Применение малых молекул для увеличения экспрессии mafa в панкреатических эндокринных клетках

Авторы патента:

РЕЗАНИА Алиреза (US)

C12N5/071 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2694311:

ЯНССЕН БАЙОТЕК, ИНК. (US)

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к индукции экспрессии MAFA в панкреатических энтодермальных клетках, панкреатических эндокринных клетках-предшественниках или панкреатических эндокринных клетках. Способ включает культивирование панкреатических энтодермальных клеток, панкреатических эндокринных клеток-предшественников или панкреатических эндокринных клеток, полученных из человеческих плюрипотентных клеток неэмбрионального происхождения, со средой, обогащенной одним или более из трийодтиронина, тироксина и аналога гормона щитовидной железы; ингибитором ALK; или как одним или более из трийодтиронина, тироксина и аналога гормона щитовидной железы, так и ингибитором ALK, и где среда также обогащена одним или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 13 з.п. ф-лы, 4 табл., 21 ил., 7 пр.

Перекрестные ссылки на смежные заявки

Настоящая заявка испрашивает преимущество предварительной заявки на патент США № 61/994,259, поданной 16 мая 2014 г., которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к способам дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток и клеткам и популяциям, получаемым в результате такой дифференцировки. В частности, изобретение относится к применению конкретных малых молекул для создания панкреатических эндокринных клеток и популяций таких клеток, которые показывают увеличенную экспрессию MAFA.

Предпосылки создания изобретения

Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1-го типа и нехватка островков Лангерганса, выполненных с возможностью трансплантации, заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или бета-клеток, подходящих для приживления трансплантата. Один подход представляет собой получение функционализированных бета-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки.

При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентная клетка дает начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму), в ходе процесса, известного как «гаструляция». Ткани, такие как ткань щитовидной железы, вилочковой железы, поджелудочной железы, кишечника и печени, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточная стадия данного процесса представляет собой образование дефинитивной энтодермы.

К концу гаструляции энтодерма разделяется на передний и задний домены, которые можно распознать по экспрессии ряда факторов, однозначно выделяющих переднюю, среднюю и заднюю области энтодермы. Например, HHEX и SOX2 идентифицируют переднюю область, в то время как CDX1, 2 и 4 идентифицируют заднюю область энтодермы.

Миграция ткани энтодермы приближает энтодерму к различным мезодермальным тканям, которые способствуют регионализации кишечной трубки. Это осуществляется с помощью большого числа секретируемых факторов, таких как факторы роста фибробластов (FGF), белки WNT, трансформирующие факторы роста бета (TGF-β), ретиноевая кислота и лиганды костного морфогенетического белка (BMP) и их антагонисты. Например, FGF4 и BMP способствуют экспрессии CDX2 в предполагаемой энтодерме задней кишки и подавляют экспрессию передних генов HHEX и SOX2 (2000 Development, 127:1563-1567). Было продемонстрировано, что сигнализация WNT также действует параллельно с сигнализацией FGF, способствуя развитию задней кишки и препятствуя зачаткам передней кишки (2007 Development, 134:2207-2217). Наконец, ретиноевая кислота, секретируемая мезенхимой, регулирует границу между передней и задней кишкой (2002 Curr. Biol., 12:1215-1220).

Уровень экспрессии специфических факторов транскрипции можно применять для определения типа ткани. Во время преобразования дефинитивной энтодермы в примитивную кишечную трубку кишечная трубка становится разделенной на широкие домены, которые можно наблюдать на молекулярном уровне с помощью ограниченных паттернов экспрессии генов. Например, регионализованный домен поджелудочной железы в кишечной трубке демонстрирует очень высокую экспрессию PDX1 и очень низкую экспрессию CDX2 и SOX2. PDX1, NKX6.1/PTFlA и NKX2.2 высоко экспрессируются в ткани поджелудочной железы, а экспрессия CDX2 высока в кишечной ткани.

Образование поджелудочной железы происходит при дифференцировке дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Дорсальный и вентральный домены поджелудочной железы формируются из эпителия передней кишки. Передняя кишка также дает начало формированию пищевода, трахеи, легких, щитовидной железы, желудка, печени и системы желчных протоков.

Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют панкрео-дуоденальный, содержащий гомеобокс ген PDX1. В отсутствие PDX1 поджелудочная железа не развивается дальше образования вентрального и дорсального зачатков. Следовательно, экспрессия PDX1 является важным этапом органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит как экзокринную, так и эндокринную ткани, которые образуются при дифференцировке панкреатической энтодермы.

DʹAmour et al. описывают производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, полученной из человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005, 23:1534-1541; патент США № 7,704,738). Трансплантация этих клеток под капсулу почки у мышей приводила к дифференцировке в более зрелые клетки с характеристиками ткани энтодермы (патент США № 7,704,738). Клетки дефинитивной энтодермы, полученные из человеческих эмбриональных стволовых клеток, могут быть дополнительно дифференцированы в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 и ретиноевой кислоты (заявка на патент США № 2005/0266554). Последующая трансплантация этих клеток-предшественников панкреатических клеток в жировое тело иммунодефицитных мышей привела к образованию функционализированных панкреатических эндокринных клеток с последующей 3-4-месячной стадией созревания (патенты США № 7,534,608 и № 7,993,920).

Fisk et al. сообщают о системе получения клеток панкреатических островков из человеческих эмбриональных стволовых клеток (патент США № 7,033,831). В данном случае процесс дифференцировки был разделен на три стадии. Человеческие эмбриональные стволовые клетки сначала были дифференцированы в энтодерму при помощи комбинации бутирата натрия и активина A (патент США № 7,326,572). Впоследствии клетки культивировали с антагонистами BMP, такими как Ноггин, в комбинации с EGF или бета-целлюлином для генерирования PDX1-положительных клеток. Конечную дифференцировку индуцировали никотинамидом.

Низкомолекулярные ингибиторы также применяют для индуцирования панкреатических эндокринных клеток-предшественников. Например, низкомолекулярные ингибиторы рецептора TGF-ß и рецепторов BMP (Development 2011, 138:861-871; Diabetes 2011, 60:239-247) применяют для значительного увеличения числа панкреатических эндокринных клеток. Дополнительно для генерирования клеток дефинитивной энтодермы или клеток-предшественников панкреатических клеток также применяют низкомолекулярные активаторы (Curr. Opin. Cell Biol. 2009, 21:727-732; Nature Chem. Biol. 2009, 5:258-265).

НВ9 (также известный как HIXB9 и MNX1) является транскрипционным активаторным белком bHLH, экпрессируемым на ранней стадии развития поджелудочной железы, начинающейся приблизительно на восьмой эмбриональный день. Экспрессия HB9 неравномерна и достигает пика примерно в день 10,5 в эпителии поджелудочной железы, будучи экспрессированной в клетках, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1. Примерно в день 12,5 экспрессия HB9 снижается и на поздних стадиях ограничивается только β-клетками. У мышей, гомозиготных по нулевой мутации HB9, дорсальная доля поджелудочной железы не развивается (Nat. Genet. 23:67-70, 1999; Nat. Genet. 23:71-75, 1999). HB9-/β-клетки экспрессируют низкие уровни глюкозного транспортера, GLUT2 и NKX6.1. Кроме того, HB9 -/- поджелудочной железы демонстрирует значительное снижение числа инсулин-положительных клеток, в то же время не оказывая значительного влияния на экспрессию прочих гормонов поджелудочной железы. Таким образом, временной контроль HB9 чрезвычайно важен для нормального развития и функционирования β-клетки. В то время как о факторах, регулирующих экспрессию HB9 в β-клетках, известно немного, недавнее исследование на рыбе данио предполагает, что ретиноевая кислота может положительно регулировать экспрессию HB9 (Development, 138, 4597-4608, 2011).

В заявке на патент США № 13/998,883, полностью включенной в настоящий документ путем ссылки, было продемонстрировано, что трийодтиронин (Т3) может выступать в качестве индуктора экспрессии белка HB9 при дифференцировке клеток в β-клетки. Также в ней описаны способы получения панкреатических энтодермальных клеток, которые оказались успешными для NKX6.1, PDX1 и HB9, с помощью Т3 и/или Т4. Дополнительно и как описано в заявке на патент США № 13/998,884, полностью включенной в настоящий документ путем ссылки, было продемонстрировано, что экспрессия панкреатических эндокринных маркеров может быть значительно усилена посредством культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость и с помощью Т3 и ингибиторов активин-рецептороподобной киназы (ALK) 5.

Множество факторов транскрипции регулируют дифференцировку панкреатических эндокринных клеток в секретирующие инсулин β-клетки. Одним из этих факторов является гомолог А онкогена v-maf птичьей мышечно-апоневротической фибросаркомы (MAFA). Фактически считается, что MAFA может представлять собой основной регулятор стимулированной глюкозой секреции инсулина в β-клетках.

В целом, процесс дифференцировки прогениторных клеток в функционализированные β-клетки проходит через различные стадии, и протоколы получения панкреатических клеток из прогениторных клеток, таких как человеческие плюрипотентные стволовые клетки, были в значительной степени улучшены. Несмотря на эти продвижения в исследованиях, каждый этап в процессе дифференцировки прогениторных клеток является уникальной задачей. Таким образом, сохраняется необходимость в дополнительной разработке протокола дифференцировки с целью получения функционализированных эндокринных клеток и в частности функционализированных β-клеток. В частности, желательно разработать процессы, в которых увеличена экспрессия MAFA в панкреатических эндокринных клетках.

Краткое описание чертежей

ФИГ. 1А-1М представляют собой графики, отображающие данные анализов ПЦР в реальном времени кратного изменения по сравнению с недифференцированными ЭС-клетками экспрессии гена PDX1, NKX6.1, PAX4, PAX6, NGN3, MAFA, ABCC8, хромогранина A, G6PC2, IAPP, инсулина, глюкагона и PTF1a в линии стволовых клеток H1, дифференцированных в соответствии с примером 1.

На ФИГ. 2A-2C показаны результаты цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) клеток стадии 3, дифференцированных в соответствии с примером 1 и окрашенных следующим образом: PDX1 (ось X) окрашена вместе с Ki67 (ось Y) на ФИГ. 2A; PDX1 (ось X) окрашена вместе с CDX2 (ось Y) на ФИГ. 2B; и NKX6.1 на ФИГ. 2C.

На ФИГ. 3A-3D показаны результаты цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) клеток стадии 4, дифференцированных в соответствии с примером 1 и окрашенных следующим образом: хромогранин (ось X) окрашен вместе с NKX6.1 (ось Y) на ФИГ. 3A; PDX1 (ось X) окрашена вместе с Ki67 (ось Y) на ФИГ. 3B; NKX6.1 (ось X) окрашена вместе с инсулином (ось Y) на ФИГ. 3C; и NeuroD1 на ФИГ. 3D.

На ФИГ. 4A-4E показаны результаты цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) клеток стадии 5, дифференцированных в соответствии с примером 1 и окрашенных следующим образом: хромогранин (ось X) окрашен вместе с NKX6.1 (ось Y) на ФИГ. 4A; PDX1 (ось X) окрашена вместе с Ki67 (ось Y) на ФИГ. 4B; и NKX6.1 (ось X) окрашена вместе с инсулином (ось Y) на ФИГ. 4C; NeuroD1 на ФИГ. 4D; и инсулин (ось X) окрашен вместе с глюкагоном (ось Y).

На ФИГ. 5A-5F показаны результаты цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) клеток стадии 6, дифференцированных в соответствии с примером 1 и окрашенных следующим образом: хромогранин (ось X) окрашен вместе с NKX6.1 (ось Y) на ФИГ. 5A; PDX1 (ось X) окрашена вместе с Ki67 (ось Y) на ФИГ. 5B; и NKX6.1 (ось X) окрашена вместе с инсулином (ось Y) на ФИГ. 5C; PAX6 (ось X) окрашена вместе с Oct 3/4 (ось Y) на ФИГ. 5D; инсулин (ось X) окрашен вместе с глюкагоном (ось Y) на ФИГ. 5E; и FOXA2 на ФИГ. 5F.

На ФИГ. 6A-6F показаны результаты цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) клеток стадии 7, дифференцированных в соответствии с примером 1 и окрашенных следующим образом: хромогранин (ось X) окрашен вместе с NKX6.1 (ось Y) на ФИГ. 6A; PDX1 (ось X) окрашена вместе с Ki67 (ось Y) на ФИГ. 6B; и NKX6.1 (ось X) окрашена вместе с инсулином (ось Y) на ФИГ. 6C; PAX6 (ось X) окрашена вместе с Oct 3/4 (ось Y) на ФИГ. 6D; инсулин (ось X) окрашен вместе с глюкагоном (ось Y) на ФИГ. 6E; и FOXA2 на ФИГ. 6F.

ФИГ. 7 представляет собой график выраженной в процентах экспрессии множества панкреатических энтодермальных маркеров (FOXA2, PDX1, NKX6.1), маркера недифференцированных ЭС-клеток (Oct3/4), эндокринных маркеров (PAX6, ISl-1, NKX2.2, хромогранин) и гормона (инсулин, глюкагон) в клетках стадии 3-7, дифференцированных в соответствии с примером 1.

ФИГ. 8A-8E представляют собой графики, отображающие данные анализов ПЦР в реальном времени кратного изменения экспрессии инсулина и MAFA в дифференцированных клетках по сравнению с недифференцированными клетками после обработки малыми молекулами на стадии 6-7.

ФИГ. 9 представляет собой график, отображающий данные анализов ПЦР в реальном времени кратного изменения экспрессии AXL и GAS6 в дифференцированных клетках из примера 4 по сравнению с недифференцированными клетками.

ФИГ. 10A-F представляют собой графики данных анализов ПЦР в реальном времени кратного изменения экспрессии MAFA, UCN3, G6PC2, NKX6.1, PDX1 и инсулина в дифференцированных клетках по сравнению с недифференцированными клетками после обработки малыми молекулами на стадии 7 в соответствии с примером 6.

ФИГ. 11A-D представляют собой графики, отображающие данные анализов ПЦР в реальном времени кратного изменения экспрессии MAFA, PDX1, NKX6.1 и инсулина в дифференцированных клетках по сравнению с недифференцированными клетками после обработки малыми молекулами на стадии 7 в соответствии с примером 7.

Подробное описание изобретения

Следующее подробное описание изобретения будет более понятно при изучении вместе с приложенными фигурами. В целях иллюстрирования изобретения на фигурах показаны варианты осуществления настоящего изобретения. Однако изобретение не ограничивается приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами. Для ясности описания, а не в целях ограничения, подробное описание изобретения разделено на подразделы, описывающие или иллюстрирующие конкретные элементы, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к получению панкреатических эндокринных клеток более зрелого фенотипа посредством обработки менее зрелых панкреатических эндокринных клеток конкретными малыми молекулами. В определенных вариантах осуществления изобретения панкреатические эндокринные клетки культивируют, за одну или более стадий, в присутствии малых молекул, которые представляют собой один или более из ингибитора протеин метилтрансферазы, ингибитора киназы Aurora и ингибитора киназы S6 рибосомального белка p90 (RSK). Таким образом, в настоящем изобретении предложены клеточные культуры для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, показывающие характеристики панкреатических эндокринных клеток, а также дифференцировочная среда, которая инициирует и облегчает такую дифференцировку, и дифференцированные клетки и клеточные популяции, получаемые в результате дифференцировки. Способы изобретения обеспечивают образование популяции панкреатических эндокринных клеток, причем, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, более предпочтительно, по меньшей мере, 30% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 50% клеток экспрессируют единственный гормон инсулин и являются PDX1-, NKX6.1- и MAFA-положительными.

Преимущественно и предпочтительно клеточные культуры и дифференцировочную среду изобретения можно применять в сочетании с дифференцировкой на поверхности раздела воздух-жидкость. Культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость может происходить на всех стадиях процесса дифференцировки от плюрипотентных стволовых клеток до панкреатических эндокринных клеток зрелого фенотипа или может включать в себя культивирование планарной культуры, погруженной в среду на ранних стадиях дифференцировки, с последующим культивированием на поверхности раздела воздух-жидкость во время одной или нескольких более поздних стадий дифференцировки. Более предпочтительно процесс изобретения включает в себя комбинацию культивирования плюрипотентных стволовых клеток на поддерживающей поверхности, погруженной в среду, на ранних стадиях и впоследствии культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость на более поздних стадиях дифференцировки. В таких вариантах осуществления клетки могут быть первоначально посеяны на твердую поверхность для погруженного культивирования и впоследствии удалены с твердой поверхности и пересеяны на пористую поверхность для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость. Альтернативно клетки могут быть изначально посеяны на пористую поддерживающую поверхность, которая впоследствии погружается в среду, на ранних стадиях дифференцировки и впоследствии расположены на поверхности раздела воздух-жидкость на более поздних стадиях дифференцировки.

В еще одном варианте осуществления дифференцировку на одной или более стадиях также выполняют в присутствии одного или более из Т3, Т4, их аналогов и необязательно, но предпочтительно с ингибитором активин-рецептороподобной киназы 5 (ALK 5). В предпочтительном варианте осуществления популяцию панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников культивируют в среде, содержащей один или более из Т3, Т4, их аналогов и ингибитор ALK5, в панкреатические эндокринные клетки. В более предпочтительном варианте осуществления полученные панкреатические эндокринные клетки дополнительно дифференцируются в присутствии среды, содержащей один или более из Т3, Т4, их аналогов и ингибитор ALK5.

Особым открытием изобретения является то, что обработка панкреатических энтодермальных клеток комбинацией одного или более из ингибитора ALK5 и агониста рецепторов щитовидной железы с последующим культивированием полученных панкреатических эндокринных клеток в комбинации с одним или более из ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L, ингибитора киназы Aurora и ингибитора RSK значительно увеличивает число клеток в популяции, экспрессирующих единственный гормон инсулин, MAFA, PDX1 и NKX6.1, а также увеличивает уровень экспрессии MAFA в клетках. Изобретение является особенно полезным при применении в сочетании с дифференцировкой на поверхности раздела воздух-жидкость.

Определения

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, образованные со способностью, на одноклеточном уровне, к самообновлению и дифференцировке. Стволовые клетки могут продуцировать клетки-потомки, включая самообновляющиеся прогениторные клетки, необновляющиеся прогениторные клетки и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться в условиях in vitro в функционализированные клетки различных линий дифференцировки из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы). Стволовые клетки также дают начало тканям множества зародышевых листков после трансплантации и вносят существенный вклад в образование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

Стволовые клетки классифицируются по потенциалу развития. Плюрипотентные стволовые клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток.

Дифференцировка представляет собой процесс, посредством которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной клетки или мышечной клетки. Дифференцированная клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в клеточной линии дифференцировки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки относится к клетке, дошедшей в процессе дифференцировки до стадии, с которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до конкретного типа клеток или подмножества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться к менее дифференцированному типу клеток. «Дедифференцировка» обозначает процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в пределах клеточной линии дифференцировки. В настоящем документе «клеточная линия дифференцировки» обозначает наследственность клетки, т. е. из каких клеток произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. Клеточная линия дифференцировки размещает клетку в пределах наследственной схемы развития и дифференцировки. Маркер, специфичный для линии дифференцировки, относится к характеристике, специфически ассоциированной с фенотипом клеток интересующей линии дифференцировки, и его можно применять для оценки дифференцировки некоммитированной клетки в клетки интересующей линии дифференцировки.

В настоящем документе «маркеры» представляют собой молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов, которые дифференциально экспрессируются в интересующей клетке. В данном контексте под дифференциальной экспрессией понимают повышенный уровень положительного маркера и пониженный уровень отрицательного маркера по сравнению с недифференцированной клеткой или клеткой на другой стадии дифференцировки. Обнаруживаемый уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличать ее от других клеток с помощью любого из множества способов, известных в данной области.

В настоящем документе клетка является «положительной по» установленному маркеру, «положительной» или обозначается со знаком «+», если установленный маркер обнаруживают в клетке в достаточном количестве. Аналогично, клетка является «отрицательной по» установленному маркеру, «отрицательной» или обозначается со знаком «-», если установленный маркер не обнаруживают в клетке в достаточном количестве. В частности, положительность при цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), как правило, означает уровень более чем около 2%, в то время как отрицательный предел для FACS, как правило, составляет менее чем около 1%. Положительность при цитометрии с помощью полимерной цепной реакции (ПЦР), как правило, означает около или менее 30 циклов (Cts); при этом отрицательность для ПЦР, как правило, составляет более чем около 31 цикла.

