Одноцепочечные белки-агонисты trail-рецептора

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к белкам-агонистам рецептора TRAIL, и может быть использовано в медицине для противоопухолевого лечения. Белок включает димер двух полипептидов, включающих три растворимых домена TRAIL, слитых через пептидные линкеры, и домен Fc-фрагмента антитела, который слит с С-концом третьего растворимого домена TRAIL через петлевой линкерный элемент. Два полипептида могут быть ковалентно связаны посредством трех межцепочечных дисульфидных связей, образованных между цистеиновыми остатками 513, 519 и 522 каждого полипептида. При этом остатки аспарагина в положениях 168 и 337 полипептида(ов) являются N-гликозилированными, а N-концевой глютамин полипептида(ов) модифицирован в пироглютамат. Изобретение позволяет получить белки-агонисты рецептора TRAIL с пониженной агрегацией. 7 н. и 6 з.п. ф-лы, 24 ил., 9 табл., 7 пр.

 

Связанные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США 61/983152, поданной 23 апреля 2014, которая полностью включена в настоящее описание в виде ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает специфические белки агонисты TRAIL рецептора, включающие три растворимых TRAIL домена и Fc-фрагмент, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белки агонисты TRAIL рецептора, и их применение. Белки агонисты TRAIL рецептора являются по существу не-агрегирующими и подходящими для терапевтического, диагностического и/или исследовательского применения.

Предшествующий уровень техники изобретения

Известно, что для эффективного связывания и активации рецептора требуется тримеризация цитокинов суперсемейства TNF (TNFSF). Однако тримерные комплексы цитокинов суперсемейства TNF трудно получить из рекомбинантных мономерных единиц.

В WO 01/49866 и WO 02/09055 описывают рекомбинантные сшитые белки, включающие цитокин TNF и компонент мультимеризации, в частности белок из семейства C1q белков или коллектин. Недостатком указанных сшитых белков является, однако, что домен тримеризации обычно имеет большую молекулярную массу и/или такая тримеризация является скорее неэффективной.

Schneider et al. (J Exp Med 187 (1989), 1205-1213) описывает, что тримеры цитокинов TNF стабилизируются посредством N-терминально расположенных фрагментов стабилизации. В CD95L, стабилизация тримера рецептор-связывающего домена, вероятно, обусловлена N-концевыми доменами аминокислот, которые располагаются около цитоплазматической мембраны.

Shiraishi et al. (Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202) описывают, что рецептор-связывающий домен CD95L может быть стабилизирован расположенными на N-конце искусственными фрагментами биспиралей α-спиралей (лейциновыми молниями). Было обнаружено, однако, что трудно предсказать ориентацию полипептидных цепей относительно друг друга, например, параллельную или антипараллельную ориентацию. Кроме того, трудно определить оптимальное количество семивалентных повторов в двухспиральном фрагменте молнии. Кроме того, двухспиральные структуры имеют тенденцию образовывать макромолекулярные агрегаты после изменения pH и/или ионной силы.

WO 01/25277 относится к одноцепочечным олигомерным полипептидам, которые связываются с внеклеточным лиганд-связывающим доменом клеточного рецептора, где полипептид включает по меньшей мере три рецептор-связывающих сайта, из которых по меньшей мере один способен связываться с лиганд-связывающим доменом клеточного рецептора и по меньшей мере один неспособен эффективно связываться с лиганд-связывающим доменом клеточного рецептора, посредством чего одноцепочечные олигомерные полипептиды способны связываться с рецептором, но неспособны активировать рецептор. Например, мономеры получают из лигандов цитокинов семейства TNF, в частности из TNF-α.

В WO 2005/103077 описаны одноцепочечные сшитые полипептиды, включающие по меньшей мере три мономера члена семейства лигандов TNF и по меньшей мере два пептидных линкера, которые связывают мономеры членов семейства лигандов TNF один с другим. Недавние эксперименты, однако, показали, что такие одноцепочечные сшитые полипептиды демонстрировали нежелательную агрегацию.

В WO 2010/010051 описывают одноцепочечные сшитые полипептиды, включающие три растворимых домена цитокинов семейства TNF и по меньшей мере два пептидных линкера. Описанные сшитые полипептиды являются по существу не-агрегированными.

Более того, предшествующие работы, включая таковую Papadopoulos et al. (Cancer Chemother Pharmacol, 2015, DOI 10.1007/s00280-015-2712-0), продемонстрировали, что образование сверхскоплений рецептора TRAIL может приводить к токсичности.

Соответственно, в области техники существует необходимость в новых агонистах рецептора TRAIL, которые проявляют высокую биологическую активность, хорошую стабильность, низкую токсичность и позволяют осуществлять эффективное рекомбинантное производство.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает специфические белки агонисты рецептора TRAIL, которые обладают низкой протеолитической деградацией, длительным периодом полужизни и незначительным образованием сверхскоплений рецептора TRAIL in vivo (вместе с сопутствующей токсичностью).

Белки агонисты рецептора TRAIL по настоящему изобретению обычно включают:(i) первый растворимый цитокиновый домен TRAIL; (ii) первый пептидный линкер; (iii) второй растворимый домен TRAIL; (iv) второй пептидный линкер; (v) третий растворимый домен TRAIL; и (vi) Fc-фрагмент антитела.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает одноцепочечный сшитый полипептид, включающий: (i) первый растворимый домен TRAIL, (ii) первый пептидный линкер, (iii) второй растворимый домен TRAIL, (iv) второй пептидный линкер, (v) третий растворимый домен TRAIL, и (vi) Fc-фрагмент антитела. В одном варианте осуществления изобретения Fc-фрагмент антитела (vi) располагается на N-конце относительно первого домена TRAIL (i) и/или ближе к C-концу относительно третьего домена TRAIL (v). В другом варианте осуществления изобретения Fc-фрагмент антитела располагается ближе к C-концу относительно третьего TRAIL домена (v). В одном варианте осуществления изобретения, полипептид по существу не образует агрегатов. В другом варианте осуществления изобретения второй и/или третий растворимый домен TRAIL является доменом, укороченным с N-конца, который необязательно включает мутации последовательности аминокислот.

В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из растворимых доменов TRAIL, особенно по меньшей мере один из растворимых доменов TRAIL (iii) и (v), представляет собой растворимый домен TRAIL с N-концевой последовательностью, которая начинается между аминокислотами Gln120 и Val122 человеческого TRAIL и где Arg121 может быть заменен нейтральной аминокислотой, например, Ser или Gly. В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из растворимых доменов TRAIL, в частности по меньшей мере один из растворимых доменов TRAIL (iii) и (v), представляет собой растворимый домен TRAIL с N-концевой последовательностью, выбираемой из (a) Arg121-Val122-Ala123 и (b) (Gly/Ser)121-Val122-Ala123. В одном варианте осуществления изобретения растворимый домен TRAIL заканчивается аминокислотой Gly281 человеческого TRAIL и/или необязательно включает мутацию в положениях R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, I266, D267 или D269 или двух или более из указанных положений. В одном варианте осуществления изобретения растворимый домен TRAIL (i) состоит из аминокислот Gln120-Gly281 человеческого TRAIL по SEQ ID NO: 1 и растворимые домены TRAIL (iii) и (v) состоят из аминокислот Arg121-Gly281 человеческого TRAIL по SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления изобретения первый и второй пептидные линкеры (ii) и (iv) независимо имеют длину 3-8 аминокислот, в частности длину 3, 4, 5, 6, 7, или 8 аминокислот, и предпочтительно являются глициновыми/сериновыми линкерами, необязательно включающими аспарагиновый остаток, который может быть гликозилированным. В одном варианте осуществления изобретения первый и второй пептидные линкеры (ii) и (iv) состоят из последовательности аминокислот по SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления изобретения полипептид дополнительно включает N-концевой домен сигнального пептида, например, SEQ ID NO: 12, который может включать сайт расщепления протеазой, и/или который дополнительно включает C-концевой элемент, который может включать и/или быть связанным с доменом распознавания/очистки, например, Strep-меткой по SEQ ID NO: 13.

В одном варианте осуществления изобретения Fc-фрагмент антитела (vi) является сшитым с растворимым доменом TRAIL (i) и/или (v) посредством петлевого линкера, предпочтительно SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления изобретения Fc-фрагмент антитела (vi) состоит из последовательности аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 10 или 17. В другом варианте осуществления изобретения полипептид включает последовательность аминокислот SEQ ID NO: 14, 15 или 18.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает белок агонист рецептора TRAIL, включающий полипептид, имеющий последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, 20 или 21.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает белок агонист рецептора TRAIL, включающий полипептид, имеющий последовательность аминокислот, указанную SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, или 30.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает белок агонист рецептора TRAIL, включающий два полипептида, имеющие последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19. В одном варианте осуществления изобретения два полипептида ковалентно связаны посредством трех межцепочечных дисульфидных связей, образованных между цистеиновыми остатками 513, 519, и 522 каждого полипептида.

В одном варианте осуществления изобретения один или более аспарагиновых остатков в положениях 168 и 337 полипептида(ов) являются N-гликозилированными. В другом варианте осуществления изобретения аспарагиновые остатки в положениях 168 и 337 полипептида(ов) оба являются N-гликозилированными.

В другом варианте осуществления изобретения полипептид(ы) дополнительно посттрансляционно модифицируются. В другом варианте осуществления изобретения посттрансляционная модификация включает N-концевой глютамин, модифицированный в пироглютамат.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую белок агонист рецептора TRAIL, описанный в настоящем описании и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, вспомогательных веществ и/или добавок. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок агонист рецептора TRAIL. В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает вектор экспрессии, включающий молекулу нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает клетку, включающую молекулу нуклеиновой кислоты. В дополнительном варианте осуществления изобретения клеткой является клетка эукариот. В другом варианте осуществления изобретения клеткой является клетка млекопитающего. В другом варианте осуществления изобретения клеткой является клетка яичника китайского хомяка (CHO). В других вариантах осуществления изобретения клетку выбирают из группы, состоящей из клеток CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, и CHO-K1. В других вариантах осуществления изобретения клетку выбирают из группы, состоящей из клеток Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4, и гибридомы.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения пациента, имеющего TRAIL-ассоциированное заболевание или расстройство, способ включает введение пациенту эффективного количества белка агониста рецептора. В одном варианте осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL вводят отдельно. В другом варианте осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL вводят до, одновременно с или после введения второго агента. В другом варианте осуществления изобретения заболевание или расстройство выбирают из группы, состоящей из: опухолей, инфекционных заболеваний, воспалительных заболеваний, метаболических заболеваний, аутоиммунных расстройств, дегенеративных заболеваний, заболеваний, ассоциированных с апоптозом, и отторжения трансплантата. В одном варианте осуществления изобретения опухолями являются солидные опухоли. В одном варианте осуществления изобретения опухоли выбирают из группы раков, состоящей из саркомы, рака пищевода и рака желудка. В другом варианте осуществления изобретения опухоли выбирают из саркомы Юинга или фибросаркомы, В другом варианте осуществления изобретения опухоли выбирают из группы раков, состоящей из немелкоклеточной карциномы легких (NSCLC), рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака молочной железы, рака яичника, рака головы и шеи и мелкоклеточного рака легкого (SCLC). В другом варианте осуществления изобретения опухолями являются лимфатические опухоли. В одном варианте осуществления изобретения опухолями являются гематологические опухоли. В другом варианте осуществления изобретения опухоли выбирают из не-Ходжкинской лимфомы, лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелолейкоза (AML), B клеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, хронического миелоцитарного лейкоза (CML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), или волосатоклеточного лейкоза. В другом варианте осуществления изобретения аутоиммунными заболеваниями являются ревматоидные заболевания, артритические заболевания или ревматоидные и артритические заболевания. В дополнительном варианте осуществления изобретения заболеванием или расстройством является ревматоидный артрит. В другом варианте осуществления изобретения дегенеративным заболеванием является нейродегенеративное заболевание. В дополнительном варианте осуществления изобретения нейродегенеративным заболеванием является рассеянный склероз.

В одном варианте осуществления изобретения вторым агентом является химиотерапевтический, радиотерапевтический или биологический агент. В одном варианте осуществления изобретения второй агент выбирают из группы, состоящей из Дувелисиба, Ибрутиниба, Навитоклакса и Венетоклакса. В другом варианте осуществления изобретения вторым агентом является апоптоидный агент. В одном варианте осуществления изобретения второй апоптоидный агент выбирают из группы, состоящей из Бортезомиба, Азацитидина, Дазатиниба и Гефитиниба. В определенном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, вводят пациенту посредством внутривенного или подкожного введения. В других вариантах осуществления изобретения описанные фармацевтические композиции вводят пациенту посредством перорального, парентерального, внутримышечного, внутрисуставного, интрабронхиального, внутрибрюшного, интракапсулярного введения, введения в хрящ, в полость, в брюшную полость, в мозжечок, в желудочки головного мозга, внутрикишечно, в шейку матки, в желудок, внутрипеченочно, в миокард, внутрикостно, в таз, в перикард, интраперитонеально, интраплеврально, в предстательную железу, внутрилегочно, интраректально, интраренально, в сетчатку, интраспинально, интрасиновиально, в грудную клетку, в матку, в мочевой пузырь, путем болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального или трансдермального введения.

