень распространенности и таксономическое присвоение.

[0053] Для конструирования зубных MLG, выбирали 371990 маркерных генов (Критерий суммы рангов Уилкоксона, FDR < 0,1) из 1900774 гена (представленных в по меньшей мере 10% образцов). Для слюнных MLG выбирали 258055 маркерных генов (Критерий суммы рангов Уилкоксона, FDR < 0,1) из 2030636 генов (представленных в по меньшей мере 10% образцов).

[0054] Таксономическое присвоение и профилирование распространенности MLG выполняли в соответствии с таксономией и относительной распространенностью их составляющих генов, как описано ранее (Qin et al. 2012, supra). Все гены из одного MLG выравнивали с референсными микробными геномами на нуклеотидном уровне и базе данных NCBI-nr (National Center for Biotechnology Information) на белковом уровне. Из выравниваний с референсными микробными геномами может быть получен список хорошо картированных бактериальных геномов для каждой MLG и можно упорядочить эти бактериальные геномы в соответствии с долей генов, которые могли быть картированы в бактериальном геноме, а также средней идентичностью выравниваний.

[0055] Присвоение к видам может требовать более чем 90% генов в одной MLG для выравнивания с геномом видов с более чем 95% идентичности, 70% перекрывания запроса. Присвоение MLG к роду может требовать более чем 80% его генов для выравнивания с геном с 85% идентичности как в последовательностях ДНК, так и в и белковых последовательностях.

[0056] MLG дополнительно кластеризовали в соответствии с корреляцией Спирмана между их распространенностями во всех образцах независимо от состояния случай-контроль.

[0057] Корреляцию MLG из различных локализаций в организме анализировали таким же образом у 69 пациентов (36 контролей, 33 не получавших терапии случая) с фекальными, зубным и слюнными образцами.

[0058] Далее выполняли канонический анализ соответствий (CCA) на MLG профиль распространенности контрольных и РА образцов для оценки влияния каждого из приведенных факторов (Feng, Q. et al. Gut microbiome development along the colorectal adenoma carcinoma sequence. Nat. Commun. 6, 6528 (2015), полностью включенный в данное описание путем ссылки).

[0059] Идентифицировали 117219 генных маркеров, дифференциально обогащенных у пациентов с РА или контролей (Критерий суммы рангов Уилкоксона, FDR < 0,3). Это могло помочь точно определить особенности ассоциированной с РА кишечной микробиоты. Метагеномные группы сцепления (MLG) рассчитывали на основании ковариаций распространенностей между генами среди образцов (Qin et al. 2012, supra). 88 MLG, которые содержали по меньшей мере 100 генов, разделяли в соответствии с их направлением обогащения в каноническом координатном анализе (CCA), подтверждая что они преимущественно ассоциированы со статусом РА.

[0060] 171 зубную и 142 слюнных MLG, которые содержали по меньшей мере 100 генов, разделяли в соответствии с их направлением обогащения в CCA, подтверждая их ассоциацию с РА.

[0061] Ассоциация между MLG и клиническими индексами описана далее. Выполняли корреляцию Спирмана между относительной распространенностью каждой MLG и непрерывными переменными, измеренными клинически, как описано ранее (Karlsson, F. H. et al. Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control. Nature 498, 99-103 (2013), полностью включенном в данное описание путем ссылки).

[0062] Численные ковариации исследовали между относительной распространенностью MLG и клиническими индексами с применением корреляции Спирмана. Это могло помочь исследовать диагностическое или прогностическое значение кишечного микробиома для РА.

[0063] В одном примере может быть оценена относительная распространенность MLG в образце на основании величин относительной распространенности генов из этой MLG. Для этой MLG было возможно отбросить гены, которые были среди 5% с наиболее высокой и наиболее низкой относительной распространенностью, соответственно, и затем подбирали распределение Пуассона для оставшегося. Оцененное среднее распределения Пуассона может быть интерпретировано, как относительная распространенность этой MLG. Может быть получен профиль MLG в числе всех образцов для дальнейших анализов. Относительная распространенность биомаркера в образце может быть рассчитана подобным образом.

[0064] Фиг. 2 иллюстрирует результаты анализа на влияние фенотипов на кишечные, зубные и слюнные MLG, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В этом примере, фиг. 2 демонстрирует результат CCA на влияние фенотипов на кишечные (a), зубные (b) или слюнные (c) MLG. Не анализировали категориальные или континуальные фенотипы, отсутствовавшие в половине образцов. Сплошные точки представляют обогащенные контролем MLG, тогда как полые точки представляют собой обогащенные РА MLG. Обогащенные РА MLG, напр., Clostridium asparagiforme, Bacteroides sp. и Lactobacillus sp. (наиболее родственные L. salivarius, таблица 2-1, таблица 2-2) положительно коррелировали с преобладающим антителом иммунной системы слизистых оболочек, IgA, или с главным сывороточным иммуноглобулином, IgG.

[0065] В то же время, анаэробы такие как Lactobacillus salivarius, Atopobium sp. и Cryptobacterium curtum, были обнаружены как в слюнных, так и зубных образцах пациента с РА.

[0066] Сборка более релевантных по отношению к РА геномов описана далее. Затем было возможно собрать бактериальные геномы непосредственно из MLG и их ассоциированных считываний метагеномного секвенирования с применением программного пакета в семействе SOAP (программа для выравнивания коротких олигонуклеотидов), напр., SOAPMeta (заявка на патент PCT/CN2012/079492, включенная в данное описание посредством ссылки). Для Lactobacillus sp. (наиболее родственные Lactobacillus salivarius), сборка была достаточно полной после одного цикла высокотехнологичной сборки с применением данных пациента с РА (таблица 3), и она демонстрировала колинеарность с референсным геномом Lactobacillus salivarius CECT (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo) 5713.