При попытках воспроизвести дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в функционализированные панкреатические эндокринные клетки в статичных клеточных культурах в условиях in vitro процесс дифференцировки часто рассматривают как прохождение через несколько последовательных стадий. В частности, процесс дифференцировки обычно рассматривают как прохождение через множество стадий. В этой поэтапной дифференцировке «стадия 1» обозначает первый этап в процессе дифференцировки, то есть дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы («клетки стадии 1»). «Стадия 2» обозначает второй этап, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки («клетки стадии 2»). «Стадия 3» обозначает третий этап, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки («клетки стадии 3»). «Стадия 4» обозначает четвертый этап, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки («клетки стадии 4»). «Стадия 5» обозначает пятый этап, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток и/или панкреатических эндокринных клеток-предшественников (совместно обозначаемых как «клетки стадии 5» или альтернативно «панкреатические энтодермальные/эндокринные клетки-предшественники»). «Стадия 6» обозначает шестой этап, то есть дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, которые представляют собой незрелые бета-клетки («клетки стадии 6»). Клетки стадии 6 экспрессируют единственный гормон инсулин и являются PDX1-, NKX6.1- и хромогранин-положительными. В процессе и с целью продуцирования популяций клеток изобретения применяется седьмой этап (стадия 7), который обозначает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, которые представляют собой незрелые бета-клетки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, которые представляют собой созревающие бета-клетки и которые обладают более зрелым фенотипом по сравнению с клетками стадии 6. Под выражением «клетки стадии 7» подразумевается панкреатическая эндокринная клетка, которая является инсулин(единственный гормон)-, MAFA-, NKX6.1- и PDX1-положительной, но также экспрессирует MAFA в более высокой концентрации, чем незрелая бета-клетка. Дополнительно популяция клеток, полученная при выполнении стадии 7, имеет больший процент MAFA-положительных и экспрессирующих единственный гормон инсулин клеток по сравнению с популяциями клеток стадии 6.

Необходимо отметить, что не все клетки в отдельно взятой популяции проходят через эти стадии с одинаковой скоростью. Вследствие этого в клеточных культурах в условиях in vitro нередко обнаруживается наличие клеток, менее или более дифференцированных по сравнению с большинством клеток, присутствующих в популяции, особенно на более поздних стадиях дифференцировки. Например, нередко наблюдается появление маркеров, характерных для панкреатических эндокринных клеток, во время стадии 5 культивирования клеток. Для иллюстративных нужд настоящего изобретения в настоящем документе описаны характеристики различных типов клеток, связанных с определенными выше стадиями.

В настоящем документе «дефинитивная энтодерма» обозначает клетки, обладающие характеристиками клеток, происходящих от эпибласта при гаструляции, и формирующие желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют, по меньшей мере, один из следующих маркеров: FOXA2 (также известный как ядерный фактор гепатоцитов 3-β (HNF3-β)), GATA4, SOX17, CXCR4, Brachyury, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1. Маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, представляют собой CXCR4, FOXA2 и SOX17. Таким образом, клетки дефинитивной энтодермы могут характеризоваться своей экспрессией CXCR4, FOXA2 и SOX17. Дополнительно, в зависимости от длительности времени, на протяжении которого клеткам позволяется оставаться на стадии 1, можно наблюдать рост в HNF4α.

В настоящем документе «клетки кишечной трубки» обозначает клетки, полученные из дефинитивной энтодермы, из которых могут образоваться все энтодермальные органы, такие как легкие, печень, поджелудочная железа, желудок и кишечник. Клетки кишечной трубки могут характеризоваться своей постоянно растущей экспрессией HNF4α, выше, чем экспрессия клеток дефинитивной энтодермы. Например, рост экспрессии HNF4α в мРНК в десять-сорок раз можно наблюдать на стадии 2.

В настоящем документе «энтодерма передней кишки» обозначает клетки, из которых образуются пищевод, легкие, желудок, печень, поджелудочная железа, желчный пузырь и часть двенадцатиперстной кишки. Клетки энтодермы передней кишки экспрессируют, по меньшей мере, один из следующих маркеров: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2 и HNF4α. Клетки энтодермы передней кишки могут характеризоваться ростом экспрессии PDX1 по сравнению с клетками кишечной трубки. Например, более пятидесяти процентов клеток в культурах стадии 3 типично экспрессируют PDX1.

В настоящем документе «панкреатические клетки-предшественники передней кишки» обозначают клетки, экспрессирующие, по меньшей мере, один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF6, NGN3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, гастрин, FOXA2, PTF1a, PROX1 и HNF4α. Панкреатические клетки-предшественники передней кишки могут характеризоваться как положительные по отношению к экспрессии, по меньшей мере, одного из PDX1, NKX6.1 и SOX9.

В настоящем документе «панкреатические энтодермальные клетки» обозначают клетки, экспрессирующие, по меньшей мере, один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1β, PTF1α, HNF6, HNF4α, SOX9, NGN3, гастрин; HB9 или PROX1. Панкреатические энтодермальные клетки могут характеризоваться отсутствием у них существенной экспрессии CDX2 или SOX2.

В настоящем документе «панкреатические эндокринные клетки-предшественники» обозначают панкреатические энтодермальные клетки, способные стать панкреатической клеткой, экспрессирующей гормоны. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники экспрессируют, по меньшей мере, один из следующих маркеров: NGN3, NKX2.2, NeuroD11, ISL1, PAX4, PAX6 или ARX. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут характеризоваться своей экспрессией NKX2.2 и NeuroD11.

В настоящем документе «панкреатические эндокринные клетки» обозначают клетки, способные экспрессировать, по меньшей мере, один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин, грелин и панкреатический полипептид. В дополнение к этим гормонам маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включают в себя один или более из NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, ARX, NKX2.2, HB9 и PAX6. Одно подмножество панкреатических эндокринных клеток представляет собой «незрелые бета-клетки», которые представляют собой клетки, способные экспрессировать инсулин (но не глюкагон), соматостатин, грелин и панкреатический полипептид. Дополнительно маркеры, характерные для незрелых бета-клеток, включают в себя один или более из NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, HB9 и PAX6. Второе подмножество панкреатических эндокринных клеток представляет собой «созревающие бета-клетки», которые представляют собой клетки, способные экспрессировать инсулин (но не глюкагон), соматостатин, грелин и панкреатический полипептид. Дополнительно маркеры, характерные для созревающих бета-клеток, включают в себя один или более из NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, HB9, PAX6 и MAFA. Еще одно подмножество панкреатических эндокринных клеток представляет собой клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для зрелых бета-клеток, которые могут характеризоваться своей экспрессией PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, HB9, MAFA и PAX6, а также выбросом инсулина в ответ на глюкозную нагрузку, которые являются устойчивыми и увеличенными по сравнению с менее зрелыми бета-клетками..

В настоящем документе «поверхность раздела воздух-жидкость» или «ALI» обозначает поверхность раздела воздух-жидкость, которая присутствует в открытом сосуде для культивирования или сосуде для культивирования, частично наполненном средой. Хотя в настоящем документе для удобства применяется термин «воздух», изобретение не ограничивается смесью газов и композиций, находящихся в окружающей среде. Изобретение детально рассматривает и включает в себя газообразные смеси, имеющие композиции, отличные от окружающей среды, включая, например, смеси, обогащенные определенным компонентом или в которых содержание определенного компонента понижено или исключено.

В настоящем документе взаимозаменяемо применяются выражения «d1», «1d» и «день 1»; «d2», «2d» и «день 2» и так далее. Эти комбинации цифр и букв обозначают конкретный день инкубации на различных стадиях в процессе постадийного протокола дифференцировки настоящей заявки.

Термин «LDN-193189» обозначает ((6-(4-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенил)-3-(пиридин-4-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин, гидрохлорид)), ингибитор рецептора BMP, который можно приобрести в компании Shanghai ChemPartner, Co., LTD.

Характеристики, источник, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток

А. Характеристики плюрипотентных стволовых клеток

Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать одно или более из указанных TRA-1-60 и TRA-1-81 антител (Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в условиях in vitro приводит к потере экспрессии TRA-1-60 и TRA-1-81. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, как правило, имеют щелочнофосфатазную активность, которую можно обнаружить путем фиксации клеток 4%-ным раствором параформальдегида и впоследствии путем выращивания с использованием набора щелочнофосфатазных субстратов, который продается под товарным знаком VECTOR® Red, в соответствии с описанием производителя (Vector Laboratories, Inc., г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью полимерной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Другое желательное фенотипическое свойство выращенных плюрипотентных стволовых клеток представляет собой потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток можно подтвердить, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксации образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и впоследствии их гистологического исследования на наличие клеточных типов, происходящих от этих трех зародышевых листков. Альтернативно плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализу эмбриоидных телец на наличие маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток можно кариотипировать с помощью стандартного метода G-бэндинга и сравнивать с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получать клетки, имеющие «нормальный кариотип», т. е. эуплоидные клетки, в которых все хромосомы человека присутствуют и не имеют видимых изменений.

В. Источники плюрипотентных стволовых клеток

Любые плюрипотентные стволовые клетки можно применять в способах изобретения. Примерные типы плюрипотентных стволовых клеток, которые можно применять, включают в себя стабильные линии плюрипотентных клеток, в том числе преэмбриональной ткани (такой как бластоцист), эмбриональной или фетальной ткани, взятой в любой момент во время беременности, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно от 10 до 12 недель беременности. Неограничивающие примеры представляют собой стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, такие как линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (код NIH: WA01), H7 (код NIH: WA07), H9 (код NIH: WA09) (WiCell Research Institute, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и SA002 (Cellartis AB Corporation, г. Гетеборг, Швеция).

Клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток, также являются приемлемыми. Индуцированные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, полученные из зрелых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов транскрипции, относящихся к плюрипотенции, такие как OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185; см. также IPS, Cell, 126(4): 663-676), также могут применяться. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, применяемые в способах изобретения, также могут быть получены, как описано Thomson et al. (патент США № 5,843,780; Science, 1998, 282:1145-1147; Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165; Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848). Мутантные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, такие как BG01v (BresaGen, г. Атенс, штат Джорджия), или клетки, полученные из зрелых человеческих соматических клеток, такие как клетки, описанные Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007), также могут применяться. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки, приемлемые для применения в настоящем изобретении, могут быть получены в соответствии со способами, описанными в: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008); Takahashi et al. (Cell 131: 861-872, 2007); и в заявке на патент США № 2011/0104805. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки, приемлемые для применения в настоящем изобретении, могут считаться «интактными» и могут быть получены в соответствии со способами, описанными в: Gafni et al. (Nature, 504:282, 2013); и Ware et al. (PNAS, 111: 4484-4489, 2014). Все эти ссылки, патенты и заявки на патенты полностью включены в настоящий документ путем ссылки, в частности, поскольку они относятся к выделению, культивированию, размножению и дифференцировке плюрипотентных клеток.

Другие источники плюрипотентных стволовых клеток включают в себя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPS, Cell, 126(4): 663-676). Еще одни источники приемлемых клеток включают в себя клетки, полученные из ткани пуповины человека, клетки, полученные из амниотической жидкости человека, клетки, полученные из плаценты человека, и человеческие партеноты. В одном варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины человека, могут быть получены способом, описанным в патенте США № 7,510,873. В другом варианте осуществления клетки, полученные из ткани плаценты, могут быть получены с помощью способов, описанных в заявке на патент США № 2005/0058631. В другом варианте осуществления клетки, полученные из амниотической жидкости, могут быть получены с помощью способов, описанных в заявке на патент США № 2007/0122903. Описания каждой из этих заявок на патент полностью включены в настоящий документ путем ссылки, поскольку они относятся к выделению и характеризации клеток. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки могут иметь неэмбриональное происхождение.

С. Размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток

Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируются на слое питающих клеток, которые оказывают разностороннюю поддержку плюрипотентным стволовым клеткам. Альтернативно плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной системе, которая по существу не содержит питающих клеток, но, тем не менее, поддерживает пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток, не допуская существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуре без дифференцировки часто поддерживают с помощью среды, кондиционированной путем предварительного культивирования клеток иного типа. Альтернативно рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуре без дифференцировки поддерживают с помощью среды с определенным химическим составом.

Плюрипотентные клетки можно легко размножить в культуре с помощью различных питательных слоев или с помощью сосудов, покрытых матриксными белками. Альтернативно поверхности с определенным химическим составом в комбинации с определенными средами, такими как среды, которые продаются под товарным знаком mTESR®1 (StemCell Technologies, Inc., г. Ванкувер, провинция Британская Колумбия, Канада), можно применять для обычного размножения клеток. Плюрипотентные клетки можно легко удалять из культуральных планшетов с помощью ферментативного расщепления, механического разделения или с помощью различных кальциевых хелаторов, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Альтернативно плюрипотентные клетки можно размножать в суспензии в отсутствие каких-либо матриксных белков или питательного слоя.

В заявленном изобретении можно применять множество различных известных способов размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток. Например, в способах изобретения можно применять способы Reubinoff et al., Thompson et al., Richards et al. и заявки на патент США № 2002/0072117. Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science 282: 1145-1147 (1998) описывают культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с помощью слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов. Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) оценили группу из одиннадцати слоев различных человеческих зрелых, фетальных и неонатальных питающих клеток по их способности поддерживать культуру человеческих плюрипотентных стволовых клеток и отметили, что «линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных на зрелых питающих фибробластах кожи, сохраняют морфологию человеческих эмбриональных стволовых клеток и остаются плюрипотентными». В заявке на патент США № 2002/0072117 описаны линии клеток, продуцирующие среду, которая поддерживает рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток культуре. Использованные линии клеток представляют собой мезенхимальные и фибробластоподобные линии клеток, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент США № 2002/072117 также описано применение линий клеток в качестве первичного слоя питающих клеток.

Прочие известные приемлемые способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, например, в Wang et al., Stojkovic et al., Miyamoto et al. и Amit et al. Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005), описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток. Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, полученную в результате спонтанной дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток. Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают источник питающих клеток, полученных из плаценты человека. Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из крайней плоти человека.

Другие приемлемые способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, например, в Inzunza et al., патенте США № 6,642,048, WO 2005/014799, Xu et al. и в заявке на патент США № 2007/0010011. Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток из фибробластов постнатальной крайней плоти человека. В патенте США № 6,642,048 описана среда, поддерживающая рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток культуре, а также линии клеток, используемые для производства такой среды. В патенте США № 6,642,048 сообщается о мезенхимальных и фибробластоподобных линиях клеток, полученных из эмбриональной ткани или дифференцированных из эмбриональных стволовых клеток, а также о способах получения таких линий клеток, обработки среды и выращивания стволовых клеток с помощью такой среды. В международной заявке WO 2005/014799 описана кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В международной заявке WO 2005/014799 сообщается, что культуральная среда, формируемая в соответствии с описанием, кондиционируется с помощью секреторной активности мышиных клеток, в частности дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов под названием MMH (Met-гепатоциты мыши). Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для сверхэкспрессии обратной транскриптазы теломеразы человека. В заявке на патент США № 2007/0010011 описана культуральная среда с определенным химическим составом для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.

В известной альтернативной культуральной системе используют бессывороточную среду, обогащенную факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Примеры таких культуральных систем включают в себя, без ограничений, системы, описанные в Cheon et al., Levenstein et al. и в заявке на патент США № 2005/0148070. Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описывают не содержащую питающих клеток бессывороточную культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, замещающей сыворотку среде, обогащенной различными факторами роста, способными запускать самообновление эмбриональных стволовых клеток. Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды с помощью среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF). В заявке на патент США № 2005/0148070 описан способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде с определенным составом без сыворотки и без питающих фибробластных клеток, причем данный способ включает культивирование стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере, один трансферрин или заменитель трансферрина, по меньшей мере, один инсулин или заместитель инсулина, при этом культуральная среда по существу не содержит фетальной сыворотки млекопитающих и содержит, по меньшей мере, около 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, при этом фактор роста взят из источника, который не является просто слоем питающих фибробластов, при этом среда поддерживает пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без питающих клеток или кондиционированной среды.

Другие известные приемлемые способы культивирования и размножения плюрипотентных стволовых клеток описаны в заявке на патент США № 2005/0233446, патенте США № 6,800,480, заявке на патент США № 2005/0244962 и WO 2005/065354. В заявке на патент США № 2005/0233446 описана среда с определенным составом, используемая при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. Среда в растворе является по существу изотонической по сравнению с культивируемыми стволовыми клетками. В данной культуре конкретная среда представляет собой основную среду и количество каждого из bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, необходимое для поддержания по существу недифференцированного роста зародышевых стволовых клеток. В патенте США № 6,800,480 отмечено, что культуральная среда для выращивания зародышевых стволовых клеток приматов предоставляется в по существу недифференцированном состоянии и включает в себя основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. В описании патента 6,800,480 дополнительно сообщается, что основную среду объединяют с питательной сывороткой, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбранным из питающих клеток и компонента внеклеточного матрикса, полученного из питающих клеток. Дополнительно отмечено, что эта среда включает в себя заменимые аминокислоты, антиоксидант и первый фактор роста, выбранный из нуклеозидов и соли пировиноградной кислоты. В заявке на патент США № 2005/0244962 сообщается, что в одном аспекте описания предложен способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов и что стволовые клетки культивируют в культуре, по существу не содержащей фетальную сыворотку млекопитающих (предпочтительно также по существу не содержащей сыворотку любого животного), и при наличии фактора роста фибробластов, полученного из источника, отличного от просто слоя питающих фибробластов.

В международной заявке WO 2005/065354 описана изотоническая культуральная среда с определенным составом, которая по существу не содержит питающих клеток и сыворотки и содержит основную среду, bFGF, инсулин и аскорбиновую кислоту в количествах, достаточных для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих. Кроме того, в международной заявке WO 2005/086845 описан способ поддержания недифференцированной стволовой клетки, причем указанный способ включает воздействие на стволовую клетку представителя семейства белков трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), представителя семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамида в количестве, достаточном для поддержания клетки в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения необходимого результата.

Плюрипотентные стволовые клетки можно наносить на приемлемый культуральный субстрат. В одном варианте осуществления приемлемый культуральный субстрат представляет собой компонент внеклеточного матрикса, такой как компонент, полученный из базальной мембраны, или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с адгезивными молекулами. Приемлемый культуральный субстрат представляет собой восстановленную базальную мембрану, продаваемую под товарным знаком MATRIGEL™ (Corning Incorporated, Corning, г. Нью-Йорк). MATRIGEL™ представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель с образованием восстановленной базальной мембраны.

В качестве альтернативы приемлемыми являются и другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов, известные в данной области. В зависимости от типа пролиферирующих клеток данные компоненты могут включать в себя, по отдельности или в различных комбинациях, ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т. п.

Плюрипотентные стволовые клетки можно наносить на субстрат с приемлемым распределением и при наличии среды, поддерживающей выживаемость, размножение и сохранение желательных характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению при посеве и могут быть без труда определены специалистом в данной области. Приемлемые культуральные среды могут быть получены из следующих компонентов: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), продаваемая под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 11965-092) компанией Life Technologies Corporation, г. Гранд Айленд, штат Нью-Йорк; нокаутирующая модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), продаваемая под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 10829-018) компанией Life Technologies Corporation; основная среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мМ L-глутамин, продаваемый под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 25030-081) компанией Life Technologies; раствор заменимых аминокислот, продаваемый под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 11140-050) компанией Life Technologies; β-меркаптоэтанол, Sigma-Aldrich Company, LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури (№ по каталогу M7522); человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), продаваемый под товарным знаком GIBCO® (№ по каталогу 13256-029) компанией Life Technologies.

Размножение в больших объемах и управляемые процессы дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток также могут быть получены с помощью суспендирующих биореакторов. Такие системы могут производить достаточные для клинического применения количества клеток с большей эффективностью в управляемой культуральной системе. Применение широко известных биореакторных культуральных систем, которые позволяют размножать плюрипотентные мышиные клетки и человеческие ЭС-клетки, описано, например, в Journal of Biotechnology, May 2014, Vol. 178: 54-64, Stem Cell Reports, Apr 2014, Vol. 3, № 6:1132 и Tissue Engineering Part C: Methods, Feb 2013, Vol. 19, № 2: 166-180.

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток

По мере того как плюрипотентные клетки дифференцируются в β-клетки, они дифференцируются через различные стадии, каждая из которых может характеризоваться наличием или отсутствием определенных маркеров. Дифференцировка клеток на этих стадиях достигается путем создания специфических условий культивирования, включая наличие или отсутствие определенных факторов, добавленных в культуральную среду. В целом, эта дифференцировка может включать в себя дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток по линии дефинитивной энтодермы и в клетки дефинитивной энтодермы. Эти клетки могут впоследствии дифференцироваться в клетки кишечной трубки, которые в свою очередь могут впоследствии дифференцироваться в клетки энтодермы передней кишки. Клетки энтодермы передней кишки могут дифференцироваться в панкреатические клетки-предшественники передней кишки, которые могут впоследствии дополнительно дифференцироваться в панкреатические клетки энтодермы, панкреатические эндокринные клетки-предшественники или и в оба типа клеток. Эти клетки могут дифференцироваться в панкреатические клетки, продуцирующие или секретирующие гормоны. В настоящей заявке предложена стадийная дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки, предпочтительно путем культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость, которая присутствует в пределах сосуда для культивирования, частично наполненного средой, в особенности путем культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость на одной или более из стадий 5-7.