В одном варианте осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL вводят в виде единственного болюса. В другом варианте осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL можно вводить в нескольких отдельных дозах. Белок агонист рецептора TRAIL можно вводить в дозе около 0,1-100 мг/кг. В одном варианте осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL можно вводить в дозировке, выбираемой из группы, состоящей из: около 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-15, 1-7,5, 1,25-15, 1,25-7,5, 2,5-7,5, 2,5-15, 5-15, 5-7,5,1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, и 10-100 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL присутствует в фармацевтических композициях в количестве около 0,1-100 мг/мл. В одном варианте осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL присутствует в фармацевтических композициях в количестве, выбираемом из группы, состоящей из: около 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, или 10-100 мг/мл. В других вариантах осуществления изобретения пациенту вводят терапевтически эффективное количество белка агониста рецептора TRAIL. В другом варианте осуществления изобретения пациенту вводят профилактически эффективное количество белка агониста рецептора TRAIL.

Описание чертежей

Фиг. 1 Структура домена одноцепочечного сшитого полипептида, включающего три домена TRAIL. I, II, III. Растворимые домены TRAIL.

Фиг. 2 Схематическое изображение, представляющее общую структуру TRAIL.

▄ ▄ ▄ Клеточная мембрана, N-конец, локализованный в клетке,

1. Анти-параллельная β-складка рецептор-связывающего домена (RBD),

2. Граница фаз RBD и клеточной мембраны,

3. Сайт расщепления протеазой.

Фиг. 3 Схематическое изображение, представляющее собой структуру нативного тримера TRAIL. Цилиндрические структуры представляют собой RBD. N-концы соединяют RBD с клеточной мембраной.

Фиг. 4 Схематическое изображение, представляющее собой структуру трех растворимых доменов, включающих рецептор-связывающий домен TRAIL. I, II, III растворимые домены TRAIL.

Фиг. 5 Тримеризация растворимых доменов TRAIL, включающих RBD, отличающихся тем, что N- и C-концы трех растворимых доменов образуют поверхность.

Фиг. 6 Схематическое изображение представляет собой структуру одноцепочечного TRAIL, включающего все или часть стебелькового участка, иллюстрирующее потребность в более длинных линкерах для компенсации расстояния до N-конца следующего растворимого домена.

Фиг. 7 сшитый белок scFv-TRAIL, известный из области техники.

Фиг. 8 сшитый белок Fc-TRAIL, известный из области техники.

Фиг. 9A Одноцепочечный сшитый полипептид, включающий дополнительный Fab-фрагмент антитела.

Фиг. 9B Одноцепочечный сшитый полипептид, включающий дополнительный scFv-фрагмент антитела.

Фиг. 10 Димеризация двух N-терминально сшитых scFc полипептидов, сшитых посредством дисульфидных мостиков.

Фиг. 11 Димеризация двух C-концево сшитых scFc полипептидов, сшитых посредством дисульфидных мостиков.

Фиг. 12 Димеризация одноцепочечных сшитых полипептидов посредством линкера.

Фиг. 13 Одноцепочечный сшитый полипептид, включающий дополнительный Fab-фрагмент антитела, дополнительно сшитый со вторым сшитым полипептидом или с scFv-сшитым полипептидом.

Фиг. 14 Димеризация двух scFab сшитых полипептидов посредством дисульфидных мостиков.

Фиг. 15 сшитые N-концами scFc сшитые полипептиды, дополнительно включающие Fv- и/или Fab-фрагмент антитела.

Фиг. 16 Сшитые C-концами scFc сшитые полипептиды, дополнительно включающие Fv- и/или Fab-фрагменты антител.

Фиг. 17A Примерный белок агонист рецептора TRAIL, как показано с N-концевым сигнальным пептидным доменом, указанным в SEQ ID NO: 14. Зрелый белок (который не включает N-концевой сигнальный пептидный домен) указан в SEQ ID NO: 19.

Фиг. 17B Схематическое изображение, представляющее общую структуру и обозначенную последовательность примерного белка агониста рецептора TRAIL.

Фиг. 18 Схема анализа ELISA для количественной оценки агонистов рецептора TRAIL, содержащих FC-домен.

Фиг. 19 Белок агонист рецептора TRAIL, включающий два полипептида, имеющие последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 19, индуцирует клеточную смерть в человеческих опухолевых клеточных линиях in vitro. Клетки SKM-1, Colo205 или Jurkat обрабатывали увеличивающимися концентрациями белка агониста рецептора TRAIL в течение 24 часов и оценивали выживаемость клеток.

Фиг. 20(A-C) Белок агонист рецептора TRAIL, включающий два полипептида, имеющие последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 19, действует синергически с противоопухолевыми агентами in vitro. SU-DHL-4 клетки инкубировали с увеличивающимися концентрациями белка агониста рецептора TRAIL в присутствии или отсутствии указанных концентраций венетоклакса (фиг. 20A) или навитоклакса (фиг. 20B) в течение 24 часов. Альтернативно, (фиг. 20C) клетки NCl-H596 обрабатывали увеличивающимися концентрациями белка агониста рецептора TRAIL в присутствии или отсутствии указанных концентраций доцетаксела (DTX) в течение 72 часов. Оценивали выживаемость клеток и синергию определяли по сумме Bliss.

Фиг. 21 Эффект белка агониста рецептора TRAIL, включающего два полипептида, имеющие последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата колоректальной карциномы Colo205.

Фиг. 22 Эффект белка агониста рецептора TRAIL, включающего два полипептида, имеющие последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата острого миелолейкоза SKM-1.

Фиг. 23 Эффект белка агониста рецептора TRAIL, включающего два полипептида, имеющие последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата немелкоклеточного рака легкого H460LM.

Фиг. 24(A-G) Эффект белков агонистов рецептора TRAIL, включающих два полипептида, имеющие последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, на рост опухоли в моделях PDX. Ромбы, обработанные белком агонистом рецептора TRAIL; квадраты, необработанные. Объемы опухолей показаны для (A) CTG-0069, (B) CTG-0167, (C) CTG-0293, (D) CTG-0785, (E) CTG-0714, (F) CTG-0136, и (G) CTG-0485.

Подробное описание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что сшивка одноцепочечного домена, связывающего TRAIL рецептор, с Fc-доменом приводит к шестивалентному агонисту рецептора TRAIL, обеспечивающему высокую биологическую активность в комбинации с хорошей стабильностью. Соответственно, обеспечивают одноцепочечный сшитый полипептид, включающий по меньшей мере три растворимых домена TRAIL, связанные двумя пептидными линкерами и на N-конце и/или C-конце с Fc-фрагментом антитела.

Предпочтительно, одноцепочечный сшитый белок является не-агрегированным. Термин "не-агрегированный" относится к содержанию мономера в препарате ≥50%, предпочтительно ≥70% и более предпочтительно ≥90%. Соотношение содержания мономера к содержанию агрегата может быть определено путем исследования количества образованного агрегата с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). Стабильность, касающаяся агрегации, может быть определена посредством SEC после определенных временных периодов, например, от короткого периода до нескольких дней, до недель и месяцев в различных условиях хранения, например, при 4°C или 25°C. Чтобы охарактеризовать сшитый белок по существу неагрегирующим предпочтительно, чтобы содержание мономера составляло, как определено после периода времени нескольких дней, например, 10 дней, более предпочтительно через несколько недель, например, 2, 3 или 4 недель, и наиболее предпочтительно через несколько месяцев, например, 2 или 3 месяца хранения при 4°C или 25°C.

Одноцепочечные сшитые белки могут включать дополнительные домены, которые могут быть расположены на N- и/или C-концах. Примеры дополнительных сшитых доменов представляют собой, например, N-концевые сигнальные пептидные домены, которые могут включать сайт расщепления протеазой, или C-концевой элемент, который может включать и/или соединяться с доменом распознавания/очистки. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения сшитый полипептид включает Strep-метку на C-конце, который сшит посредством линкера. Примерная Strep-метка, включающая короткий сериновый линкер, показана в SEQ ID NO: 13.

Белок агонист рецептора TRAIL по настоящему изобретению включает три растворимых домена, полученных из TRAIL. Предпочтительно, такие растворимые домены получают от млекопитающих, особенно из человеческих TRAIL, включая аллельные варианты и/или их производные. Растворимые домены включают внеклеточную часть TRAIL, включая рецептор-связывающий домен без доменов, расположенных в мембране. Как другие белки суперсемейства TNF, TRAIL заякорен в мембране посредством N-концевой части из 15-30 аминокислот, так называемого стебелькового участка. Стебельковый участок участвует в тримеризации и обеспечивает определенное расстояние до клеточной мембраны. Однако, стебельковый участок не является частью рецептор-связывающего домена (RBD).

Важно, что RBD характеризуется определенной локализацией его N- и C-концевых аминокислот. Указанные аминокислоты являются соседними и располагаются центрально относительно оси тримера. Первые N-концевые аминокислоты RBD образуют антипараллельную бета-спираль с C-концевыми аминокислотами RBD (фиг. 2 и 3).

Следовательно, границу раздела с клеточной мембраной образует антипараллельная бета спираль RBD, которая связана с и заякорена в клеточной мембране посредством аминокислот участка «стебля». Крайне предпочтительно, чтобы растворимые домены TRAIL белка агониста рецептора TRAIL включали рецептор-связывающий домен TRAIL, не имеющий какой-либо аминокислоты из участка «стебля» (фиг. 4 и 5). Иными словами, будет требоваться длинный линкер, соединяющий C-конец одного из растворимых доменов с N-концом следующего растворимого домена, для компенсации N-концевого участка «стебля» следующего растворимого домена (фиг. 6), что может приводить к нестабильности и/или образованию агрегатов.

Дополнительным преимуществом таких растворимых доменов является то, что N- и C-концевые аминокислоты RBD недоступны для любых антител к лекарственным средствам. Предпочтительно одноцепочечный сшитый полипептид способен образовывать упорядоченную трехмерную структуру, включающую по меньшей мере один функциональный сайт связывания для соответствующего TRAIL рецептора.

Белок агонист рецептора TRAIL включает три функциональных сайта связывания рецептора TRAIL, т.е. последовательности аминокислот, способные образовывать комплекс с рецептором TRAIL. Следовательно, растворимые домены способны связываться с соответствующим рецептором TRAIL. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один из растворимых доменов способен активировать рецептор, посредством чего можно влиять на апоптоидную и/или пролиферативную активность. В дополнительном варианте осуществления изобретения один или более из растворимых доменов выбирают как неспособные активировать рецептор.

Растворимый TRAIL домен может быть получен из человеческого TRAIL, как показано в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, растворимые домены TRAIL получают из человеческого TRAIL, в частности начиная с аминокислот 120-122, и они включают в частности аминокислоты 120-281, 121-281 или 122-281 SEQ ID NO: 1. Необязательно, аминокислота Arg121 SEQ ID NO: 1 может быть заменена незаряженной аминокислотой, например, Ser или Gly.

Таблица 1: Последовательность человеческого белка TRAIL

SEQ ID NO	Последовательность
1	MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

Как указано выше, растворимые домены TRAIL могут включать последовательности дикого типа, как показано в SEQ ID NO: 1. Необходимо отметить, что возможно вносить мутации в один или более из указанных растворимых доменов, например, мутации, которые изменяют (например, усиливают или ослабляют) свойства связывания растворимых доменов. В одном варианте осуществления изобретения могут быть выбраны растворимые домены, которые не могут связываться с соответствующим цитокиновым рецептором.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения растворимый домен TRAIL (i) включает мутант TRAIL или его рецептор-связывающий домен, который связывает и/или активирует TRAIL-рецептор 1 (TRAILR1) и/или TRAIL-рецептор 2 (TRAILR2). Связывание и/или активность мутанта может быть, например, определена посредством анализов, как описано в van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), или MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270).

Мутант может быть получен любой методикой и известен специалисту, например, методиками, описанными в van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215), или MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270), и может включать любой тип структурных мутаций, например, замену, делецию, дупликацию и/или вставку аминокислоты. Предпочтительным вариантом осуществления является получение замен. Замена может влиять на по меньшей мере одну аминокислоту TRAIL или его рецептор-связывающего домена, как описано в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления изобретения замена может влиять на по меньшей мере одну из аминокислот TRAIL, например, человеческого TRAIL (например, SEQ ID NO: 1). Предпочтительные замены в таком отношении влияют по меньшей мере на одну из следующих аминокислот человеческого TRAIL по SEQ ID NO: 1: R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269. Предпочтительные замены аминокислот человеческого TRAIL SEQ ID NO:1 представляют собой одну из следующих замен: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, или D269K.

Замена(ы) аминокислот могут влиять на связывание и/или активность TRAIL, например, человеческого TRAIL, с или на или TRAILR1 или TRAILR2. Альтернативно, замена(ы) аминокислот могут влиять на связывание и/или активность TRAIL, например, человеческого TRAIL, с или на обоих, TRAILR1 и TRAILR2. На связывание и/или активность TRAILR1 и/или TRAILR2 можно влиять в положительном направлении, т.е. обеспечивать более сильное, более селективное или более специфическое связывание и/или большую активацию рецептора. Альтернативно, на связывание и/или активность TRAILR1 и/или TRAILR2 можно влиять отрицательно, т.е. обеспечивать более слабое, менее селективное или менее специфическое связывание и/или меньшую или отсутствие активации рецептора.

Примеры мутантов TRAIL с заменой(ами) аминокислот по изобретению, которые могут влиять на связывание и/или активацию и TRAILR1 и TRAILR2, могут быть обнаружены, например, в таблице 1 MacFarlane et al. (цит. выше) и могут включать человеческий TRAIL мутант со следующими двумя заменами аминокислот SEQ ID NO: 1 Y213W и S215D или со следующей единственной заменой аминокислоты: Y189A.