[0067] Фиг. 3 и фиг. 4 демонстрируют предварительный геном Lactobacillus sp. Фиг. 3 демонстрирует график GC-смерть для Lactobacillus sp. после высокотехнологичной сборки, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Фиг. 4 демонстрирует колинеарность между сборкой (из образца D201) и референсным предварительным геномом Lactobacillus salivarius CECT 5713 из NCBI (NC_017481,1), в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Функции, кодируемые геномом, по большому счету являются сходными с функциями в Lactobacillus salivarius CECT 5713 или другими Lactobacillus strains, за исключением того, что эта обогащенная РА Lactobacillus sp. кодирует различные модификации клеточной стенки, которые должны быть распознаны иммунной системой хозяина.

[0068] Соответствие между кишечным и оральным микробиомом описано далее. Несмотря на различия между кишечными и оральными бактериальными таксонами, ассоциированными c РА, Lactobacillus salivarius были обнаружены единообразно обогащенными у пациента с РА, кишечные и слюнные MLG позитивно коррелировали с IgG, и зубные L. salivarius демонстрировали второе по величине отношение шансов среди всех зубных MLG (таблица 2-1). Эти результаты делают их сильными кандидатами на роль биомаркеров на РА. Кроме того, L. salivarius был более избыточным в очень активных (DAS28 >5,1) случаях РА по сравнению с активностью от слабой до умеренной (DAS28 ≤5,1) случаев РА (таблица 4, p=0,017, 0,036, 0,084 в экскрементах, зубных налетах и слюне, соответственно, Критерий суммы рангов Уилкоксона), что подчеркивает его потенциал для неинвазивного прогноза.

[0069] В соответствии с вариантом осуществления настоящего открытия, биомаркер для оценки или диагностирования РА содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего открытия биомаркер для оценки или диагностирования РА может содержать по меньшей мере частичную последовательность SEQ ID NO: 1-593; SEQ ID NO: 594-1536; или SEQ ID NO: 1537-2594, как указано в таблице 2-2. Список последовательностей, представленный посредством настоящего, включает в себя нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, соответствующие вышеупомянутым SEQ ID.

[0070] Фиг. 5 демонстрирует стратификацию пациентов на основании ассоциированной с РА бактерии, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Относительные распространенности MLG Lactobacillus salivarius фекальных, зубных и слюнных отображены графически, и различие между очень активными и умеренно активными случаями РА является значительным в фекальных и зубных образцах (p=0,017, 0,036, 0,084 соответственно, Критерий суммы рангов Уилкоксона). Идентификационные номера MLG указаны в скобках после аннотаций. Классификацию заболевания осуществляли в соответствии с критерием Европейской антиревматической лиги (EULAR), т.е., 3,2 < DAS28 ≤ 5,1, умеренное; DAS28 > 5,1, очень активное (таблица 4).

[0071] Было возможно подсчитать корреляции между относительными распространенностями фекальных, зубных и слюнных MLG среди образцов (n=69). Это могло помочь лучше понять распределение ассоциированных с РА бактерий по локализациям в организме. L. salivarius из трех локализаций (Lactobacillus sp. в кишечнике) демонстрировали позитивную корреляцию друг с другом (таблица 5), подтверждая присутствие бактерии во множестве локализаций в организме.

[0072] Если классификацию на основании двух локализаций применяли для отклонения от некоторых неправильных классификаций на основании другой локализации, ни один из пациентов не был неправильно классифицирован за исключением одного родственного контроля, что подчеркивает возможность изучения микробиома во множественных локализациях (таблица 6). Более того, эти результаты указывают на то, что все из фекальных, зубных и слюнных микробных маркеров были исключительно пригодны для диагноза и контроля течения РА, при этом зубной микробиом (с вероятностью РА 0,94), вероятно, является более чувствительным, чем кишечный микробиом (с вероятностью РА 0,73).

[0073] Фиг. 6-8 демонстрируют корреляцию между кишечными и оральными MLG. Фиг. 6 демонстрирует корреляции между относительными распространенностями кишечных и зубных MLG, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Фиг. 7 демонстрирует корреляции между относительными распространенностями кишечных и слюнных MLG, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В соответствии с обеими фиг. 6 и фиг. 7 рассчитывали корреляцию Спирмана между относительными распространенностями кишечных и зубных или слюнных MLG (≥ 100 генов) для пациентов с полным набором фекальных, зубных и слюнных образцов (n=69). Подобные корреляции наблюдали с применением других измерений, т.е TIGRESS (Trustful Inference of Gene Regulation using Stability Selection), Boruta, CLR (Context Likelihood of Relatedness), Bicor (Biweight midcorrelation), MINE (Maximal Information Nonparametric Exploration). Размер узлов отражает количество генов в каждой MLG. MLG окрашивали в соответствии с локализацией в организме и направлением обогащения. Идентификационные номера MLG приведены в скобках, если более чем одна MLG аннотирована к одинаковым видам или неклассифицированным видам в роде (sp.). Возможные названия штаммов приведены в таблице 2-1 для всех MLG с более чем 50% генов, аннотированных к штамму(ам), даже, если не были удовлетворены критерии для точного указания видов или рода. Сплошные линии (грани) представляют коэффициент корреляции Спирмана (cc) > 0,4, p < 0,05; пунктирные линии (грани) представляют cc < -0,4, p < 0,05.