Один или более из гормонов щитовидной железы трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) и их аналогов, отдельно или дополнительно в комбинации с ингибитором ALK5, можно применять для культивирования клеток на одной или более из стадий 1-7 дифференцировки и предпочтительно на каждой из стадий 5-7. Альтернативно ингибитор ALK5 можно применять отдельно на одной или более стадиях дифференцировки, но предпочтительно на каждой из стадий 5-7. Более предпочтительно один или более из гормонов щитовидной железы или их аналогов и ингибитор ALK5 применяют на одной или более стадиях дифференцировки и предпочтительно на каждой из стадий 5-7. Приемлемые аналоги гормонов щитовидной железы могут включать в себя, без ограничений: GC-1 (Sobertirome) (продаваемый компанией R&D Systems, Inc., г. Миннеаполис, штат Миннесота); 3,5-дийодтриопропионовую кислоту (DIPTA); KB-141, обсуждаемый в J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 2008(111): 262-267 и Proc. Natl. Acad. Sci. US 2003,100 10067-10072; MB07344, обсуждаемый в Proc. Natl. Acad. Sci. US 2007,104 15490-15495; T0681, обсуждаемый в J. Lipid Res., May 2009, 50:938 и Endocr. Pract. 2012; 18(6): 954-964, описания которых полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Используемые ингибиторы ALK5 включают в себя: ингибитор ALK5 II (Enzo Life Sciences, Inc., г. Фармингдейл, штат Нью-Йорк), который также представляет собой предпочтительный ингибитор ALK5; ALK5 I (Axxora, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния), SD208 (R&D Systems); ингибитор TGF-β SB431542 (Xcess Biosciences, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния); ITD-1 (Xcess Biosciences); LY2109761 (Xcess Biosciences); A83-01 (Xcess Biosciences); LY2157299 (Xcess Biosciences); ингибитор рецептора TGF-β V (EMD Millipore Chemical, г. Гибстаун, штат Нью-Джерси); ингибитор рецептора TGF-β I (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β IV (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β VII (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β VIII (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β II (EMD Millipore); ингибитор рецептора TGF-β VI (EMD Millipore); и ингибитор рецептора TGF-β VI (EMD Millipore).

Кроме того, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения способы включают в себя обработку клеток на одной или более стадиях, но предпочтительно обработку клеток во время стадии 7 дифференцировочной средой, которая включает в себя один или оба из антиоксиданта, такого как витамин Е, ацетилцистеин, витамин С, антиоксидантная добавка (№ по каталогу A1345, компания Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури), глутатион, супероксиддисмутаза, каталаза и т. п. и их комбинации. В других предпочтительных вариантах осуществления при выполнении стадии 6 применяется ингибитор гамма-секретазы, который может представлять собой ингибитор гамма-секретазы XX (EMD Millipore), ингибитор гамма-секретазы XXI (EMD Millipore), ингибитор гамма-секретазы XVI (EMD Millipore), N-[(3,5-дифторфенил)ацетил]-L-аланил-2-фенил]глицин-1,1-диметиловый эфир (DAPT) (№ по каталогу 2634, Tocris Bioscience, г. Бристоль, Великобритания) и т. п. и их комбинации. Используемые количества ингибитора гамма-секретазы могут составлять около 50-5000 нМ, предпочтительно около 50-500 нМ. Количество антиоксиданта может составлять около 0,1-100 мкМ, альтернативно около 0,1-20 мкМ и предпочтительно около 1-10 мкМ. Альтернативно используемые количества антиоксиданта могут составлять приблизительно от 100 нМ до 5 мМ, приблизительно от 1000 нМ до 2 мМ и предпочтительно приблизительно от 0,1 до 1 мМ.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения конкретные малые молекулы применяются в среде на одной или более стадиях дифференцировки, предпочтительно на стадии 6 и/или 7. Интересующие малые молекулы представляют собой молекулы, способные ингибировать киназу Aurora, киназу p90 рибосомального белка S6 или метилтрансферазу DOT1L, и предпочтительно применяются вместе с антиоксидантами, которые уменьшают окислительный стресс культивируемых клеток. Такие используемые ингибиторы включают в себя ингибитор киназы Aurora II (4-(4ʹ-бензамиданилин)-6,7-диметоксихиназолин), SNS 314 мезилат (N-(3-хлорфенил)-N'-[5-[2-(тиено[3,2-d]пиримидин-4-иламино)этил]-2-тиазолил]мочевины метансульфонат), GSK1070916 (3-(4-(4-(2-(3-((диметиламино)метил)фенил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-4-ил)-1-этил-1H-пиразол-3-ил)фенил)-1,1-диметилмочевина), TAK-901 (5-(3-(этилсульфонил)фенил)-3,8-диметил-N-(1-метилпиперидин-4-ил)-9H-пиридо[2,3-b]индол-7-карбоксамид), ингибитор RSK II (рацемическую смесь дигидро-птеридинон 2-(3,5-дифтор-4-гидрокси-анилин)-8-изопентил-5,7-диметил-7H-птеридин-6-он) и EPZ-5676 (9H-пурин-6-амин, 9-[5-дезокси-5-[[цис-3-[2-[6-(1,1-диметилэтил)-1H-бензимидазол-2-ил]этил]циклобутил](1-метилэтил)амино]-β-D-рибофуранозил]-) и их комбинации. Особый интерес представляют ингибитор киназы Aurora II, ингибитор RSK II и ингибитор DOT1L, в частности EPZ-5676. В предпочтительном варианте осуществления изобретения малая молекула применяется в среде на одной или более из стадий 6 и 7 и более предпочтительно на стадии 7. Используемое количество малых молекул может быть определено путем выбора количества, демонстрирующего наибольшую экспрессию маркеров созревания, но не производящего токсических эффектов. Как правило, используемые количества будут составлять приблизительно от 500 нМ до 10 мкМ, альтернативно приблизительно от 500 нМ до 5 мкМ и предпочтительно приблизительно от 500 нМ до 2 мкМ.

Дифференцировка плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток со зрелым фенотипом

Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. Маркеры плюрипотентных стволовых клеток включают в себя, например, экспрессию одного или более из следующих маркеров: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81. Они могут быть обнаружены посредством ОТ-ПЦР.

Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают в себя человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002. Также приемлемыми являются клетки, экспрессирующие, по меньшей мере, один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81.

Для применения в настоящем изобретении приемлемой является клетка, экспрессирующая, по меньшей мере, один из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В альтернативном аспекте клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку мезэнтодермы. В альтернативном аспекте клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.

Также для применения в настоящем изобретении приемлемой является клетка, экспрессирующая, по меньшей мере, один из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляет собой клетку панкреатической энтодермы, в которой экспрессия PDX1 и NKX6.1 по существу превышает экспрессию CDX2 и SOX2. В определенных вариантах осуществления более 30% клеток экспрессируют PDX1 и NKX6.1 и менее 30% клеток экспрессируют CDX2 или SOX2 при измерении с помощью FACS. В частности, используемыми являются клетки, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1, по меньшей мере, в два раза превышает экспрессию CDX2 или SOX2.

Также приемлемой для применения в настоящем изобретении является клетка, экспрессирующая, по меньшей мере, один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном аспекте изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатической эндокринной клеткой может быть панкреатическая клетка, экспрессирующая гормоны, а именно клетка, способная к экспрессии, по меньшей мере, одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина, грелина или панкреатического полипептида. В предпочтительном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка представляет собой инсулин-продуцирующую β-клетку.

В определенных вариантах осуществления изобретения для получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных бета-клеток зрелого фенотипа, используется протокол, начинающийся с плюрипотентных стволовых клеток. Данный протокол включает в себя следующее.

Стадия 1: Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, полученные из культуры клеточных линий, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования образования клеток дефинитивной энтодермы.

Стадия 2: Клетки, полученные на стадии 1, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования образования клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки.

Стадия 3: Клетки, полученные из клеток стадии 2, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дополнительной дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки.

Стадия 4: Клетки, полученные на стадии 3, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дополнительной дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки. В конце стадии 4 клетки необязательно культивируются на поверхности раздела воздух-жидкость.

Стадия 5: Клетки, полученные на стадии 4, обрабатываются соответствующими факторами, включая в определенных вариантах осуществления: (i) один или более из Т3, Т4 или их аналога; (ii) ингибитор ALK5; или (iii) культивируются (i) и (ii) совместно, необязательно и предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников.

Стадия 6: Клетки, полученные из клеток стадии 5, обрабатываются соответствующими факторами, включая в определенных вариантах осуществления: (i) один или более из Т3, Т4 или их аналога; (ii) ингибитор ALK5; (iii) один или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L; (iv) вместе (i) и (ii); (v) (i), (ii) и (iii); (vi) (i) и (iii); или (vii) культивируются (ii) и (iii), необязательно и предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.

Стадия 7: Клетки, полученные из клеток стадии 6, обрабатываются соответствующими факторами, включая в определенных вариантах осуществления: (i) один или более из Т3, Т4 или их; (ii) ингибитор ALK5; (iii) антиоксидант; (iv) один или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L; (v) (i) и (ii); (vi) (i) и (iii); (vii) (i) и (iv); (viii) (ii) и (iii); (ix) (ii) и (iv); (x) (i), (ii) и (iii); (xi) (i), (iii) и (iv); (xii) (ii), (iii) и (iv); (xiii) (i), (ii) и (iv); (xiv) (iii) и (iv); или (xv) культивируются (i), (ii), (iii) и (iv), необязательно и предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, для стимулирования образования панкреатических эндокринных клеток, которые экспрессируют единственный гормон инсулин и являются PDX1, NKX6.1 и MAFA-положительными и которые имеют более высокий уровень экспрессии MAFA, чем клетки стадии 6, и полученная популяция клеток имеет более высокий процент MAFA-положительных и экспрессирующих единственный гормон инсулин клеток, чем клетки стадии 6.

Наряду с тем, что изобретение в определенных вариантах осуществления включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток (например, клеток, предшествующих стадии 1) в клетки стадии 7, изобретение также включает дифференцировку клеток других стадий в клетки стадии 7. В частности, изобретение включает дифференцировку клеток стадии 4-7. Более того, хотя способ описан в отдельных стадиях, обработка, так же как и прохождение клеток через процесс дифференцировки, может быть последовательной или непрерывной. Более того, дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки стадии 6 или стадии 7 может быть выполнена в суспензионных культурах.

Эффективность дифференцировки можно определить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток агентом, таким как антитело, который специфически распознает белковый маркер, экспрессированный интересующими дифференцированными клетками. Способы оценки экспрессии белковых маркеров и маркеров нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Эти способы включают в себя ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг, гибридизацию in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), а также иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, экспрессированных на интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Дифференцированные клетки также могут быть дополнительно очищены. Например, после обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов настоящего изобретения дифференцированные клетки можно очистить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток агентом, таким как антитело, который специфически распознает белковый маркер, характерно экспрессируемый очищенными дифференцированными клетками.

Любую приемлемую ростовую среду, содержащую достаточные количества витаминов, минералов, солей, глюкозы, аминокислот и белков-носителей, подходящих для дифференцировки клеток, можно применять для различных стадий от 1 до 7. Однако предпочтительно применять следующие среды: стадия 1 - MCDB-131 (продаваемая компанией Life Technologies Corporation, г. Гранд Айленд, штат Нью-Йорк) или RPMI (продаваемая компанией Sigma-Aldrich); стадия 2 - MCDB-131 или модифицированная по способу Дульбекко среда Игла F12 (DMEM-F12); стадия 3-5 - MCDB-131, BLAR (таблица 1) или DMEM; и стадии 6 и 7 - BLAR или CMRL (Life Technologies). Предпочтительно концентрация глюкозы в среде поддерживается на уровне равном или, более предпочтительно, меньшем, чем около 10 мМ, для стадий 1-4 и большем, чем около 10 мМ, для стадий 5-7.

Стадия 1: Дифференцировка плюрипотентных клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.

Плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, любым способом, известным специалистам в данной области, или любым способом, предложенным в изобретении. Способы, используемые для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, описаны в: DʹAmour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005); Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004); McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007); DʹAmour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006). Дополнительные приемлемые способы дифференцировки описаны в: заявке на патент США № 2007/0254359; заявке на патент США № 2009/0170198; заявке на патент США № 2011/0091971; заявке на патент США № 2010/0015711; заявке на патент США № 2012/0190111; заявке на патент США № 2012/0190112; и заявке на патент США № 2012/0196365. Эти описания полностью включены в настоящий документ путем ссылки, поскольку они относятся к дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы.

В одном варианте осуществления плюрипотентные клетки обрабатывают приемлемой ростовой средой, предпочтительно MCDB-131 или RPMI. Среду предпочтительно обогащают ростовым фактором дифференцировки, таким как ростовой фактор дифференцировки 8 (GDF8), и ингибитором киназы гликогенсинтазы-3 β (GSK3β), таким как циклические анилин-пиридинотриазиновые композиции, описанные в заявке на патент США № 2010/0015711 (полностью включенной в настоящий документ путем ссылки), для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Предпочтительным ингибитором GSK3β является 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он (композиция MCX). Обработка может включать в себя контакт плюрипотентных стволовых клеток со средой, обогащенной от около 50 нг/мл до около 150 нг/мл, альтернативно от около 75 нг/мл до около 125 нг/мл, предпочтительно около 100 нг/мл GDF8. Обработка может также включать в себя контакт клеток с от около 0,1 до около 5 мкМ, альтернативно от около 0,5 до около 2,5 мкМ, предпочтительно около 1 мкМ композиции МСХ. Плюрипотентные клетки можно культивировать на протяжении около двух-пяти дней, предпочтительно около двух-трех дней, для облегчения дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.

В предпочтительном варианте осуществления клетки культивируют в присутствии GDF8 и композиции МСХ на протяжении одного дня, с последующим культивированием в присутствии GDF8 и более низкой концентрации композиции МСХ на протяжении одного дня, с последующим культивированием в присутствии GDF8 на протяжении одного дня без добавления композиции МСХ. В частности, клетки культивируют в присутствии GDF8 и около 1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, с последующим культивированием в присутствии GDF8 и около 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, с последующим культивированием в присутствии GDF8 на протяжении одного дня без добавления композиции МСХ. Альтернативно клетки можно культивировать в присутствии GDF8 и около 1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, с последующим культивированием в присутствии GDF8 и около 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня.

Альтернативно плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в среде, содержащей активин А, но не содержащей сыворотку, впоследствии культивировать клетки с активином А и сывороткой, с последующим культивированием клеток с активином А и сывороткой в другой концентрации, как описано в DʹAmour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005). В качестве еще одной альтернативы плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А, но не содержащей сыворотку, с последующим культивированием клеток с активином A и сывороткой, как описано в DʹAmour et al., Nature Biotechnology, 2005. Дополнительно плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и WNT-лиганд, но не содержащей сыворотку, с последующим удалением WNT-лиганда и культивированием клеток с активином A и сывороткой, как описано в DʹAmour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

В одном варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки обрабатывают активином А и WNT3A для получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Обработка может включать в себя контакт плюрипотентных стволовых клеток с активином А в концентрации от около 50 нг/мл до около 150 нг/мл, альтернативно от около 75 нг/мл до около 125 нг/мл, альтернативно около 100 нг/мл. Обработка также может включать в себя контакт клеток с WNT3A в концентрации от около 10 нг/мл до около 50 нг/мл, альтернативно от около 15 нг/мл до около 30 нг/мл, альтернативно около 20 нг/мл. Плюрипотентные клетки можно культивировать в течение приблизительно трех дней для получения клеток дефинитивной энтодермы. В одном варианте осуществления плюрипотентные клетки культивируются в присутствии активина А и WNT3A на протяжении одного дня с последующим культивированием в присутствии активина А (без присутствия WNT3A).

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, можно определить путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют таких маркеров. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток может быть обнаружена, когда клетки начинают экспрессировать маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы.

Стадия 2: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки.

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, можно дополнительно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки в ростовой среде, такой как MCDB-131 или DMEM F12. В одном варианте осуществления формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает в себя культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, со средой, содержащей фактор роста фибробластов (FGF), предпочтительно FGF7 или FGF10, для дифференцировки клеток. Например, клеточная культура может включать от около 10 нг/мл до около 75 нг/мл, альтернативно от около 25 нг/мл до около 75 нг/мл, альтернативно от около 30 нг/мл до около 60 нг/мл, альтернативно около 50 нг/мл фактора роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7 и наиболее предпочтительно около 25 нг/мл FGF7. Клетки можно культивировать в этих условиях на протяжении двух-трех дней, предпочтительно около двух дней.

В другом варианте осуществления формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает в себя культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, с фактором роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, и аскорбиновой кислотой (витамином С). Культуральная среда может включать от около 0,1 мМ до около 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. Клеточная культура также может включать от около 10 нг/мл до около 35 нг/мл, альтернативно от около 15 нг/мл до около 30 нг/мл, альтернативно около 25 нг/мл фактора роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7. Например, культуральная среда может включать около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и около 25 нг/мл FGF7. В одном варианте осуществления клетки стадии 1 обрабатываются FGF7 и аскорбиновой кислотой на протяжении 2 дней.

Стадия 3: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки.

Клетки кишечной трубки, полученные при выполнении стадии 2, можно дополнительно дифференцировать в клетки стадии 3 или клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, путем культивирования этих клеток в ростовой среде, такой как MCDB-131, DMEM или специализированной среде, такой как BLAR (таблица I). Среда может быть обогащена следующими соединениями: (i) фактор роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7; (ii) ретиноевая кислота (RA); (iii) антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH) (такой как антагонист Smoothened 1 (SANT-1), который представляет собой 1-пиперазинамин, N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)- или ((E)-4-бензил-N-((3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил),этилен-пиперазин-1-амин), HPI-1, который представляет собой 2-метоксиэтил 1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-(3гидроксифенил)-7-(2-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-3-хинолинкарбоксилат, и предпочтительно SANT-1; (iv) активатор протеинкиназы С (PKC), такой как ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам) (TPB), форбол-12,13-дибутират(PDBu), форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) или индолактам V (ILV) и предпочтительно TPB; (v) ингибитор костного морфогенетического белка (BMP), такой как LDN-193189, Ноггин или Хордин и предпочтительно LDN-193189; и (vi) аскорбиновая кислота. Альтернативно также может применяться ингибитор рецептора Smoothened (SMO) (такой как MRT10 (N[[[3-бензоиламино)фенил]амино]тиоксометил]-3,4,5-триметоксибензамид)) или циклопамин. Например, клеточная культура может включать от около 100 нМ до около 500 нМ, альтернативно от около 100 нМ до около 400 нМ, альтернативно около 200 нМ активатора PKC. Клетки можно культивировать в присутствии этих факторов роста, низкомолекулярных агонистов и антагонистов на протяжении около двух-четырех дней, предпочтительно около двух-трех дней, более предпочтительно около двух дней.

Альтернативно клетки стадии 2 можно дифференцировать в клетки стадии 3 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, обогащенной ингибитором рецептора SMO, SANT-1, ретиноевой кислотой и Ноггин. Клетки можно культивировать на протяжении приблизительно двух-четырех дней, предпочтительно около двух дней.

В одном варианте осуществления среда обогащена: от около 10 нг/мл до около 35 нг/мл, альтернативно от около 15 нг/мл до около 30 нг/мл, альтернативно около 25 нг/мл фактора роста фибробластов, предпочтительно FGF7 или FGF10, более предпочтительно FGF7; от около 0,1 мМ до около 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ, альтернативно около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; от около 0,1 мкМ до около 0,4 мкМ SANT-1; от около 100 до около 300 нМ TPB; и от около 50 нМ до около 200 нМ и около 100 нМ LDN-193189. В другом варианте осуществления среда обогащена около 25 нг/мл FGF-7, около 1 мкМ ретиноевой кислоты, около 0,25 мкМ SANT-1, около 200 нМ ТРВ, около 100 нМ LDN-193189 и около 0,25 мкМ аскорбиновой кислоты.

В одном варианте осуществления среда обогащена от около 0,1 мкМ до около 0,3 мкМ SANT-1, от около 0,5 мкМ до около 3 мкМ ретиноевой кислоты и от около 75 нг/мл до около 125 нг/мл Ноггин.

Стадии 4-7: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток зрелого фенотипа, путем обработки культуральной средой, обогащенной гормоном щитовидной железы и/или ингибитором ALK, а также одним или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L, предпочтительно путем культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость.

Хотя в одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость на всех стадиях пути для плюрипотентной клетки до панкреатической эндокринной клетки, в изобретении предпочтительно предложено формирование клеток стадии 1-4 в планарной или погруженной культуре и клеток стадии 5, 6 и 7 путем культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток, включающему культивирование клеток на стадиях 4, 5 и 6 на поверхности раздела воздух-жидкость. В определенных вариантах осуществления клетки, культивируемые в течение стадий 4-7, могут культивироваться на поверхности раздела воздух-жидкость. В других вариантах осуществления на поверхности раздела воздух-жидкость культивируются только клетки от поздней стадии 4 до стадии 6 или клетки стадии 5 и стадии 6. В еще одном альтернативном варианте осуществления стадии 1-4 выполняются путем культивирования клеток в погруженных планарных культурах, а стадии 5-7 выполняются путем культивирования в погруженных суспензионных культурах.

