Способ верификации инфицированного панкреонекроза

Изобретение относится к биотехнологии и решает задачу верификации инфицированного панкреонекроза с помощью определения уровня некротических ДНК-комет. 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии, и может быть использовано при применении методов оценки уровня апоптоза в популяции свежевыделенных нейтрофилов в диагностировании инфицированного панкреонекроза.

Острый панкреатит, особенно его деструктивные формы, является одной из тяжелых хирургических патологий органов брюшной полости и относится к одной из важнейших проблем современной неотложной абдоминальной хирургии. По известным данным (см. Литвин А.А., Хоха В.М., Лурье В.Н. Современные тенденции в хирургическом лечении острого некротизирующего панкреатита, инфицированного панкреонекроза // Новости хирургии. - 2011. - №5. - С. 138-146), инфицирование зон некротической деструкции развивается у 30-50% больных панкреонекрозом и является одним из основных факторов риска летального исхода. Ранняя диагностика инфицирования зон некротической деструкции представляет на сегодняшний день значительные трудности, что зачастую приводит к выбору необоснованной тактики ведения и лечения.

Известны сведения, что удельный вес диагностических ошибок при верификации инфекционных осложнений панкреонекроза достигает 40% и более (см. Овсяник Д.М. Диагностика инфицированного панкреонекроза на основании оценки показателей эндотелиальной дисфункции // Новости хирургии. - 2014. - №4. - С. 428-435). Учитывая, что панкреонекроз сопровождается системной воспалительной реакцией даже при отсутствии инфекции, а традиционно используемые клинико-лабораторные тесты не являются достаточно специфичными и чувствительными в диагностике развития панкреатогенной инфекции, весьма актуальным является поиск новых эффективных маркеров развития инфекционного процесса.

Известен способ диагностики инфицированного панкреонекроза (см. RU №2319150, кл. G01N 33/52, опубл. 10.03.2008), заключающийся в том, что всем больным с подозрением на острый деструктивный панкреатит при поступлении проводят комплексное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование, дополнительно оценивают уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной активности плазмы крови (АОС) методом люминолзависимой железоиндуцированной хемилюминисценции на биохемилюминаторе БХЛ-60М (НИЦ «Биоавтоматика», г. Нижний Новгород). Для чего, в измерительную кювету вносят 0,1 мл плазмы крови, 0,4 мл фосфатного буфера, 0,4 мл сульфата железа и 0,2 мл люминола. Инициирование реакции осуществляют введением 0,2% перекиси водорода. Время регистрации показателей ПОЛ и АОС составляет 30-60 секунд. При оценке кинетики хемилюминисценции оценивают следующие показатели: интенсивность свечения (J max), светосумму (S) и коэффициент K (J max/S). При значении J max меньше 30 мВ и коэффициента K меньше 0,056 у.е. диагностируют инфицированный панкреонекроз. Чувствительность предлагаемого способа порядка 80,0%.

Недостатком известного способа является недостаточная точность, сложность применения метода в рутинной клинической практике и необходимость иметь сложное лабораторное оборудование.

Известен способ прогнозирования развития гнойных осложнений острого панкреатита (см. RU №2454671, кл. G01N 33/53, опубл. 27.06.2012), по которому у больных оценивают параметры кинетики хемилюминисценции лейкоцитов, активированной взвесью клинических штаммов Acinetobacter baumannii или Pseudomonas aeruginosa или метицилленрезистентного Staphylococcus aureus - MRSA. При сочетании значений времени достижения максимума - Т max более 1400,0 сек, максимальной интенсивности - I max менее 5131,5 у.е., светосуммы - S менее 144000, 0 у.е. для реакции, инициированной Acinetobacter baumannii., или при сочетании значений Т max > 1435, 0 сек, I max < 4708, 0 у.е. - для реакции, инициированной Pseudomonas aeruginosa, или при сочетании значений Т max > 3520, 0 сек, I max < 4257, 0 у.е., S<169000, 0 у.е. - для реакции, инициированной MRSA, прогнозируют развитие гнойных осложнений. Чувствительность предлагаемого способа 93,8%.