Примеры мутантов TRAIL с заменой(ами) аминокислот по изобретению, которые влияют на связывание и/или активацию TRAILR1, могут быть обнаружены, например, в таблице 1 MacFarlane et al. (цит. выше) и могут включать человеческий TRAIL мутант со следующими четырьмя заменами аминокислот SEQ ID NO: 1 N 199V, K201R, Y213W и S215D или со следующими пятью заменами аминокислот: Q193S, N199V, K201R, Y213W и S215D, или могут быть обнаружены в таблице 2 Kelley et al. (цит. выше) и могут включать человеческий TRAIL мутант со следующими шестью заменами аминокислот: Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199V, и K201R, или с Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199R, и K201R.

Примеры мутантов TRAIL с заменой(ами) аминокислот по изобретению, которые влияют на связывание и/или активацию TRAILR2, могут быть обнаружены, например, в таблице 1 MacFarlane et al. (цит. выше) или в таблице 2 Kelley et al. (цит. выше), и могут включать человеческий TRAIL мутант со следующими шестью заменами аминокислот SEQ ID NO: 1: Y189Q, R191 K, Q193R, H264R, I266L, и D267Q, или может быть обнаружен в таблице 2 van der Sloot et al. (цит. выше) и может включать человеческий TRAIL мутант со следующей заменой единственной аминокислоты: D269H, или со следующими двумя заменами аминокислот: D269H и E195R или D269H и T214R.

Следовательно, одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения является белок агонист рецептора TRAIL, как описано в настоящем описании, где по меньшей мере один из растворимых доменов включает мутант TRAIL или его рецептор-связывающий домен, который связывает и/или активирует TRAILR1 и/или TRAILR2.

Дополнительные примеры мутантов TRAIL, которые продемонстрировали сниженную индуцированную TRAIL агрегацию рецепторов, представляют собой H168 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q) и H177 (S, T).

Один предпочтительный вариант осуществления белка агониста рецептора TRAIL, включающий мутант TRAIL или его рецептор-связывающий домен, как описано в настоящем описании, представляет собой белок агонист рецептора TRAIL, где компонент (i) включает по меньшей мере одну замену аминокислоты, в частности, как указано ниже.

Такие замены аминокислоты влияют на по меньшей мере одно из следующих положений аминокислот человеческого TRAIL (SEQ ID NO: 1): R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269.

Такая замена аминокислоты представляет собой по меньшей мере одну из следующих: R13OE, G16OM, H168 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q), H177 (SJ)1 Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R, или D269K.

Предпочтительный TRAIL-R2 селективный домен включает замены аминокислот Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L и D267Q.

Предпочтительный TRAIL-R1 селективный домен включает замены аминокислот Y189A, Q193S, N199V, K201R, Y213W и S215D.

Одноцепочечные сшитые молекулы по настоящему изобретению включают три растворимых TRAIL домена, а именно компоненты (i), (iii) и (v). Стабильность одноцепочечного TRAIL сшитого полипептида в отношении агрегации усиливается, если второй и/или третий растворимые TRAIL домены представляют собой домен, укороченный с N конца, который необязательно включает мутации последовательности аминокислот. Следовательно, предпочтительно оба и второй и третий растворимые TRAIL домены являются доменами, укороченными с N конца, которые необязательно включают мутации последовательности аминокислот в N-концевых участках, предпочтительно в первых пяти аминокислотах N-конца растворимого TRAIL домена. Такие мутации могут включать замену заряженной, например, кислой или основной аминокислоты, нейтральными аминокислотами, в частности серином или глицином.

В противоположность этому выбор первого растворимого домена TRAIL не является критичным. Здесь может быть использован растворимый домен, имеющий полнодлинновую N-концевую последовательность. Необходимо отметить, однако, что также первый растворимый TRAIL домен может иметь укороченную с N-конца и необязательно мутированную последовательность.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растворимые домены TRAIL (i), (iii) и (v) представляют собой растворимые домены человеческого TRAIL. Первый растворимый TRAIL домен (i) может быть выбран из нативных, укороченных и/или мутированных последовательностей. Следовательно, первый растворимый TRAIL домен (i) имеет N-концевую последовательность, которая может начинаться между аминокислотой Glu116 и Val122 человеческого TRAIL, и где Arg121 может быть заменен нейтральной аминокислотой, например, Ser или GIy. Второй и третий растворимые TRAIL домены (iii) и (v) имеют укороченную N-концевую последовательность, которая предпочтительно начинается между аминокислотой Gln120 и Val122 человеческого TRAIL и где Arg121 может быть заменен другой аминокислотой, например, Ser или Gly.

Предпочтительно, N-концевую последовательность растворимых TRAIL доменов (iii) и (v) выбирают из:

(a) Arg121-Val122-Ala123 и

(b) (Gly/Ser) 121.

Растворимый TRAIL домен предпочтительно заканчивается аминокислотой Gly281 человеческого TRAIL. В определенных вариантах осуществления изобретения TRAIL домен может включать внутренние мутации, как описано выше.

Компоненты (ii) и (iv) белка агониста рецептора TRAIL представляют собой элементы пептидного линкера, расположенные между компонентами (i) и (iii) или (iii) и (v), соответственно. Гибкие линкерные элементы имеют длину 3-8 аминокислот, в частности длину 3, 4, 5, 6, 7, или 8 аминокислот. Линкерными элементами являются предпочтительно линкеры глицин/серин, т.е. пептидные линкеры, по существу состоящие из аминокислот глицина и серина. В случаях, в которых растворимый цитокиновый домен заканчивается S или G (C-конец), например, человеческий TRAIL, линкер начинается после S или G. В случаях, когда растворимый цитокиновый домен начинается с S или G (N-конец), линкер заканчивается до такого S или G.

Необходимо отметить, что линкер (ii) и линкер (iv) не должны быть одной длины. С целью уменьшения потенциальной иммуногенности, может быть предпочтительно использовать более короткие линкеры. Кроме того, выяснилось, что более короткие линкеры дают одноцепочечные молекулы со сниженной тенденцией к образованию агрегатов. Тогда как линкеры, которые длиннее, чем таковые, описанные в настоящем описании, могут проявлять нежелательные свойства агрегации.

Если желательно, линкер может включать аспарагиновый остаток, который может образовывать гликозилатный сайт Asn-Xaa-Ser. В определенных вариантах осуществления изобретения один из линкеров, например, линкер (ii) или линкер (iv) включает сайт гликозилирования. В других вариантах осуществления изобретения оба линкера (iv) включают сайты гликозилирования. С целью увеличения растворимости белков sc TRAIL и/или с целью уменьшения потенциальной иммуногенности, может быть предпочтительно, чтобы линкер (ii) или линкер (iv) или оба включали сайт гликозилирования.

Предпочтительные линкерные последовательности выбирают из GSGSGSGS (SEQ ID NO: 3), GSGSGNGS (SEQ ID NO: 2), GGSGSGSG (SEQ ID N0: 4), GGSGSG (SEQ ID NO: 5), GGSG (SEQ ID NO: 6), GGSGNGSG (SEQ ID NO: 7), GGNGSGSG (SEQ ID NO: 8), GGNGSG (SEQ ID NO: 9), и GSGS (SEQ ID NO: 23).

В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления изобретения, линкерные последовательности каждая представляет собой GSGSGNGS в соответствии с SEQ ID NO: 2. Примеры линкерных последовательностей показаны в таблице 2.

Таблица 2: Примеры линкерных последовательностей

SEQ ID NO	Последовательность
2	GSGSGNGS
3	GSGSGSGS
4	GGSGSGSG
5	GGSGSG
6	GGSG
7	GGSGNGSG
8	GGNGSGSG
9	GGNGSG
22	GSGSGS
23	GSGS
24	GSG

Белок агонист рецептора TRAIL дополнительно включает домен Fc-фрагмента антитела, который может быть расположен на N-конце относительно первого домена TRAIL (i) и/или на C-конце относительно третьего домена TRAIL (v). Предпочтительно, домен Fc-фрагмента антитела включает или состоит из последовательности аминокислоты, как показано в SEQ ID NO: 10. Альтернативно, домен Fc-фрагмента включает или состоит из последовательности аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 17. Примеры доменов Fc-фрагмента показаны в таблице 3.

Таблица 3: Пример доменов Fc-фрагмента

SEQ ID NO	Последовательность
10	PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
17	PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Общее количество гликосайтов и индивидуальное положение углеводов в трех измерениях может влиять на стабильность in-vivo белков агонистов рецептора TRAIL. Кроме того, распознавание углеводов зависит от локальной плотности терминальных сахаридов, разветвления углеводного дерева и относительного положения углеводной основы.

Истощение CH2-домена углеводов необходимо с целью избегания Fc-рецептор-основанной сшивки in vivo и потенциальной токсичности в результате образования скоплений TRAIL-рецепторов. Кроме того, частично разрушенные углеводы уменьшают период полужизни белков агонистов рецепторов TRAIL in vivo посредством лектин-запускаемых механизмов. Вследствие уменьшения общего количества сайтов гликозилирования на молекуле полученное соединение является менее доступно для этих механизмов, что увеличивает период полужизни. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения общее количество гликосайтов на белках агонистах рецептора TRAIL по настоящему изобретению уменьшалось посредством истощения CH2-гликосайтов, приводя к образованию белков агонистов рецептора TRAIL, включающих N297S эквивалентные мутации (в соответствии с ЕС системой нумерации), создавая домены агликозил-CH2.

CH2-гликосайты, присутствующие на внутренней поверхности, обычно защищают субдомен от протеаз во время «открытого перехода Fc-конформации», когда петлевые межцепочечные дисульфидные связи уменьшены и ковалентные межцепочечные связи прерываются. Это позволяет осуществить CH2-диссоциацию и воздействие протеаз на внутреннюю площадь поверхности. Белки агонисты рецептора TRAIL, включающие N297S эквивалентную мутацию (в соответствии с ЕС системой нумерации), создавая агликозил-CH2, следовательно, является менее протеолитически стабильными, чем эквивалентные структуры с гликозилированием CH2 дикого типа. Это влияет на стабильность соединения при USP/DSP/хранении, когда присутствуют протеазы клеток хозяев и имеют длительный доступ к структуре. Соответственно, в определенных вариантах осуществления изобретения агонист рецептора TRAIL не имеет CH2-гликосайтов, но включает гликосайты в линкерных последовательностях каждой полипептидной цепи (например, GSGSGNGS в соответствии с SEQ ID NO: 2). В определенных примерных вариантах осуществления изобретения агонист рецептора TRAIL включает два гликосайта на полипептидной цепи, всего до четырех гликосайтов.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, домен Fc-фрагмента антитела сшит посредством петлевого линкерного элемента. Петлевой линкерный элемент имеет длину 10-30 аминокислот, в частности длину 15-25 аминокислот, например, 22 аминокислоты. Петлевой линкерный элемент предпочтительно включает петлеподобную последовательность иммуноглобулина, в настоящем описании называемую как ʺIg петлевой участокʺ. Термин ʺIg петлевой участокʺ обозначает любой полипептид, включающий последовательность аминокислот, которая разделяет идентичность последовательности или сходство с частью натуральной последовательности петлевого участка Ig, который включает цистеиновые остатки, дисульфидные связи которых связывают две тяжелых цепи иммуноглобулина.

Производные и аналоги петлевого участка могут быть получены путем мутаций. Производное или аналог, как указано в настоящем описании, представляют собой полипептид, включающий последовательность аминокислот, которая разделяет идентичность последовательности или сходство с полнодлинновой последовательностью дикого типа (или натурального белка) за исключением того, что она имеет одно или более различий в последовательности аминокислот, обусловленных делецией, вставкой и/или заменой. В соответствии с настоящим изобретением, однако, термин ʺпетлевой линкерʺ не ограничен линкерами, включающими петлевой участок Ig или его производное, но допускают любые линкеры, достаточно длинные для возможности прикрепления доменов, прикрепленных посредством петлевого линкерного элемента для сохранения биологически активной конформации.

Количество молекул с открытой Fc-конформацией в отдельном белке агонисте рецептора TRAIL зависит от количества межцепочечных дисульфидных связей, присутствующих в петлевом участке. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения третий цистеин вносили в петлевой регион белков агонистов рецептора TRAIL по настоящему изобретению с целью облегчения эффекта истощения CH2-гликосайтов.

Кроме того, белки агонисты рецептора TRAIL по изобретению дополнительно включают мутацию верхнепетлевого лизина в глицин для уменьшения протеолитической обработки в этом сайте.

Особенно предпочтительный петлевой линкерный элемент включает или состоит из последовательности аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 11 (Таблица 4).

Белок агонист рецептора TRAIL может дополнительно включать N-концевой сигнальный пептидный домен, который позволяет обработку, например, внеклеточную секрецию, в подходящей клетке хозяине. Предпочтительно, N-концевой сигнальный пептидный домен включает сайт расщепления протеазой, например, сайт расщепления сигнальной пептидазой и, следовательно, может быть удален после или во время экспрессии для получения зрелого белка. Особенно предпочтительный N-концевой сигнальный пептидный домен включает последовательность аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 12 (таблица 4).