Дополнительно культивирование в течение одной или более и предпочтительно всех из стадий 5, 6 и 7 выполняется в присутствии одного или более из Т3, Т4 и их аналогов, или ингибитора ALK5, или одного или более из Т3, Т4 и их аналогов и ингибитора ALK5. В предпочтительных вариантах осуществления культивирование в течение одной или более и предпочтительно всех из стадий 5, 6 и 7 предпочтительно выполняется в присутствии Т3 и ингибитора ALK5 и более предпочтительно в присутствии Т3 и ингибитора ALK5 II. Приемлемые количества гормонов щитовидной железы или их аналогов составляют от около 0 до около 1000 нМ, альтернативно от около 10 до около 900 нМ, альтернативно от около 100 до около 800 нМ, альтернативно от около 200 до около 700 нМ, альтернативно от около 300 до около 600 нМ, альтернативно от около 400 до около 500 нМ, альтернативно от около 1 до около 500 нМ, альтернативно от около 1 до около 100 нМ, альтернативно от около 100 до около 1000 нМ, альтернативно от около 500 до около 1000 нМ, альтернативно от около 100 до около 500 нМ, альтернативно около 1 мкМ, и предпочтительно от около 0,1 до 1 мкМ. Количества ингибитора ALK5 составляют от около 250 нМ до 2 мкМ, альтернативно от около 300 до около 2000 нМ, альтернативно от около 400 до около 2000 нМ, альтернативно от около 500 до около 2000 нМ, альтернативно от около 600 до около 2000 нМ, альтернативно от около 700 до около 2000 нМ, альтернативно от около 800 до около 2000 нМ, альтернативно от около 1000 до около 2000 нМ, альтернативно от около 1500 до около 2000 нМ, альтернативно от около 250 до около 1000 нМ, альтернативно от около 250 до около 500 нМ, альтернативно от около 300 до около 1000 нМ, альтернативно от около 400 до около 1000 нМ, альтернативно от около 500 до около 1000 нМ, альтернативно от около 600 до около 1000 нМ, альтернативно от около 700 до около 1000 нМ, альтернативно от около 800 до около 1000 нМ, альтернативно около 500 нМ, альтернативно около 10 мкМ и предпочтительно около 10 мкМ.

При культивировании клеток на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) клетки можно культивировать на пористом субстрате таким образом, что клетки находятся в контакте с воздухом на верхней стороне и с клеточной культуральной средой на нижней стороне. Например, достаточный объем среды можно добавить на дно сосуда для культивирования, содержащего пористый субстрат (например, фильтрующую вставку), таким образом, что среда будет контактировать с нижней поверхностью клеток, расположенных на субстрате, но не будет герметизировать или погружать их. Приемлемые пористые субстраты могут быть сформированы из любого материала, который не окажет отрицательного влияния на рост и дифференцировку клеток. Примеры пористых субстратов изготовлены из полимеров, таких как полиэтилентерефталат (РЕТ), полиэфир или поликарбонат. Приемлемые пористые субстраты могут быть с покрытием или без покрытия. В одном варианте осуществления покрытие может представлять собой MATRIGEL™. В одном варианте осуществления изобретения пористый субстрат представляет собой пористую фильтрующую вставку, которая может быть покрыта MATRIGELтм. В одном варианте осуществления изобретения пористый субстрат представляет собой фильтрующую вставку без покрытия. Пористость субстрата должна быть достаточной для поддержания жизнеспособности клетки и стимуляции дифференцировки клеток. Приемлемые субстраты включают в себя фильтрующие вставки, имеющие размер пор от около 0,3 до около 3,0 мкм, от около 0,3 до около 2,0 мкм, от около 0,3 до около 1,0 мкм, от около 0,3 до около 0,8 мкм, от около 0,3 до около 0,6 мкм, от около 0,3 до около 0,5 мкм, от около 0,3 до около 3,0 мкм, от около 0,6 до около 3,0 мкм, от около 0,8 до около 3,0 мкм, от около 1,0 до около 3,0 мкм, от около 2,0 до около 3,0 мкм, предпочтительно около 0,4 мкм, и плотность пор от около 50 до около 120 миллионов пор/см², от около 60 до около 110 миллионов пор/см², от около 70 до около 100 миллионов пор/см², предпочтительно от около 80 до около 100 миллионов пор/см², от около 90 до около 100 миллионов пор/см² и более предпочтительно около 100 миллионов пор/см².

Среду можно менять или обновлять через день или предпочтительно каждый день. Клетки, выросшие на верхней стороне пористого субстрата, по существу не являются одиночными клетками, но чаще они формируют пласт или существуют в виде агрегированного скопления клеток. Клетки, культивируемые на поверхности раздела воздух-жидкость, могут испытывать большее давление кислорода по сравнению с клетками, погруженными в среду.

Настоящее изобретение включает формирование клеток стадий 4-7, предпочтительно клеток стадий 5-7, на поверхности раздела воздух-жидкость. Клетки можно получить путем дифференцировки плюрипотентных столовых клеток или путем дополнительной дифференцировки клеток стадий 3, 4, 5 или 6. Клетки стадии 4 можно культивировать полностью на поверхности раздела воздух-жидкость, или клетки можно культивировать в погруженной планарной культуре во время раннего периода стадии 4, то есть около одного-двух дней, и впоследствии культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость во время позднего периода стадии 4, то есть приблизительно от второго до третьего дня. Предпочтительно стадия 4 выполняется не на поверхности раздела воздух-жидкость, а в погруженной культуре.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предложен способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование плюрипотентных стволовых клеток; дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермы передней кишки; дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования, необязательно на поверхности раздела воздух-жидкость. Способ может включать обработку средой, обогащенной одним или обоими из (i) Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитором ALK5; или как (i), так и (ii). Способ может включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки (клетки стадии 3), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки (клетки стадии 4), путем обработки средой, обогащенной (i) одним или обоими из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитором ALK5; или как (i), так и (ii), и культивирования в планарной культуре. Способ может также включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки (клетки стадии 4), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток (клетки стадии 6), путем обработки средой, обогащенной (i) одним или обоими из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитором ALK5; или как (i), так и (ii), и культивирования в планарной культуре или предпочтительно культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость. Способ дополнительно включает дифференцировку клеток стадии 6 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, и которые имеют более зрелый фенотип по сравнению с клетками стадии 6 (клетки стадии 7), путем обработки средой, обогащенной (i) одним или обоими из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитором ALK5; или как (i), так и (ii), а также одним или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L и необязательно, но предпочтительно антиоксидантом, таким как витамин Е или предпочтительно ацетилцистеин. Используемое количество ацетилцистеина составляет от около 0,1 до около 2 мМ. Количество витамина Е составляет от около 0,1 до около 10 мкМ. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает выполнение стадии 6 путем обработки клеток стадии 5 средой, обогащенной (i) одним или обоими из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитором ALK5; или как (i), так и (ii), а также одним или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L. В еще одном варианте осуществления стадия 6 выполняется путем обработки клеток стадии 5 средой, обогащенной (i) одним или обоими из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитором ALK5; или как (i), так и (ii), а также одним или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L с последующим выполнением стадии 7 путем обработки средой, обогащенной (i) одним или обоими из Т3, Т4 или их аналогов; (ii) ингибитором ALK5; или как (i), так и (ii), а также одним или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L и необязательно, но предпочтительно антиоксидантом, таким как витамин Е или предпочтительно ацетилцистеин.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой способ формирования панкреатических эндокринных клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для созревающих бета-клеток (клетки стадии 7), включающий дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки (клетки стадии 4), в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток стадии 7, путем культивирования, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к образованию клеток стадии 6 или клеток, которые представляют собой незрелые бета-клетки, причем способ предпочтительно, по меньшей мере, в течение стадий 5-7 включает обработку средой, обогащенной Т3, Т4 или их аналогом и/или ингибитором ALK5.

Культивирование клеток на поверхности раздела воздух-жидкость включает в себя посев клеток на пористый субстрат, такой как пористая фильтрующая вставка. В определенных вариантах осуществления размер пор в субстрате может находиться в диапазоне от около 0,3 до около 3 мкм. Посев может быть выполнен путем высвобождения одиночных клеток из однослойных культур или скоплений клеток из однослойных культур в суспензию и последующего аликвотирования суспензии из одиночных клеток или взвешенной клеточной культуры на пористый субстрат на поверхности раздела воздух-жидкость. Клетки можно посеять на пористый субстрат из суспензии, имеющей от около 1000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 90 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 80 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 70 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 60 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 50 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 40 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 30 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 20 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 10 000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 5000 клеток/мкл, от около 5000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 10 000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 20 000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 30 000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 40 000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 50 000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 60 000 клеток/мкл до около 100 000 клеток/мкл, от около 20 000 клеток/мкл до около 80 000 клеток/мкл, от около 30 000 клеток/мкл до около 70 000 клеток/мкл, от около 40 000 клеток/мкл до около 60 000 клеток/мкл и предпочтительно около 50 000 клеток/мкл. Клетки могут быть посеяны в виде капель клеточной суспензии, содержащей отдельные клетки или агрегаты или скопления клеток. Итоговый пласт клеток может содержать от около 5×106 до около 5×107 клеток/см², от около 6×106 до около 5×107 клеток/см², от около 7×106 до около 5×107 клеток/см², от около 8×106 до около 5×107 клеток/см², от около 9×106 до около 5×107 клеток/см², от около 1×107 до около 5×107 клеток/см², от около 2×107 до около 5×107 клеток/см², от около 3×107 до около 5×107 клеток/см², от около 4×107 до около 5×107 клеток/см², от около 5×106 до около 4×107 клеток/см², от около 5×106 до около 3×107 клеток/см², от около 5×106 до около 2×107 клеток/см², от около 5×106 до около 1×107 клеток/см², от около 5×106 до около 9×106 клеток/см², от около 5×106 до около 8×106 клеток/см², от около 5×106 до около 7×106 клеток/см², от около 5×106 до около 6×106 клеток/см², от около 7×106 до около 4×107 клеток/см², от около 8×106 до около 3×107 клеток/см², от около 9×106 до около 2×107 клеток/см² и предпочтительно около 1×107 клеток/см².

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу увеличения числа клеток, положительных в отношении единственного гормона (например, клетки, которые одновременно экспрессируют NKX6.1 и инсулин, или клетки, которые одновременно экспрессируют NKX6.1 и хромогранин, путем культивирования и дифференцировки популяции клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость. В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивируемые на поверхности раздела воздух-жидкость, дополнительно дифференцируются в панкреатические эндокринные клетки путем обработки композицией, выбранной из следующих: ингибитор ALK5, ингибитор ВМР, ингибитор гамма-секретазы, Эфрин лиганды, ингибитор EphB, ингибитор РКС, ингибитор EGFr, ретиноевая кислота, витамин С, Т3/Т4, глюкоза, регуляторы клеточного цикла, регуляторы WNT, ингибитор SHH, ингибитор Aurora, антиоксиданты, витамин Е, ацетилцистеин или их комбинации.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к поэтапному способу дифференцировки плюрипотентных клеток, который включает культивирование клеток стадий 4-6 в среде, содержащей достаточные количества (i) одного или более из Т3, Т4 и их аналогов; (ii) ингибитора ALK5; или как (i), так и (ii), и дополнительное культивирование клеток стадии 6 в среде, которая необязательно и предпочтительно содержит один или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L и антиоксидант для получения панкреатических эндокринных клеток и популяций панкреатических эндокринных клеток, которые экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA.

В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 10% клеток итоговой клеточной популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В других вариантах осуществления, по меньшей мере, 20% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В других вариантах осуществления, по меньшей мере, 30% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере, 40% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере, 50% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, 60% клеток экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В еще одних альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, 70% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере, 80% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В других вариантах осуществления, по меньшей мере, 90% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA. В альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% клеток популяции экспрессируют инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA.

Стадия 4: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки.

В одном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 3 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую ростовую среду и предпочтительно представляет собой MCDB-131, DMEM или специализированную среду, такую как BLAR (таблица I). Среда может быть обогащена одним или более из следующих компонентов: (а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора рецептора TGF-β V, ингибитора рецептора TGF-β I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III, ингибитора рецептора TGF-β SB431542, SD-208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5 I и ингибитора ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из Т3, Т4, аналогов Т3, аналогов Т4 и их смесей (c) антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), выбранный из SANT-1 или HIP-1; (d) ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, Ноггин или Хордин; (e) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA и ILV; (f) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF-7 или FGF-10; (g) ретиноевая кислота; и (h) аскорбиновая кислота;. Например, ростовая среда, такая как MCDB131 или, и предпочтительно, BLAR, может быть обогащена антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH) (таким как SANT-1 или HPI-1), ингибитором ВМР (таким как LDN-193189, Ноггин или Хордин), аскорбиновой кислотой и активатором PKC (таким как TPB, PDBu, PMA или ILV) для обеспечения приемлемой дифференцировочной среды. Культивирование клеток стадии 3 в такой среде на протяжении около двух-четырех дней, предпочтительно около двух-трех дней, более предпочтительно около трех дней, как правило, является достаточным для дифференцировки клеток стадии 3 в клетки стадии 4. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны средой, обогащенной около 0,25 мкМ SANT-1; около 100 нМ RA; около 2 нг/мл FGF7; около 100 нM LDN-193189; и около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и около 200 нМ в течение трех дней.

На стадии 4 клетки можно культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость либо в течение всей стадии, либо, и предпочтительно, через 2-3 дня после планарного культивирования. В частности, в настоящем изобретении предложена клеточная культура в условиях in vitro для дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток на поверхности раздела воздух-жидкость, содержащая: (а) сосуд для культивирования; (b) объем ростовой среды в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема сосуда; (с) воздух в пределах сосуда, который заполняет часть сосуда, свободную от среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между средой и воздухом; и (е) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности субстрата таким образом, что среда контактирует только с частью поверхности клеток. Альтернативно стадия 4 может выполняться полностью в планарной культуре.

В дополнительном варианте осуществления клетки по завершении стадии 4 могут быть обработаны ингибитором Rho-ассоциированной киназы (ROCK), таким как Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-аминоэтил)-N-(пиридин-4-ил)циклогексанкарбоксамид), GSK269962 (N-[3-[[2-(4-амино-1,2,5-оксадиазол-3?-ил)-1-этил-1H-имидазо[4,5-c]пиридин-6-ил]окси]фенил]-4-[2-(4-морфолинил)этокси]бензамид), H1152 ((S)-(+)-2-метил-1-[(4-метил-5-изохинолинил)сульфонил]гомопиперазин, 2 HCl,) и SR3677 (N-[2-[2-(диметиламино)этокси]-4-(1H-пиразол-4-ил)фенил-2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-2-карбоксамиддигидрохлорид). В определенных вариантах осуществления можно применять около 1-20 мкМ, альтернативно около 1-15 мкМ, альтернативно около 1-10 мкМ, предпочтительно около 10 мкМ ингибитора ROCK.

В определенных вариантах осуществления только клетки поздней стадии 4, то есть клетки, которые были культивированы в течение 1-2 дней в планарных культурах, можно затем культивировать на поверхности раздела воздух-жидкость для завершения стадии 4. В одном варианте осуществления только клетки поздней стадии 4, которые были обработаны ингибитором ROCK, культивируются на поверхности раздела воздух-жидкость. В других вариантах осуществления выполняют посев от 0,5 до около 0,75×105 клеток/микролитр для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость; альтернативно выполняют посев приблизительно от 2 до 6×106 клеток для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость. В определенных вариантах осуществления клетки можно обрабатывать раствором для разъединения клеток, таким как раствор, содержащий протеолитические и коллагенолитические ферменты, такой как TrypLE™, Accutase™ или Dispase™, перед культивированием на поверхности раздела воздух-жидкость.

В альтернативном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5, Ноггин и активатором РКС, таким как ТРВ. В определенных вариантах осуществления среда может быть обогащена около 0,1 мкМ ингибитора ALK5, около 100 нг/мл Ноггин и около 500 нМ ТРВ. Клеточная культура может быть в однослойном формате. Обработка может длиться в целом около трех дней. В определенных вариантах осуществления клетки могут обрабатываться на протяжении двух дней, и впоследствии, в последний день, клетки могут обрабатываться протеолитическими ферментами, коллагенолитическими ферментами или и теми, и другими, такими как Dispase™, и разбиваться на клеточные кластеры, имеющие диаметр менее чем приблизительно 100 микрон, с последующим культивированием в присутствии ингибитора ALK5 и LDN-193189. В определенных вариантах осуществления клеточные кластеры, имеющие диаметр менее чем приблизительно 100 микрон, могут культивироваться в среде, обогащенной около 200 нМ ингибитора ALK5 и около 100 нМ LDN-193189. В альтернативном варианте осуществления культивирование клеток стадии 4 на поверхности раздела воздух-жидкость может значительно увеличить экспрессию маркеров панкреатической энтодермы и маркеров, относящихся к эндокринным клеткам. Соответственно, в изобретении предложены способы увеличения экспрессии маркеров панкреатической энтодермы и маркеров, относящихся к эндокринным клеткам, путем культивирования клеток стадии 4 на поверхности раздела воздух-жидкость.

Стадия 5: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников.

В одном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую ростовую среду и предпочтительно представляет собой MCDB-131, DMEM или, и предпочтительно, специализированную среду, такую как BLAR (таблица I). Среда может быть обогащена одним или более из следующих компонентов: (а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора рецептора TGF-β V, ингибитора рецептора TGF-β I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III, ингибитора рецептора TGF-β SB431542, SD-208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5 I и ингибитора ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из Т3, Т4, аналогов Т3, аналогов Т4 и их смесей; (с) антагонист сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), выбранный из SANT-1 или HIP-1; (d) ингибитор рецептора ВМР, выбранный из LDN-193189, Ноггин или Хордин; (e) ретиноевая кислота; (f) аскорбиновая кислота; (g) гепарин; и (h) сульфат цинка, и культивирование клеток, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, в течение около двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В другом варианте осуществления ростовая среда также обогащена одним или обоими из ингибитора SMO (такого как MRT10 или циклопамин) и фактора роста фибробластов, предпочтительно выбранного из FGF-7 или FGF-10. Обработка клеток стадии 4 выполняется в течение около двух-четырех дней, предпочтительно около 3 дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5.

В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной от около 0,1 мкМ до около 0,4 мкМ SANT-1 и предпочтительно около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, от около 0,1 мМ до около 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от около 0,2 мМ до около 0,4 мМ и предпочтительно около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, от около 50 нМ до около 200 нМ и предпочтительно около 100 нМ LDN-193189, около 1 мкМ Т3 и около 10 000 нМ ингибитора ALK5, более предпочтительно ингибитора ALK5 II. В еще одном варианте осуществления клетки необязательно и предпочтительно также обрабатывают около 1-15 мкМ, альтернативно около 1-10 мкМ ZnSO4, альтернативно около 5-10 мкМ, предпочтительно около 10 мкМ около 10 мкМ сульфата цинка и около 1-100 мкг/мл, предпочтительно около 10 мкг/мл гепарина. Обработка клеток стадии 4 выполняется в течение около двух-четырех дней, предпочтительно около 3 дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5.

В еще одном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), RA, ингибитором рецептора BMP и ингибитором ALK5, и культивирование клеток на поверхности раздела воздух-жидкость на протяжении около 3 дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), а также RA, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5. Таким образом, в одном варианте осуществления клетки стадии 4 можно дифференцировать в клетки стадии 5 путем обработки клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ZnSO4, ингибитором SMO или антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), RA, LDN-193189 и ингибитором ALK5 II. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). В одном варианте осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 50 нМ LDN-193189, около 10 нМ Т3 и около 1000 нМ ингибитора ALK5. Приемлемые ингибиторы ALK5 включают, без ограничений, SD-208, ингибитор ALK5 II, ингибитор рецептора TGF-β V, ингибитор рецептора TGF-β I, ингибитор рецептора TGF-β IV, ингибитор рецептора TGF-β VII, ингибитор рецептора TGF-β VIII, ингибитор рецептора TGF-β II, ингибитор рецептора TGF-β VI, ингибитор рецептора TGF-β III и их комбинации. Обработка клеток стадии 4 выполняется в течение около двух-четырех дней, предпочтительно около 3 дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5.

В предпочтительном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II. В другом предпочтительном варианте осуществления применяется около 10 000 нМ ингибитора ALK5 II. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 4 обрабатывают средой, обогащенной около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 100 нМ LDN-193189 и около 10 000 нМ ингибитора ALK5 II. В еще одном альтернативном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором SMO или антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), RA и ингибитором ALK5, и культивирование клеток предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость на протяжении около двух-четырех дней, предпочтительно около 3 дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). В одном варианте осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 50 нМ LDN-193189, около 1 мкМ T3 и около 1000 нМ ингибитора ALK5.

Количество клеток, посеянных для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость, может варьировать. Например, для культивирования клеток на поверхности раздела воздух-жидкость капли клеточной суспензии, содержащей приблизительно от 0,5 до 6×105 клеток/мкл, могут быть посеяны на пористый субстрат (например, фильтр). Суспензия может содержать от около 2×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 4×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 5×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 5×105 клеток/мкл до около 6×105 клеток/мкл; от около 2×105 клеток/мкл до около 5×105 клеток/мкл; от около 2×105 клеток/мкл до около 4×105 клеток/мкл; или около 3×105 клеток/мкл, которые могут быть посеяны на пористый субстрат, такой как фильтр, размещенный на поверхности раздела воздух-жидкость. В некоторых вариантах осуществления капли клеточной суспензии, содержащие от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл; от около 0,6×105 клеток/мкл до около 0,75×105 клеток/мкл; или от около 0,5×105 клеток/мкл до около 0,6×105 клеток/мкл, сеют на пористую подложку для культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость.