Недостатками известного решения является недостаточная точность, многоступенчатость исследования и необходимость иметь сложное лабораторное оборудование.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ диагностики инфицированности панкреонекроза путем определения уровня апоптоза в популяции свежевыделенных нейтрофилов методом проточной цитометрии с помощью окрашивания клеток пропидиумом йодидом (см. RU №2428122, кл. А61В 10/00, опубликовано 10.09.2011). Сравнение больных с инфицированным и стерильным панкреонекрозом показало, что низкий уровень апоптоза нейтрофилов является характерным признаком у больных с гнойными осложнениями независимо от их заболевания. Данный феномен обусловлен повышенной активностью провоспалительных цитокинов. Так, если у пациентов с гнойными осложнениями уровень апоптоза нейтрофилов составил в среднем около 4%, то в группе больных со стерильным панкреонекрозом - более 4% (Р<0,001). Чувствительность предполагаемого способа 80,0%.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в повышении точности диагностики инфицированного панкреонекроза.

Технический эффект, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в получении способа верификации инфицированного панкреонекроза путем оценки ДНК-повреждения мононуклеарных клеток крови методом гель-электрофореза.

Для решения поставленной задачи способ верификации инфицированного панкреонекроза путем исследования мононуклеарных клеток крови больного отличается тем, что с целью повышения точности способа определяют уровень некротических ДНК-комет и при их уровне содержания менее 9,6% диагностируют инфицированный панкреонекроз, а при уровне более 9,6% - стерильный панкреонекроз.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».

Совокупность признаков изобретения обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, вывод о типе панкреонекроз по уровню концентрации в крови больного некротических ДНК-комет, определяемой методом гель-электрофореза (метод «ДНК-комет»). При этом установлено, что ранним признаком развития инфекционного процесса в некротизированных тканях поджелудочной железы является снижение в крови уровня некротических ДНК-комет менее 9,6%.

Преимуществом данного способа является патогенетичность, так как оценке подлежат структурно-функциональные свойства генома мононуклеарных клеток крови. Отмечено, что содержание некротических ДНК-комет в группе больных без развития инфекционных осложнений было значительно выше, чем у больных с развитием инфекционных осложнений. По-видимому, это определяется тем, что активная гибель мононуклеарных клеток крови связана с их участием в разрешении, в том числе и инфекционных осложнений, и в конечном итоге определяет предупреждение их развития у этих больных.

Таким образом, для осуществления заявленного способа верификации инфицированного панкреонекроза исследуют мононуклеарные клетки крови больного, проводя их гель-электрофорез (метод «ДНК-комет»). При уровне некротических ДНК-комет менее 9,6% диагностируют инфицированный панкреонекроз, при уровне более 9,6% - стерильный панкреонекроз.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследование ДНК-повреждения, уровень апоптотических, некротических мононуклеарных клеток крови больных панкреонекрозом оценивают методом гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») (см. Dhawan A., Anderson D. The Comet Assay in Toxicology Developmental Toxicology Division // Indian Institute of Toxicology Research. Lucknow. India. - 2009. - P. 478). Для чего, образцы крови (2 мл) смешивают с равным объемом среды RPMI-1640, содержащей 10% диметилсульфоксида, далее, замораживают или хранят до анализа при температуре минус 20°С. Затем для анализа образцы крови в объеме 50 мкл переносят в пробирки с 500 мкл 1% раствора агарозы, ресуспендируют и наносят на предварительно покрытые агарозой предметные стекла. После затвердения агарозы микропрепараты лизируют охлажденным буфером (10 mM Tris HCI [рН 10], 2,5 М NaCI, 100 mМ EDTA-Na₂, 1% Triton Х-100, 10% DMSO) в течение не менее 1 часа. После окончания лизиса микропрепараты инкубируют в буфере для электрофореза (300 mM NaOH, 1 mМ EDTA-Na₂, рН>13) в течение 20 минут для реализации щелочно-лабильных сайтов и щелочной денатурации ДНК.

Далее, проводят электрофорез в течение 20 минут при напряженности поля 1/V cm и силе тока - 300 mA. После чего, микропрепараты фиксируют в 70% растворе этилового спирта, высушивают и хранят до анализа при комнатной температуре.

