Кристаллообразующий штамм бактерий brevibacillus laterosporus с широким спектром антагонистической активности и его применение

Группа изобретений относится к биотехнологии и включает кристаллообразующий штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 и варианты его применения. Предлагаемый штамм является спорообразующим и обладает широким спектром антагонистической активности против различных видов организмов, что позволяет использовать его как эффективный биоцид. При этом данный штамм может быть применен в качестве биоцидного средства разной направленности. Возможны следующие виды применения - в качестве фунгицидного средства для борьбы с фитопатогенными микроскопическими грибами, в качестве альгицидного средства для борьбы с сине-зелёными и зелёными микроводорослями, в качестве инсектицидного средства против личинок комаров отряда Diptera: Anopheles stephensi, Aedes aegipti, Culex pipiens, в качестве средства, обладающего способностью подавлять патогенные бактерии. Уровень биоцидной активности заявляемого штамма достаточно высок, что позволит производить эффективные биоцидные препараты. 5 н.п. ф-лы, 6 табл., 8 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к производству и применению биологических средств защиты растений от поражения фитопатогенными грибами, патогенными бактериями, для борьбы с микроскопическими водорослями и комарами.

Микроорганизмы являются наиболее востребованными продуцентами различных соединений и обладают широким спектром антагонистической активности. Среди микроорганизмов, продуцирующих биологически активные соединения различной направленности, особое место занимают спорообразующие грамположительные бактерии рода Brevibacillus laterosporus (BL). Интерес к этим бактериям обусловлен отсутствием у них токсичности для теплокровных животных.

Штаммы В. laterosporus обладают рядом биотехнологических преимуществ: растут на относительно дешевых питательных средах, не требуют специальных условий для культивирования, способны поддерживаться в лабораторных условиях в течение длительного времени, сохраняя свои уникальные свойства.

Бациллы В. laterosporus способны к синтезу инсектицидных факторов [1-3], продуцируют целый спектр антагонистических факторов, которые обуславливают антибактериальный эффект [4], фунгицидную и цианолитическую активности [5], активность против фито- и зоонематод и моллюсков[6-9]. BL применяют в качестве эффективных пробиотиков [10-12].

Некоторые штаммы BL используют в медицине [13], так как они продуцируют большое число антибиотиков различной химической структуры и механизмов действия. Водорастворимый антибиотик небелковой природы - латероспорамин обладает слабой ингибирующей активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий [4]. Аналог антибиотика спергуалина, 15-дезоксиспергуалин, обладает противоопухолевой активностью и выраженным иммунодепрессивным действием на различные трансплантационные модели [14-15].

Из морского штамма В. laterosporus выделены лолоатины - группа циклических декапептидов тироцидинового семейства, обладающие высокой антибиотической активностью против патогенных грамположительных бактерий [16].

Циклический декапептид латероцидин выделен из штамма ВКПМ В-8287 в России [17]. Учитывая токсикологическую безопасность и способность к быстрой колонизации кишечника теплокровных, некоторые штаммы В. laterosporus используют как эффективные пробиотики. Так, бактерии В. laterosporus BOD входят в состав препаратов-пробиотиков в гастроэнтерологии, применяемых для лечения заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры кишечника человека, проявляя фунгицидное и антибактериальное действие [18].

Известны штаммы В. laterosporus, обладающие инсектицидным эффектом против домашней мухи, личинок комаров, кукурузного корневого червя [19-22].

Имеются данные об антагонистической активности В. laterosporus против возбудителей болезней растений. Штамм В. laterosporus ВКПМ В-8287 использован при создании биологического фунгицида для защиты картофеля от фитопатогенных грибов [23].

Культуру В. laterosporus, наряду с другими почвенными бактериями, предлагают включить в состав комплексных бактериальных препаратов, для бинарного действия и возможного потенциирования эффективности действия ряда химических гербицидов [24]. Некоторые штаммы В. laterosporus подавляют развитие патогенных грибов, поражающих человека и животных. Введение животному культуры В. laterosporus снижает за 7 дней рост Candida albicans на 95-99% [25].