В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором рецептора ВМР (например, LDN-193189, Ноггин или Хордин) и ингибитором ALK5, на протяжении около 1 дня для дифференцировки клеток стадии 4 в клетки стадии 5. Например, среда может быть обогащена около 100 нМ LDN-193189, и около 100 нМ ингибитора ALK5, и около 1 мкМ Т3. Клетки могут быть сформированы в кластеры. В определенных вариантах осуществления клетки можно обрабатывать раствором для разъединения клеток, таким как раствор, содержащий протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием на поверхности раздела воздух-жидкость.

В соответствии с вышеупомянутым способом в изобретении дополнительно предложена клеточная культура для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, содержащая: (а) сосуд для культивирования; (b) объем ростовой среды в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух в пределах указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, свободную от указанной среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенных на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.

Стадия 6: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.

В одном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 5 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую ростовую среду, предпочтительно такую как MCDB-131 или CMRL, и более предпочтительно специализированную среду, такую как BLAR (таблица I). Среда может быть обогащена одним или более из следующих компонентов: (а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора рецептора TGF-β V, ингибитора рецептора TGF-β I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III, ингибитора рецептора TGF-β SB431542, SD-208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5 I и ингибитора ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из Т3, Т4, их аналогов и их смесей; (c) ингибитор рецептора ВМР, предпочтительно выбранный из LDN-193189, Ноггин или Хордин; (d) ингибитор гамма-секретазы, такой как ингибитор гамма-секретазы XX, ингибитор гамма-секретазы XXI, ингибитор гамма-секретазы XVI или DAPT; (e) аскорбиновая кислота; (f) гепарин; и (g) сульфат цинка, и культивированием, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, в течение около двух-четырех, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток стадии 5 в клетки стадии 6. Необязательно среда может быть дополнительно обогащена одним или более из антагониста сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитора рецептора Smoothened, фактора роста фибробластов и ретиноевой кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной около 50 нМ RA, около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, около 100 нМ LDN-193189, около 10 000 нМ ингибитора ALK5 и предпочтительно ингибитора ALK5 II, 1 мкМ Т3, около 100 нМ ингибитора гамма-секретазы в течение около семи дней. Альтернативно клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки клеток средой, обогащенной около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, около 1000 нМ ингибитора ALK5 и 1 мкМ T3 в течение около трех дней. Клетки можно культивировать в такой среде на протяжении дополнительных двух дней или более, если это желательно.

Альтернативно клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитором ВМР, Т3, Т4, их аналогами и их смесями и ингибитором ALK5, и культивирования, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, в течение около одного-семи дней, альтернативно около шести дней, альтернативно около семи дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH). Например, клетки можно культивировать в среде, обогащенной около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 100 нМ LDN-193189, около 1000 нМ Т3 и от около 500 до около 10 000 нМ, альтернативно около 500 нМ, альтернативно около 1000 мМ и альтернативно около 10 000 нМ ингибитора ALK5. Приемлемые ингибиторы ALK5 включают, без ограничений, SD-208, ингибитор ALK5 II, ингибитор рецептора TGF-β V, ингибитор рецептора TGF-β I, ингибитор рецептора TGF-β IV, ингибитор рецептора TGF-β VII, ингибитор рецептора TGF-β VIII, ингибитор рецептора TGF-β II, ингибитор рецептора TGF-β VI, ингибитор рецептора TGF-β III и их комбинации.

В другом варианте осуществления клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитором ВРМ, Т3 и ингибитором ALK5 II, и культивирования на поверхности раздела воздух-жидкость на протяжении от около 5 дней до около 7 дней, альтернативно около 5 дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней. В этих вариантах осуществления среда может быть обогащена около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 100 нМ LDN-193189, около 1000 нМ Т3 и около 10 000 нМ ингибитора ALK5 II. В определенных вариантах осуществления среда может быть дополнительно обогащена сульфатом цинка (ZnSO4). Например, среда может быть дополнительно обогащена около 10 мМ ZnSO4. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и антагонистом сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH).

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения к среде добавляют один или более из ингибитора киназы Aurora, предпочтительно ингибитора киназы Aurora II, ингибитора RSK, предпочтительно ингибитора RSK II, и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L, предпочтительно EPZ 5676. Добавленное количество может составлять около 100-5000 нМ, альтернативно около 1000-5000 нМ, альтернативно около 2000-5000 нМ, альтернативно около 3000-5000 нМ и предпочтительно около 1000-2000 нМ для киназы Aurora и ингибиторов RSK и около 100-1000 нМ для ингибитора DOT1L и более предпочтительно от около 1 мкМ до около 10 нМ.

В соответствии с вышеупомянутым способом в изобретении дополнительно предложена клеточная культура для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, содержащая: (а) сосуд для культивирования; (b) объем ростовой среды в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух в пределах указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, свободную от указанной среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между указанной средой и указанным воздухом; и (d) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенных на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.

В одном варианте осуществления клетки стадии 5, полученные в соответствии с вариантами осуществления изобретения, используются и дифференцируются в клетки стадии 6, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки стадии 5, полученные в соответствии с другими протоколами.

В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, положительных в отношении единственного гормона. Таким образом, в одном варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые совместно экспрессируют NKX6.1, инсулин, хромогранин и PDX1. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые совместно экспрессируют NKX6.1 и инсулин. В определенных вариантах осуществления способ включает применение специализированной среды BLAR (см. таблицу I) на стадиях 4-6, или начиная от поздней стадии 4 до стадии 6, или на стадиях 5 и 6. Среда может меняться, и предпочтительно меняется, каждый день или альтернативно через день.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток стадии 6, совместно экспрессирующих NKX6.1 и хромогранин, включающему культивирование клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 6 на поверхности раздела воздух-жидкость. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток стадии 6, положительных в отношении единственного гормона инсулина и экспрессирующих NKX6.1, путем культивирования клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 6 на поверхности раздела воздух-жидкость.

Стадия 7: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, имеющих более зрелый фенотип.

В одном варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 6 дифференцировочной средой, которая может представлять собой любую приемлемую ростовую среду, предпочтительно такую как MCDB-131 или CMRL, или, и более предпочтительно, специализированную среду, такую как BLAR (таблица I). Среда обогащена одним или более из следующих компонентов: (а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из: ингибитора рецептора TGF-β V, ингибитора рецептора TGF-β I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III, ингибитора рецептора TGF-β SB431542, SD-208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5 I и ингибитора ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из Т3, Т4, их аналогов и их смесей; (c) гепарин; (d) сульфат цинка; (e) антиоксидант, выбранный из группы, состоящей из витамина Е, витамина C, ацетилцистеина, антиоксидантной добавки А1345, глутатиона, супероксиддисмутазы, каталазы и их комбинаций; и (f) один или более из ингибитора киназы Aurora, который предпочтительно представляет собой ингибитор киназы Aurora II, ингибитора RSK, который предпочтительно представляет собой ингибитор RSK II, и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L, который предпочтительно представляет собой EPZ 5676, и культивированием, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, в течение приблизительно от семи до двадцати одного дня, предпочтительно в течение приблизительно от семи до десяти дней, более предпочтительно приблизительно семи дней, для дифференцировки клеток стадии 6 в клетки стадии 7. В одном варианте осуществления ростовая среда обогащена Т3, Т4, их аналогами и их смесями, ингибитором ALK5, антиоксидантом и ингибитором киназы Aurora, предпочтительно ингибитором киназы Aurora II, или ингибитором RSK, предпочтительно ингибитором RSK II. Клетки стадии 6 можно дифференцировать в клетки стадии 7 путем обработки средой, обогащенной около 10 000 нМ ингибитора ALK5 II, около 1000 нМ Т3, около 10 мкМ 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты (Trolox) и от около 1 мкМ до около 1 мкМ ингибитора киназы Aurora II или ингибитора RSK II в течение около семи дней.

В одном варианте осуществления клетки стадии 6 можно дифференцировать в клетки стадии 7 путем обработки средой, обогащенной около 10 000 нМ ингибитора ALK5, около 1 мкМ Т3, около 2 мкМ одного или более из ингибитора киназы Aurora II, ингибитора RSK II и EPZ 5676 и около 1 мМ N-ацетилцистеина. Альтернативно также можно добавить одно или более из около 0,25 мкМ SANT-1, около 50 нМ RA, около 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и около 100 нМ LDN-193189.

Альтернативно клетки стадии 6 можно дифференцировать в клетки стадии 7 путем обработки средой, обогащенной гепарином, Т3, Т4, их аналогами или их смесями, ингибитором ALK5, антиоксидантом и ингибитором киназы Aurora, ингибитором RSK, ингибитором протеин метилтрансферазы DOT1L или их смесями, и культивирования, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, в течение приблизительно от семи до двадцати одного дня, альтернативно приблизительно от семи до десяти дней, предпочтительно приблизительно семи дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена одним или более из ретиноевой кислоты, ингибитора SMO, антагониста сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH), ингибитора рецептора BMP и N-ацетилцистеина.

В предпочтительном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II. В более предпочтительном варианте осуществления применяется около 10 000 нМ ингибитора ALK5 II. Соответственно, в одном варианте осуществления клетки стадии 6 можно дифференцировать в клетки стадии 7 путем обработки средой, обогащенной гепарином, Т3, Т4, их аналогами и их смесями и ингибитором ALK5, антиоксидантом и ингибитором киназы Aurora, ингибитором RSK или ингибитором протеин метилтрансферазы DOT1L, и культивирования, предпочтительно на поверхности раздела воздух-жидкость, в течение приблизительно семи дней. В определенных вариантах осуществления клетки можно обрабатывать раствором для разъединения клеток, таким как раствор, содержащий протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием на поверхности раздела воздух-жидкость. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения к среде добавляют один или более из ингибитора киназы Aurora, предпочтительно ингибитора киназы Aurora II, ингибитора RSK, предпочтительно ингибитора RSK II, и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L, предпочтительно EPZ 5676. Добавленное количество может составлять около 100-5000 нМ, альтернативно около 1000-5000 нМ, альтернативно около 2000-5000 нМ, альтернативно около 3000-5000 нМ и предпочтительно около 1000-2000 нМ ингибитора киназы Aurora, более предпочтительно около 2000 нМ ингибитора киназы Aurora или ингибитора RSK, или около 100-500 нМ ингибитора DOT1L и более предпочтительно от около 1 мкМ до около 10 нМ ингибитора DOT1L.

В соответствии с вышеупомянутым способом в изобретении дополнительно предложена клеточная культура для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для зрелых панкреатических эндокринных клеток, содержащая: (а) сосуд для культивирования; (b) объем ростовой среды в пределах указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух в пределах указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, свободную от указанной среды; (d) пористый субстрат, размещенный на поверхности раздела между указанной средой и указанным воздухом; и (d) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенных на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.

В одном варианте осуществления клетки стадии 6, полученные в соответствии с вариантами осуществления изобретения, используются и дифференцируются в клетки стадии 7, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки стадии 6, полученные в соответствии с другими протоколами.

В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 7, положительных в отношении единственного гормона. Таким образом, в одном варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 7, которые совместно экспрессируют NKX6.1, инсулин, PDX1 и MAFA. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 7, которые совместно экспрессируют NKX6.1, PDX1, инсулин и MAFA. В еще одном варианте осуществления образуется популяция клеток, в которой каждая клетка из, по меньшей мере, около 10%, альтернативно, по меньшей мере, около 20%, альтернативно, по меньшей мере, около 30%, альтернативно, по меньшей мере, около 40%, альтернативно, по меньшей мере, около 50%, альтернативно, по меньшей мере, около 60%, альтернативно, по меньшей мере, около 70%, альтернативно, по меньшей мере, около 80% или альтернативно, по меньшей мере, около 90% популяции клеток экспрессирует инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA.

В определенных и предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ включает применение специализированной среды BLAR (таблица I) на стадиях 4-7, или начиная от поздней стадии 4 до стадии 7, или на стадиях 5, 6 и 7. Среда предпочтительно может заменяться каждый день или альтернативно через день.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток стадии 7, совместно экспрессирующих NKX6.1, PDX1, MAFA и инсулин, включающему культивирование клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 7 на поверхности раздела воздух-жидкость. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток стадии 7, положительных в отношении единственного гормона инсулина и экспрессирующих NKX6.1, PDX1 и MAFA, путем культивирования клеток стадии 4, предпочтительно клеток поздней стадии 4, в клетки стадии 7 на поверхности раздела воздух-жидкость.

Клетки стадии 6 и 7, полученные в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, также хорошо подходят для применения в композициях, используемых для скрининга, из-за их влияния на секрецию панкреатических гормонов и эндокринных маркеров. В частности, клетки стадий 4-7, культивированные на поверхности раздела воздух-жидкость, можно тестировать в различных формах для культивирования, содержащих от 384 до 6 лунок. Такие формы позволяют оценить множество малых молекул или биологических препаратов в различных дозах и временных интервалах в отношении последующей экспрессии маркеров панкреатических энтодермальных клеток, панкреатических эндокринных клеток-предшественников, панкреатических эндокринных клеток и панкреатических бета-клеток. Такая оценка может быть выполнена путем измерения экспрессии генов с помощью ПЦР, экспрессии белков с помощью FACS, или иммуноокрашивания, или с помощью ИФА в отношении секреции факторов клетками, подвергнутыми воздействию малых молекул/биологических препаратов.

Клетки, получаемые с помощью способов изобретения

В изобретении предложена клетка или популяция клеток, которую можно получить способом изобретения. В изобретении также предложена клетка или популяция клеток, предпочтительно экспрессирующая маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток зрелого фенотипа. В изобретении также предложена инсулин-положительная клетка или популяция инсулин-положительных клеток, предпочтительно экспрессирующая маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток зрелого фенотипа, которая характеризуется экспрессией NKX6.1 (предпочтительно более чем около 30%), экспрессией PDX1 (предпочтительно более чем около 30%) и экспрессией MAFA (предпочтительно более чем около 10%).

Способы лечения

В настоящем изобретении предложены способы лечения и, в частности, для лечения пациентов, страдающих диабетом или находящихся в группе риска развития диабета. В изобретении также предложена популяция клеток, получаемых или полученных способом изобретения, для применения в способе лечения. В частности, в изобретении предложена клетка или популяция клеток, получаемых или полученных способом изобретения, для применения в способе лечения пациента, страдающего диабетом или находящегося в группе риска развития диабета. Диабет может быть диабетом 1-го типа или 2-го типа.

В одном варианте осуществления способ лечения включает имплантацию клеток, полученных или получаемых способом изобретения, пациенту. В одном варианте осуществления способ лечения включает дифференцировку плюрипотентных клеток в условиях in vitro в клетки стадии 1, стадии 2, стадии 3, стадии 4, стадии 5, стадии 6 или стадии 7, например как описано в настоящем документе, и имплантацию дифференцированных клеток пациенту. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает этап культивирования плюрипотентных стволовых клеток, например как описано в настоящем документе, до этапа дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток. В дополнительном варианте осуществления способ дополнительно включает этап дифференцировки клеток в условиях in vivo после этапа имплантации. В одном варианте осуществления пациент, получающий лечение любым из способов, представляет собой млекопитающее и, предпочтительно, человека.

В одном варианте осуществления клетки можно имплантировать в виде диспергированных клеток или скоплений клеток, которые можно вводить путем инфузии в сосудистую систему, например в воротную вену печени. Альтернативно, клетки могут быть обеспечены в биосовместимых, разлагаемых, полимерных подложках, пористых, неразлагаемых устройствах или в герметизированном виде для защиты от иммунной системы организма-хозяина. В одном варианте осуществления способ лечения дополнительно включает внедрение клеток в трехмерную подложку перед имплантацией. Клетки можно поддерживать в условиях in vitro на этой подложке перед имплантацией пациенту. Альтернативно, подложку, содержащую клетки, можно имплантировать непосредственно в организм пациента без дополнительного культивирования в условиях in vitro. В подложку может быть необязательно внедрен, по меньшей мере, один фармацевтический агент, способствующий выживаемости и функционированию трансплантированных клеток. Клетки могут быть имплантированы в подходящий участок в реципиенте, включая, например, печень, естественную поджелудочную железу, субкапсулярное пространство почек, сальник, брюшную полость, субсерозное пространство, кишечник, желудок или подкожный карман.

Для повышения дополнительной дифференцировки, выживаемости или активности имплантированных клеток в условиях in vivo можно вводить дополнительные факторы, такие как факторы роста, антиоксиданты или противовоспалительные агенты, до, одновременно или после введения клеток. Данные факторы могут секретироваться эндогенными клетками и подвергаться воздействию введенных клеток in situ. Дифференцировку имплантированных клеток можно стимулировать любой комбинацией эндогенных и введенных экзогенно факторов роста, известных в данной области.

Количество клеток, применяемых при имплантации, зависит от ряда факторов, включая состояние реципиента и его реакцию на имплантационную терапию, и может быть определено специалистом в данной области.

Для дополнительного разъяснения сути изобретения приведены следующие примеры, не имеющие ограничительного характера.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Панкреатические энтодермальные клетки, культивируемые на поверхности раздела воздух-жидкость - прогрессирующее увеличение экспрессии MAFA от стадии 5 до стадии 7

Этот пример демонстрирует кинетику экспрессии MAFA в панкреатических энтодермальных клетках, культивируемых на поверхности раздела воздух-жидкость (ALI) в течение стадий 5-7 и обрабатываемых от стадии 5 до стадии 7 Т3 и ингибитором ALK5 II. Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (клетки WA01, исследовательский институт WiCell, г. Мэдисон, штат Висконсин) при пассаже 42 были посеяны в виде одиночных клеток в концентрации 1×105 клеток/см² на чашки, покрытые MATRIGEL™ в разведении 1: 30 (Corning Incorporated, г. Корнинг, штат Нью-Йорк, № по каталогу 354230), в модифицированную по способу Дульбекко среду Игла; смесь питательных веществ F-12 (DMEM-F12) (Life Technologies Corporation, г. Карлсбад, штат Калифорния, № по каталогу 11330-032), GlutaMAX™ (Life Technologies, № по каталогу 35050-079) в разведении 1: 100 (концентрация 1X), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma Aldrich Co. LLC, г. Сент-Луис, штат Миссури, № по каталогу A4544), 100 нг/мл фактора роста фибробластов 2 (FGF2) (R & D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота, № по каталогу 233-FB-025), 1 нг/мл трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) (R & D Systems Inc., № по каталогу 240-B-002), инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITS-X) (Life Technologies, № по каталогу 51500056) при разведении 1: 100, 2% не содержащий жирных кислот бычий сывороточный альбумин (FAF-BSA) (Proliant, Inc., г. Бун, штат Айдахо, № по каталогу 68700) и 20 нг/мл инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) (R & D Systems, № по каталогу 291-G1-200), обогащенная 10 мкМ ингибитора Rock Y-27632 (№ по каталогу Y0503, Sigma-Aldrich). Через сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном PBS (натрий-фосфатный буфер без магния или кальция) с последующей инкубацией с TrypLE™ Express Enzyme (Life Science; № по каталогу 14190) в концентрации 1x в течение 3-5 минут при 37 °C. Высвобожденные клетки промыли DMEM-F12 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок повторно суспендировали в DMEM-F12, обогащенной 10 мкМ Y-27632, GlutaMAX™ в разведении 1: 100 (концентрация 1X), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл FGF2, 1 нг/мл TGF-β, ITS-X в разведении 1: 100, 2% FAF-BSA и 20 нг/мл IGF-1, и суспензию одиночных клеток посеяли с плотностью приблизительно от 1,3 до 1,5×105 клеток/см². Культуры питали каждый день средой, а дифференцировку, в соответствии с нижеследующим протоколом, начали через 48 часов после посева, что обеспечило исходную конфлюентность около 90%. В течение стадий 1-4 применяемого протокола дифференцировки культуры поддерживали в виде планарных адгезивных культур, а в течение стадий 5-7 на поверхности раздела воздух-жидкость.

Стадия 1 (3 дня):

Клетки нанесли на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), которые сначала промыли неполным натрий-фосфатным буфером Дульбекко (DPBS) в концентрации 1X, а впоследствии культивировали в течение одного дня в следующих средах стадии 1: среда MCDB-131 (Life Technologies, № по каталогу 10372-019), обогащенная 0,5% FAF-BSA, 1,2 г/1000 мл бикарбоната натрия (Sigma-Aldrich, № по каталогу S3187); GlutaMAX™ в концентрации 1X; 4,5 мМ D-глюкозы (Sigma-Aldrich, № по каталогу G8769), где использовались на этой стадии и последующих стадиях для получения концентрации 10 мМ глюкозы (Sigma-Aldrich, № по каталогу G8769); 100 нг/мл фактора роста/дифференцировки 8 (GDF8) (Peprotech, г. Роки-Хилл, штат Нью-Джерси, № по каталогу 120-00); и 1 мкМ 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он (композиция MCX). Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% не содержащим жирных кислот BSA, 1,2 г/1000 мл бикарбоната натрия, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.