Кроме того, белок агонист рецептора TRAIL может дополнительно включать C-концевой элемент, имеющий длину, например, 1-50, предпочтительно 10-30 аминокислот, которые могут включать или соединяться с доменом распознавания/очистки например, FLAG доменом, Strep-меткой или Strep-меткой II доменом и/или поли-His доменом. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществлением изобретения сшитый белок включает Strep-метку, сшитую с C-концом посредством короткого серинового линкера, как показано в SEQ ID NO: 13 (таблица 4).

Примерный петлевой линкерный элемент, домен N-концевого сигнального пептида и короткий сериновый линкер показаны в таблице 4.

Таблица 4: Примерные домены и линкеры

SEQ ID NO	Последовательность
11	GPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPC
12	METDTLLVFVLLVWVPAGNG
13	SSSSSSAWSHPQFEK
25	GPGSSSSSSGSCDKTHTCPPC

В соответствии с определенным предпочтительным вариантом осуществления изобретения, сшитый полипептид включает три растворимых домена TRAIL, сшитых элементами пептидных линкеров SEQ ID NO: 2. Первый растворимый домен TRAIL (i) состоит из аминокислот 120-281 человеческого TRAIL по SEQ ID NO: 1 и растворимые домены TRAIL (iii) и (v) состоят из аминокислот 121-281 человеческого TRAIL по SEQ ID NO: 1. Кроме того, сшитый полипептид включает домен Fc-фрагмента антитела по SEQ ID NO: 10, который является сшитым с растворимым доменом TRAIL (v) с С-концом посредством петлевого линкера по SEQ ID NO: 11. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что такой определенный сшитый полипептид обеспечивает улучшенную биологическую активность и является особенно стабильным. Последовательность аминокислот примерного варианта осуществления белка агониста рецептора TRAIL по изобретению указана в SEQ ID NO: 19.

Кроме того, сшитый полипептид может включать N-концевой домен сигнального пептида, например, по SEQ ID NO: 12. Специфические примеры белка агониста рецептора TRAIL по изобретению показаны в SEQ ID NO: 14.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения сшитый белок может дополнительно включать C-концевую метку, которая сшита с полипептидом по изобретению посредством короткого серинового линкера, как показано в SEQ ID NO: 13. В соответствии с указанным аспектом настоящего изобретения Fc-фрагмент предпочтительно состоит из последовательности аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 10 или 17. Кроме того, Fc-фрагмент может состоять из более короткого Fc-фрагмента, например, включающего аминокислоты 1-217 SEQ ID NO: 10. Особенно предпочтительные примеры сшитых полипептидов, включающие C-концевую Strep-метку, показаны в SEQ ID NO: 15 и 18.

Примерные белки агонисты рецептора TRAIL, как показано в SEQ ID NO: 14, 15 и 18, каждый включает N-концевой домен сигнального пептида. Домен сигнального пептида включает аминокислоты 1-20. В каждом случае зрелый белок начинается с аминокислоты 21. Зрелые примерные белки агонисты рецепторов TRAIL по настоящему изобретению указаны в SEQ ID NO: 19, 20, 21, 26, 27, 28, 29, и 30. Примерные белки агонисты рецептора TRAIL, описанные выше, показаны в таблице 5.

Агонист рецептора TRAIL, как указано в SEQ ID NO: 19, имеет уменьшенное общее количество сайтов гликозилирования (N297S мутация в CH2 участке, обеспечивающем агликозилированный CH2 домен), увеличенное количество межцепочечных дисульфидных связей в петлевом участке, и мутацию верхнепетлевого лизина в глицин. Такие изменения обеспечивают уменьшение потенциальной деградации и образования скоплений рецептора TRAIL (вместе с сопутствующей токсичностью) при увеличении периода полужизни молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения N-концевой глютамин модифицируют в пироглютамат (Liu et al. 2011, J. Biol. Chem. 286:11211-11217).

Таблица 5: Примерные белки агонисты рецептора TRAIL

SEQ ID NO	Последовательность
14	METDTLLVFVLLVWVPAGNGQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15	METDTLLVFVLLVWVPAGNGQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSSSSSAWSHPQFEK
18	METDTLLVFVLLVWVPAGNGQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
19	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
20	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSSSSSAWSHPQFEK
21	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
26	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSGSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSSSSSAWSHPQFEK
27	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSSSSSAWSHPQFEK
28	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSSSSSAWSHPQFEK
29	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGNGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
30	QRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGSGSGSRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGGPGSSSSSSSGSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белок агонист рецептора TRAIL, как описано в настоящем описании. Молекулой нуклеиновой кислоты может быть молекула ДНК, например, двухцепочечная или одноцепочечная молекула ДНК, или молекула РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может кодировать белок агонист рецептора TRAIL или его предшественник, например, про- или пре-проформу белка агониста рецептора TRAIL, который может включать сигнальную последовательность или другие гетерологичные части аминокислот для секреции или очистки, которые предпочтительно располагаются на N- и/или C-конце белка агониста рецептора TRAIL. Гетерологичные части аминокислот могут быть связаны с первым и/или вторым доменом посредством сайта расщепления протеазой, например, фактора X3, тромбина или сайта расщепления IgA протеазой. Специфический пример последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению показан в таблице 6, как SEQ ID NO: 16. Указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует сшитый полипептид SEQ ID NO: 14.

Таблица 6: Последовательность нуклеиновой кислоты примерного белка агониста рецептора TRAIL

SEQ ID NO

Последовательность

16

gatatcggtaccgccaccatggaaaccgacaccctgctggtgttcgtgctgctcgtgtgggtgccagccggcaatggacagagagtggccgctcatatcaccggcacccggggcagatctaacaccctgtccagccccaactccaagaacgagaaggccctgggccggaagatcaactcctgggagtcctccagatccggccactcctttctgtccaacctgcacctgagaaacggcgagctggtcatccacgagaagggcttctactacatctactcccagacctacttcaggtttcaggaagagatcaaagagaacacaaagaacgacaagcagatggtgcagtatatctacaagtacacctcctaccccgaccccatcctgctgatgaagtccgcccggaactcctgctggtccaaggatgctgagtacggcctgtacagcatctaccagggcggcatcttcgagctgaaagagaacgaccggatcttcgtgtccgtgaccaacgagcacctgatcgacatggaccacgaggccagctttttcggcgcctttctcgtgggcggatccggaagcggaaacggcagtagagtggctgcccacattaccggaaccagaggccggtccaacaccctgagcagccctaacagcaaaaatgagaaagctctcgggcgcaagatcaacagctgggaatctagcagaagcggccacagctttctgagcaatctgcatctgcggaacggcgaactcgtgattcatgagaaggggttttattatatctatagccagacatactttcgattccaggaggaaatcaaggaaaacaccaaaaatgataaacagatggtccagtacatttataagtataccagctaccctgatcctatcctcctcatgaagtctgccagaaactcttgttggagcaaggacgccgagtatggactgtactctatctatcagggggggatctttgaactcaaagaaaacgatcgcatctttgtcagcgtcaccaatgagcatctcattgatatggatcatgaagctagtttcttcggggcattcctcgtgggaggctccggctctggcaacggatctagagtcgccgcacacatcacagggaccagaggcagaagcaataccctgtcctccccaaatagtaaaaacgaaaaggcactcggccgcaaaattaattcctgggagagcagcagatccgggcacagttttctgtctaatctccatctgaggaatggggagctggtgattcacgaaaaaggattttactacatttacagtcagacttactttcgttttcaggaagagattaaggaaaataccaaaaacgacaagcagatggtccagtacatctataaatacacctcttatcctgacccaattctgctcatgaagagtgcccgcaacagctgctggtctaaagacgccgaatacgggctgtattccatttaccaggggggaatttttgagctgaaggaaaatgatcggatttttgtctctgtcacaaacgaacacctcatcgatatggatcacgaagcctctttctttggcgccttcctggtcggaggccctggctcgagttccagctcctcttctggctcctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccctgaactgctgggcggaccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtctcacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtactcctccacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagccgggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtcaagggcttttacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggcaaatgatagaagcttgatatc

Молекула нуклеиновой кислоты может быть гибко связана с последовательностью, контролирующей экспрессию, например, последовательностью, контролирующей экспрессию, которая позволяет экспрессировать молекулу нуклеиновой кислоты в желаемой клетке хозяине. Молекула нуклеиновой кислоты может быть расположена на векторе, например, плазмиде, бактериофаге, вирусном векторе, хромосомном интеграционном векторе и др. Примеры подходящих последовательностей, контролирующих экспрессию, описаны, например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, and Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons или в его более поздних изданиях.

Различные системы векторов экспрессии/клеток хозяев могут быть использованы для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белки агониста рецептора TRAIL по настоящему изобретению. Подходящие клетки хозяева включают, без ограничения, клетки прокариот, такие как бактерии, например, E.coli, клетки хозяева эукариот, такие как клетки дрожжей, клетки насекомых, растительные клетки или животные клетки, предпочтительно клетки млекопитающих, более предпочтительно, человеческие клетки. Кроме того, изобретение относится к нечеловеческому организму, трансформированному или трансфицированному молекулой нуклеиновой кислоты, как описано выше. Такие трансгенные организмы могут быть получены известными методами генетического переноса, включая гомологичную рекомбинацию.

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической или диагностической композиции, включающей в качестве активного ингредиента по меньшей мере один белок агонист рецептора TRAIL, соответствующую нуклеиновую кислоту, кодирующую его, или трансформированную или трансфицированную клетку, все как описано в настоящем описании.

Термин ʺTRAIL-ассоциированное заболевание или расстройствоʺ, как используется в настоящем описании, представляет собой любое заболевание или расстройство, которое может быть облегчено путем добавления агониста рецептора TRAIL. По меньшей мере один белок агонист рецептора TRAIL, соответствующая нуклеиновая кислота, кодирующая, его, или трансформированная или трансфицированная клетка, все как описано в настоящем описании, могут быть использованы в терапии, например, в профилактике и/или лечении расстройств, вызванных посредством, ассоциированных с и/или сопровождаемых дисфункцией TRAIL, в частности пролиферативных расстройств, таких как опухоли, например, солидные или лимфатические опухоли; инфекционных заболеваний; воспалительных заболеваний; метаболических заболеваний; аутоиммунных расстройств, например, ревматоидных и/или артритических заболеваний; дегенеративных заболеваний, например, нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз; апоптоз-ассоциированных заболеваний или отторжения трансплантата.

Термин "дисфункция TRAIL", как используется в настоящем описании, понимают как любую функцию или экспрессию TRAIL, которая получается в результате нормальной функции или экспрессии TRAIL, например, избыточная экспрессия гена или белка TRAIL, сниженной или отмененной экспрессии гена или белка TRAIL по сравнению с нормальным физиологическим уровнем экспрессии TRAIL, увеличенная активность TRAIL, сниженная или отмененная активность TRAIL, увеличенное связывание TRAIL с любыми связывающими партнерами, например, с рецептором, особенно рецептором TRAIL, или другой цитокиновой молекулой, сниженным или отмененным связыванием с любым связывающим партнером, например, с рецептором, особенно TRAIL рецептором или другой цитокиновой молекулой, по сравнению с нормальной физиологической активностью или связыванием TRAIL.

В различных вариантах осуществления изобретения обеспечивают способ диагностики и/или лечения человека, страдающего от расстройства, которое может быть диагностировано и/или излечено путем нацеливания на TRAIL рецепторы, включающий введение человеку белка агониста рецептора TRAIL, описанного в настоящем описании, такого что эффект в отношении активности мишени, или мишеней, который достигают у человека является агонистическим, один или более симптомов облегчаются, и/или излечиваются. Белки агонисты рецептора TRAIL, обеспечиваемые в настоящем описании, могут быть использованы для диагностики и/или лечения людей, страдающих от первичного и метастатического рака, включая карциномы молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, легкого (например, мелкоклеточный рак легкого "SCLC" и немелкоклеточный рак легкого "NSCLC"), ротоглотки, гортаноглотки, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкой кишки, мочевых путей (включая почки, мочевой пузырь и уротелий), женских половых путей (включая шейку матки, матку и яичники, а также хориокарциному и гестационное трофобластическое заболевание), мужского полового тракта (включая предстательную железу, семенные пузырьки, яички и опухоли половых клеток), эндокринных желез (включая щитовидную железу, надпочечники и гипофиз), и кожи, а также гемангиомы, меланомы, саркомы (включая таковые, происходящие из костей и мягких тканей, а также саркому Капоши), опухоли головного мозга, нервов, глаз и оболочек (включая астроцитомы, глиомы, глиобластомы, ретинобластомы, невромы, нейтробластомы, шванномы и менингиомы), опухоли, развивающиеся из гематопоэтических злокачественных новообразований, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелолейкоз (AML), B клеточную лимфому, лимфому Беркитта, хронический миелолейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), волосатоклеточный лейкоз, Ходжкинскую и не-Ходжкинскую лимфому, DLBCL, фолликулярные лимфомы, гематопоэтические злокачественные новообразования, саркому Капоши, злокачественную лимфому, злокачественный гистиоцитоз, злокачественную меланому, множественную миелому, паранеопластический синдром/гиперкальциемию злокачественных новообразований или солидные опухоли.