Пептидный антибиотик с мол. массой 1608 Да, продуцируемый штаммом В. laterosporus, выделен из морского осадка. Он обладает фунгицидной активностью против Candida albicans и Aspergillus fumigatus, а также антибактериальной активностью против ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий [26].

Бактерии В. laterosporus BOD проявляют себя как экологически безвредные транзитные организмы, обеспечивающие подавление опасной и развитие здоровой или полезной микрофлоры пищеварительной системы. Штамм В. laterosporus BOD, входящий в состав пробиотика «Flora Balance», за 28 дней снижает долю Candida albicans в кишечном тракте человека со 100% до 19% [18]. Обработка почвы бактериями В. laterosporus увеличивает рост растений и повышает урожайность зерновых культур почти на 30% по сравнению с не обработанной почвой [21]. Предварительная обработка почвы бактериями В. laterosporus снижает количество аэробных бактерий кишечной группы, что обеспечивает фиксацию щелочной среды почвы. Обработка целевых растений бактериями данного вида ингибирует развитие фитопатогенных бактерий и микроскопических грибов, что повышает урожайность растений [27].

Фактором патогенности для нематод является щелочная протеиназа с молекулярной массой около 30 кДа, синтезируемая штаммами В. laterosporus. [28]. Известна антагонистическая активность В. laterosporus против белых червей [29], а циклический декапептид - латероцидин, выделенный из штамма В. laterosporus ВКПМ В-8287, проявляет антагонистическую активность против различных видов организмов, в том числе, и против простейших [17].

Для некоторых штаммов В. laterosporus выявлена способность подавлять рост микроскопических водорослей - альгицидный эффект [30-32]. Проблема борьбы с микроводорослями становится все более актуальной во всем мире. Потепление климата, а также иррациональное ведение хозяйства: поступление хозяйственно-бытовых, промышленных и сельскохозяйственных сточных вод, приводит к интенсивному загрязнению водоемов, что сопровождается так называемым «цветением» воды. «Цветение» происходит за счет развития различных типов микроскопических водорослей, и, прежде всего, сине-зеленых водорослей (цианобактерий). «Цветение» водоемов сопровождается отмиранием избыточной биомассы микроводорослей, многие из которых являются токсичными. Выделение токсинов, нарушение кислородного режима водоемов, органолептические проявления гниения вызывают ряд серьезных социальных и экономических последствий: приводит к ухудшению качества питьевой воды, нежелательному для бытового, рекреационного, рыбо-хозяйственного, энергетического использования. Многочисленные отрицательные последствия «цветения» водных объектов предопределяют необходимость борьбы с сине-зелеными бактериями и продуктами их метаболизма. Микроводоросли развиваются также в рисовых чеках, что приводит к заражению их токсинами риса. Выделен пептид из штамма ВКПМ В-10531, названный латероцином и обладающий цианолитической активностью, который относится к семейству тироцидиновых антибиотиков [33].

Насекомые отряда Diptera (комары родов Aedes, Anopheles, Culex) представляют собой существенную угрозу для здоровья людей вследствие их способности переносить возбудителей серьезных инфекционных заболеваний, таких как малярия и лимфатический филяриоз, а также ряда вирусных инфекций (энцефалит, денге, онкоцерциоз и др.). Эти насекомые угрожают более чем трем миллиардам человек в тропических и субтропических регионах.

Задача заявляемого изобретения:

- расширить арсенал штаммов Brevibacillus laterosporus, обладающих широким спектром антагонистической активности.

Задача решена:

- путем получения штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186, обладающего широким спектром антагонистической активности; путем применения штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве фунгицидного средства для борьбы с фитопатогенными микроскопическими грибами;

- путем применения штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве альгицидного средства для борьбы с сине-зелеными и зелеными микроводорослями;

- путем применения штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве инсектицидного средства против личинок комаров отряда Diptera: Anopheles stephensi, Aedes aegypti и Culex pipiens;

- путем применения штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве средства, обладающего способностью подавлять вирулентные свойства патогенных бактерий.