Полученные с микропрепаратов изображения «ДНК-комет» анализируют с использованием программного обеспечения, например, CASP 2.2.1. (CaspLab, USA). При этом, в качестве показателя поврежденности ДНК чаще всего используют длину «хвоста», процентное содержание ДНК в «хвосте» или их произведение - так называемый «момент хвоста» (tail moment). Апоптотические «ДНК-кометы» идентифицируют как специфичные фрагменты ДНК с диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой», а некротические - как широкие диффузные «ДНК-кометы» неправильной формы.

Данный способ апробирован и используется в ГБУ PC (Я) «Республиканская больница №2 - Центр экстренной медицинской помощи» в г. Якутске. С помощью предложенного способа обследовано 1024 больных с острым деструктивным панкреатитом, при этом чувствительность метода составила 96,3%, специфичность - 85,1%.

Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из историй болезни.

Пример №1. Больной Д., 45 лет, 22. 07.15 г. в 14 часов 10 мин доставлен в хирургическое отделение многопрофильного хирургического Центра г. Якутска с направительным диагнозом: острый панкреатит. Жалобы при поступлении на: сильные, опоясывающие, приступообразные боли в эпигастральной области, тошнота, рвота съеденной пищей и слабость.

Анамнез заболевания: считает себя больным с 13 часов 18.07.15 г., когда появились боли в эпигастральной области умеренного характера после употребления алкоголя в течение 7 предыдущих дней. На боли в животе внимания не обращал. После приема очередной дозы алкоголя боли стихали. 22.07.15 г. боли в животе усилились, появилась неукротимая рвота и слабость. Самостоятельно принимал анальгетики. На фоне приема препаратов состояние не улучшалось, боли усилились и носили постоянный характер, что заставило больного обратиться за медицинской помощью.

Объективно: состояние больного тяжелое. Кожные покровы чистые, бледные и сухие на ощупь. Язык сухой обложен белым налетом. Периферические лимфоузлы не пальпируются. Температура тела - 38,6 С⁰. Костно-мышечная система без особенностей. Дыхание самостоятельное, частота дыхательных движений - 28 в минуту. Аускультативно дыхание проводится по всем легочным полям, жесткое, хрипов нет. Тоны сердца ясные, ритмичные. АД - 110/70 мм. рт.ст., пульс - 101 ударов в минуту. Живот вздут, при пальпации напряжен, болезненный в верхних квадрантах. Отмечаются положительные симптомы Керте, Мейо-Робсона, Воскресенского. Перистальтика кишечника вялая. Симптом Пастернацкого отрицательный с обеих сторон. Мочеиспускание свободное, диурез снижен.

Для уточнения диагноза назначены лабораторные и инструментальное методы исследования включающие: общий и биохимический анализы крови с определением уровня α-амилаза крови, УЗИ брюшной полости.

По результатам исследования выявлено. Общий анализ крови: эритроциты - 4,8⋅10¹²/л, гемоглобин - 140 г/л, гематокрит - 0,31, цветной показатель - 0,82, лейкоциты - 22⋅10⁹/л, палочкоядерные нейтрофилы - 19%, сегментоядерные нейтрофилы - 74%, лимфоциты - 5%, моноциты - 2%, СОЭ - 50 мм/час. Биохимический анализ крови: общий белок - 68 г/л, глюкоза - 7,2 ммоль/л, билирубин - 16,8 мкмоль/л, холестерин - 4,2 ммоль/л, мочевина - 10 ммоль/л, креатинин - 120,6 мкмоль/л, АЛТ - 45,1 ед/л, ACT - 50,2 ед/л, α-амилаза - 328,3 ед/л. К⁺ - 1,9 ммоль/л, Na⁺ - 150 ммоль/л.