Обеспечивают фармацевтическую композицию, включающую белок агонист рецептора TRAIL, описанный в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент для лечения расстройства. Например, дополнительным агентом может быть терапевтический агент, химиотерапевтический агент; агент для визуализации, цитотоксический агент, ингибитор ангиогенеза, ингибитор киназы (включая, без ограничения, ингибитор KDR и TIE-2), ко-стимулирующий модулятор молекул или ингибитор иммунных контрольных точек (включая, без ограничения анти-B7.1, анти-B7.2, анти-B7.3, aнти-B7.4, анти-CD28, анти-B7RP1, CTLA4-Ig, анти-CTLA-4, анти-PD-1, анти-PD-L1, анти-PD-L2, анти-ICOS, анти-LAG-3, анти-Tim3, анти-VISTA, анти-HVEM, анти-BTLA, LIGHT сшитый белок, анти-CD137, анти-CD137L, анти-OX40, анти-OX40L, анти-CD70, анти-CD27, анти-GAL9, анти-A2AR, анти-KIR, анти-IDO-1, анти-CD20), модулятор дендритных клеток/антиген-представляющих клеток (включая, без ограничения, анти-CD40 антитело, анти-CD40 L, анти-DC-SIGN, анти-Dectin-1, анти-CD301, анти-CD303, анти-CD123, анти-CD207, анти-DNGR1, анти-CD205, анти-DCIR, анти-CD206, анти-ILT7), модулятор Toll-подобных рецепторов (включая, без ограничения анти-TLR-1, анти-TLR-2, анти-TLR-3, анти-TLR-4, анти-TLR-4, анти-TLR-5, анти-TLR-6, анти-TLR-7, анти-TLR-8, анти-TLR-9), блокатор молекул адгезии (включая, без ограничения анти-LFA-1 антитело, анти-E/L селектин антитело, низкомолекулярный ингибитор), анти-цитокиновые антитела или их фрагменты (включая, без ограничения, анти-IL-18, анти-TNF, или антитело к IL-6/цитокиновому рецептору), биспецифическая перенаправленная цитотоксичность T клеток или NK клеток (включая, без ограничения BiTE®), терапию на основе химерного T клеточного рецептора (CAR-T), терапию на основе T клеточного рецептора (TCR), терапевтическую противораковую вакцину, метотрексат, циклоспорин, рапамицин, FK506, определяемую метку или репортер, антагонист TNF, анти-ревматоидные, мышечные релаксанты, наркотики, нестероидные противовоспалительные средства (NSAID), обезболивающие, анестетики, седативные, местные анестетики, нейромышечные блокаторы, антимикробные, антипсориатические, кортикостероиды, анаболические стероиды, эритропоэтин, иммунные препараты, иммуноглобулин, иммуносупрессивную терапию, гормон роста, заместительную гормональную терапию, радиофармпрепараты, антидепрессанты, антипсихотические средства, стимуляторы, препараты от астмы, бета агонисты, ингаляционные стероиды, эпинефрин или аналог, цитокин или антагонист цитокина.

В одном варианте осуществления изобретения в способе лечения рака или в профилактике или ингибировании метастазирования опухолей, описанных в настоящем описании, белок(ки) агонисты рецептора TRAIL могут быть использованы отдельно или в комбинации с одним или более дополнительными агентами, например, химиотерапевтическими, радиотерапевтическими или биологическими агентами. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент может включать следующее: 13-цис-ретиноевую кислоту; 2-CdA; 2-хлордеоксиаденозин; 5-азацитидин; 5-фторурацил; 5-FU; 6-меркаптопурин; 6-MP; 6-TG; 6-тиогуанин; абраксан; Аккутан®; Актиномицин-D; Адриамицин®; Адруцил®; Афинитор®; Агрилин®; Ала-Корт®; Альдезлейкин; Алемтузумаб; ALIMTA; Алитретиноинn; Алкабан-AQ®; Алкеран®; AII-трансретиноевую кислоту; альфа интерферон; Алтретамин; Аметоптерин; Амифостин; Аминоглютетимид; Анагрелид; Анандрон®; Анастрозол; Арабинозилцитозин; Ара-C Аранесп®; Аредиа®; Аримидекс®; Аромазин®; Арранон®; Триоксид мышьяка; Арцерра™; Аспарагиназа; ATRA; Авастин®; Азацитидин; БЦЖ; BCNU; Бендамустин; Бевацизумаб; Бексаротен; BEXXAR®; Бикалютамид; BiCNU; Бленоксан®; Блеомицин; Бортезомиб; Бусульфан; Бусульфлекс®; C225; Лейковорин кальция; Кампат®; Камптозар®; Камптотецин-11; Капецитабин Carac™; Карбоплатин; Кармустин; Кармустин Wafer; Казодекс®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Церубидин®; Цетуксимаб; Хлорамбуцил; Цисплатин; Цитроворум фактор; Кладрибин; Кортизон; Космеген®; CPT-11; Циклофосфамид; Цитадрен®; Цитарабин; Цитарабин липосомальный; Цитозар-U®; Цитоксан®; Дакарбазин; Дакоген; Дактиномицин; Дарбэпоэтин альфа; Дазатиниб; Дауномицин; Даунорубицин; Даунорубицина гидрохлорид; Даунорубицин липосомальный; ДауноКсом®; Декадрон; Децитабин; Дельта-Кортеф®; Дельтазон®; Денилейкин; Дифтитокс; ДепоЦит™; Дексаметазон; Дексаметазона ацетат; фосфат дексаметазона натрия; Дексазон; Дексазоксан; DHAD; DIC; Диодекс; Доцетаксел; Доксил®; Доксорубицин; Доксорубицин липосомальный; Дроксиа™; DTIC; DTIC-Dome®; Дуралон®; Дувелисиб; Эфудекс®; Элигард™; Элленс™; Элоксатин™; Элспар®; Эмцит®; Эпирубицин; Эпоэтин альфа; Эрбитукс; Эрлотиниб; Эрвиния L-аспарагиназа; Эстрамустин; Этиол Этопофос®; Этопозид; Этопозида фосфат; Эулексин®; Эверолимус; Эвиста®; Экземестан; Фарестон®; Фазлодекс®; Фемара®; Филграстим; Флоксуридин; Флудара®; Флударабин; Флуроплекс®; Фторурацил; Фторурацил (крем); Флуоксиместерон; Флутамид; Фолиновая кислота; FUDR®; Фулвестрант; Гефитиниб; Гемцитабин; Гемтузумаб озогамицин; Гемзар; Гливек™; Глиадел® Wafer; GM-CSF; Гозерелин; Гранулоцит-колоний-стимулирующий фактор (G-CSF); гранулоцитарно-макрофагальный колоний-стимулирующий фактор (G-MCSF); Галотестин®; Герцептин®; Гексадрол; Гексален®; Гексаметилмеламин; HMM; Гикамтин®; Гидреа®; Гидрокорт ацетат®; Гидрокортизон; Гидрокортизона натрия фосфат; Гидрокортизона натрия сукцинат; Гидрокортона фосфат; Гидроксимочевина; Ибрутиниб; Ибритумомаб; Ибритумомаб Тиуксетан; Идамицин®; Идарубицин Ifex®; Интерферон-альфа; Интерферон-альфа-2b (PEG конъюгат); Ифосфамид; Интерлейкин-11 (IL-11); Интерлейкин-2 (IL-2); Иматиниб мезилат; Имидазола карбоксамид; Интрон A®; ипилимумаб, Иресса®; Иринотекан; Изотретиноин; Иксабепилон; Иксемпра™; КАДСИЛА®; Кидролаза (t) Ланакорт®; Лапатиниб; L-аспарагиназа; LCR; Леналидомид; Летрозол; Лейковорин; Лейкеран; Лейкин™; Лейпролид; Лейрокристин; Лейстатин™; Лирилумаб; Липосомальный Ara-C; Жидкий Pred®; Ломустин; L-PAM; L-сарколизин; Люпрон®; Люпрон депо®; Матулан®; Максидекс; Мехлоретамин; Мехлорэтамина гидрохлорид; Медралон®; Медрол®; Мегасе®; Мегестрол; Мегестрола ацетат; MEK ингибиторы; мелфалан; меркаптопурин; Месна; Меснекс™; Метотрексат; Метотрексат натрия; Метилпреднизолон; Метикортен®; Митомицин; Митомицин-C; Митоксантрон M-Преднизол®; MTC; MTX; Мустарген®; Мустин; Мутамицин®; Милеран®; Милоцел™; Милотарг®; Навитоклакс; Навельбин®; Неларабин; Неосар®; Ньюласта™; Ньюмега®; Нейпоген®; Нексавар®; Ниландрон®; Нилотиниб; Нилутамид; Нипент®; азотистый иприт Новальдекс®; Ниволумаб; Новантрон®; Nplate; Октреотид; Октреотида ацетат; Офатумумаб; Онкоспар®; Онковин®; Онтак®; Онксал™; Опрелвекин; Орапред®; Орасон®; Оксалиплатин; Паклитаксел; Паклитаксел белок-связанный; Памидронат; Панитумумаб; Панретин®; Параплатин®; Пазопаниб; Педиапред®; PEG интерферон; Пегаспаргаза; Пегфилграстим; PEG-ИНТРОН™; PEG-L-аспарагиназа; ПЕМЕТРЕКСЕД; Пембролизумаб; Пентостатин; Пертузумаб; Фенилаланин горечь; Пидилизумаб; Платинол®; Платинол-AQ®; Преднизолон; Преднизон; Прелон®; Прокарбазин; ПРОКРИТ®; Пролейкин®; Пролифероспан 20 с кармустиновым имплантом; Пуринетол®; ингибиторы BRAF; Ралоксифен; Ревлимид®; Ревматрекс®; Ритуксан®; Ритуксимаб; Роферон-A®; Ромиплостим; Рубекс®; Рубидомицина гидрохлорид; Сандостатин®; Сандостатин ЛАР®; Сарграмостим; Солу-Кортеф®; Солу-Медрол®; Сорафениб; SPRYCEL™; STI-571; STIVAGRA™, Стрептозоцин; SU11248; Сунитиниб; Сутент®; Тамоксифен Тарцева®; Таргретин®; Тасинья®; Таксол®; Таксотер®; Темодар®; Темозоломид Темсиролимус; Тенипозид; ТЕСПА; Талидомид; Таломид®; ТераЦис®; Тиогуанин; Тиогуанин Таблоид®; Тиофосфамид; Тиоплекс®; Тиотепа; TICE®; Топозар®; Топотекан; Торемифен; Торисел®; Тозитумомаб; Трастузумаб; Треанда®; Тремелимумаб; Третиноин; Трексолл™; Трисенокс®; TSPA; ТАЙКЕРБ®; Урелимаб; VCR; Вектибикс™; Велбан®; Велкейд®; Венетоклакс; ВеПесид®; Весаноид®; Виадур™; Видаза®; Винбластин; Винбластин сульфат; Винказар Pfs®; Винкристин; Винорелбин; Винорелбин тартрат; VLB; VM-26; Вориностат; Вотриент; VP-16; Вумон®; Кселода®; Занозар®; Зевалин™; Зинекард®; Золадекс®; Золендрованная кислота; Золинза; или Зомета®, и/или любой другой агент, специфически не перечисленный в настоящем описании, который нацелен на сходные пути.

Когда используют два или более веществ или компонентов, как часть комбинированной схемы лечения, их можно вводить посредством одного пути введения или посредством различных путей введения, по существу в одно и то же время или в различные моменты времени (например, по существу одновременно, последовательно или в соответствии с попеременным режимом). Когда вещества или компоненты вводят одновременно или посредством одного и того же пути введения, их можно вводить в виде различных фармацевтических рецептур или композиций или части комбинированной рецептуры или композиции, как очевидно специалисту.

Также, когда два или более активных веществ или компонентов необходимо использовать как часть комбинированной схемы лечения, каждое из веществ или компонентов можно вводить в одном количестве и в соответствии с той же схемой, как используется, когда соединение или компонент используют самостоятельно, и такое комбинированное применение может приводить или может не приводить к синергическому эффекту. Однако, когда комбинированное применение двух или более веществ или компонентов приводит к синергическому эффекту, также может быть возможно уменьшать количество одного, более чем одного или всех веществ или компонентов, которые вводят, при этом все еще достигая желаемого терапевтического действия. Это может, например, быть применимым для избегания, ограничения или уменьшения любых нежелательных побочных эффектов, которые ассоциированы с применением одного или более веществ или компонентов, когда их используют в их обычных количествах, при этом все еще получая желаемый фармацевтический или терапевтический эффект.

Эффективность схемы лечения по изобретению может быть определена и/или отслежена любым способом, известным как таковой, для определенного заболевания или расстройства, как очевидно врачу. Врач также способен, когда необходимо, индивидуально изменять или модифицировать определенную схему лечения, так чтобы достичь желаемого терапевтического эффекта, чтобы избежать, ограничить или уменьшить нежелательные побочные эффекты, и/или чтобы достичь соответствующего баланса между достижением желаемого терапевтического эффекта с одной стороны и избеганием, ограничением или уменьшением нежелательных побочных эффектов с другой стороны.

Обычно, схеме лечения можно следовать до достижения желаемого терапевтического эффекта и/или пока желаемый терапевтический эффект необходимо поддерживать. Также это может быть определено врачом.

В различных вариантах осуществления изобретения в настоящем описании обеспечивают фармацевтические композиции, включающие один или более белков агонистов рецептора TRAIL, или отдельно или в комбинации с профилактическими средствами, терапевтическими средствами и/или фармацевтически приемлемыми носителями. В различных вариантах осуществления изобретения, неограничивающие примеры применения фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании, включают диагностику, определение и/или мониторинг расстройства, профилактику, лечение, ведение и/или облегчение расстройства или одного или более его симптомов и/или в исследованиях. Рецептуры фармацевтических композиций, или отдельно или в комбинации с профилактическими средствами, терапевтическими средствами, и/или фармацевтически приемлемыми носителями, известны специалисту в области техники (патентная публикация США No. 20090311253 A1).