[0074] Фиг. 8 демонстрирует корреляции между относительными распространенностями кишечных и слюнных MLG, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В соответствии с фиг. 8 MLG окрашивали в соответствии с локализацией в организме и направлением обогащения. Идентификационные номера MLG приведены в скобках, если более чем одна MLG аннотирована к одинаковым видам или неклассифицированным видам в роде (sp.). Возможные названия штаммов приведены в таблице 2-1 для всех MLG с более чем 50% генов аннотированных штамму(ам), даже, если не были удовлетворены критерии для точного указания видов или рода. Сплошные линии (грани) представляют коэффициент корреляции Спирмана (cc) > 0,6, p < 0,05; пунктирные линии (грани) представляют cc < -0,6, p < 0,05.

[0075] Фиг. 9 демонстрирует блок-схему иллюстративного процесса, в котором использован биомаркер для оценки риска РА, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Во-первых, кишечные и/или оральные образцы отбирали в 902 у индивида для оценки риска РА индивида. Кишечные образцы могли включать в себя фекальные образцы, тогда как оральные образцы могли включать в себя зубные и слюнные образцы. Экстракцию ДНК выполняли для каждого образца в 904. Экстрагированную ДНК подвергали секвенированию, напр., посредством метагеномного секвенирования в 906, для получения последовательности ДНК. В одном варианте осуществления могли быть получены последовательности ДНК полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с праймером, который гибридизовался с по меньшей мере некоторыми из ДНК. В другом варианте осуществления могли быть получены последовательности ДНК посредством использования одного или более зондов, которые специфически распознавали по меньшей мере некоторые из ДНК.

[0076] Затем в 908 гены биомаркера идентифицировали из каждого образца на основании каталога генов. Например, биомаркер может представлять собой обогащенные РА MLG, напр., Clostridium asparagiforme, Bacteroides sp. и Lactobacillus sp. (наиболее родственными L. salivarius) и/или анаэробы, такие как Lactobacillus salivarius, Atopobium sp. и Cryptobacterium curtum. В одном варианте осуществления Lactobacillus salivarius является предпочтительным биомаркером для оценки риска РА. Термин “ген”, как это применено в данном описании, может относиться к любой последовательности ДНК.

[0077] Относительные распространенности биомаркера в каждом образце определяли в 910. Например, было возможно составить список генов биомаркера среди последовательностей ДНК в образце в порядке соответствующих относительных распространенностей генов. После удаления верхних 5% генов с наиболее высокой относительной распространенностью и нижних 5% генов с наиболее низкой относительной распространенностью, относительные распространенности оставшихся генов биомаркера могли быть усреднены и или приведены в соответствие с распределением Пуассона для определения относительной распространенности биомаркера в образце.

[0078] В 912 относительные распространенности сравнивали с предварительно определенными пороговыми значениями. Предварительно определенное пороговое значение может быть связано с типом образца, напр., фекальных, зубных или слюнных образцов, и определено на основании статистического анализа, связанного с биомаркером. Риск РА индивида оценивали на основании сравнения в 914. Например, так как L. salivarius является более избыточным в очень активных (DAS28 >5,1) случаях РА по сравнению со случаями РА с активностью от слабой до умеренной (DAS28 ≤5,1), пороговое значение могло быть установлено как относительная распространенность L. salivarius, которая соответствует DAS28 =5,1. Затем, риск РА индивида является высоким, если относительная распространенность L. salivarius является более высокой, чем пороговое значение. В другом варианте осуществления относительные распространенности различных типов образцов могут быть комбинированы для оценки риска РА.

[0079] Различные иллюстративные пороговые значения относительной распространенности MLG для классификации приведены в таблице 6, для различных типов образцов. Когда относительная распространенность MLG является более высокой, чем пороговое значение, индивид имеет риск РА.

[0080] В другом варианте осуществления риск РА может быть оценен на основании классификатора, который генерирован на основании тренировочной совокупности. Для данной относительной распространенности биомаркера, классификатор может указывать вероятность того, что индивид имеет РА. Тренировочная совокупность может содержать относительные распространенности биомаркера в образцах множества пациентов, имеющих РА, и множества пациентов, не имеющих РА. Классификатор может быть генерирован на основании Многовариантной статистической модели, напр., модели randomForest. Например, для некоторых относительных распространенностей биомаркера соответствующая вероятность РА может быть определена на основании классификатора. Затем, может быть оценен риск РА индивида на основании вероятности. Например, вероятность более высокая, чем предварительно определенное пороговое значение, указывает на то, что пациент имеет или имеет риск наличия РА.

[0081] Модифицация лечения DMARD РА микробиома описана далее. Было возможно подсчитать MLG перед и после лечения (в течение 3 месяцев, за исключением 6 образцов) в фекальных образцах 40 индивидов (таблица 1-3). Это могло помочь исследовать, востанавливает ли лечение посредством DMARD здоровый микробиом. Большинство пациентов получало якорное лекарственное средство метотрексат (MTX), традиционный китайский лекарственный компонент Tripterygium wilfordii (thunder god vine), гликозиды (T2), или и то, и другое (MTX+T2) в качестве DMARD. До начала лечения или обогащенные РА MLG, такие как BDM-3355 (BDM, перед DMARD) и Bacteroides sp. (с мотивами сходными с коллагеном XI и HLA-DR4/1) не были уменьшены после лечения с T2 на большее значение, чем с MTX или MTX+T2, тогда как обогащенные после лечения MLG, такие как ADM-2636 (наиболее родственные Escherichia coli) и ADM-2944 (ADM, после DMARD) были более повышены после T2. Но применение MTX или MTX+T2 может быть лучше в других аспектах, напр., более высокие уровни Bacteroides caccae и Haemophilus sp. Эти данные могут указывать на то, что различные DMARD модулируют кишечный микробиом по-другому, и могут предполагать, что обзор кишечного микробиома может помочь оптимизировать выбор DMARD и вспомогательных терапий.