Стадия 2 (2 дня):

Сначала клетки промыли неполным DPBS в концентрации 1X, а впоследствии обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA; 1,2 г/1000 мл бикарбоната натрия; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 4,5 мМ D-глюкозы; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, Inc., № по каталогу 251-KG).

Стадия 3 (2 дня):

Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR (произведенной компанией Life Technologies, компоненты перечислены в таблице I), обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (N-[(3,5-диметил-1-фенил-1H-пиразол-4-ил)метилен]-4-(фенилметил)-1-пиперазинамин) (Sigma Aldrich, № по каталогу S4572); 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) (Sigma Aldrich, № по каталогу R2625); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ активатора PKC ((2S, 5S-(E,E)-8-(5-(4-трифторметил)фенил-2,4,-дентадиеноиламино)бензолактам (TPB) (EMD Millipore Corporation, г. Гибстаун, штат Нью-Джерси; № по каталогу 565740); и 100 нМ ингибитора рецептора костного морфогенетического белка (BMP) LDN-193189 (Shanghai ChemPartners Co Ltd., г. Шанхай, Китай) в течение двух дней.

Стадия 4 (3 дня):

Клетки обрабатывали средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 100 нM LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нM TPB в течение трех дней. После завершения стадии 4 (3 дня) клетки, культивированные на планарных чашках, обрабатывали на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промывали PBS и обрабатывали на протяжении 5 минут при комнатной температуре ферментом TrypLE™ Express Enzyme (LifeTechnologies Corporation, № по каталогу 12604-013) в концентрации 1X с последующим удалением фермента, промывкой средой BLAR и соскабливанием клеток клеточным скребком. Полученная суспензия клеток была засеяна с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (в аликвотах объемом 5-10 мкл) на пористых фильтрующих вставках для культивирования клеток с размером ячейки 0,4 мкм (Corning, № по каталогу 353493) на 6-луночных планшетах. 1,5 мл среды добавили на дно каждой вставки, а на верхушку или верхнюю часть фильтра дополнительную среду не добавляли. Среду меняли ежедневно в течение стадий 5, 6 и 7.

Стадия 5 (3 дня):

Клетки культивировали на поверхности раздела воздух-жидкость в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; глюкозой для достижения конечной концентрации 20 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 мкг/мл гепарина (Sigma Aldrich, № по каталогу H3149), 10 мкМ ZnSO4 (Sigma Aldrich, № по каталогу Z0251), 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM ретиноевой кислоты; 100 нM LDN-193189; 1 мкМ Т3 в форме натриевой соли 3,3´,5-трийод-L-тиронина (Sigma Aldrich, № по каталогу T6397), 10 000 нМ 2-(3-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)-1,5-нафтиридин (ингибитор ALK5 II) (Enzo Life Sciences, Inc., Фармингдейл, штат Нью-Йорк, № по каталогу ALX-270-445) в течение трех дней.

Стадия 6 (7 дней):

Клетки стадии 5 обрабатывали средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; глюкозой для достижения конечной концентрации 20 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 1,5 г/мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкМ ZnSO4, 100 нМ LDN-193189, 1 мкМ Т3, 100 нМ (S,S)-2-[2-(3,5-дифторфенил)ацетиламино]-N-(5-метил-6-оксо-6,7-дигидро-5H-дибензо[b,d]азепин-7-ил)пропионамид (ингибитор гамма-секретазы XX) (EMD Millipore, № по каталогу 565789) и 10 000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 7 дней.

Стадия 7 (7 дней):

Клетки стадии 6 обрабатывали средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; глюкозой для достижения конечной концентрации 20 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 1 мкМ Т3, 10 000 ингибитора ALK5 II, 10 мкМ аналога витамина Е Trolox (EMD Millipore, № по каталогу 648471) в течение 7-15 дней.

На Фиг. 1А-M представлены данные анализов ПЦР в реальном времени следующих генов в человеческих эмбриональных стволовых клетках линии H1, дифференцированных, как описано в примере 1: PDX1(ФИГ. 1A); NKX6.1 (ФИГ. 1B); PAX4 (ФИГ. 1C); PAX6 (ФИГ. 1D); NGN3 (ФИГ. 1E); MAFA (ФИГ. 1F); ABCC8 (ФИГ. 1G); хромогранин A (ФИГ. 1H); G6PC2 (ФИГ. 1I); IAPP (ФИГ. 1J); инсулин (ФИГ. 1K); глюкагон (ФИГ. 1L); и PTF1a (ФИГ. 1M). Как показано на ФИГ. 1F, наблюдалось явное увеличение, или положительная регуляция, MAFA при сравнении стадий 4 и 5 со стадиями 6 и 7, что указывает на увеличение созревания клеток по бета-клеточной линии дифференцировки. Однако на стадиях 6 и 7 экспрессия мРНК, кодирующей MAFA, была ниже, чем в островках взрослого человека.

Таблица I. Список компонентов среды BLAR
Компонент	Концентрация (мМ)
Аминокислоты
Глицин	3,0E-02
Аланин	3,0E-02
Аргинин	3,0E-01
Аспарагин	1,0E-01
Аспарагиновая кислота	1,0E-01
Цистеин	2,0E-01
Глутаминовая кислота	3,0E-02
Гистидин	1,1E-01
Изолейцин	1,0E-02
Лейцин	9,0E-02
Лизина гидрохлорид	1,5E-01
Метиан	3,0E-02
Фенилаланин	3,0E-02
Пролин	1,0E-01
Серин	1,0E-01
Теронин	3,0E-02
Триптофан	2,0E-03
Тирозиндинатрий	1,0E-02
Валин	3,0E-02
Витамины
Биотин	3,0E-05
Холина хлорид	5,0E-03
D-кальций пантотенат	1,5E-03
Соль кальция фолиевой кислоты	2,3E-03
Ниацинамид	4,9E-03
Пиридоксина гидрохлорид	9,7E-04
Рибофлавин	1,0E-05
Тинамина гидрохлорид	3,0E-03
Витамин В12	3,7E-06
I-инозитол	2,8E-03
Минералы/прочее
Кальция хлорид (CaCl2-2H2O)	3,0E-01
Меди сульфат (CuSO4-5H2O)	4,8E-06
Железа сульфат (FeSO4-7H2O)	1,0E-03
Магния сульфат (MgSO4-7H2O)	4,1E-01
Калия хлорид (KCl)	3,8E+00
Натрия бикарбонат (NaHCO3)	1,4E+01
Натрия хлорид (NaCl)	1,1E+02
Натрия фосфат двухосновный (Na2HPO4-7H2O)	5,0E-01
Цинка сульфат (ZnSO4-H2O)	1,0E-04
Aденин	1,0E-03
D-глюкоза (декстроза)	5,0E+00
Липоевая кислота	1,2E+05
Фенол красный	1,0E-02
Натрия пируват	1,0E+00
Тимидин	9,8E-05

Для дополнительного определения характеристик различных стадий клетки собрали на стадиях 3, 4, 5, 6 и 7 и проанализировали с помощью цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). Окрашивание в анализе FACS выполнили, как описано в Diabetes, 61, 2016, 2012, с применением антител, перечисленных в таблице III. Вкратце, клетки инкубировали в TrypLE™ Express (Life Technologies, № по каталогу 12604) в течение 3-5 минут при 37 °C и высвободили в суспензию одиночных клеток, после чего их дважды промыли буферным натрий-фосфатным раствором для окрашивания, содержащим 0,2% BSA (BD Sciences, № по каталогу 554657). Клетки (от 1×105 до 1×106) повторно суспендировали в 100 мкл блокирующего буферного раствора 0,5% человеческого гамма-глобулина, разведенного 1: 4 в буферном растворе для окрашивания для создания поверхности. К клеткам добавили напрямую конъюгированные первичные антитела в конечном разведении 1: 20 с последующей инкубацией при 4 °C в течение 30 минут. Окрашенные клетки дважды промыли в буферном растворе для окрашивания с последующим повторным суспендированием в 200 мкл буферного раствора для окрашивания, а впоследствии инкубировали в 15 мкл 7AAD для распознавания живых/погибших клеток перед анализом FACS на BD Canto II. Внутриклеточное окрашивание с помощью антител выполнили путем инкубирования с клеточной краской Green Fluorescent LIVE/DEAD (Life Technologies, № по каталогу L23101) при 4 °C в течение 20 минут с последующей однократной промывкой в холодном PBS. Фиксацию клеток выполнили в 250 мкл буферного раствора Cytofix/Cytoperm (BD, № по каталогу 554723) с последующим повторным суспендированием клеток в 100 мкл промывочного буферного окрашивающего/блокирующего раствора Perm с 2% нормальной козлиной сывороткой. Клетки инкубировали при 4 °C в течение 30 минут с первичными антителами в предварительно эмпирически определенных разведениях с последующими двумя промывками в буферном растворе Perm/Wash. Впоследствии клетки инкубировали с подходящими антителами при 4 °C в течение 30 минут, а впоследствии дважды промыли перед анализом на BD FACS Canto II. Примененные концентрации антител показаны в таблице III. Антитела для маркеров поджелудочной железы протестировали на специфичность с помощью человеческих островков или недифференцированных клеток H1 в качестве положительного контроля. В качестве вторичных антител добавили и инкубировали при 4 °C в течение 30 минут следующие компоненты: антимышиные антитела Alexa Fluor® 647 в разведении 1: 500 (Life Technologies), козлиные антикроличьи антитела, меченные фикоэритрином (PE), в разведении 1: 200 (об.) или ослиные антикозлиные антитела Alexa 647 в разведении 1: 800 (Life Technologies) с последующей окончательной промывкой в буферном растворе Perm/Wash и анализом на BD FACS Canto II с помощью программного обеспечения BD FACS Diva Software и регистрацией, по меньшей мере, 30 000 событий.

На Фиг. 2-6 показаны результаты анализа FACS для клеток, собранных на стадиях 3, 4, 5, 6 и 7, соответственно. Как показано на Фиг. 4, на стадии 5 приблизительно 15% клеток совместно экспрессировали инсулин и NKX6.1 и приблизительно 21% PDX1-положительных клеток находились в активной фазе клеточного цикла при измерении на основании совместной экспрессии PDX1 и KI-67 (~23%; KI-67 является характерным для клеток, находящихся в активной фазе клеточного цикла). Однако на стадии 6 и стадии 7 (Фиг. 5 и 6) произошел значительный спад в пролиферации PDX1+ клеток (1-2%), в то время как наблюдался значительный рост числа NKX6.1+ клеток, совместно экспрессирующих инсулин (~39% на стадии 6 и ~50% на стадии 7). Более того, отмечен значительный рост клеток, экспрессирующих эндокринные прекурсорные маркеры ISL-1, NeuroD1 и NKX2.2. Эти результаты указывают на то, что культуры стадий 6 и 7 обеспечивают быстрое созревание клеток от пролиферирующей клетки-предшественника к созревающим эндокринным клеткам в раннем периоде созревания. Кроме того, при дальнейшем переходе от стадии 6 к стадии 7 (Фиг. 5 по сравнению с Фиг. 6) наблюдалось увеличение процентной доли клеток, совместно экспрессирующих инсулин и NKX6.1 (33%). На Фиг. 7 показана экспрессия в процентах множества панкреатических энтодермальных маркеров (FOXA2, PDX-1, NKX6.1), маркеров недифференцированных ЭС-клеток (Oct3/4), эндокринных маркеров (Pax6, ISl-1, NKX2.2, хромогранин) и гормона (инсулин, глюкагон) от стадии 3 до стадии 7.

Таблица II. Список антител, применяемых для анализа FACS
Антиген	Вид	Источник/номер по каталогу	Разведение
Глюкагон	Мышь	Sigma-Aldrich Co. LLC/G2654	1: 250
Инсулин	Кролик	Cell Signaling Technology. Inc., г. Денверс, штат Массачусетс/3014B	1: 10
NKX6.1	Мышь	Developmental Studies Hybridoma Bank, г. Айова-Сити, штат Айова/F55A12	1: 50
NKX2.2	Мышь	Developmental Studies Hybridoma Bank/74.5A5	1: 100
PDX1	Мышь	BD BioSciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния/562161	1: 50
Ki67	Мышь	BD Biosciences/558595	1: 20
Pax6	Мышь	BD Biosciences, 561552	1: 20
Хромогранин А	Кролик	Dako, г. Карпинтерия, штат Калифорния/A0430	1: 40
ISL-1	Мышь	BD Biosciences/562547	1: 20
NeuroD1	Мышь	BD Biosciences/563001	1: 40
FOXA2	Мышь	BD Biosciences/561589	1: 80
OCT3/4	Мышь	BD Biosciences/560329	1: 20

Пример 2

Скрининг для выявления малых молекул, которые способны значительно повысить экспрессию MAFA и инсулина

Этот пример относится к выявлению малых молекул, которые способы значительно увеличить созревание клеток в панкреатические бета-клетки. Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н1 (WA01) при пассаже 42 были посеяны в виде одиночных клеток с плотностью 1×105 клеток/см² на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), в среду, содержащую DMEM-F12, GlutaMAX™ (разведение 1: 100), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β, ITS-X (разведение 1: 100), 2% FAF-BSA и 20 нг/мл IGF-1, обогащенного 10 мкМ Y-27632. Через сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном PBS (натрий-фосфатный буфер без Mg или Ca) с последующей инкубацией с TrypLE™ Express Enzyme (Life Science; № по каталогу 14190) в концентрации 1x в течение 3-5 минут при 37 °C. Высвобожденные клетки промыли DMEM-F12 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок повторно суспендировали в DMEM-F12, обогащенной 10 мкМ Y-27632, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл FGF2, 1 нг/мл TGF-β, ITS-X в разведении 1: 100, 2% FAF-BSA и 20 нг/мл IGF-1, и суспензию одиночных клеток посеяли с плотностью приблизительно от 1,3 до 1,5×105 клеток/см². Культуры питали каждый день средой, а дифференцировку, в соответствии с нижеследующим протоколом, начали через 48 часов после посева, что обеспечило исходную конфлюентность около 90%. Если не указано иное, источники сред, реагентов, молекул и т. п. в примерах аналогичны таковым, приведенным в примере 1.

Стадия 1 (3 дня):

Клетки нанесли на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), которые сначала промыли неполным натрий-фосфатным буфером Дульбекко (DPBS) в концентрации 1X, а впоследствии культивировали в течение одного дня в средах стадии 1: среда MCDB-131, обогащенная 0,5% FAF-BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 4,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8; и 1 мМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.

Стадия 2 (2 дня):

Сначала клетки промыли неполным DPBS в концентрации 1X, а впоследствии обрабатывали в течение двух дней средой MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA; 0,0012 г/мл бикарбоната натрия; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 4,5 мМ D-глюкозы; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 25 нг/мл FGF7.

Стадия 3 (2 дня):

Клетки обрабатывали специализированной средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 0,0025 г/мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 1 мкM ретиноевой кислоты; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нM TPB; и 100 нM LDN-193189 в течение двух дней.

Стадия 4 (3 дня):

Клетки обрабатывали средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 0,0025 г/мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 100 нM LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ TPB в течение трех дней, впоследствии, по завершении стадии 4, клетки, культивированные на планарных чашках, обрабатывали на протяжении 4 часов 10 мкМ Y-27632, промывали PBS и обрабатывали на протяжении 5 минут при комнатной температуре ферментом TrypLE™ в концентрации 1X с последующим удалением фермента, промывкой базовой средой BLAR и соскабливанием клеток клеточным скребком. Полученную клеточную суспензию засеяли с плотностью 0,5-0,75×106 клеток (аликвотами объемом 5-10 мкл) на пористые фильтрующие вставки для культивирования клеток с размером ячеек 0,4 мкм в 6-луночные планшеты. 1,5 мл среды добавили на дно каждой вставки, а на верхнюю часть фильтра дополнительную среду не добавляли. Среду меняли ежедневно в течение стадий 5, 6 и 7.

Стадия 5 (3 дня):

Клетки культивировали на поверхности раздела воздух-жидкость в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 20 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM ретиноевой кислоты; 100 нM LDN-193189; 1 мкM Т3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина и 10 000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.

Стадия 6 (7 дней):

Клетки стадии 5 культивировали на поверхности раздела воздух-жидкость и обрабатывали средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 20 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 100 нМ LDN-193189, 1 мкМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 100 нМ ингибитора гамма-секретазы XX и 10 000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 7 дней.

Стадия 7 (7 дней):

Клетки стадии 6 культивировали на поверхности раздела воздух-жидкость и обрабатывали средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 20 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 1000 нМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 10 000 нМ ингибитора ALK5 II, 10 мкM Trolox в течение 7 дней.

На стадиях 6 или 7 добавляли различные малые молекулы и оценивали их влияние с помощью ПЦР в реальном времени. В таблице III перечислены оцененные малые молекулы и указано, когда они были добавлены.