В различных вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция может включать одну или более аминокислот, один или более полисахаридов и/или полисорбатов, и белок агонист рецептора TRAIL присутствует в концентрации от около 0,1 до 100 мг/мл, включая конечные точки (например, 0,1-10, 1-10,,01-50, 1-50, 1-100, 10-100, 25-100, 25-50, или 50-100 мг/мл), где композиция имеет pH от около 5,0 до 7,0, включая конечные точки (например, pH около 5,0-6,0, 5,5-6,0, 5,0-6,5, 5,5-6,5, или 6,0-7,0). В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна аминокислота в композиции является гистидином и присутствует в концентрации около 10-20 мM, 10-15 мM, 15-20 мM, или около 15 мM. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один полисахарид в композиции представляет собой сахарозу и присутствует в концентрации около 0-8,0% масса/объем (масс/об). В одном варианте осуществления изобретения полисорбатом в композиции является полисорбат 80 и он находится в концентрации около 0-0,06% масс/об. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна аминокислота в композиции представляет собой аргинин и присутствует в концентрации около 0-1,5% масс/об (например, 0,5-1,5, 1,0-1,5, или 0,5-1,0 масс/об). В одном варианте осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL присутствует в композиции в концентрации около 0,1-100 мг/мл, (например, около 1-100 мг/мл, или около 1-15 мг/мл, или около 1-7,5 мг/мл, или около 2,5-7,5 мг/мл, или около 5-7,5 мг/мл, или около 25-100 мг/мл, или около 20-60 мг/мл, или около 25-50 мг/мл, или около 25 мг/мл, или около 50 мг/мл, или около 0,1-60 мг/мл, или около 0,1-25 мг/мл, или около 1,0-60 мг/мл, или около 0,5-60 мг/мл, или около 0,1-2,0 мг/мл, или около 0,5-2,0 мг/мл, или около 1-5 мг/мл, или около 1-7,5 мг/мл, или около 1-15 мг/мл, или около 0,5 мг/мл, или около 1,0 мг/мл).

Как используется в настоящем описании, фраза "эффективное количество" обозначает количество белка агониста рецептора TRAIL, которое приводит к заметному улучшению (например, по меньшей мере около 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или более от исходного) одного или более параметров, ассоциированных с дисфункцией TRAIL, или с TRAIL-ассоциированным заболеванием или расстройством.

В различных вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция является водной композицией, лиофилизированной композицией или лиофилизированной и регидратированной композицией. В одном варианте осуществления изобретения гидратационным раствором является декстроза и/или солевой раствор (например, декстроза в концентрации около 5% масс/об и/или солевой раствор в концентрации около 0,9% масс/об). В одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает около 15 мM гистидина, около 0,03% (масс/об) полисорбата 80, около 4% (масс/об) сахарозы, и около 0,1-25 мг/мл белка агониста рецептора TRAIL, или около 1-15 мг/мл белка агониста рецептора TRAIL, и имеет pH около 6. В одном варианте осуществления изобретения композиция дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный агент.

В различных вариантах осуществления изобретения используют композицию, содержащую 25 мг/мл белка агониста рецептора TRAIL, около 15 мM гистидина, 0,03% полисорбата 80 (массы/объема, масс/об), 4,0% сахарозы (масс/об), и pH около 6,0. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция не включает аргинин. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция проявляет неожиданно улучшенную стабильность при замораживании-оттаивании, стабильность жидкой композиции и/или стабильность лиофилизированной композиции по сравнению с другими композициями, включающими другие компоненты или концентрации.

Способы введения терапевтического средства, обеспечиваемые в настоящем описании, включают, без ограничения, пероральное введение, парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, введение в опухоль, введение на слизистые (например, интраназальный и пероральный пути) и легочное введение (например, аэрозольные соединения, вводимые с помощью ингалятора или небулайзера). Рецептура фармацевтических композиций для специфических путей введения, или материалы и методики, необходимые для различных методов введения, доступны и известны специалисту в области техники (патентная публикация США No. 20090311253 A1).

В различных вариантах осуществления изобретения, схемы лечения могут быть отрегулированы для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно вводить единственный болюс, несколько отдельных доз можно вводить в течение времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, что диктуется потребностями терапевтической ситуации. В некоторых вариантах осуществления изобретения парентеральные композиции рецептируют в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозировки. Термин ʺстандартная лекарственная формаʺ относится к физически отдельным единицам, используемым как однократные дозировки для млекопитающих, которых лечат; каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем.

Примерный, неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества белка агониста рецептора TRAIL, обеспечиваемый в настоящем описании, составляет около 0,1-100 мг/кг, (например, около 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-15, 1-7,5, 1,25-15, 1,25-7,5, 2,5-7,5, 2,5-15, 5-15, 5-7,5, 1-20, 1-50, 7-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, или 10-100 мг/кг, или любая концентрация между). В некоторых вариантах осуществления изобретения белок агонист рецептора TRAIL присутствует в фармацевтической композиции в терапевтически эффективной концентрации, например, концентрации около 0,1-100 мг/мл (например, около 0,1-0,5, 0,1-1, 0,1-10, 0,1-20, 0,1-50, 0,1-75, 1-10, 1-20, 1-50, 1-75, 1-100, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-50, 5-75, 10-20, 10-50, 10-75, или 10-100 мг/мл, или любая концентрация между). Обратите внимание, что значения дозировки могут варьироваться в зависимости от типа и/или тяжести состояния, которое облегчают. Необходимо понимать, что для любого определенного пациента специфические схемы лечения могут быть изменены с течением времени в соответствии с индивидуальными требованиями и/или профессиональным мнением лица, вводящего или наблюдающего за введением композиций, и что диапазон дозировок, указанный в настоящем описании, является только примерным и не предназначен для ограничения диапазона и применения заявленной композиции.

Примеры

1. Получение белка агониста рецептора TRAIL (sc TRAIL wt)

1.1 Структура полипептида

A) Аминокислоты Met1-Gly20

Ig-каппа-сигнальный пептид, предположительный сигнальный сайт расщепления пептидазой после аминокислоты Gly 20.

B) Аминокислоты Gln21-Gly182

Первый растворимый цитокиновый домен человеческого лиганда TRAIL (TRAIL, аминокислота 120-281 SEQ ID NO: 1).

C) аминокислоты Gly 183-Ser 190

Первый пептидный линкерный элемент SEQ ID NO: 2.

D) аминокислоты Arg191-Gly351

Второй растворимый цитокиновый домен лиганда человеческого TRAIL (TRAIL, аминокислоты 121-281 SEQ ID NO: 1).

E) Аминокислоты Gly352-Ser359.

Второй пептидный линкерный элемент SEQ ID NO: 2.

F) Аминокислоты Arg360-Gly520

Третий растворимый цитокиновый домен лиганда человеческого TRAIL (TRAIL, аминокислоты 121-281 SEQ ID NO: 1).

G) Аминокислоты Gly521-Cys542

Петлевой линкерный элемент SEQ ID NO: 11.

H) Аминокислоты Pro543-Lys760

Домен Fc-фрагмента антитела SEQ ID NO: 10.

Вышеуказанный белок агонист рецептора TRAIL показан в SEQ ID NO: 14.

Указанные линкеры могут быть заменены другими предпочтительными линкерами, например, как показано в SEQ ID NO: 3-9.

Необходимо отметить, что первый и второй пептидные линкеры не должны быть идентичными.

Сигнальная пептидная последовательность (A) может быть заменена любой другой подходящей, например, сигнальной пептидной последовательностью млекопитающего.

1.2 Генная кассета, кодирующая полипептид

Синтетический ген может быть оптимизирован в свете использования его кодона для экспрессии в подходящей клетке хозяине, например, клетках насекомых или клетках млекопитающих. Предпочтительная последовательность нуклеиновой кислоты показана в SEQ ID NO: 16.

2. Экспрессия и очистка

Клонирование, экспрессия и очистка сшитых полипептидов.

Вышеупомянутые сшитые белки экспрессировались рекомбинантно в двух различных клетках хозяевах эукариот:

Для исходного анализа вышеупомянутых сшитых белков агонистов рецептора TRAIL, клетки Hek293T выращивали в DMEM+GlutaMAX (GibCo), дополненной 10% FBS, 100 единиц/мл Пенициллина и 100 мкг/мл Стрептомицина, транзиторно трансфицировали плазмидой, содержащей кассету экспрессии для сшитого полипептида и соответствующего селективного маркера, например, функциональную кассету экспрессии, включающую ген резистентности к бластицидину, пуромицину и гидромицину. В тех случаях, когда множество полипептидных цепей необходимо для получения конечного продукта, кассеты экспрессии или комбинируют на одной плазмиде или располагают на различных плазмидах во время трансфекции. Надосадочную жидкость культуры клеток, содержащую рекомбинантный сшитый белок, собирали через три дня после трансфекции и очищали центрифугированием при 300xg с последующей фильтрацией через стерильный фильтр 0,22 мкм.

Для более крупномасштабной экспрессии сшитых белков агонистов рецепторов TRAIL для использования in vivo, синтетические ДНК кассеты, кодирующие вышеупомянутые белки, вставляли в векторы экспрессии эукариот, включающие соответствующие маркеры селекции (например, функциональную кассету экспрессии, включающую ген резистентности к бластицидину, пуромицину или гигромицину) и генетические элементы, подходящие для увеличения количества транскрипционно активных сайтов вставки в геноме клетки хозяина. Векторы экспрессии с подтвержденной последовательностью вносили посредством электропорирования в суспензию адаптированных клеток яичника китайского хомяка (CHO-S, Invitrogen). Соответствующее давление выбора применяли через три дня после трансфекции в отношении трансфицированных клеток. Выжившие клетки, несущие полученный из вектора ген(ы) резистентности, восстанавливали путем последующего культивирования при давлении селекции. При стабильном росте выбранных клеточных пулов в химически определенной среде (PowerCHO2-CD, Lonza) при 37°С и атмосфере 7% CO2 в орбитальном инкубаторном шейкере (100 об/мин, 50 мм шейкерное расстояние), отдельные надосадочные жидкости анализировали посредством ELISA-анализа, определяющего вышеупомянутые белки, и клеточные пулы с наивысшей специфической продуктивностью размножали в встряхиваемой колбе для получения белка (орбитальный шейкер, 100 об/мин, шейкерное расстояние 50 мм).

Для продукции белка в лабораторном масштабе отдельные клеточные пулы культивировали в течение 7-12 дней в химически определенной среде (PowerCHO2-CD, Lonza) при 37°C и атмосфере 7% CO2 в волновом биореакторе 20/50 EHT (GE-Healthcare). Базальной средой была PowerCHO2-CD, дополненная 4 мМ Glutamax. Волновую культуру начинали с концентрации живых клеток от 0,3 до 0,4×10e6 клеток/мл и следующих условий (для пяти- или десятилитрового пакета): частота встряхивания 18 об/мин, угол встряхивания 7°, ток газа 0,2-0,3 л/мин, 7% CO2, 36,5°С. В рамках серии опытов клеточную культуру кормили дважды PowerFeed A (Lonza), обычно в день 2 (20% подкормки) и день 5 (30% подкормки). После второй подкормки частоту встряхивания увеличивали до 22 об/мин, а также угол встряхивания до 8°.

Содержимое биореактора обычно собирали на анализ между днем 7 и днем 12, когда выживаемость клеток падала ниже 80%. Сначала, надосадочную жидкость культур очищали с использованием системы ручной глубокой фильтрации (Millipore Millistak Pod, MC0HC 0,054 м²). Для Strep-меченных белков добавляли Авидин до конечной концентрации 0,5 мг/л. Наконец, надосадочную жидкость культур, содержащую сшитый белок агонист рецептора TRAIL, стерильно фильтровали с использованием фильтра на горлышко бутыли (0,22 мкм, PES, Corning) и хранили при 2-8°C до последующей обработки.

Для афинной очистки Streptactin Sepharose упаковывали в колонку (гелевая подушка 1 мл), уравновешивали 15 мл буфера W (100 мM Tris-HCl, 150 мM NaCl, pH 8,0) или PBS pH 7,4 и надосадочную жидкость культуры клеток наносили на колонку со скоростью тока 4 мл/мин. Впоследствии колонку промывали 15 мл буфера W и связанный полипептид пошагово элюировали путем добавления 7×1 мл буфера E (100 мM Tris HCl, 150 мM NaCl, 2,5 мM Дестиобиотина, pH 8,0). Альтернативно, на этой стадии может быть использован PBS pH 7,4, содержащий 2,5 мM дезтиобиотина.