[0082] Лечение DMARD продемонстрировало многообещающую модуляцию орального микробиома с некоторыми обогащенными контролем зубными или слюнными MLG, напр., Aggregatibacter sp., представленным в большом количестве у пациентов с хорошим ответом по сравнению с пациентами с умеренным или без улучшения. Обогащенные контролем зубные MLG, такие как Con-16138, Prevotella intermedia, являлись наиболее избыточными у пациентов, подвергаемых лечению с MTX+T2 по сравнению с T2 отдельно или MTX отдельно, тогда как RA-9938, RA-10684 и RA-9998 были наиболее снижены у пациентов, подвергаемых лечению с MTX отдельно. Также наблюдали в образцах слюны дифференциальные модуляции ассоциированных с РА или с контролем MLG посредством MTX, MTX+T2 или T2. Стоит отметить, что не было детектировано значительного различия в Lactobacillus salivarius в каком-либо из вышеупомянутых сравнений, что указывает на то, что кишечный и оральный микробиом не являлся полностью здоровым после лечения. Таким образом, как кишечный, так и оральный микробиом отвечали частично на DMARD и должны подвергаться контролю в соответствии с тяжестью РА и выбранного DMARD.

[0083] Фиг. 10 демонстрирует блок-схему иллюстративного процесса, в котором биомаркер использован для оценки лечения, относящегося к РА, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Во-первых, кишечный и/или оральный образцы отбирали в 1002 у пациентов с РА перед лечением. Кишечные образцы могли включать в себя фекальные образцы, тогда как оральные образцы могли включать в себя зубные и слюнные образцы. Как было указано выше, лечение могло представлять собой лечение DMARD, подобное MTX, T2 или MTX+T2, или могло представлять собой любое лечение от РА. В 1004 кишечный и/или оральный образцы отбирали у тех же пациентов с РА после того, как они получили лечение. Экстракцию ДНК выполняли для каждого образца в 1006. Экстрагированную ДНК подвергали секвенированию в 1008, напр., посредством метагеномного секвенирования, для получения последовательности ДНК. В одном варианте осуществления могли быть получены последовательности ДНК посредством ПЦР с праймером, который гибридизовался с по меньшей мере некоторыми из ДНК. В другом варианте осуществления могли быть получены последовательности ДНК посредством использования одного или более зондов, которые специфически распознавали по меньшей мере некоторые из ДНК.

[0084] Затем в 1010, гены биомаркера идентифицировали из каждого образца на основании каталога генов. Например, биомаркер мог представлять собой обогащенные РА MLG, напр., Clostridium asparagiforme, Bacteroides sp. и Lactobacillus sp. (наиболее родственные L. salivarius) и/или анаэробы, такие как Lactobacillus salivarius, Atopobium sp. и Cryptobacterium curtum. В одном варианте осуществления предпочтительным биомаркером для оценки от РА являлась Lactobacillus salivarius.

[0085] Относительные распространенности биомаркера в каждом образце определяют в 1012. Например, было возможно составить список генов биомаркера в образце в порядке их соответствующих относительных распространенностей. После удаления 5% генов с наиболее высокой относительной распространенностью и нижних 5% генов с наиболее низкой относительной распространенностью, относительные распространенности оставшихся генов биомаркера могли быть усреднены или приведены в соответствие с распределением Пуассона для определения относительной распространенности биомаркера в образце. Это могло быть выполнено для образцов перед и после лечения.

[0086] В 1014 было возможно сравнить относительные распространенности биомаркера перед и после лечения для каждого РА пациента. Например, относительные распространенности L. salivarius в одинаковом типе образца (напр., фекальные, зубные или слюнные образцы) могли быть определены как перед тем, как РА пациент получал лечение, и после того, как РА пациент получал лечение. Затем относительные распространенности перед и после лечения могли быть сравнены для определения того, если L. salivarius являлся менее избыточным после лечения. Если это так, то лечение демонстрировало некоторый эффект по меньшей мере для этого пациента. Подобные сравнения могли быть выполнены для всех пациентов с РА с собранными образцами.

[0087] Затем лечение оценивали на основании сравнения(ий) в 1016. Например, для всех пациентов с РА при оценке, относительные распространенности L. salivarius перед и после лечения могли быть сравнены для того, чтобы оценить являлся ли L. salivarius менее избыточным после лечения. В одном варианте осуществления, если относительная распространенность L. salivarius была снижена после лечения на большее значение, чем у данного процента пациентов с РА, то лечение могло быть определено как являющееся эффективным. В другом варианте осуществления, если средняя относительная распространенность L. salivarius среди пациентов с РА снижалась на определенное количество после лечения, лечение могло быть определено являющимся эффективным.