Заявляемый штамм получен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма Brevibacillus laterosporus 16-1702, выделенного из природных источников, и депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-13186.

В качестве ближайшего аналога заявляемого штамма рассмотрен штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-10531, обладающий альгицидным, фунгицидными и фитопатогеным действием. Заявляемый штамм отличается от ближайшего аналога способностью образовывать кристаллы и более широким спектром антагонистической активности -альгицидной, фунгицидной, антибактериальной и инсектицидной.

1. Культивирование штамма.

В качестве питательных использовали NBY, ASC, SG, YM среды следующего состава (мас. %):

среда NBY:

питательный бульон «Difco»	0,8;
дрожжевой экстракт «Difco»	0,3;
вода	остальное,

среда YM

гидролизные дрожжи	4,5;
вода	остальное

среда ASC:

дрожжевой экстракт «Difco»	0,5;
сахароза	2,0;
лимонная кислота	1,17;
Na2SO4	0,4;
(NH4)2HPO4	0,42;
KCl	0,076;
MgCl2×6H2O	- 0,042.
вода	- остальное

среда SG:

сукцинат натрия	0,5;
глицерин	1,5;
MgSO4	0,02;
(NH4)2HPO4	0,5;
KCl	0,2;
вода	остальное

Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды добавляли агар-агар (2,0 мас. %).

2. Культурально-морфологические признаки.

При культивировании на агаризованной среде NBY через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-5 мм светлого кремового цвета с гладкой поверхностью и неровным краем. Через 72-96 часа роста на питательной среде NBY штамм образует споры.

Исследование морфологических особенностей заявляемого штамма В. laterosporus с помощью светового микроскопа выявило у них признаки, характерные для данного вида бактерий. Грамположительные подвижные вегетативные палочковидные клетки, перитрихи, размером 0,4-0,7×3,2-5,0 мкм, цепочек не образуют. Штамм хорошо спорулирует в жидкой и на твердой питательной среде NBY. В процессе споруляции образует характерную каноэвидную структуру, примыкающую к споре с одной из сторон. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,7-1,2×2,5-4,7 мкм. Параспоральное каноэвидное включение прикреплено к одной стороне споры. По данным световой микроскопии помимо каноэвидных включений обнаружены кристаллические включения. Кристаллы штамма при лизисе спорангия высвобождаются раздельно от споры.

3. Физиолого-биохимические свойства.

Культивирование заявляемого штамма осуществляют в диапазоне температур 28-30°С при рН 6,8-7,2. Оптимальными являются температура +30°С и рН 7,0.

Штамм образуют каталазу. Гидролизует эскулин, казеин и желатин. Не гидролизует крахмал и твин 80. Мочевину не расщепляет. Не образует кислоты из арабинозы, сахарозы, D-галактозы, D-ксилозы, D-лактозы. Образует кислоту из D-глюкозы, D-мальтозы, D-маннита, D-маннозы, фруктозы и салицина. Глюкозу сбраживает без газа. Образует лецитиназу и твин-эстеразу. Растет в присутствии лизоцима (10 мг/мл) и 2% NaCl. Не растет в присутствии 10% NaCl.

На основании культуральных, морфологических (наличие каноэвидной структуры, прикрепленной к споре и кристаллических включений), физиологических и биохимических признаков, а также по результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, заявляемый штамм наиболее близок к виду Brevibacillus laterosporus (99%) [34-35].

Антагонистическая активность

Заявляемый штамм подавляет развитие следующих микроскопических водорослей (таблица 1).

Выявлена также антагонистическая активность штамма по отношению к:

фитопатогенным грибам: Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phoma solanicola, Alternaria tenuis, Botrytis cinerea; Magnaporthe grisea;

грамположительным бактериям: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous;

грамотрициательным бактериям: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumniae, Acinetobacter baumannii;

инсектицидную активность для личинок II-ой стадии развития комаров трех видов: Culex pipiens (Liston), Aedes aegypti (L.) и Anopheles stephensi (L.) (отряда Diptera).