Альтернативно методу, основанному на Streptactin Sepharose, афинную очистку проводили с использованием колонки с иммобилизованным протеином-A в качестве афинного лиганда и Akta хроматографической системы (GE-Healthcare). Выбирали твердофазный материал с высокой афинностью к FC-домену сшитого белка: MABSelect Sure^TM (GE Healthcare). Коротко, очищенную надосадочную жидкость культуры клеток нагружали на колонку HiTrap MabSelectSure (CV=5 мл), уравновешенную в промывочном буфере-1 (20 мM Pi, 95 мM NaCl, pH 7,2), не превосходя нагрузку 10 мг сшитого белка на мл колонки-подложки. Колонку промывали десятью объемами колонки (10CV) вышеупомянутого уравновешивающего буфера с последующими четырьмя объемами колонки (4CV) промывочного буфера-2 (20 мM Pi, 95 мM NaCl, pH 8,0) для истощения белка клетки хозяина и ДНК клетки хозяина. Колонку затем элюировали элюирующим буфером (20 мM Pi, 95 мM NaCl, pH 3,5) и элюат собирали до десяти фракций, каждая фракция имеет объем, равный объему колонки-подложки (5 мл). Каждую фракцию нейтрализовали равным объемом вышеупомянутого промывочного буфера-2. Линейную скорость устанавливали на 150 см/ч и поддерживали постоянной в течение вышеупомянутого анализа афинной хроматографии.

Количество белка фракций элюата оценивали количественно и пиковые фракции концентрировали ультрафильтрацией и дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией (SEC).

SEC проводили на колонках Superdex 200 10/300 GL или HiLoad 26/60 с использованием системы хроматографии Akta (GE-Healthcare). Колонки уравновешивали фосфатным буферным раствором и концентрировали, афинно очищенный полипептид загружали на колонку SEC с объемом образца, не превосходящим 2% (об/об) объема колонки. В случае колонок Superdex200 10/300 GL (GE Healthcare) применяли скорость тока 0,5 мл в минуту. В случае колонок HiLoad 26/60 Superdex200 применяли скорость тока 2,5 мл в минуту. Профиль элюции полипептида отслеживали по поглощению при 280 нм.

Для определения средней молекулярной массы очищенного сшитого полипептида в нативных условиях колонку Superdex 200 загружали стандартными белками с известной молекулярной массой. На основании объема элюции стандартных белков создавали калибровочную кривую и определяли среднюю молекулярную массу очищенного сшитого полипептида. FC-домен, включающий сшитые белки агонисты рецептора TRAIL, обычно элюировали из колонок Superdex200 со средней молекулярной массой гомодимера прибл. 160-180 кДа.

3. Анализ апоптоза

Клеточный анализ с перманентной Т-клеточной линией Jurkat A3 использовали для определения активности индукции апоптоза сшитыми белками агонистами рецептора TRAIL. Клетки Jurkat выращивали в колбах со средой RPMI 1640+GlutaMAX (GibCo), дополненной 10% FBS, 100 единиц/мл Пенициллина и 100 мкг/мл Стрептомицина. Перед анализом 100000 клеток сеяли на ячейку в 96-луночный планшет микротитратора. Добавление различных концентраций сшитых пептидов в ячейки отслеживали при 3 часовой инкубации при 37°C. Клетки лизировали путем добавления лизирующего буфера (250 мM HEPES, 50 мM MgCl2, 10 мM EGTA, 5% Triton-X-100, 100 мM DTT, 10 мM AEBSF, pH 7,5) и планшеты помещали на лед в течение от 30 минут до 2 часов. Апоптоз сопровождался повышенной активностью каспаз, например, Каспазы-3. Следовательно, отщепление специфического субстрата каспазы Ac DEVD-AFC (Biomol) использовали для определения выраженности апоптоза. Действительно, активность каспазы коррелирует с процентом апоптоидных клеток, определенным морфологически после окрашивания клеток йодидом пропидия и Hoechst-33342. Для анализа активности каспазы 20 мкл лизата клеток переносили в черный 96-луночный планшет микротитратора. После добавления 80 мкл буфера, содержащего 50 мM HEPES, 1% сахарозы, 0,1% CHAPS, 50 мкM Ac-DEVD-AFC, и 25 мM DTT, pH 7,5, планшет переносили в счетчик микропланшетов Tecan Infinite 500 и отслеживали увеличение интенсивности флуоресценции (длина волны возбуждения 400 нм, длина волны излучения 505 нм).

3.1 Анализ клеточной смерти

Для определения клеточной смерти в клетках фибросаркомы HT1080 15000 клеток сеяли в 96-луночные планшеты в течение ночи в среде RPM1 1640+GlutaMAX (GibCo), дополненной 10% FBS (Biochrom). Клетки совместно инкубировали с циклогексимидом (Sigma) в конечной концентрации 2,5 г/мл. Клеточную смерть оценивали количественно путем окрашивания буферным KV (0,5% кристаллический фиолетовый, 20% метанол). После окрашивания, ячейки промывали водой и сушили на воздухе. Краситель элюировали метанолом и оптическую плотность при 595 нм измеряли с помощью счетчика ELISA.

4. Исследование стабильности/агрегации

4.1 Принципы анализа агрегации (Определение растворимого белка)

Содержание мономеров (определенная тримерная композиция модулей, связывающих рецептор TRAIL) и агрегатов определяли аналитической SEC, как описано в примере 2. Для такой определенной цели анализ проводили в буферах, содержащих физиологические концентрации соли при физиологическом pH (например, 0,9% NaCl pH 7,4; PBS pH 7,4). Типичный анализ агрегации проводили на колонке Superdex200 (GE Healthcare). Указанная колонка отделяет белки в диапазоне от 10 до 800 кДа.

Для определения средней молекулярной массы очищенного сшитого полипептида в нативных условиях колонку Superdex 200 загружали стандартными белками известной молекулярной массы. На основании объема элюции стандартных белков строили калибровочную кривую и среднюю молекулярную массу очищенного сшитого полипептида рассчитывали на основании объема элюции.

SEC анализ растворимых, неагрегированных белков, например, тримерного TRAIL, обычно показывает отдельный пик единственного белка в определенном объеме элюции. Такой объем элюции соответствует средней нативной молекулярной массе определенного белка и приблизительно соответствует теоретической молекулярной массе, рассчитанной на основании первичной последовательности аминокислот.

Если развивается агрегация белка, анализ SEC показывает дополнительные пики белков с более низким удерживающим объемом. Для TRAIL агрегация растворимых белков развивается характерным образом. Белки имеют тенденцию к формированию олигомеров "тримеров", образуя нонамеры (3×3) и 27меры (3×9). Такие олигомеры служат как агрегационные основы и высокое содержание олигомеров потенциально приводит к агрегации белка. Олигомеры большой молекулярной массы и агрегаты элюируют в свободном объеме колонки Superdex200 и не могут быть проанализированы SEC в отношении их нативной молекулярной массы.

Из-за индукции (полной) агрегации очищенные препараты сшитых белков TRAIL-SF предпочтительно содержат только определенные тримерные белки и только очень низкое количество олигомеризированного белка. Степень агрегации/олигомеризации определенных препаратов белка TRAIL-SF определяют на основании анализа SEC путем расчета площадей пиков диаграммы OD280 для определенной тримерной и олигомерной/агрегированной фракции, соответственно. На основании общей площади пика процент определенного тримерного белка рассчитывали, как указано далее:

(% содержания тримера=[площадь пика тримера]/[общая площадь пика] x 100)

Определение растворимого белка, как используется в настоящем тексте, описывает получение белка очищенного TRAIL в буфере с физиологической концентрацией соли при физиологическом pH, который содержит количество определенного растворенного белка (тримерная ассоциация доменов TRAIL) >90% в рамках типичного диапазона концентрации белка от 0,2 до 10,0 мг/мл.

5. Определение периода полужизни

Молекулы A-D каждая состоит из двух полипептидов, ковалентно связанных межцепочечными дисульфидными связями. Исследовали количество гликосайтов и петлевых цистеинов (приводящих к межцепочечным дисульфидным связям между белками) с целью определить эффект, который изменение указанных характеристик оказывает на период полужизни указанных соединений.

Самок мышей NMRI лечили 1,2 мг/кг м.т. и/или 4 мг/кг м.т. указанных соединений в виде разовой внутривенной болюсной инъекции. Цельную кровь получали до применения (перед использованием препарата), и до 168 часов после введения тестируемого препарата. Сыворотку получали и образцы хранили при -80°C до определения концентраций в сыворотке. Фармакокинетические параметры рассчитывали с использованием средних концентраций в сыворотке и программы фармакокинетической оценки PK Solutions версия 2.0 для некомпартментного анализа фармакокинетических данных (Summit Research Services, Montrose, CO). PK Solutions представляет собой автоматическое приложение на основе Excel, которое рассчитывает фармакокинетические параметры из данных концентрация-время, полученных из анализа, например, биологических образцов после внутривенного или экстрасосудистого путей введения. PK Solutions рассчитывает результаты без предположительной какой-либо специфической компартментной модели.

Количественную оценку тестируемых веществ в сыворотке проводили с помощью ELISA-анализа, определяющего отдельные агонисты рецептора TRAIL, показанные в таблице 7, независимо от Strep-метки, являющейся частью молекул. Общий результат показан на фиг. 18. Результаты суммированы в таблице 7.

Молекула A (состоящая из двух полипептидов SEQ ID NO:26) имеет два петлевых цистеина (образующих две межцепочечных дисульфидных связи) и N остаток в положении 297 Fc-участка (в соответствии с индексом EU), приводя к CH2-гликозилированию дикого типа. Молекула A также имеет гликосайты в положениях 168 и 337. Молекула B (состоящая из двух полипептидов SEQ ID NO: 19) имеет три петлевых цистеина (образующих три межцепочечных дисульфидных связи) (в положениях 513, 519, и 522) и N297S мутацию в положении 297 Fc-участка (в соответствии с EU индексом), приводя к агликозилированию CH2-домена. Молекула B также имеет гликосайты в положениях 168 и 337. Молекула C (состоящая из двух полипепептидов SEQ ID NO: 27) имеет три петлевых цистеина (образующих три межцепочечных дисульфидных связи) и N297S мутацию в положении 297 Fc-участка (в соответствии с EU индексом), приводя к агликозилированию CH2-домена. Кроме того, существует гликосайт в положении 168 (линкер 1), но не в положении 337 (линкер 2). Молекула D (состоящая из двух полипептидов SEQ ID NO:28) имеет три петлевых цистеина (образующих три межцепочечных дисульфидных связи) и N297S мутацию в положении 297 Fc участка (в соответствии с EU индексом), приводя к агликозилированию CH2-домена. Кроме того, гликосайты на обоих линкере 1 и линкере 2 (положения 168 и 337, соответственно) в молекуле D истощены.

Стабильность in vivo (что видно из периода полужизни соединения) молекулы B (оба линкера гликозилированы, CH2-гликосайты истощены, и добавлен третий петлевой цистеин) была увеличена по сравнению с молекулой A. Кроме того, истощение всех гликосайтов соединения (молекула D) приводило к сниженной стабильности in vivo и низкой продуктивности во время транзиторной экспрессии. Молекула C (первый линкер гликозилирован, второй линкер агликозилирован, CH2-гликосайты истощены) продемонстрировала промежуточную стабильность in vivo при сравнении с молекулами B и D (см. результаты в таблице 7).

Таблица 7: Результаты исследования периода полужизни соединения у мышей NMRI

Молекула	Количество сайтов гликозилирования	Количество петлевых цистеинов	Конечный период полужизни 4 мг/кг в/в (час)	Конечный период полужизни 1,2 мг/kg в/в (час)
A	6	2	23,1	17,7
B	4	3	33,94	28,28
C	2	3	21,03	-
D	0	3	8,81	-

Полученные экспериментальные результаты демонстрируют, что комбинация гликозилирования линкеров (в обоих линкерах 1 и 2) с третьей межцепочечной дисульфидной связью (посредством добавления петлевого цистеина) и дегликозилированием CH2-домена в Fc-участке приводит к большей стабильности in vivo в молекулах по настоящему изобретению.

6. Демонстрация эффективности in vitro

6.1 Белок агонист рецептора TRAIL SEQ ID NO: 19 ингибирует выживаемость клеток гематологических и солидных опухолей человека in vitro

Опухолевые клетки сеяли по 10000 клеток/ячейку в 96-луночные планшеты в рекомендованной среде, содержащей 10% FBS, и обрабатывали белком агонистом рецептора TRAIL, состоящим из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, в течение 24 часов при 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO₂. Выживаемость клеток впоследствии оценивали с использованием реагента CellTiter-Glo®, как описано в инструкции производителя (Promega; Madison, WI). Значения ИК₅₀ определяли нелинейным регрессионным анализом данных концентрация-ответ, нормализованных относительно необработанных контрольных клеток. Примеры полученных кривых концентрация-ответ для клеток Colo205, Jurkat и SKM-1, которые продемонстрировали снижение выживаемости клеток в ответ на обработку белком агонистом рецептора TRAIL, состоящим из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, показаны на фиг. 19. В таблице 8 показаны результаты клеточных линий гематологических опухолей (A; (n=40; Не-Ходжкинская лимфома, NHL; Острая миелолимфома, AML; острый лимфобластный лейкоз, ALL) и солидных опухолей (B; (n=44; немелкоклеточная карцинома легких, NSCLC; рак поджелудочной железы, колоректальный, CRC; рак молочной железы, BrCa; яичника, фибросаркома; головы и шеи, H&N; мелкоклеточный рак легкого, SCLC), обработанных белком агонистом рецептора TRAIL, состоящим из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, в течение 24 часов и выживаемость оценивали CellTiter-Glo®. Представлены полученные ИК₅₀ для эффектов, опосредованных белком агонистом рецептора TRAIL, состоящим из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, в отношении выживаемости клеток.