[0088] В другом варианте осуществления лечение, относящееся к РА, могло быть оценено просто на основании образца, отобранного у пациентов с РА после лечения. В этом случае относительные распространенности биомаркера, напр., L. salivarius, могли быть рассчитаны для всех пациентов после лечения. Затем, относительные распространенности могли быть сравнены с предварительно определенным пороговым значением для определения того, если лечение снижает относительную распространенность биомаркера до безопастного диапазона, что указывало на отсутствие риска или низкий риск РА. Если этот так, то лечение могло быть оценено как эффективное. Лечение также возможно было оценить с классификатором.

[0089] В соответствии с различными вариантами осуществления биомаркер, напр., L. salivarius, может иметь различные применения. Настоящее открытие включает в себя, но не ограничено ими: L. salivarius для применения в качестве биомаркера; L. salivarius для применения в качестве поддающегося измерению индикатора РА; L. salivarius для применения для оценки или прогнозирования риска РА у пациента; L. salivarius для применения для диагностирования РА у пациента; и L. salivarius для применения для оценки лечения от заболевания, напр., РА.

[0090] В одном примере было возможно применить биомаркер для оценки или прогнозирования риска РА у пациента, подвергавшегося тестированию. У пациента отбирали образец. Из образца выделяли ДНК. Получали последовательности ДНК. Затем, рассчитывали относительную распространенность биомаркера на основании последовательностей ДНК. Биомаркер может содержать последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Вероятность того, что пациент имел заболевание могла быть определена на основании относительной распространенности. Риск РА у пациента было возможно оценить или предсказать на основании вероятности.

[0091] В другом примере возможно было применить биомаркер для оценки лечения от заболевания, напр., РА. Для каждого пациента из множества пациентов, имеющих заболевание, отбирали образец у пациента после того, как пациент получал лечение. Выделяли ДНК из образца. Получали последовательности ДНК. Затем рассчитывали относительную распространенность биомаркера на основании последовательностей ДНК. Биомаркер может содержать последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Лечение было возможно оценить на основании относительных распространенностей, рассчитанных для множества пациентов.

[0092] В еще одном примере биомаркер возможно было применить для оценки лечения от заболевания, напр., РА. Для каждого пациента из множества пациентов, имевших заболевание, первый образец отбирали у пациента перед тем, как пациент получал лечение, и второй образец отбирали у пациента после того, как пациент получал лечение. Рассчитывали первую относительную распространенность биомаркера на основании первого образца. Рассчитывали вторую относительную распространенность биомаркера на основании второго образца. Биомаркер содержал последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. Затем лечение могло быть оценено на основании первых относительных распространенностей и вторых относительных распространенностей, рассчитанных для множества пациентов.

[0093] В соответствии с вариантом осуществления настоящего открытия биомаркер для оценки лечения от заболевания, напр., РА, содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего открытия биомаркер для оценки лечения от заболевания, напр., РА, может содержать по меньшей мере частичную последовательность SEQ ID NO: 1-593; SEQ ID NO: 594-1536; или SEQ ID NO: 1537-2594, как указано в таблице 2-2. Список последовательностей, представленный посредством настоящего, включает в себя нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, соответствующие вышеупомянутым SEQ IDs.

[0094] Несмотря на то, что были продемонстрированы и описаны иллюстративные варианты осуществления, специалист в данной области примет во внимание, что вышеприведенные варианты осуществления не могут быть истолкованы как ограничивающие открытие, и могут быть внесены изменения, альтернативы и модификации в варианты осуществления без отклонения от основной идеи, принципов и объема настоящего открытия.

Таблица 1-1. Образцы, примененные для конструирования каталога генов

Группа	случай	контроль	общее количество
Образцы, примененные для конструирования каталога генов	фекальные образцы	115 (включая 21 из обработанных DMARD - пациентов)	97	212
	образцы зубных налетов	54	51	105
образцы слюны	51 (включая 4 из обработанных DMARD - пациентов)	47	98

Таблица 1-2. Выборочная информация о тренировочных совокупностях (выбранная для образцов, примененных для конструирования каталога генов в таблице 1-1)

Группа	случай	контроль	общее количество
Тренировочные совокупности	фекальные образцы	77	80	157
	образцы зубных налетов	50	50	100
образцы слюны	47	47	94

Таблица 1-3. Выборочная информация о тренировочных совокупностях

Группа	случай	контроль	общее количество
Тренировочные совокупности	фекальные образцы	17	17	34
	фекальные образцы	40 (подвергаемые лечению с DMARD пациенты)	--	40
	образцы зубных налетов	37 (подвергаемые лечению с DMARD пациенты)	--	37
образцы слюны	24 (подвергаемые лечению с DMARD пациенты)	--	24