Таблица III. Оцененные малые молекулы
Химическое наименование/№ CAS/молекулярная формула	Мишень	Название малой молекулы/поставщик/ № по каталогу	Концентрация
4-(ацетиламино)-N-(2-аминофенил)бензамид/112522-64-2/C15H15N3O2	ингибитор гистондеацетилазы (HDAC)	CI-994/Sigma Aldrich Co LLC./EPI109A	1 мкM на стадии 6
(E)-N-гидрокси-3-[4-[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил)этиламино]метил]фенил]проп-2-енамид/404950-80-7/C21H23N3O2	ингибитор активности гистондеацетилазы 1 (HDAC1)	Панобиностат (LBH-589)/Sigma Aldrich Co LLC./EPI009B	1 мкM на стадии 6
N-гидрокси-N′-фенил-октандиамид/149647-78-9/C14H20N2O3	ингибитор гистондеацетилазы 1 (HDAC1) и 3 (HDAC3)	SAHA/Sigma Aldrich Co LLC./EPI009C	1 мкM на стадии 6
N,N′-дигидроксиоктандиамид/38937-66-5/C8H16N2O4	Ингибитор гистондеацетилазы (HDAC), который, как было показано, ингибирует HDAC1	SBHA/Sigma Aldrich Co LLC./EPI009D	1 мкM на стадии 6
6-(1,3-диоксо-1H, 3H-бензо[де]изохинолин-2-ил)-капроновой кислоты гидроксамид/287383-59-9/C18H18N2O4	Ингибитор гистондеацетилазы (HDAC)	Скриптаид/Sigma Aldrich Co LLC./EPI009E	1 мкM на стадии 6
[R-(E,E)]-7-[4-(диметиламино)фенил]-N-гидрокси-4,6-диметил-7-оксо-2,4-гептадиенамид/58880-19-6/C17H22N2O3	Ингибитор гистондеацетилазы	Трихостатин A/Sigma Aldrich Co LLC./EPI009F	1 мкM на стадии 6
N1-[4-[(2R,4R,6S)-4-[[(4,5-дифенил-2-оксазолил)тио]метил]-6-[4-(гидроксиметил)фенил]-1,3-диоксан-2-ил]фенил]-N8-гидроксиоктандиамид/537049-40-4/C41H43N3O7S	Ингибитор гистондеацетилазы 6	Тубацин/Sigma Aldrich Co LLC./EPI009G	1 мкM на стадии 6
Таблица III. Оцененные малые молекулы (продолжение)
1,4-диметокси-9(10H)-акридинтион/141992-47-4/C15H13NO2S	Ингибитор циклинзависимой киназы (cdk) 4	NSC625987/Tocris Bioscience/2152	1 мкM на стадии 6
4-[4,5-дигидро-5-(4-метоксифенил)-3-фенил-1H-пиразол-1-ил]бензолсульфонамид/71203-35-5/C22H21N3O3S	Ингибитор ГТФазы Cdc42	ML141/Tocris Bioscience/4266	1 мкM на стадии 6
N-(2-хлорфенил)-6-(пиперидин-4-ил)имидазо[1,2-a]пиридин-3-карбоксамид оксалат/1198408-39-7/C21H21ClN4O5	Ингибитор рецепторной тирозинкиназы EphB3	LDN211904 (ингибитор EphB3)/EMD Millipore Corporation, г. Биллерика, штат Массачусетс/428201-5MG	1 мкM на стадии 6
(S)-2-(4-(4-хлорфенил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазол[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил)ацетамид/1446144-04-2/C19H18ClN5OS	Ингибитор CPIe белка BRD4 семейства BET (содержит бромодомен и экстратерминальный домен)	CPI203/Xcess Biosciences, Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния/M60124-2	1 мкM на стадии 6
1-(3,6-дибром-9H-карбазол-9-ил)-3-(фениламино)пропан-2-ол/301353-96-8/C21H18Br2N2O	пронейрогенная, нейропротекторная малая молекула	P7C3/Xcess Biosciences, Inc./M60017-2	1 мкM на стадии 6
2-(4-бензоилфенокси)-N-(1-бензилпиперидин-4-ил)ацетамид/924416-43-3/C27H28N2O3	агонист адипонектинового рецептора (AdipoR)	AdipoRon/Xcess Biosciences, Inc./M60152-2s	1 мкM на стадии 6
(S)-2-((S)-2-(3,5-дифторфенил)-2-гидроксиацетамид)-N-((S)-5-метил-6-оксо-6,7-дигидро-5H-дибензо[b,d]азепин-7-ил)пропанамид/209984-57-6/C26H23F2N3O4	ингибитор гамма-секретазы	LY411575/Xcess Biosciences, Inc./M60078-5s	1 мкM на стадии 6
2-(4-(трет-бутил)фенил)-1H-бенз[d]имидазол/49671-76-3/C17H18N2	транскрипционный активатор PGC-1α	ZLN005/Xcess Biosciences, Inc./M60142-5s	1 мкM на стадии 6
2-хлор-4-фтор-3-метил-N-(2-(4-метилпиперазин-1-ил)-5-нитрофенил)бензамид/1422389-91-0/C19H20ClFN4O3	антагонист взаимодействия WDR5-MLL	WDR5-C47/Xcess Biosciences, Inc./M60118-2	1 мкM на стадии 6
3-пиридинилметил[[4-[[(2-аминофенил)амино]карбонил]фенил]метил]карбамат/209783-80-2/C21H20N4O3	ингибитор HDAC; антипролиферативный; предпочтительно ингибирует HDAC1 по сравнению с HDAC3	MS-275/Sigma Aldrich Co LLC./EPS002	1 мкM на стадии 6
4-(диметиламино)-N-[7-(гидроксиамино)-7-оксогептил]-бензамид/251456-60-7/C16H25N3O3	ингибитор HDAC; подтип, селективный к HDAC6 по сравнению с HDAC1	M344/Sigma Aldrich Co LLC./M5820	1 мкM на стадии 6
1-[[4-этил-5-[5-(4-феноксифенил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]-2-тиенил]метил]-3-ацетидинкарбоновая кислота/913827-99-3/C25H23N3O4S	агонист сфингозин-1-фосфатного рецептора 1 (S1P1); показывает увеличенную в 5000 раз селективность к S1P1 по сравнению с S1P3	CS2100/Tocris Bioscience, г. Бристоль, BS11 0QL, Великобритания/4543	1 мкM на стадии 6
Таблица III. Оцененные малые молекулы (продолжение)
2-(4-бром-2-хлорфенокси)-N-[[[4-[[(4,6-диметил-2-пиримидинил)амино]сульфонил]фенил]амино]тиоксометил]ацетамид/587841-73-4/C21H19BrClN5O4S2	Селективный ингибитор Cdc42	ZCL278/Tocris Bioscience/4794	1 мкM на стадии 6
N-(4-(2-амино-3-хлорпиридин-4-илокси)-3-фторфенил)-4-этокси-1-(4-фторфенил)-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-карбоксамид/1025720-94-8/C25H19ClF2N4O4	Ингибитор белков Met, ингибирующий c-Met, Axl, Ron и Tyro3	BMS-777607/Selleck Chemicals, г. Хьюстон, штат Техас/S1561	1 мкM на стадии 6
N-(2,6-дифторфенил)-5-(3-(2-(5-этил-2-метокси-4-(4-(4-(метилсульфонил)пиперазин-1-ил)пиперидин-1-ил)фениламино)пиримидин-4-ил)H-имидазол[1,2-a]пиридин-2-ил)-2-метоксибензамид/1089283-49-7/C44H47F2N9O5S	Ингибитор IGF-1R и IR	GSK1904529A/Selleck Chemicals/S1093	1 мкM на стадии 6
N-(4-(3-(2-аминопиримидин-4-ил)пиридин-2-илокси)фенил)-4-(4-метилтиофен-2-ил)фталазин-1-амин/945595-80-2/C28H21N7OS	Общий ингибитор киназы Aurora, ингибирующий Aurora A/B/C	AMG-900/Selleck Chemicals/S2719	1 мкM на стадии 6
5-((1-(3-изопропил-1,2,4-оксадиазол-5-ил)пиперидин-4-ил)метокси)-2-(4-(метилсульфонил)фенил)пиридин/1032823-75-8/C23H28N4O4S	агонист GPR119	GSK1292263/Selleck Chemicals/S2149	1 мкM на стадии 6
4-(5-амино-1-(2,6-дифторбензоил)-1H-[1,2,4]триазол-3-иламино)-бензолсульфонамид/443797-96-4/C15H12F2N6O3S	общий ингибитор CDK с наибольшей специфичностью к CDK1/2	JNJ-7706621/Selleck Chemicals/S1249	1 мкM на стадии 6
6-(дифтор(6-(1-метил-1H-пиразол-4-ил)-[1,2,4]триазол[4,3-b]пиридазин-3-ил)метил)хинолин/943540-75-8/C19H13F2N7	ингибитор c-Met	JNJ-38877605/Selleck Chemicals/S1114	1 мкM на стадии 6
(R)-4-(8-циклопентил-7-этил-5-метил-6-оксо-5,6,7,8-тетрагидроптеридин-2-иламино)-3-метокси-N-(1-метилпиперидин-4-ил)бензамид/755038-02-9/C28H39N7O3	ингибитор Plk1	BI 2536/Selleck Chemicals/S1109	1 мкM на стадии 6
Таблица III. Оцененные малые молекулы (продолжение)
N-гидрокси-2-(4-(((1-метил-1H-индол-3-ил)метиламино)метил)пиперидин-1-ил)пиримидин-5-карбоксамид/875320-29-9/C21H26N6O2	Ингибитор HDAC с наибольшей специфичностью к HDAC1 и наименьшей специфичностью к HDAC 6 и 7; фаза 2	Quisinostat (JNJ-26481585)/Selleck Chemicals/S1096	1 мкM на стадии 6
циклогексил 2,7,7-триметил-4-(4-нитрофенил)-5-оксо-1,4,5,6,7,8-гексагидрохинолин-3-карбоксилат/313967-18-9/C25H30N2O5	ингибитор сигнального пути Notch	FLI-06/Selleck Chemicals/ S7399	1 мкM на стадии 6
4H-[1,2,4]триазол[4,3-a][1,4]бензодиазепин-4-ацетамид, 6-(4-хлорфенил)-N-этил-8-метокси-1-метил-, (4S)-/1260907-17-2/C22H22ClN5O2	ингибитор белков BET	I-BET-762 (GSK525762)/Selleck Chemicals/S7189	1 мкM на стадии 6
N-(6-(4-(2-((4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)амино)-2-оксоэтил)фенокси)пиримидин-4-ил)циклопропанкарбоксамид/1421227-53-3/C29H31F3N6O3	малая молекула, которая стимулирует пролиферацию панкреатических β-клеток в первичных островках грызунов и человека	WS6/Xcess Biosciences, Inc./M60097-2s	1 мкM на стадии 6
1-[3-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-амино-5--бром-7H-пиррол[2,3-d]пиримидин-7-ил)-3,4-дигидро-кситетрагидрофуран-2-ил]метил](изопропил)амино]пропил]-3-[4-(2,2-диметил)фенил]мочевина/------/C28H40BrN7O4	ингибитор метилтрансферазы DOT1L	SGC0946/Selleck Chemicals/S7079	1 мкM на стадии 6
9H-пурин-6-амин, 9-[5-дезокси-5-[[цис-3-[2-[6-(1,1-диметилэтил)-1H-бензимидазол-2-ил]этил]циклобутил](1-метилэтил)амино]-β-D-рибофуранозил]-/1380288-87-8/C30H42N8O3	ингибитор протеин метилтрансферазы DOT1L	EPZ5676/Selleck Chemicals/S7062	1 мкM на стадии 6
(2R)-2-(N-(2-фтор-4-(1,2,4-оксадиазол-3-ил)бензил)-4-хлорфенилсульфонамидо)-5,5,5-трифторпентанамид/1146699-66-2/C20H17ClF4N4O4S	ингибитор γ-секретазы, ингибирующий образование Aβ40 и Aβ42	Avagacestat (BMS-708163)/Selleck Chemicals/S1262	1 мкM на стадии 6
[1,1'-бифенил]-3-карбоксамид, N-[(1,2-дигидро-4,6-диметил-2-оксо-3-пиридинил)метил]-5-[этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино]-4-метил-4'-(4-морфолинилметил)-/1403254-99-8/C34H44N4O4	ингибитор EZH2	EPZ-6438/Selleck Chemicals/S7128	1 мкM на стадии 6
Таблица III. Оцененные малые молекулы (продолжение)
N-(4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)фенил)-N-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамид/849217-68-1/C28H24FN3O5	ингибитор VEGFR2	Кабозантиниб XL184, BMS-907351) /Selleck Chemicals/S1119	1 мкM на стадии 6
3-(бензо[d]тиазол-2-ил)-6-этил-7-гидрокси-8-(пиперидин-1-илметил)-4H-хромен-4-он/222716-34-9/C24H24N2O3S	ингибитор Skp2	SKP2-C25/Xcess Biosciences, Inc./M60136-2s	1 мкM на стадии 6
5-хлор-2-[(E)-2-[фенил(пиридин-2-ил)метилиден]гидразин-1-ил]пиридин/199596-05-9/C17H13ClN4	Ингибитор гистондеметилазы Jumonji	JIB-04/Selleck Chemicals/S7281	1 мкM на стадии 6
1H-1,2,4-триазол-3,5-диамин, 1-(6,7-дигидро-5H-бенз[6,7]циклогепта[1,2-c]пиридазин-3-ил)-N3-[(7S)-6,7,8,9-тетрагидро-7-(1-пирролидинил)-5H-бензциклогептен-2-ил]-/1037624-75-1/C30H34N8	ингибитор Axl	R428 (BGB324)/Selleck Chemicals/S2841	1 мкM на стадии 7
2-хлор-3-[2-(2,4-гихлорфенокси)этокси]-6-(фторметил)пиридин/1355026-60-6/C14H11Cl3FNO2	Мощный агонист сфингозин-1-фосфатного рецептора 4 (S1P4)	CYM50260/Tocris Bioscience/4677	2 мкM на стадиях 6 и 7
N,N-дициклогексил-5-циклопропил-3-изоксазолкарбоксамид/945128-26-7/C19H28N2O2	Селективный сфингозин-1-фосфатного рецептора 3 (S1P3), аллостерический	CYM5541/Tocris Bioscience/4897	2 мкM на стадиях 6 и 7
5-[4-фенил-5-(трифторметил)тиофен-2-ил]-3-[3-(трифторметил)фенил]1,2,4-оксадиазол/256414-75-2/C20H10F6N2OS	Мощный и селективный агонист сфингозин-1-фосфатного рецептора 1 (S1P1)	SEW2871/Tocris Bioscience/2284	2 мкM на стадиях 6 и 7
[9S-(9α,10β,11β,13α)]-2,3,10,11,12,13-гексагидро-10-метокси-9-метил-11-(метиламин)-9,13-эпокси-1H,9H-дииндол[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]пиррол[3,4-j][1,7]бенздиазонин-1-он/62996-74-1/C28H26N4O3	Ингибитор протеинкиназы широкого спектра	Staurosporine/Tocris Bioscience/1285	10 нM на стадиях 6 и 7

Как показано на Фиг. 8A-8E, которые представляют собой графики, отображающие данные анализов ПЦР в реальном времени экспрессии инсулина и MAFA после обработки малыми молекулами, добавление EPZ-5676 (ингибитор протеин метилтрансферазы DOT1L) и ингибитора AXL (R428) значительно увеличило экспрессию MAFA по сравнению с необработанными культурами на стадии 6 и стадии 7 соответственно.

Пример 3 (возможного использования)

Получение эндокринных клеток, совместно экспрессирующих инсулин, PDX-1, NKX6.1 и MAFA в суспензионных культурах

Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии Н1 (WA01) сеют в виде одиночных клеток с плотностью 1×105 клеток/см² на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), в среду, содержащую DMEM-F12, GlutaMAX™ (разведение 1: 100), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β, ITS-X (разведение 1: 100), 2% FAF-BSA и 20 нг/мл IGF-1, обогащенного 10 мкМ Y-27632. Через сорок восемь часов после посева культуры промывают в неполном PBS (натрий-фосфатный буфер без Mg или Ca) с последующей инкубацией с 1x TrypLE™ Express Enzyme в течение 3-5 минут при 37 °C. Высвобожденные клетки промывают DMEM-F12 и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок повторно суспендируют в DMEM-F12, обогащенной 10 мкМ Y-27632, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 100 нг/мл FGF2, 1 нг/мл TGF-β, ITS-X в разведении:100, 2% FAF-BSA и 20 нг/мл IGF-1, и суспензию одиночных клеток сеют с плотностью приблизительно от 1,3 до 1,5×105 клеток/см². Культуры питают каждый день средой, а дифференцировку, в соответствии с нижеследующим протоколом, начинают через 48 часов после посева, что обеспечивает исходную конфлюентность около 90%. Стадии 1-4 протекают на планарных адгезионных культурах, а стадии 5-7 протекают в суспензионных культурах.

Стадия 1 (3 дня):

Клетки наносят на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), которые сначала промывают неполным натрий-фосфатным буфером Дульбекко (DPBS) в концентрации 1X, а впоследствии культивируют в течение одного дня в средах стадии 1: среда MCDB-131, обогащенная 0,5% FAF-BSA, 1,2 г/1000 мл бикарбоната натрия; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 4,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8; и 1 мМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивируют в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,2 г/1000 мл бикарбоната натрия, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивируют в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,2 г/1000 мл бикарбоната натрия, GlutaMAX™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.

Стадия 2 (2 дня):

Сначала клетки промывают неполным DPBS в концентрации 1X, а впоследствии обрабатывают в течение двух дней средой MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA; 1,2 г/1000 мл бикарбоната натрия; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 4,5 мМ D-глюкозы; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 25 нг/мл FGF7.

Стадия 3 (2 дня):

Клетки обрабатывают специализированной средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 1 мкM ретиноевой кислоты; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нM TPB; и 100 нM LDN-193189 в течение двух дней.

Стадия 4 (3 дня):

Клетки обрабатывают средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 4,5 мМ глюкозы; GlutaMAX™ в концентрации 1X; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нM RA; 2 нг/мл FGF7; 100 нM LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ TPB в течение трех дней, впоследствии, по завершении стадии 4, клетки, культивированные на планарных чашках, обрабатывают на протяжении 4 часов 10 мкМ Y-27632, промывают PBS и обрабатывают на протяжении 5 минут при комнатной температуре ферментом StemPro® Accutase® (Life Technologies, № A11105-01) в концентрации 1X, фермент удаляют и выполняют промывку базовой средой BLAR, а клетки соскабливают клеточным скребком и разделяют на клеточные кластеры (< 100 мкм). Клеточные кластеры переносят в одноразовую полистирольную пробирку Spinner Flask (Corning) объемом 125 мл и центрифугируют при 80-100 об/мин в суспензии с описанной ниже средой стадии 5.

Стадия 5 (3 дня):

Клетки стадии 4 получают в виде кластеров и культивируют в суспензии в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 20 мМ глюкозы (конечный объем); GlutaMAX™ в концентрации 1X; 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 0,25 мкМ SANT-1; 50 нM ретиноевой кислоты; 100 нM LDN-193189; 1 мкM Т3 в виде натриевой соли 3,3', 5-трийод-L-тиронина и 10 000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.

Стадия 6 (7 дней):

Клетки стадии 5 культивируют в суспензии и обрабатывают средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 20 мМ глюкозы (конечный объем); GlutaMAX™ в концентрации 1X; 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 100 нМ LDN-193189, 1 мкМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 100 нМ ингибитора гамма-секретазы XX и 10 000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 7 дней.

Стадия 7 (15 дней):

Клетки стадии 6 культивируют в суспензии и обрабатывают средой BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 200; 20 мМ глюкозы (конечный объем); GlutaMAX™ в концентрации 1X; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 1 мкМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 10 000 нМ ингибитора ALK5 II, 10 мкM Trolox, 1 мМ N-ацетилцистеина и 2 мкМ ингибитора AXL (R428) в течение 15 дней.

На стадиях 5-7 аликвоты клеточных кластеров удаляют и оценивают с помощью ПЦР, FACS и иммуногистохимических методов в отношении совместной экспрессии инсулина, NKX6.1, PDX-1 и MAFA. Предполагается, что результаты такого тестирования продемонстрируют наличие совместной экспрессии инсулина, PDXI, NKX6.1 и MAFA в пределах той же клетки и клеточной популяции, в которой, по меньшей мере, у около 10% клеточной популяции наблюдалась такая экспрессия.

Пример 4

Экспрессия мРНК, кодирующих AXL и солиганд GAS6, является очень низкой для стадии 7 или клеток человеческих островков.

Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (WA01) были посеяны в виде одиночных клеток с плотностью 1×105 клеток/см² на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), в среду, содержащую Essential 8™ (E8) (BD Biosciences; № по каталогу 356231). Через 48 часов после посева культуры промыли в неполном PBS в концентрации 1x с последующей инкубацией с ферментом TrypLE™ Express Enzyme (Life Science; № по каталогу 14190) в концентрации 1x в течение 3-5 минут при 37 °C.. Высвобожденные клетки промыли E8 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок повторно суспендировали в E8, обогащенной 10 мкМ Y-27632, и суспензию одиночных клеток посеяли с плотностью приблизительно 1,3-1,5×105 клеток/см². Культуры питали каждый день средой E8, а дифференцировку, в соответствии с нижеследующим протоколом, начали через 48 часов после посева, что обеспечило исходную конфлюентность около 90%.

Стадия 1 (3 дня):

Клетки нанесли на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), которые сначала промыли неполным натрий-фосфатным буфером Дульбекко (DPBS) в концентрации 1X, а впоследствии культивировали в течение одного дня в средах стадии 1: среда MCDB-131, обогащенная 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; Glutamax™ в концентрации 1X, 4,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8; и 1,5 мМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия, Glutamax™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия, Glutamax™ в концентрации 1X, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.

Стадия 2 (2 дня):

Сначала клетки промыли неполным DPBS в концентрации 1X, а впоследствии культивировали в течение двух дней в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA; 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; Glutamax™ в концентрации 1X, 4,5 мМ D-глюкозы; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл FGF7.

Стадия 3 (2 дня):

Клетки культивировали в специализированной среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; Glutamax™ в концентрации 1X, 4,5 мМ D-глюкозы; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 1 мкM ретиноевой кислоты; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нM TPB; и 100 нM LDN-193189 в течение двух дней.

Стадия 4 (3 дня):

Клетки культивировали в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; Glutamax™ в концентрации 1X, 4,5 мМ D-глюкозы; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 0,1 мкM ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нM LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ TPB в течение трех дней, впоследствии, по завершении стадии 4, клетки, культивированные на планарных чашках, обработали на протяжении 4 часов 10 мкМ Y-27632, промыли неполным PBS в концентрации 1X и обработали в течение 3-5 минут при комнатной температуре TrypLE™ в концентрации 1X. Фермент удалили, клетки высвободили и промыли средой BLAR и перенесли в одноразовую полистирольную пробирку Spinner Flask объемом 125 мл и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин. Полученный клеточный осадок повторно суспендировали в виде одиночных клеток с плотностью приблизительно 0,5×105 клеток/см² на фильтрующих вставках (BD Biosciences; № по каталогу 3420) (5-10 мкл на одну зону, общее число 0,25-0,5 миллиона клеток/зона). Диаметр каждой зоны составил приблизительно 1-2 мм, в зависимости от объема добавленных клеток. В случае 6-луночных вставок на дно каждой вставки добавили 1,5 мл/лунка, при этом в случае фильтрующих вставок размером 10 см добавили 8 мл. Как правило, применяли 20-15 зон на одну лунку для 6-луночной вставки и 80-90 зон для вставок размером 10 см.

Стадия 5 (3 дня):

Клетки стадии 4 культивировали в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; 20 мМ глюкозы (конечный объем); 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 0,25 мкМ SANT-1; 0,05 мкM RA; 100 нМ LDN-193189, 1 мкM Т3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина и 10 мкМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.

Стадия 6 (7 дней):

Клетки стадии 5 культивировали в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; 20 мМ глюкозы (конечный объем); 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 100 нМ LDN-193189, 1 мкМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 100 нМ ингибитора гамма-секретазы XX и 10 мкМ ингибитора ALK5 II в течение 7 дней.

Стадия 7 (7 дней):

Клетки стадии 6 культивировали в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; 20 мМ глюкозы (конечный объем); 1,5 г/л бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 1 мкМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 10 мкМ ингибитора ALK5 II, 1 мМ N-ацетилцистеина и 2 мкМ ингибитора AXL (R428) в течение 7 дней.

На стадии 4 (день 3), стадии 5 (день 3), стадии 6 (день 3) и стадии 7 (день 7) собрали мРНК и оценили экспрессию AXL и GAS 6 по сравнению с недифференцированными человеческими стволовыми клетками и трупными человеческими островками (Prodo Labs, штат Калифорния). Как показано на Фиг. 9, в недифференцированных стволовых клетках наблюдался высокий уровень экспрессии AXL. Однако дифференцировка стволовых клеток в панкреатические энтодермальные, панкреатические эндокринные и незрелые бета-клетки привела к резкому падению экспрессии AXL. Более того, на стадиях 4-7 сохранялся низкий уровень экспрессии GAS6. Экспрессия AXL также была значительно ниже в человеческих островках по сравнению с недифференцированными стволовыми клетками. Результаты показывают, что клетки стадии 6-7 имеют очень низкую экспрессию AXL.