Таблица 8

Эффективность белка агониста рецептора TRAIL SEQ ID NO: 19 в клеточных линиях опухолей человека in vitro

Опухолевая клеточная линия	Тип опухоли	ИК50 SEQ ID NO:19 (нг/мл)
A
SU-DHL-8	NHL	1,36
NUDHL-1	NHL	6,50
OCI-Ly8	NHL	7,49
ULA	NHL	8,44
OCI-Ly2	NHL	18,98
OCI-LY19	NHL	26,34
WSU-NHL	NHL	31,60
OCI-Ly7	NHL	63,76
SU-DHL-5	NHL	82,07
OCI-Ly18	NHL	196,20
OCI-Ly1	NHL	416,95
SU-DHL-16	NHL	545,55
SU-DHL-2	NHL	1000,00
WSU-DLCL2	NHL	1000,00
Toledo	NHL	1000,00
OCI-LY3	NHL	1000,00
RL	NHL	1000,00
SU-DHL-4	NHL	1000,00
U2932	NHL	1000,00
HT	NHL	1000,00
RC-K8	NHL	1000,00
SKM-1	AML	0,95
PL-21	AML	10,67
EOL-1	AML	18,31
HL-60	AML	76,62
OCI-AML2	AML	124,32
UKE-1	AML	205,35
MV4-11	AML	312,55
SET-2	AML	384,80
MOLM-13	AML	722,10
OCI-AML5	AML	1032,60
Kasumi-1	AML	1000,00
KG-1	AML	1000,00
OCI-AML3	AML	1000,00
SHI-1	AML	1000,00
SKNO-1	AML	1000,00
TF-1	AML	1000,00
THP-1	AML	1000,00
HEL	AML	1000,00
Jurkat	ALL	3,08
B
NCI-H847	NSCLC	14,53
NCI-H647	NSCLC	24,75
NCI-H2444	NSCLC	27,75
NCI-H2170	NSCLC	30,16
NCI-H460	NSCLC	36,85
NCI-H838	NSCLC	44,48
NCI-H1792	NSCLC	61,09
NCI-H2347	NSCLC	81,06
NCI-H1373	NSCLC	125,15
NCI-H522	NSCLC	259,87
NCI-H2110	NSCLC	314,20
NCI-H596	NSCLC	397,80
HCC4006	NSCLC	407,24
NCI-H2122	NSCLC	480,55
NCI-H1299	NSCLC	716,00
NCI-H1975	NSCLC	741,50
HCC827	NSCLC	2824,50
NCI-H727	NSCLC	3178,00
NCI-H1944	NSCLC	4068,75
NCI-H1299	NSCLC	4214,87
Calu-6	NSCLC	4757,00
NCI-H1693	NSCLC	5000,00
HCC2935	NSCLC	5000,00
A549	NSCLC	5000,00
NCI-H1395	NSCLC	5000,00
NCI-H2172	NSCLC	5000,00
Calu-1	NSCLC	5000,00
NCI-H441	NSCLC	5000,00
NCI-H23	NSCLC	5000,00
NCI-H661	NSCLC	5000,00
NCI-H1650-GFP	NSCLC	>3
BxPC3	Поджелудочная железа	16,00
Capan-1	Поджелудочная железа	393,00
MIA PaCa-2	Поджелудочная железа	158,00
PANC-1	Поджелудочная железа	>1000
SW48	CRC	6,10
Colo205	CRC	1,30
SW480	CRC	132,00
HCT 116-GFP	CRC	337,00
HCC38	BrCa	3,00
HCC1569	BrCa	219,00
MCF7	BrCa	>3000
MDA-MB-231	BRCa	235,00
HeyA8-GFP	яичник	141,00
Fadu-GFP	H&N	>3
HT-1080	фибросаркома	377,00
NCI-H211	SCLC	72,58

6.2 Белок агонист рецептора TRAIL SEQ ID NO: 19 действует синергически с противоопухолевыми средствами в индукции смерти опухолевых клеток

Опухолевые клетки сеяли по 10000 клеток/ячейку в 96-луночных планшетах в рекомендуемой среде, содержащей 10% FBS, и обрабатывали совместно белком агонистом рецептора TRAIL, состоящим из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, и венетоклаксом (ABT-199), навитоклаксом (ABT-263) или доцетакселом (DTX) в течение 24 ч при 37° в увлажненной атмосфере 5% CO₂. Выживаемость клеток впоследствии оценивали с использованием реагента CellTiter-Glo®, как описано в инструкции производителя. Независимую модель Bliss (Wong et al., 2012; Mol. Cancer Ther. 11:1026-1035; Bernebaum, 1981 Adv. Cancer Res. 35:269-335; Borisy et al., 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7977-7982) использовали для оценки комбинированной активности, с отрицательными целыми числами, показывающими антагонизм, нулевым значением, показывающим аддитивную активность, и положительными целыми числами, показывающими синергию. Баллы Bliss рассчитывали для каждой комбинации в матрице доз и суммировали для получения значения ʺСуммы Blissʺ. Пример синергической смерти опухолевых клеток, индуцированной путем совместной обработки человеческих опухолевых клеток белком агонистом рецептора TRAIL, состоящим из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:19, и венетоклаксом, навитоклаксом или DTX, с ассоциированной суммой Bliss показан на фиг. 20(A-C). Суммы Bliss, определенные для указанных комбинаций в ряде опухолевых клеточных линий, изображены в таблице 9.

Таблица 9

Оценка синергии Bliss уничтожения клеток белком агонистом рецептора TRAIL по SEQ ID NO:19 в комбинации с DTX в клеточных линиях NSCLC (A) и венетоклаксом или навитоклаксом в клеточных линиях NHL & AML (B) in vitro

Опухолевая клеточная линия	Сумма Bliss (SEQ ID NO:19+DTX)	Опухолевая клеточная линия	Сумма Bliss (SEQ ID NO:19+венетоклакс)	Сумма Bliss (SEQ ID NO:19+навитоклакс)
LG0552	748,2	WSU-DLCL2	1292	560
NCI-H522	549,1	SU-DHL-4	898	617
NCI-H647	452	OCI-AML3	831,9	456,4
NCI-H727	429,4	OCI-AML5	777,8	174,5
NCI-H1373	387,1	U2932	736,2	636,1
NCI-H596	261	PL-21	600,8	244,9
HCC2935	224,2	ULA	343,8	79,4
NCI-H2347	154	OCI-Ly18	309,8	8,3
NCI-H2444	135	MV4;11	301,1	351
A549	118,1	RL	286,1	446,7
NCI-H23	70,6	MOLM-13	270,6	264,8
NCI-H847	64,2	SKM-1	222,9	88,1
HCC4006	15,75	OCI-Ly1	218,8	69,1
NCI-H2170	-97,1	SU-DHL-16	217,5	142,5
LG0567	-105,2	OCI-AMl2	160,2	145,5
HCC2935	-183	OCI-Ly8	154,9	177
HCC827	-292,8	THP-1	152,7	43,1
NCI-H661	-344,5	OCI-Ly3	146,5	-242,2
NCI-H441	-362	OCI-Ly2	145	127,2
NCI-H1395	-512	OCI-Ly19	114,9	37,3
NCI-H1944	-565	SKNO-1	104,7	-138,9
NCI-H1693	-584	UKE-1	80,5	28,9
Calu-6	-628,7	WSU-NHK	79,8	84
LG0481	-803	EOL-1	69,7	-6,3
NCI-H2172	-1404	SU-DHL-2	53,5	-31,8
		Toledo	51,4	-68,2
		HEL	21,5	-92,4
		NuDHL-1	-28,4	18,7
		TF-1	-100,6	-50,2
		RC-K8	-131	-68
		HT	-173	12,1
		HL-60	-176	-112,7
		SHI-1	-208,4	-122,6
		SU-DHL-8	-210,6	-37
		SU-DHL-5	-233,8	-280,6
		SET-2	-248,4	71,2
		KG-1	-260	-20,3
		Kasumi-1	-356,4	-241,2

7. Лечение белком агонистом рецептора TRAIL SEQ ID NO:19 ингибирует рост опухоли in vivo

Эффект белка агониста рецептора TRAIL, состоящего из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:19, в отношении роста опухоли оценивали в подкожных пересаженных опухолях Colo205 (колоректальный), SKM-1 (острый миелолейкоз), и H460LM (немелкоклеточный легкого), имплантированных самкам мышей (Charles Rivers Laboratories; Wilmington, MA). Коротко, человеческие раковые клетки инокулировали подкожно в правую заднюю конечность самок мышей SCID в день исследования 0. Введение белка агониста рецептора TRAIL по SEQ ID NO:19 (0,3, 1, или 3 мкг, вводимых в/в, QDx5 или IP, Q2Dx5 как показано) инициировали в момент сравнения размера. Объем опухолей измеряли в течение эксперимента до того, как средний объем опухоли в каждой группе достигал конечной точки >2000 мм³ для Colo205 и SKM-1 или >2500 мм³ для H460LM. Результаты показаны на фиг. 21-23. Введение белка агониста рецептора TRAIL, состоящего из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:19, индуцировало достоверное ингибирование роста опухоли в моделях ксенотрансплантатов опухолей Colo205, SKM-1, и H460LM.

Эффект белка агониста рецептора TRAIL, состоящего из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:19, в отношении роста опухоли также оценивали в моделях ксенотрасплантатов от пациентов CTG-0069 (колоректальный), CTG-0167 (NSCLC), CTG-0293 (поджелудочной железы), CTG-0714 (саркома), CTG-0136 (пищевод), CTG-485 (желудок), и CTG-0785 (саркома Юинга), имплантированных самкам мышей NSG (Champions Oncology; Hackensack, NJ). Коротко, фрагменты опухолей подсаживали подкожно в правую заднюю конечность самок мышей NSG в день исследования 0. Введение белка агониста рецептора TRAIL, состоящего из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, (3 мкг, вводимых ип, Q2Dx5) начинали в момент сравнения размеров. Объем опухоли измеряли в течение эксперимента до того, как средний объем опухоли в каждой группе достигал конечной точки >2000 мм³ или 60 дней. Результаты показаны на фиг. 24(A-G). Введение белка агониста рецептора TRAIL, состоящего из двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, индуцировало достоверное ингибирование роста опухоли в PDX моделях CTG-0069 (колоректальный), CTG-0167 (NSCLC), CTG-0293 (поджелудочная железа), CTG-0714 (саркома), CTG-0136 (пищевод), CTG-485 (желудок), и CTG-0785 (саркома Юинга).

1. Белок-агонист рецептора TRAIL, включающий димер двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, где каждый мономер указанного димера включает (i) три растворимых домена TRAIL, где первый домен TRAIL состоит из аминокислот 120–281 SEQ ID NO: 1, и второй и третий домены TRAIL состоят из аминокислот 121-281 SEQ ID NO: 1, где первый и второй, и второй и третий домены TRAIL слиты вместе двумя пептидными линкерными элементами, имеющими аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и (ii) домен Fc-фрагмента антитела в соответствии с SEQ ID NO: 10, который слит с С-концом третьего растворимого домена TRAIL из (i) через петлевой линкерный элемент, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

2. Белок-агонист рецептора TRAIL по п. 1, где два полипептида являются ковалентно связанными посредством трех межцепочечных дисульфидных связей, образованных между цистеиновыми остатками 513, 519 и 522 каждого полипептида.

3. Белок-агонист рецептора TRAIL, включающий димер двух полипептидов, имеющих последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO: 19, где каждый мономер указанного димера включает (i) три растворимых домена TRAIL, где первый домен TRAIL состоит из аминокислот 120–281 SEQ ID NO: 1, и второй и третий домены TRAIL состоят из аминокислот 121-281 SEQ ID NO: 1, где первый и второй, и второй и третий домены TRAIL слиты вместе двумя пептидными линкерными элементами, имеющими аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и (ii) домен Fc-фрагмента антитела в соответствии с SEQ ID NO: 10, который слит с С-концом третьего растворимого домена TRAIL из (i) через петлевой линкерный элемент, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; два полипептида являются ковалентно связанными посредством трех межцепочечных дисульфидных связей, образованных между цистеиновыми остатками 513, 519 и 522 каждого полипептида; где остатки аспарагина в положениях 168 и 337 полипептида(ов) являются N-гликозилированными, и где N-концевой глютамин полипептида(ов) модифицирован в пироглютамат.

4. Фармацевтическая композиция для использования в лечении TRAIL-ассоциированных заболеваний или расстройств, включающая эффективное количество белка-агониста рецептора TRAIL по любому из пп. 1 или 3 и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, вспомогательных веществ и/или добавок, где указанное TRAIL-ассоциированное заболевание или расстройство представляет собой опухоль.

5. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок-агонист рецептора TRAIL по п. 1.

6. Вектор экспрессии, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 5.

7. Клетка для экспрессии белка-агониста рецептора TRAIL по п. 1, включающая вектор экспрессии, который включает молекулу нуклеиновой кислоты по п. 5, где клетка не является клеткой эмбриона человека.

8. Клетка по п. 7, которая является клеткой эукариот.

9. Клетка по п. 7, где клеткой является клетка млекопитающего.

10. Клетка по п. 7, где клеткой является клетка яичника китайского хомяка (CHO).

11. Способ лечения пациента, имеющего TRAIL-ассоциированное заболевание или расстройство, включающий введение пациенту эффективного количества белка-агониста рецептора TRAIL по любому из пп. 1 или 3, где указанное TRAIL-ассоциированное заболевание или расстройство представляет собой опухоль.

12. Способ по п. 11, где опухолью является солидная опухоль.

13. Способ по п. 11, где опухолью является лимфатическая опухоль.