Поддержание штамма ВКПМ В-13186 проводят на косяках в стандартных пробирках с агаризованной средой NBY.

Хранение штамма осуществляют после его лиофилизации. Вегетативную культуру клеток выращивают на агаризованной среде NBY до образования спор. Споры и оставшиеся клетки смывали защитной средой, содержащей стерилизованное обезжиренное молоко. Ампулы с суспензией клеток и спор выдерживают 15 мин при -70°С, а затем быстро переносят в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko") Время сушки составляет 4 часа. Лиофилизированные образцы хранят в холодильнике при температуре +4°С.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами:

Пример 1.

Получение биомассы заявляемого штамма в среде NBY

Для культивирования заявляемого штамма В-13186 используют среду NBY. Среду готовят на дистиллированной воде, доводят значение рН до 7,0; разливают в стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см³ по 50 мл и стерилизуют при давлении 0,8 атм, температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы, с содержащейся в них средой, охлаждают до +20°С. Стерильность и рН среды контролируют путем отбора соответствующих проб. В качестве посевного материала используют 5 мл культуры заявляемого штамма, полученной при культивировании в среде NBY 16 часов при 30°С при встряхивании при 250 оборотов/мин. Отсутствие посторонней микрофлоры контролируют микроскопически. К 96 часам культивирования штамм образует 90-95% спор и 5-10% вегетативных клеток. Продуктивность штамма определяют методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду. Микробиологическим методом оценивают титр КОЕ штамма ВКПМ В-13186, который составляет ~8,4×10⁸/мл.

Пример 2.

Получение биомассы заявляемого штамма в среде ASC или SG

Среды ASC и SG готовят на дистиллированной воде, доводят значение рН до 7,0, разливают в пробирки по 5-10 мл и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,8 атм при температуре 120°С в течение 30 мин. Стерильность и рН контролируют путем отбора соответствующих проб. Затем в пробирки со средой ASC или SG вносят по 1 мл посевного материала, приготовленного следующим образом: в стандартную пробирку с 5 мл стерильной питательной среды NBY помещают бактериальную культуру, собранную микробиологической петлей с твердой агаризованной среды NBY, и инкубируют в течение 16 часов при температуре 30°С со встряхиванием 250 об/мин. Содержимое пробирки, после светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры, используют как посевной материал.

Заявляемый штамм культивируют в стандартных пробирках в 5 мл в жидких питательных средах ASC или SG в течение 72-96 часов при 28-30°С со встряхиванием при 250 оборотов/мин. Методом световой микроскопии и высевом на питательную агаризованную среду оценивают наличие бактериальных клеток и спор и отсутствие посторонней микрофлоры. К 96 часам культивирования наблюдают незначительное спорообразование - 5-10% спор, преимущественно - 90-95% вегетативных клеток.

Микробиологическим методом оценивают титр колоний образующих единиц (КОЕ) штамма ВКПМ В-13186, который составляет ~9,1×10⁸/мл.

Пример 3.

Культивирование микроскопических водорослей, используемых для выявления альгицидных свойств заявляемого штамма

Используют штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp. 5781 - получен с кафедры микробиологии ЛГУ; Nostoc sp. А-10 - получен из коллекции IMET, Йена, ГДР; штаммы азот не фиксирующих цианобактерий Microcystis aeroginosa 905 и 562 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинции Хубей, г. Ухань); штаммы цианобактерий: Amorphonostoc sp. и Synechocystis sp. и штаммы зеленых микроводорослей (Cosmarium sp., Chlorella sp.) получены с кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ.

Штаммы цианобактерий Anabaena, Nostoc и зеленых водорослей Cosmarium выращивают в модифицированной среде BG-11 [36]. Штамм Chlorella vulgaris выращивают в среде Тамийя [37]. Штаммы Microcystis aeruginosa выращивают в среде В-12 [38].