Таблица 2-1 фекальные, зубные и слюнные MLG

	кишечная MLG	зубная MLG	слюнная MLG
MLG ID	2169	16600	4643
P-величина	1,16E-03	2,13E-04	5,72E-04
Обогащения (1,случай; 0,контроль)	1	1	1
Количество генов (>=30)	593	943	1058
Встречаемость случаев	0,44	0,48	0,61
Встречаемость контроля	0,21	0,18	0,28
Средняя распространенность во всех случаях	1,40E-07	3,67E-07	1,91E-07
Средняя распространенность во всех контролях	8,50E-08	4,79E-09	4,72E-08
Средняя распространенность в случаях, которые содержали MLG	3,16E-07	7,63E-07	3,14E-07
Средняя распространенность в контролях, которые содержали MLG	4,00E-07	2,71E-08	1,71E-07
Отношение шансов (95% CI)	1,09 (0,78,1,52)	222562231,41 (0,02,2859615161906952192)	1,93 (0,73,5,07)
Аннотация MLG (95% идентичности для видов, 85% идентичности для рода)	Lactobacillus sp.	Lactobacillus salivarius	Lactobacillus salivarius
Возможный штамм 1	Lactobacillus salivarius CECT 5713	Lactobacillus salivarius CECT 5713	Lactobacillus salivarius CECT 5713
# гены, аннотированные к штамму (65% идентичности)	504	897	988
Доля генов, аннотированных к штамму	0,850	0,951	0,934
Средняя идентичность (%)	98,78	99,81	99,81
Возможный штамм 2	Lactobacillus salivarius ACS-116-V-Col5a	Lactobacillus salivarius UCC118	Lactobacillus salivarius ACS-116-V-Col5a
# гены, аннотированные к штамму (65% идентичности)	499	750	818
Доля генов, аннотированные к штамму	0,841	0,795	0,773
Средняя идентичность (%)	98,69	98,92	98,99
Возможный штамм 3	Lactobacillus salivarius HO66, ATCC 11741	Lactobacillus salivarius ACS-116-V-Col5a	Lactobacillus salivarius UCC118
# гены, аннотированные к штамму (65% идентичности)	490	741	809
Доля генов, аннотированных к штамму	0,826	0,786	0,765
Средняя идентичность (%)	98,64	98,98	98,97

Таблица 2-2 SEQ ID фекальных, зубных и слюнных MLG

MLG ID	SEQ ID NO:	Количество генов
mlg_id:2169	1~593	593
mlg_id:16600	594~1536	943
mlg_id:4643	1537~2594	1058

Таблица 3 Статистические данные сборок Lactobacillus sp.

Сборка	scaftigs	Общая длина (п.о.)	Гэпы	Средняя длина (п.о.)	N50 (п.о.)	N90 (п.о.)	Макс. (п.о.)	Миню (п.о.)	Содержание GC (%)
Перед	42	1916673	NA	45635,07	109309	24416	332613	622	32,59
Петля 1	46	1929732	333	41950,7	109513	24424	327455	225	32,62
Петля 2	48	1960062	707	40834,6	109613	24415	660567	203	32,66
Корректи-рованные	46	1929666	0	41949,3	109513	24424	327432	225	32,62

Таблица 4 Относительные распространенности Lactobacillus salivarius MLG в фекальных, зубных и слюнных образцах

Относительные распространенности в фекальных образцах	Относительные распространенности в зубных образцах	Относительные распространенности в слюнных образцах
фекальный -образец	Представленность (lg10)	DAS28	Зубной -образец	Представленность (lg10)	DAS28	Слюнной -образец	Представленность (lg10)	DAS28
D98	-9	7,79868052	D100	-9	3,42175802	D100	-9	3,421758017
D93	-6,611867753	7,6226307	D102	-9	4,8480466	D104	-5,453765687	8,529890674
D90	-6,191158497	3,96041196	D104	-6,040186126	8,52989067	D108	-6,806143016	8,473621894
D86	-8,057385587	6,92415126	D108	-7,980872312	8,47362189	D113	-9	4,729856872
D82	-9	7,13190469	D113	-9	4,72985687	D114	-9	6,853552298
D80	-9	6,76503311	D114	-9	6,8535523	D117	-9	7,920189059
D79	-9	4,0279844	D117	-9	7,92018906	D118	-6,042913878	5,312956797
D77	-7,366135759	6,39025936	D118	-6,934469737	5,3129568	D121	-9	6,642354428
D73	-6,383737346	8,40886812	D121	-9	6,64235443	D122	-6,91342831	7,996274077
D69	-9	5,37571817	D122	-8,016378923	7,99627408	D124	-9	6,340241035
D64	-9	5,54410235	D124	-9	6,34024104	D126	-8,389174221	5,713773541
D60	-7,445724768	3,97640265	D126	-8,948624905	5,71377354	D130	-7,289872807	5,123969264
D57	-7,796649862	8,19776002	D130	-7,319871381	5,12396926	D132	-6,917376771	6,888682261
D55	-6,528149782	6,18476371	D132	-7,914671086	6,88868226	D133	-6,112482915	6,330335876
D53	-7,734095793	6,94704402	D144	-8,481614523	7,94002895	D135	-9	6,155991353
D44	-6,382198292	5,50022386	D145	-7,353369588	5,33562662	D144	-7,761404179	7,940028946
D41	-6,133536313	8,01285296	D147	-4,810120267	6,54878405	D145	-6,463645065	5,335626622
D33	-9	8,46060172	D15	-9	7,0018003	D147	-5,698438864	6,548784045
D31	-9	5,31457462	D150	-9	7,42699601	D15	-7,613225033	7,001800303
D29	-9	5,07110729	D157	-8,403261181	5,77013589	D150	-9	7,426996005
D264	-7,876604295	7,68636877	D158	-6,48957812	7,3559855	D158	-8,036378515	7,3559855
D255	-9	3,35880461	D166	-9	4,68402861	D166	-9	4,684028613
D246	-9	5,50895943	D172	-9	6,56338253	D172	-9	6,56338253
D235	-9	5,36245034	D177	-8,062208673	4,11058331	D173	-9	4,753267564
D226	-9	3,75826991	D178	-9	5,89379791	D177	-7,764858329	4,110583305
D225	-9	5,26730818	D179	-7,377381185	5,45372598	D178	-9	5,893797906
D220	-8,256023129	8,19234	D182	-9	7,6346388	D179	-6,666584727	5,453725981
D219	-9	4,33281686	D185	-7,268685456	4,82480113	D182	-7,495572436	7,634638802
D218	-9	4,9372116	D188	-9	6,83496525	D185	-7,098613687	4,824801134
D216	-8,891583288	6,59381524	D190	-8,76674422	5,2882132	D188	-8,143731806	6,834965253
D213	-9	4,25625778	D23	-9	7,36348085	D190	-8,742451499	5,288213199
D212	-9	4,89075966	D25	-9	6,85099036	D25	-9	6,850990358
D210	-8,979008268	7,00624114	D29	-9	5,07110729	D41	-6,853197457	8,01285296
D209	-9	4,31299239	D31	-9	5,31457462	D43	-6,797317376	6,197520423
D208	-6,483913355	5,745	D33	-9	8,46060172	D44	-6,910799717	5,500223864
D206	-9	7,25794987	D41	-5,796743841	8,01285296	D51	-9	6,847803418
D205	-9	7,6508574	D43	-8,428210194	6,19752042	D53	-7,390874351	6,947044019
D204	-9	4,1459103	D51	-9	6,84780342	D57	-6,60695896	8,197760021
D202	-9	7,63088447	D53	-8,198886903	6,94704402	D60	-7,791470779	3,976402649
D201	-5,283022546	4,78379104	D55	-6,129609376	6,18476371	D62	-7,180662842	5,942224198
D197	-9	5,04328483	D57	-6,738165176	8,19776002	D69	-9	5,375718166
D196	-9	5,45729602	D60	-9	3,97640265	D73	-6,556695801	8,408868116
D195	-7,523916323	5,88705343	D62	-8,039281704	5,9422242	D82	-9	7,131904686
D194	-9	5,07491254	D69	-9	5,37571817	D86	-6,868622111	6,924151262
D191	-6,376571261	5,96637345	D73	-7,012094288	8,40886812	D8_N	-9	5,073854483
D190	-8,662513207	5,2882132	D77	-6,835456013	6,39025936	D9	-7,736997083	8,574788032
D188	-8,169182242	6,83496525	D79	-9	4,0279844	D90	-8,720697158	3,960411962
D187	-8,31142368	8,59106614	D82	-9	7,13190469	D93	-6,901748442	7,6226307