УЗИ брюшной полости: печень несколько увеличена, левая доля 10,3 см, правая доля 16,5 см. Эхоструктура однородная, эхоплотность повышена. Внутрипеченочные желчные протоки не расширены. Портальная вена 0,9 см. Желчный пузырь размерами 9,3×3,1×3,5 см, в просвете визуализируется конкремент диаметром до 0,5 см. Поджелудочная железа визуализируется частично из-за раздутых петель кишечника, тело - 3,5 см, хвост - 3,8 см, контур железы нечеткий, эхоструктура неоднородная, эхоплотность снижена, Вирсунгов проток умеренно расширен до 5 мм. В брюшной полости определяется свободная жидкость преимущественно в сальниковой сумке - объемом до 170 мл, подпеченочно толщиной до 2,0 см, по контуру селезенки толщиной до 2,5 см, в малом тазу общим объемом до 150 мл и межкишечно в виде полосок шириной до 1,0 см. Заключение УЗИ брюшной полости: острый деструктивный панкреатит. Желчнокаменная болезнь. Хронический кулькулезный холецистит. Свободная жидкость в брюшной полости.

Также при поступлении проведена оценка ДНК-повреждения мононуклеарных клеток крови методом гель-электрофореза (метод «ДНК-комет»). При этом уровень некротических ДНК-комет составил 12,8%. Основываясь на данных предложенного способа верификации инфицированного панкреонекроза, выставлен диагноз - стерильный панкреонекроз. Больной госпитализирован в отделение реанимации и интенсивной терапии, начата интенсивная терапия.

За больным установлено динамическое наблюдение с ежедневным контролем лабораторных показателей крови и контролем УЗИ брюшной полости. Через 7 суток от начала интенсивной терапии отмечено ухудшение общего состояния больного, нарастание лейкоцитоза до 24×10⁹/л, палочкоядерные нейтрофилы - 24%, повышение температуры тела до 39,4 С⁰. По результатам УЗИ брюшной полости в динамике отмечается нарастание свободной жидкости, жидкость неоднородна, в верхнем этаже брюшной полости с признаками осумкования. При повторном исследовании уровень некротических ДНК-комет составил 9,1%, выставлен диагноз - инфицированный панкреонекроз. В связи с признаками инфицирования зон некротической деструкции, после предоперационной подготовки больной оперирован по абсолютным показаниям. Послеоперационный диагноз: инфицированный панкреонекроз. Флегмона забрюшинной клетчатки справа. Распространенный гнойный перитонит.

Пример №2. Больной М., 30 лет, 17.09.17 г. в 15 часов 30 мин доставлен в хирургическое отделение многопрофильного хирургического Центра г. Якутска с направительным диагнозом: острый панкреатит. Жалобы при поступлении на: приступообразные боли в эпигастральной области опоясывающего характера, тошноту, рвоту, головокружение, слабость.

Анамнез заболевания: считает себя больным с утра 14.09.17 г., когда появились боли в эпигастральной области ноющего характера, тошнота и рвота после приема жирной и острой пищи. Самостоятельно принимал ферментные и спазмолитические препараты. После приема препаратов на некоторое время отмечалось улучшение самочувствия, в последующем вновь появлялись боли в животе и рвота. Отсутствие результатов от самостоятельного лечения вынудило больного обратиться за медицинской помощью.

Объективно: состояние больного при поступлении тяжелое. Кожные покровы чистые, сухие. Язык сухой, обложен серым налетом. Периферические лимфоузлы не пальпируются. Температура тела - 37,7 С⁰. Костно-мышечная система без особенностей. Дыхание самостоятельное, частота дыхательных движений - 24 в минуту. Аускультативно дыхание проводится по всем легочным полям, жесткое, хрипов нет.Тоны сердца ясные, ритмичные. АД - 110/80 мм. рт.ст., пульс - 110 ударов в минуту. Живот умеренно вздут, при пальпации напряжен, болезненный в эпигастрии и левых латеральных квадрантах живота. Отмечаются положительные симптомы Керте, Мейо-Робсона. Перистальтика кишечника вялая. Симптом Пастернацкого отрицательный с обеих сторон. Мочеиспускание свободное, диурез адекватный.

Для уточнения диагноза локализации воспалительного процесса, определения состояния органов и систем назначены лабораторное и инструментальное методы исследования включающие: общий и биохимический анализы крови с определением α-амилаза крови, УЗИ брюшной полости.