Штаммы микроводорослей выращивают в соответствующих каждому виду средах в 50-100 мл в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл при 25-30°С без аэрации при комнатной температуре и круглосуточном освещении. Используют люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивают освещенность 40 мкмоль квантов м^-2 с^-1 в области ФАР. Продолжительность светового периода составляет 14 часов в сутки. Через 10-12 суток выросшую культуру микроводорослей используют в качестве тест культуры для выявления альгицидной активности.

Пример 4.

Оценка спектра альгицидной активности заявляемого штамма

Альгицидную активность оценивают по изменению окраски инкубационных смесей тестируемых микроводорослей при совместном культивировании с заявляемым штаммом. Микроводоросли синтезируют различные пигменты (хлорофилл, фикобилины, каротиноиды), которые и определяют их цвет. Обесцвечивание инкубационных смесей тест-микроводорослей с заявляемым штаммом наблюдают во всех опытах (таблица 2).

* Примечание: (+) - изменение цвета инкубационной смеси до светло-зеленого (или лимонно-желтого), (++) - осветление смеси до желтого цвета, (+++) - полное обесцвечивание.

Как следует из таблицы 2, все штаммы сине-зеленых и зеленых микроводорослей чувствительны к альгицидному действию заявляемого штамма, но уровень их чувствительности различен в зависимости от видовой принадлежности и времени воздействия. При оптической микроскопии выявлен полный лизис вегетативных клеток всех изученных тест-микроводорослей.

Пример 5.

Оценка уровня альгицидной активности заявляемого штамма

Количественную оценку уровня альгицидной активности штамма определяют при совместном культивировании сине-зеленых (Nostoc, Anabaena, Microcystis, Amorphonostoc sp. и Synechocystis sp.) или зеленых водорослей (Cosmarium, Chlorella, Chlamydomonas) путем внесения к каждой из тест-культур микроводорослей в отдельности 96-часовой культуры заявляемого штамма в соотношении 5:1 и определяют остаточную оптическую плотность по формуле: (ОП_О), как (ОП_Т / ОП_Н)×100, где ОП_Н - начальная ОП, ОП_Т - ОП после инкубации в течении Т часов соответственно.

Измеряют оптическую плотность (при длине волны 590 нм) смеси в нулевой момент времени и после совместной инкубации.

Альгицидную активность заявляемого штамма оценивают по снижению оптической плотности через 24 часа совместной инкубации. Отмечено снижение оптической плотности смеси с Nostoc и Anabaena в 10 раз, а смеси с Microcystis или Cosmarium или Chlorella в полтора - два раза (таблица 3). Лизис клеток микроводорослей выявляли также при оптической микроскопии.

* Примечание: (+++) - полное обесцвечивание при высокой мутности

Измерение оптической плотности микроводорослей Amorphonostoc sp., Synechocystis sp. с заявляемым штаммом не представлялось возможным из-за физико-химических свойств инкубационной смеси - высокой мутности полученных суспензий.

Следует отметить также значительную мутность инкубационных смесей Chlorella или Microcystis или Amorphonostoc sp. или Synechocystis sp. или Cosmarium с заявляемым штаммом. Однако обесцвечивание полученных инкубационных смесей происходит. Следует отметить, что цианобактерий Anabaena и Nostoc более чувствительны к воздействию культуральной жидкости изучаемого штамма и обесцвечивание смесей наступает уже через 2 часа совместного инкубирования. Микроскопически к концу инкубации смесей выявлен лизис вегетативных клеток всех видов тест-микроводорослей.

Пример 6.

Определение фунгицидной активности заявляемого штамма

Для выявления фунгицидной активности используют культуральную жидкость заявляемого штамма. Тестирование фунгицидной активности проводят методом лунок.