D185	-7,45074993	4,82480113	D86	-7,974661284	6,92415126	D94	-9	5,82920269
D184	-9	3,58951489	D89	-9	5,377	D98	-9	7,798680516
D179	-6,478104047	5,45372598	D8_N	-9	5,07385448	D99	-9	8,242071089
D178	-9	5,89379791	D9	-8,822539013	8,57478803
D177	-8,36954905	4,11058331	D90	-9	3,96041196
D174	-8,450552033	6,58470347	D94	-9	5,82920269
D173	-9	4,75326756
D169	-7,394270982	7,01915442
D168	-8,77581245	6,38421883
D166	-9	4,68402861
D163	-9	4,9850232
D159	-8,762169575	6,28026633
D158	-9	7,3559855
D157	-9	5,77013589
D153	-9	6,21962859
D141	-9	6,49456205
D138	-8,908362017	7,33999124
D135	-8,697956283	6,15599135
D134	-9	4,75253438
D133	-7,661497584	6,33033588
D132	-9	6,88868226
D121	-9	6,64235443
D118	-5,847384965	5,3129568
D114	-9	6,8535523
D113	-9	4,72985687
D108	-9	8,47362189
D102	-9	4,8480466
D100	-9	3,42175802

Таблица 5 корреляция Спирмана и наиболее совпавшего штамма для подобных Lactobacillus salivarius MLG из кишечных и оральных локализации. (информация о штамме как в таблице 2-1.)

Целевые виды	L. salivarius
MLG ID	кишечные 2169	слюнные 4643	слюнные 4643
MLG ID	зубные 16600	зубные 16600	кишечные 2169
Спирмана cc	0,5634221	0,8238949	0,7096382
p-величина	4,65E-07	3,51E-18	8,73E-12
MLG ID	кишечные 2169	слюнные 4643	слюнные 4643
# генов	593	1058	1058
Возможный штамм 1	Lactobacillus salivarius CECT 5713	Lactobacillus salivarius CECT 5713	Lactobacillus salivarius CECT 5713
Гены, аннотированные к штамму (65% идентичности)	504	988	988
Доля аннотированных генов	0,850	0,934	0,934
Средняя идентичность (%)	98,78	99,81	99,81
MLG ID	зубные 16600	зубные 16600	кишечные 2169
# генов	943	943	593

Возможный штамм 1	Lactobacillus salivarius CECT 5713	Lactobacillus salivarius CECT 5713	Lactobacillus salivarius CECT 5713
Гены, аннотированные к штамму (65% идентичности)	897	897	504
Доля аннотированных генов	0,951	0,951	0,850
Средняя идентичность (%)	99,81	99,81	98,78

Таблица 6 классификация результатов фекальных, зубных и слюнных MLG в 69 образцах

классификация	кишечный образец	зубной образец	слюнной образец	комбинация 3 образцов
пороговое значение * относительной распространенности MLG для классификации	>1,175e-9	>5,326e-9	>8,095e-10	кишечный образец>1,175e-9, зубной образец>5,326e-9 и слюнной образец>8,095e-10
общее количество выше порогового значения	26	17	32	13
количество РА в общем количестве	19	16	23	12
вероятность РА (количество РА /общее количество)	0,730769231	0,941176471	0,71875	0,923076923

* когда относительная распространенность MLG является более высокой, чем пороговое значение, индивид имеет риск РА.