По результатам исследования выявлено. Общий анализ крови от 17.09.17 г.: эритроциты - 4,2⋅10¹²/л, гемоглобин -120 г/л, гематокрит 0,38, цветной показатель - 0,9, лейкоциты - 17,2⋅10⁹/л, палочкоядерные нейтрофилы - 14%, сегментоядерные нейтрофилы - 73%, лимфоциты - 10%, моноциты - 3%, СОЭ - 42 мм/час. Биохимический анализ крови: общий белок - 74 г/л, глюкоза - 7,7 ммоль/л, билирубин - 15,5 мкмоль/л, холестерин - 6,2 ммоль/л, мочевина - 9,3 ммоль/л, креатинин - 101,5 мкмоль/л, АЛТ - 38,1 ед/л, ACT - 45,3 ед/л, α-амилаза - 717 ед/л. К⁺ - 4,4 ммоль/л, Na⁺ - 125 ммоль/л.

УЗИ брюшной полости: печень не увеличена, левая доля 8,3 см, правая доля 12,6 см. Эхоструктура однородная, эхоплотность средняя. Внутрипеченочные желчные протоки не расширены. Портальная вена 0,8 см. Желчный пузырь размерами 9,3×4,1×2,5 см, в просвете конкрементов нет. Стенка желчного пузыря однородная, повышенной эхогенности. Поджелудочная железа увеличена, головка - 3,7 см, тело - 2,6 см, хвост - 2,6 см, контур железы нечеткий, эхоструктура неоднородная, эхоплотность снижена, Вирсунгов проток умеренно расширен до 5 мм. Отмечается парапанкреатическая инфильтрация в виде неоднородности ткани, больше в проекции хвоста поджелудочной железы. В брюшной полости определяется свободная жидкость преимущественно в сальниковой сумке - объемом до 100 мл, подпеченочно толщиной до 1,2 см. Заключение УЗИ брюшной полости: острый деструктивный панкреатит.Парапанкреатический инфильтрат.

Также при поступлении проведена оценка ДНК-повреждения мононуклеарных клеток крови методом гель-электрофореза (метод «ДНК-комет»). При этом уровень некротических ДНК-комет составил 19,3%. Основываясь на данных предложенного способа верификации инфицированного панкреонекроза, выставлен диагноз - стерильный панкреонекроз.

За больным установлено динамическое наблюдение с ежедневным контролем лабораторных показателей крови и контролем УЗИ брюшной полости. Через 5 суток от момента госпитализации на фоне консервативной терапии отмечается ухудшение общего состояния, нарастание лейкоцитоза до 19×10⁹/л, палочкоядерные нейтрофилы - 28%, повышение температуры тела до - 38,7 С⁰. По результатам УЗИ брюшной полости в динамике отмечается нарастание свободной жидкости в сальниковой сумке. При повторном исследовании уровень некротических ДНК-комет составил 8,1%, выставлен диагноз - инфицированный панкреонекроз. В связи с неэффективностью проводимого консервативного лечения и признаками абсцедирования парапанкреатического инфильтрата после предоперационной подготовки больной оперирован по абсолютным показаниям. Послеоперационный диагноз: инфицированный панкреонекроз. Флегмона забрюшинной клетчатки справа и области корня брыжейки тонкой кишки. Диффузный гнойный перитонит.

По клиническим, лабораторным, инструментальным и данным, полученным после проведения гель-электрофореза мононуклеарных клеток крови (метод «ДНК-комет») у больных установлен диагноз: инфицированный панкреонекроз, что подтверждает результаты заявленного способа диагностики.

Таким образом, точность диагностики, подтвержденная практическими данными, и непродолжительность выполнения процедуры анализа (до 40-50 минут), позволяют судить, что предлагаемый способ может быть предложен к использованию в клинической практике.

Способ верификации инфицированного панкреонекроза путем исследования мононуклеарных клеток крови больного, отличающийся тем, что определяют уровень некротических ДНК-комет и при их уровне содержания менее 9,6 % диагностируют инфицированный панкреонекроз, а при уровне более 9,6 % – стерильный панкреонекроз.