Для этого тестируемые фитопатогенные грибы высевают в центр чашки Петри с картофельным агаром (мас. %: агар-агар - 2,0; глюкоза - 1,5; картофельный отвар - остальное, рН - при 25°С - 7,2). В лунки, вырезанные в агаре, диаметром 10 мм вносят по 150 мкл 72-часовой культуральной жидкости заявляемого штамма. Чашки инкубируют в темноте при комнатной температуре. Через 72 часа оценивают наличие или отсутствие зон подавления роста микроскопических грибов. Эффективность фунгицидного действия определяют по диаметру зоны отсутствия роста фитопатогенных грибов (таблица 4).

* Примечание: диаметр зоны задержки роста тест-гриба в мм.

Как следует из таблицы 4, заявляемый штамм подавляет рост мицелия всех исследованных фитопатогенных тест-грибов.

Пример 7.

Определение антибактериальной активности заявляемого штамма

Антибактериальное действие заявляемого штамма выявляют на грамположительных и грамотрицательных тест-бактериях. Тест-микроорганизмы культивируют при 37°С с аэрацией при 220 оборотов/мин в течение 24 часов в бульоне Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton Broth, HIMEDIA, India), мас. %: кислотный гидролизат казеина - 3,0; вытяжка из говядины - 0,175; растворимый крахмал - 0,015; вода - остальное, рН - (при 25°С) - 7,4±0,2. Тестирование антибактериальной активности проводят методом лунок на плотной агаризованной среде. Для этого бактериальные тест-культуры с оптической плотностью 0,5 высевают на чашки Петри с 20 мл агаризованной среды Мюллера-Хинтона. Чашки оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего в агаре вырезают лунки диаметром 4 мм, в которые вносят по 25 мкл образца культуральной жидкости (КЖ) заявляемого штамма, выращенного на среде NBY в течение 72 часов.

Антибактериальное действие штамма оценивают по наличию зоны задержки роста тест-бактерий через 24-48 часов и измерению величины этих зон (таблица 5).

* Примечание: (+) - наличие зоны ингибирования роста тест-бактерий; (-) - отсутствие зоны ингибирования роста тест-бактерий

Как следует из таблицы 5, заявляемый штамм проявляет антибактериальную активность против грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous, и грамотрицательных бактерий Acinetobacter baumannii, не активен против грамотрициательных бактерий: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumniae.

Пример 8.

Определение инсектицидной активности заявляемого штамма

Для тестирования инсектицидной активности заявляемого штамма используют культуральную жидкость, полученную после 96 ч культивирования в жидкой среде NBY. Уровень спорообразования в данной среде составляет от 80 до 100%.

Заявляемый штамм тестируют на инсектицидную активность против личинок комаров отряда Diptera.

В таблице 6 представлены результаты исследования токсичности 96 ч культуральной жидкости заявляемого штамма против личинок комаров II-ой стадии развития Aedes aegypti (Liston), и Anopheles stephensi (L.) Culex pipiens (L.) (Diptera). Токсичность штамма определена согласно методу оценки инсектицидной активности бактериальных штаммов по отношению к насекомым отряда Diptera [39].

* Примечание: определяли по действию нативной культуральной жидкости на насекомых: (-) гибель насекомых не наблюдалась; (+) 10% - 30% гибели насекомых; (++) 30% - 70% гибели; (+++) гибель более 70% насекомых.

Сравнительный анализ активности заявляемого штамма в отношении насекомых отряда Diptera показал, что штамм в разной степени токсичен для личинок комаров II-ой стадии трех видов: Culex pipiens, Anopheles stephensi и Aedes aegypti. Штамм наиболее активен против личинок Culex pipiens.

Установлено, что наибольшей токсичностью обладает культура заявляемого штамма на стадии спорообразования (96 ч), продуцирующая споры и кристаллы. Через 96 часов культивирования титр штамма составлет ≥ 8,4×10⁸/мл КОЕ/мл, а уровень спорообразования - 85-90%, Для заявляемого штамма в зависимости от вида комаров LC₅₀ составляла от 10^-4 до 10^-5, или в пересчете на клетки - от 10⁶ до 10⁴ КОЕ/мл. По уровню токсичности заявляемый штамм соответствует штаммам В. thuringiensis и В. sphaericus [40].