Пример 5

R428 ингибирует AXL и множество дополнительных киназ

Эффективность ингибитора AXL R428 в отношении воздействия на различные киназы оценили с помощью Kinase Profiling Services с применением АТФ в концентрации 100 мкМ (EMD Millipore). R428 протестировали в концентрации 1 и 10 мкМ. В таблице IV перечислены киназы, оцененные в отношении эффективности воздействия на них, причем меньшее число указывает на более мощное ингибирование конкретной киназы.

Таблица IV. Оценка воздействия R428 на киназы

	R428	R428
Киназа	1001010 @ 1 мкМ	1001010 @ 10 мкМ
ALK4(h)	84	48
Aurora-A(h)	20	3
Aurora-B(h)	1	0
Axl(h)	-1	-1
Blk(h)	27	2
CaMKIIβ(h)	76	5
CaMKIδ(h)	76	24
CDK1/cyclinB(Hh)	101	88
CDK5/p35(h)	101	94
CHK1(h)	71	23
CHK2(h)	47	9
CK2(h)	103	106
CK2α2(h)	112	97
CLK2(h)	78	28
cSRC(h)	51	10
EGFR(h)	89	40
Таблица IV. Оценка воздействия R428 на киназы (продолжение)
Eph A 2(h)	54	12
FGFR1(h)	17	1
Flt3(h)	9	1
GSK3α(h)	95	105
GSK3β(h)	106	99
IGF-1R(h)	93	58
IKKβ(h)	86	53
IR(h)	83	24
IRAK4(h)	94	51
JAK2(h)	96	41
JAK3(h)	69	18
MAPK1(h)	108	106
Met(h)	49	-1
NEK2(h)	60	10
PAK4(h)	97	73
PDGFRβ(h)	37	21
Pim-2(h)	87	74
PKA(h)	88	35
PKBα(h)	87	57
PKCα(h)	101	96
PKCβ1(h)	102	95
Plk1(h)	83	65
Plk3(h)	101	81
Ret(h)	1	1
ROCK-1(h)	93	41
Rsk3(h)	2	1
SAPK3(h)	106	108
SAPK4(h)	94	91
TGFBR1(h)	97	69
TrkC(h)	47	13
ZAP-70(h)	92	66
ZIPK(h)	97	46

Результаты оценки киназ указывают на то, что R428 ингибирует AXL, как предполагалось. Однако, кроме того, R428 мощно ингибирует киназы RSK3, Ret, Flt, FGFr1, AuroraA и AuroraB в концентрациях 1 и 10 мкМ. Это значит, что механизм действия R428 в отношении индукции MAFA может быть не связан с ингибированием рецептора AXL. Фактически, приведенные в настоящем документе примеры показывают, что экспрессия мРНК, кодирующей AXL, на стадии 7 является очень низкой, и это означает, что механизм действия R428 в отношении индукции MAFA связан не с ингибированием AXL, а с ингибированием других киназ, таких как киназы RSK3 и Aurora.

Пример 6

Ингибирование экспрессии киназы Aurora увеличило экспрессию MAFA на стадии 7 в отсутствие R428

Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (WA01) были посеяны в виде одиночных клеток с плотностью 1×105 клеток/см² на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30) в среду E8. При конфлюентности около 70-80% культуры промыли в неполном PBS в концентрации 1x с последующей инкубацией с ферментом TrypLE™ Express Enzyme в концентрации 1x в течение 3-5 минут при 37°C. Высвобожденные клетки промыли E8 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок повторно суспендировали в E8, обогащенной 10 мкМ Y-27632, и суспензию одиночных клеток посеяли с плотностью приблизительно 1,3-1,5×105 клеток/см². Культуры питали каждый день средой E8, а дифференцировку, в соответствии с нижеследующим протоколом, начали через 48 часов после посева, что обеспечило исходную конфлюентность около 90%.

Стадия 1 (3 дня):

Клетки нанесли на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), которые сначала промыли неполным натрий-фосфатным буфером Дульбекко (DPBS) в концентрации 1X, а впоследствии культивировали в течение одного дня в средах стадии 1: среда MCDB-131, обогащенная 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 10 мМ глюкозы в конечной концентрации; 100 нг/мл GDF8; и 1,5 мМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия, 10 мМ глюкозы в конечной концентрации, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия, 10 мМ глюкозы в конечной концентрации и 100 нг/мл GDF8.

Стадия 2 (2 дня):

Клетки промыли неполным DPBS в концентрации 1X, а впоследствии культивировали в течение двух дней в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA; 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 10 мМ глюкозы в конечной концентрации; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 50 нг/мл FGF7.

Стадия 3 (2 дня):

Клетки культивировали в специализированной среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; 10 мМ глюкозы в конечной концентрации; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 1 мкM ретиноевой кислоты; 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 300 нM TPB; и 100 нM LDN-193189 в течение двух дней.

Стадия 4 (3 дня):

Клетки культивировали в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; 10 мМ глюкозы в конечной концентрации; 2,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 0,25 мкМ SANT-1; 0,1 мкM ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нM LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ TPB в течение трех дней, впоследствии, по завершении стадии 4, клетки, культивированные на планарных чашках, обработали на протяжении 4 часов 10 мкМ Y-27632, промыли неполным PBS в концентрации 1X и обработали в течение 3-5 минут при комнатной температуре TrypLE™ в концентрации 1X. Фермент удалили, клетки высвободили и промыли средой BLAR и перенесли в одноразовую полистирольную пробирку Spinner Flask объемом 125 мл и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 мин. Полученный клеточный осадок повторно суспендировали в виде одиночных клеток с плотностью приблизительно 0,5×105 клеток/см² на фильтрующих вставках (5-10 мкл на одну зону, общее число 0,25-0,5 миллиона клеток/зона). Диаметр каждой зоны составил приблизительно 1-2 мм, в зависимости от объема добавленных клеток. В случае 6-луночных вставок на дно каждой вставки добавили 1,5 мл/лунка, при этом в случае фильтрующих вставок размером 10 см добавили 8 мл. Как правило, использовали 20-15 зон на одну лунку для 6-луночной вставки и 80-90 зон для вставок размером 10 см.

Стадия 5 (3 дня):

Стадия 6 (7 дней):

Стадия 7 (7 дней):

Клетки стадии 6 культивировали в течение семи дней в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; 20 мМ глюкозы (конечный объем); 1,5 г/л бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 мкM ZnSO4, 1 мкМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 10 мкМ ингибитора ALK5 II, 1 мМ N-ацетилцистеина. Некоторые культуры также включали в себя 2 мкМ R428 или 2 мкМ ингибитора киназы Aurora VI (4-(4-(N-бензоиламино)анилин)-6-метокси-7-(3-(1-морфолин)пропокси)хиназолин) (EMD Millipore; № по каталогу 18941), или 2 мкМ ингибитора киназы Aurora II (4-(4ʹ-бензамиданилин)-6,7-диметоксихиназолин) (EMD Millipore; № по каталогу 189404).

На стадии 7 (день 7) собрали мРНК и оценили экспрессию MAFA, UCN3, PDX1, NKX6.1, инсулина и G6PC2 по сравнению с недифференцированными человеческими стволовыми клетками. Как показано на Фиг. 10, удаление R428 привело к значительному уменьшению экспрессии MAFA. Значительный рост экспрессии UCN3 и G6PC2, оба из которых являются маркерами зрелых бета-клеток, был отмечен в культурах, не обработанных R428, и это показывает, что, хотя R428 увеличивает экспрессию MAFA, данная композиция уменьшает другие маркеры созревания бета-клеток. Замена ингибиторами киназы Aurora ингибитора R428 восстановила экспрессию MAFA, но при этом не уменьшила концентрации G6PC2. Таким образом, индукция экспрессии MAFA с помощью R428 на стадии 7 скорее всего была связана не с ингибированием AXL, а с ингибированием киназ Aurora. Применение ингибитора киназы Aurora II привело к увеличению экспрессии MAFA и сохранению экспрессии UCN3 и G6PC2.

Пример 7

Ингибирование киназы Aurora или RSK увеличило экспрессию MAFA на стадии 7 в отсутствие R428

Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (WA01) были посеяны в виде одиночных клеток с плотностью 1×105 клеток/см² на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30) в среду E8. При конфлюентности около 70-80% культуры промыли в неполном PBS в концентрации 1x с последующей инкубацией с ферментом TrypLE™ Express Enzyme в концентрации 1x в течение 3-5 минут при 37 °C. Высвобожденные клетки промыли E8 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок повторно суспендировали в E8, обогащенной 10 мкМ Y-27632, и суспензию одиночных клеток посеяли с плотностью приблизительно 1,3-1,5×105 клеток/см². Культуры питали каждый день средой E8, а дифференцировку, в соответствии с нижеследующим протоколом, начали через 48 часов после посева, что обеспечило исходную конфлюентность около 90%.

Стадия 1 (3 дня):

Клетки нанесли на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1: 30), которые сначала промыли неполным натрий-фосфатным буфером Дульбекко (DPBS) в концентрации 1X, а впоследствии культивировали в течение одного дня в средах стадии 1: среда MCDB-131, обогащенная 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия; 10 мМ глюкозы в конечной концентрации; 100 нг/мл GDF8; и 1,5 мМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия, 10 мМ глюкозы в конечной концентрации, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Впоследствии клетки культивировали в течение одного дополнительного дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,5% FAF-BSA, 1,5 г/1000 мл бикарбоната натрия, 10 мМ глюкозы в конечной концентрации и 100 нг/мл GDF8.

Стадия 2 (2 дня):

Стадия 3 (2 дня):

Стадия 4 (3 дня):

Стадия 5 (3 дня):

Стадия 6 (7 дней):

Стадия 7 (7 дней):

Клетки стадии 6 культивировали в течение четырнадцати дней в среде BLAR, обогащенной ITS-X в разведении 1: 100; 20 мМ глюкозы (конечный объем); 1,5 г/л бикарбоната натрия; 2% FAF-BSA; 10 мкг/мл гепарина, 10 М ZnSO4, 1 мкМ T3 в виде натриевой соли 3,3´, 5-трийод-L-тиронина, 10 мкМ ингибитора ALK5 II, 1 мМ N-ацетилцистеина. Некоторые культуры также включали в себя 2 мкМ R428 или 2-5 мкМ ингибитора RSK II (2-(3,5-дифтор-4-гидрокси-анилин)-8-изопентил-5,7-диметил-7H-птеридин-6-он) (EMD Millipore; № по каталогу 559286-5MG), или 2-5 мкМ ингибитора киназы Aurora II (EMD Millipore), или комбинацию 2-5 мкМ ингибитора RSK II и 2-5 мкМ ингибитора киназы Aurora II.

На стадии 7 (день 14) мРНК собрали и сравнили с недифференцированными человеческими стволовыми клетками. Как показано на Фиг. 11, удаление R428 привело к значительному уменьшению экспрессии MAFA. Замена ингибитора R428 ингибитором киназы Aurora II восстановила экспрессию MAFA. Аналогично, замена ингибитором RSK ингибитора R428 восстановила экспрессию MAFA. Замена ингибитора R428 ингибитором киназы Aurora II и ингибитором RSK дополнительно увеличила экспрессию MAFA. Эти данные указывают на то, что индукция экспрессии MAFA ингибитором R428 скорее всего была связана не с ингибированием AXL, а с ингибированием киназы Aurora, RSK или их комбинации.

1. Способ индукции экспрессии MAFA в панкреатических энтодермальных клетках, панкреатических эндокринных клетках-предшественниках или панкреатических эндокринных клетках, включающий культивирование панкреатических энтодермальных клеток, панкреатических эндокринных клеток-предшественников или панкреатических эндокринных клеток со средой, обогащенной

i) одним или более из трийодтиронина, тироксина и аналога гормона щитовидной железы;

ii) ингибитором ALK; или

iii) как (i), так и (ii); и

где среда также обогащена одним или более из ингибитора киназы Aurora, ингибитора RSK и ингибитора протеин метилтрансферазы DOT1L, и

где указанные панкреатические энтодермальные клетки, панкреатические эндокринные клетки-предшественники или панкреатические эндокринные клетки получают из человеческих плюрипотентных клеток неэмбрионального происхождения.

2. Способ по п. 1, в котором среда обогащена ингибитором киназы Aurora.

3. Способ по п. 2, в котором ингибитор киназы Aurora представляет собой ингибитор киназы Aurora II.

4. Способ по п. 1, в котором среда обогащена ингибитором RSK.

5. Способ по п. 4, в котором ингибитор RSK представляет собой ингибитор RSK II.

6. Способ по п. 1, в котором среда дополнительно содержит антиоксидант.

7. Способ по п. 1, где среда обогащена ингибитором протеин метилтрансферазы DOT1L.

8. Способ по п. 7, где протеин метилтрансфераза DOT1L представляет собой EPZ-5676.

9. Способ по п. 1, где среда обогащена одним или более из ингибитора киназы Aurora II (4-(4’-бензамиданилино)-6,7-диметоксихиназолин), SNS 314 мезилат (N-(3-хлорфенил)-N'-[5-[2-(тиено[3,2-d]пиримидин-4-иламино)этил]-2-тиазолил]мочевины метансульфонат), GSK1070916 (3-(4-(4-(2-(3-((диметиламино)метил)фенил)-1H-пирроло[2,3-b]пиридин-4-ил)-1-этил-1H-пиразол-3-ил)фенил)-1,1-диметилмочевина), TAK-901 (5-(3-(этилсульфонил)фенил)-3,8-диметил-N-(1-метилпиперидин-4-ил)-9H-пиридо[2,3-b]индол-7-карбоксамид), ингибитора RSK II и EPZ-5676.

10. Способ по любому из пп. 1 - 9, где аналог гормона щитовидной железы представляет собой GC-1,3,5-дийодтриопропионовую кислоту, KB-141, MB07344 или T0681.

11. Способ по любому из пп. 1 - 10, где ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II, ALKi, SD208, SB431542, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор рецептора TGF-β I, ингибитор рецептора TGF-β II, ингибитор рецептора TGF-β III, ингибитор рецептора TGF-β IV, ингибитор рецептора TGF-β V, ингибитор рецептора TGF-β VI, ингибитор рецептора TGF-β VII или ингибитор рецептора TGF-β VIII.

12. Способ по любому из пп. 1 - 11, где способ включает культивирование одних или обеих из панкреатических энтодермальных клеток и эндокринных клеток-предшественников.

13. Способ по любому из пп. 1 - 11, где способ включает культивирование панкреатических эндокринных клеток.

14. Способ по любому из пп. 1 - 13, где среда обогащена как (i) одним или более из трийодтиронина, тироксина и аналога гормона щитовидной железы; так и (ii) ингибитором ALK5.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов, которые имеют стандартизированную чувствительность по отношению к полипептиду нейротоксина клостридии, и стандартизации чувствительности к полипептиду нейротоксина клостридии нейронов, происходящих из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также определению биологической активности полипептида нейротоксина клостридии и применению GT1b.

Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа и способ его получения // 2693432

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа млекопитающего. Способ включает получение донорского материала в виде донорского паренхиматозного органа или его части, дальнейшую фрагментацию донорского материала, формируя фрагменты размером от 10 мм до 15 мм, замораживание фрагментов и их последующее оттаивание, первоначальное измельчение фрагментов, получая частицы с размером от 0,5 мм до 5 мм.

Слитые белки, содержащие связывающие pdgf и vegf части, и способы их применения // 2692652

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, связывающихся с PDGF и VEGF, и рекомбинантных вирусных частиц, кодирующих слитые белки, и может быть использовано в медицине.

Клетки sc-β и композиции и способы для их создания // 2692595

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиция для секреции инсулина при стимуляции глюкозой, содержащей экспрессирующую инсулин ненативную панкреатическую β-клетку и среду, или фармацевтически приемлемый носитель, или разбавитель.

Улучшенные способы лечения васкуляризированных злокачественных опухолей // 2692248

Изобретение относится к композиция для применения в лечении глиобластомы, где указанная композиция содержит: (a) эффективное количество антитела, фрагмента антитела или диатела, которое обладает специфичностью в отношении В7-Н3, и (b) эффективное количество антитела или фрагмента антитела, которое обладает специфичностью в отношении VEGF или VEGFR.

Перепрограммирование эндотелия человека в гемопоэтических предшественников множественных линий дифференцировки с использованием определенных факторов // 2691062

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения гемопоэтических предшественников множественных линий дифференцировки (HMLP) из эндотелиальных клеток (EC).

Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека // 2690498

Изобретение относится к способу получения белково-пептидной композиции с ноотропными свойствами и включает в себя: забор биоптата кожи, получение культуры фибробластов, криоконсервацию культуры фибробластов, размораживание культуры фибробластов, репрограммирование фибробластов для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), культивирование ИПСК, криоконсервацию ИПСК, размораживание ИПСК, нейрональную дифференцировку ИПСК, получение белково-пептидного комплекса.

Генетическая модификация крыс // 2690352

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к созданию линии крысиных эмбриональных стволовых клеток, получению генетически модифицированной крысы и композиции для культивирования и поддержания плюрипотентности крысиных эмбриональных стволовых клеток.

Суспендирование и кластеризация плюрипотентных стволовых клеток человека с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки // 2689710

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению трехмерных клеточных кластеров и их дифференцировке. Способ включает обработку плюрипотентных стволовых клеток, которые являются индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, клетками, полученными из ткани пуповины человека, партенотами, клетками, полученными из амниотической жидкости, или эмбриональными стволовыми клетками человека линии H1, H7, H9, SA002 или BG01v, культивированных в плоской адгезивной культуре вместе с хелатирующим агентом или ферментом, с высвобождением клеточных агрегатов из плоской адгезивной культуры.

Способ конструирования аллогенных и устойчивых к лекарственным препаратам т-клеток для иммунотерапии // 2689558

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть применено в медицине для иммунотерапии рака. Способ ex-vivo получения Т-клеток, устойчивых к клофарабину и/или флударабину, включает стадии: (а) трансфекции Т-клеток нуклеотидной последовательностью, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, специфически направленную на ген, экспрессирующий фермент, обладающий активностью дезоксицитидинкиназы (dcK – EC 2.7.1.74); (b) экспрессии указанной эндонуклеазы в указанных Т-клетках для достижения направленной инактивации указанного гена dcK; (c) размножения указанных сконструированных Т-клеток, полученных на этапе (b), необязательно в присутствии клофарабина и/или флударабина.

Иммортализованные фибробласты эмбриона цыпленка // 2694318

Группа изобретений относится к области генетической инженерии, в частности к иммортализованным фибробластам эмбриона цыпленка (ФЭЦ) для размножения вирусов, способам их получения, к культурам клеток, включающим иммортализованные ФЭЦ, к способам репликации вирусов птиц в таких клетках и к способам получения вакцин. Стабильно трансфицированный иммортализованный ФЭЦ экспрессирует SV40 T антиген, экспрессирует теломеразу цыпленка (cTERT) под контролем гетерологичного промотора, не включает экзогенную ретровирусную ДНК с Длинным концевым повтором, обладает способностью к непрерывной пролиферации и дает более 45 удвоений популяции. Способы получения иммортализованных ФЭЦ включают трансфекцию первичных клеток ФЭЦ при помощи одной или нескольких молекул ДНК, не содержащих ДКП последовательности и включающих инвертированные повторы транспозона, ген, кодирующий SV40 T антиген под контролем подходящего промотора, ген, кодирующий cTERT под контролем подходящего промотора, ген, кодирующий транспозазу под контролем подходящего промотора. В результате отбирают клетки ФЭЦ, которые культивируют в течение по меньшей мере 45 клеточных циклов. Полученные клетки ФЭЦ имеют морфологию фибробластов, которая сохраняется на протяжении пассирования, и являются субстратом для репликации вирусов птиц или вирусного вектора птиц для дальнейшего получения вакцин. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 пр.

Способ культивирования в системе посевных ферментеров (варианты) // 2694327

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ получения рекомбинантного белка и его выделения (варианты). Способ включает помещение рекомбинантных клеток млекопитающих в первую культуральную среду для получения первой культуры клеток, периодическое культивирование, помещение первой культуры клеток в перфузионный биореактор со второй культуральной средой для получения второй культуры клеток, перфузионное культивирование, помещение второй культуры клеток в производственный биореактор с третьей культуральной средой для получения культуры клеток-продуцентов и их перфузионное культивирование в позволяющих рекомбинантным клеткам секретировать рекомбинантный белок условиях. В одном варианте способа используют содержащий рекомбинантные клетки замороженный клеточный банк. При этом рекомбинантный белок выделяют из третьей культуральной среды, удаленной из производственного биореактора. Изобретения обеспечивают снижение числа стадий культивирования, количества времени от начальной культуры клеток до инокуляции производственного биореактора, количества ручных манипуляций, риска контаминации, а также более высокую начальную плотность жизнеспособных клеток в производственном биореакторе. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 пр., 9 ил.