1. Способ определения вероятности ревматоидного артрита (РА) у пациента, содержащий:

получение доступных последовательностей ДНК, выделенных из образца, который отобран у пациента;

расчет относительной распространённости биомаркера на основании последовательностей ДНК, где биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius; и

определение вероятности ревматоидного артрита у пациента на основании относительной распространённости, сравнением относительной распространённости с предварительно определенным пороговым значением для принятия решения, что пациент имеет риск ревматоидного артрита, если относительная распространённость биомаркера выше, чем предварительно определенное пороговое значение;

где образец содержит по меньшей мере один из фекального образца, зубного образца и слюнного образца,

где расчет относительной распространённости биомаркера на основании последовательностей ДНК включает:

расчет числа копий каждой последовательности ДНК биомаркера среди последовательностей ДНК;

расчет относительной распространённости последовательности ДНК для каждой последовательности ДНК биомаркера, которая содержится среди последовательностей ДНК, где расчет основан на соотношении числа копии последовательности ДНК и суммы числа копий всех последовательностей ДНК в образце; и

расчет относительной распространённости биомаркера, основанный на по меньшей мере некоторых из относительных распространённостей последовательностей ДНК биомаркера;

в котором биомаркер содержит по меньшей мере одну из следующих метагеномных групп сцепления (MLG):

MLG, соответствующая фекальному образцу и состоящая из MLG ID NO: 2169;

MLG, соответствующая зубному образцу и состоящая из MLG ID NO: 16600; и

MLG, соответствующая слюнному образцу и состоящая из MLG ID NO: 4643;

в котором:

MLG ID NO: 2169 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-593;

MLG ID NO: 16600 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 594-1536; и

MLG ID NO: 4643 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1537-2594.

2. Способ оценки лечения ревматоидного артрита (РА), содержащий:

для каждого пациента из множества пациентов, имеющих ревматоидный артрит:

получение первых доступных последовательностей ДНК, выделенных из первого образца, который отбирают у пациента перед тем, как пациент получал лечение,

расчет первой относительной распространённости биомаркера на основании первых последовательностей ДНК, в котором биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius,

получение вторых доступных последовательностей ДНК, выделенных из второго образца, который отбирают у пациента после того, как пациент получил лечение, и

расчет второй относительной распространённости биомаркера на основании вторых последовательностей ДНК; и

оценку лечения на основании первых относительных распространённостей и вторых относительных распространённостей, рассчитанных для множества пациентов, сравнением относительной распространённости до и после лечения, где, если относительная распространённость биомаркера снижена после прохождения лечения у более чем определенного процента пациентов, страдающих ревматоидным артритом, лечение считается эффективным;

где указанные первые и вторые образцы принадлежат одному типу и каждый содержит по меньшей мере один из фекального образца, зубного образца и слюнного образца,

где расчет первой относительной распространённости или второй относительной распространённости биомаркера, основанный на последовательностях ДНК, включает:

расчет числа копий каждой последовательности ДНК биомаркера среди последовательностей ДНК;

расчет относительной распространённости последовательности ДНК для каждой последовательности ДНК биомаркера, которая содержится среди последовательностей ДНК, где расчет основан на соотношении числа копии последовательности ДНК и суммы числа копий всех последовательностей ДНК в образце; и

расчет относительной распространённости биомаркера, основанный на по меньшей мере некоторых из относительных распространённостей последовательностей ДНК биомаркера;

где биомаркер содержит по меньшей мере одну из следующих метагеномных групп сцепления (MLG):

MLG, состоящая из MLG ID NO: 2169;

MLG, состоящая из MLG ID NO: 16600; и

MLG, состоящая из MLG ID NO: 4643;

где:

MLG ID NO: 2169 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-593;

MLG ID NO: 16600 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 594-1536; и

MLG ID NO: 4643 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1537-2594.

3. Способ оценки лечения ревматоидного артрита, содержащий:

для каждого пациента из множества пациентов, имеющих ревматоидный артрит:

получение доступных последовательностей ДНК, выделенных из образца, который отбирают у пациента после того, как пациент получил лечение, и

расчет относительной распространённости биомаркера на основании последовательностей ДНК, в котором биомаркер содержит последовательность ДНК в геноме Lactobacillus salivarius; и

оценку лечения на основании относительных распространённостей, рассчитанных для множества пациентов, сравнением относительной распространённости с предварительно определенным пороговым значением, где, если относительная распространённость биомаркера ниже, чем предварительно определенное пороговое значение, лечение считается эффективным;

где расчет относительной распространённости биомаркера, основанный на последовательностях ДНК, включает:

расчет числа копий каждой последовательности ДНК биомаркера среди последовательностей ДНК;

расчет относительной распространённости последовательности ДНК для каждой последовательности ДНК биомаркера, которая содержится среди последовательностей ДНК, где расчет основан на соотношении числа копии последовательности ДНК и суммы числа копий всех последовательностей ДНК в образце; и

расчет относительной распространённости биомаркера, основанный на по меньшей мере некоторых из относительных распространённостей последовательностей ДНК биомаркера;

где биомаркер содержит по меньшей мере одну из следующих метагеномных групп сцепления (MLG):

MLG, состоящую из MLG ID NO: 2169;

MLG, состоящую из MLG ID NO: 16600; и

MLG, состоящую из MLG ID NO: 4643;

где:

MLG ID NO: 2169 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-593;

MLG ID NO: 16600 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 594-1536; и

MLG ID NO: 4643 состоит из генов, имеющих полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1537-2594.