Список литературы.

1. Favret, М.Е., and Yousten, А.А. 1985. Insecticidal activity of Bacillus laterosporus. J. Invertebr. Pathol. Vol. 45, p. 195-203.

2. Rivers D B, Vann С N, Zimmack H L, & Dean D H. 1991. Mosquitocidal activity of Bacillus laterosporus. Journal Invertebrate Patholology 58: 444-447.

3. Ruiu, L., G. Delrio, D.J. Ellar, I. Floris, B. Paglietti, S. Rubino and A. Satta. (2006). Lethal and sublethal effects of Brevibacillus laterosporus on the housefly (Musca domestica). Entomologia Experimentalis et Applicata 118: 137-144.

4. Gerard, J.M., Haden, P., Kelly, M.T., Andersen, R.J., 1999. Loloatins A-D, cyclic decapeptide antibiotics produced in culture by a tropical marine bacterium. J. Nat. Prod. 62: 80-85.

5. Barsby, Т., Kelly, M. Т., and R.J. Andersen. 2002. Tupuseleiamides and basiliskamides, new acyldipeptides and antifungal polyketides produced in culture by a Bacillus laterosporus isolate obtained from a tropical marine habitat. J. Nat. Prod. V. 65(10), p. 1447-1451.

6. Singer, S. 1977. Isolation and development of bacterial pathogens of vectors. In Biological regulation of vectors, p. 3-18. DHEW Publ. No. (NUT) 77-1180. Bethesda, MD: NIH.

7. De Oliviera, E.J., L. Rabinovitch, R.G. Monnerat, L.K.J. Passos and V. Zahner. 2004. Molecular characterization of Brevibacillus laterosporus and its potential use in biological control. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 70, pp. 6657-6664.

8. Huang, X., Tian, В., Niu, Q., Yang, J., Zhang, L., and Zhang, K. 2005. An extracellular protease from Bacillus laterosporus G4 without parasporal crystals can serve as a pathogenic factor in infection of nematodes. Res.Microb 156(5-6): 719-727.

9. Baoyu, Т., Jinki, Y., Lihui, L., Chunyan, W., Ning, L., Zhang, K.Q. 2007. Role of an extracellular neutral protease in infection against nematodes by Brevibacillus laterosporus strain G4. Appl. Microbiol. Biotechn. Vol. 74, N. 2, p. 372-380.

10. Sanders, M. E., Morelly, L., and T. A. Tompkins. 2002. Sporeformers as human probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus and Brevibacillus. Comp. Rev. Food Sci. Food Saf. Vol. 2, p. 101-110.

11. Desjardine, K., Pereira, A., Wright, H., Matainaho, Т., Kelly, M., and R.J. Andersen. 2007. Tauramamide, a lipopeptide antibiotic produced in culture by Brevibacillus laterosporus isolated from a marine habitat: structure elucidation and synthesis. J. Nat. Prod. V. 70 (12), p. 1850-1853.

12. Сорокулова И.Б., Рыбалко С.Л., Руденко А.А., Берестовая Т.Г., Легеза К.Н., Подгорский В.С, Курищук К.В. Пробиотик Субалин - принципиально новый подход к лечению бактериальных и вирусных инфекций, Киев, 2007 г.

13. Youshida, S., Naganawa, Н., Aoyagi, Т., Takeuchi, Т, Takeuchi, Y, and Kodama, Y. 1991. Leuhistin, a new inhibitor of aminopeptidase M, produced by Bacillus laterosporus BMI156-14F1. II. Structure determination of leuhistin. J. Antibiotics, Vol. 44, No. 6, p. 579-581.

14. Shoji, J., Sakazaki, R, Wakisaka, Y., Koizumi, K., Mayama, M., Matsuura, S. and K. Matsumoto. J. Antibiotics. 1976, V. 29, No. 4, p. 390-393.

15. Fudaba, Y., Fukuda, Y, Yamamoto, H., Ohdan, H., Shintaku, S., Shibata, S., Miyata, Y., Marubayashi, S, Asahara, Т., and Dohi, K. 1998. Transplant. Proc., 1998, V. 30, No. 7, p. 3582-3583.

16. Tanabe, K., Takahashi, K., Nemoto, K., Okada, M., Yasuo, M., Hayasaka, Y., Toma, H., and Ota, K. J. Urol. Vol., 1994, V. 152, No. 2, part 1, p. 562-566.

17. Патент РФ №2229520.

18. Huynh H., Le Hong Duc, Cutting S. FEMS Microbiology Rev., 2005, V. 29, p. 813-835

19. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Ганушкина Л.А., Азизбекян P.P. Биотехнология, 1995, т. 3-4, с. 11-16.

20. Орлова M.B.. Smirnova Т.А, Ganushkina L.A., Yacubovich V.Y., Азизбекян P.P. Appl. Environ. Microbiol., 1998, v. 64, N7, p. 2723-2728.

21. Aronson A., Dunn P. U.S. Patent, No. 5,055, 293, 1993.

22. Ruiu L., Satta A., Floris I. Environ Entomol., 2008, V. 37(2), p. 505-509.

23. Патент РФ 2242125

24. Branly K., Atkins R. U.S. Patent, No. 6,232,270. 2001.

25. O'Donnell B. Patent U.S., No. 5,455,028, 1995.

26. Ren Z.Z., Zheng Y., Sun M., Liu J.Z., Wang Y.J., Wei Sheng, Wu Xue Bao, 2007, V. 47 (6), p. 997-1001.

27. O'Donnell B. Patent U.S., No. 5,702,701. 1997.

28. Qiuhong N., Xiaowei H., Baoyu Т., Jinkui Y., Jiang L., Lin Z., Keqin Z.. Appl Microbiol Biotechnol., 2007, V. 74(2), p. 372-380.

29. Chang S.F., Wan Y.L., Cui J.Y., Wang B.S. Acta Entomol. Sin., 1984, V. 26, p. 419-425.

30. Кузнецова Н.И., Азизбекян P.P., Конюхов И.В., Погосян С.И., Рубин А.Б. Доклады Академии наук, 2007, т. 241, №2, с. 262-266.

31. Патент РФ 2323968

32. Shida О., Takagi Н., Kadowaki K., Komagata K. 1996. J. Sysyt.Bacteriol., 45: 939-946

33. Патент РФ 2430966

34. Pavlicek A., et al. Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol. (Praha). 1999. 45(3): 97-99.

35. Ruiz-Garcia C. et. al. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 191-195.

36. Stanier, R.Y., Kunisawa, R, Mandel M., Cohen-Basire, G. Bacteriool. Rev. 1971, t. 35 (2), 171-205.

37. Воншак А.В кн. Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения. М. Агропромиздат.1989. С. 310-328.

38. Nakagawa, М., Y. Takamura, and 0. Yagi. 1987. Agric. Biol. Chem. 51: 329-337.

39. Войцик A.A., Расницын С.П. 1992. Мед. паразитол. №4. С. 55-57.

40. De Barjac, Н. 1990. Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies. New Brunswick, NJ: Rutgers Univ. Press., p. 228-236.

1. Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186, обладающий широким спектром антагонистической активности.

2. Применение штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве фунгицидного средства для борьбы с фитопатогенными микроскопическими грибами.

3. Применение штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве альгицидного средства для борьбы с сине-зелеными и зелеными микроводорослями.

4. Применение штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве инсектицидного средства против личинок комаров отряда Diptera: Anopheles stephensi, Aedes aegypti и Culex pipiens.

5. Применение штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-13186 в качестве средства, обладающего способностью подавлять вирулентные свойства патогенных бактерий.