Композиции для содействия заживлению кожных язв и ран

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и хирургии, и касается средства для заживления ран и язв. Для этого местно применяют композицию, содержащую гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и кальциевую соль фосфомицина. GM-CSF представлен в форме молграмостима или сарграмостима и составляет от 1 мкг/г до 10 мкг/г. Такой состав композиции обеспечивает более высокую скорость заживления ран, язв, пролежней, ожогов и других повреждений кожи или слизистых оболочек за счет регенерирующего, активирующего противоинфекционный иммунитет и бактерицидного действия компонентов композиции при отсутствии побочных эффектов. 5 з.п. ф-лы, 4 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, которые содержат в качестве их неотъемлемых ингредиентов гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и антибиотик фосфомицин, для лечения ран, язв, пролежней, ожогов и других повреждений кожи или оболочек организма. По существу, оно значимо для областей дерматологии и сестринского ухода в областях медицины и хирургии, травматологии и ожогов.

Предпосылки изобретения

Заживление ран

Заживление ран является нормальным признаком живых животных и представляет собой динамический, интерактивный процесс, в который вовлечены клетки различных типов и внеклеточный матрикс, и его скорость и эффективность зависят от различных внутренних и внешних факторов. Нормальный процесс заживления можно описать в терминах четырех запрограммированных фаз, включающих 1) гемостаз, 2) воспаление, 3) пролиферацию и 4) ремоделирование.

1) Гемостаз представляет собой этап сосудистой реакции, который наступает незамедлительно после инсульта и обычно длится в течение вплоть до нескольких часов. Изначально рана может кровоточить, но свертывание крови и вазоконстрикция воссоздают гемостаз, в то время как свернувшаяся кровь обеспечивает временный внеклеточный матрикс для клеточной миграции.

2) Воспаление обычно начинается в момент повреждения и заканчивается в пределах 3-4 суток в ходе нормального заживления. В клинике фазу воспаления распознают по классическим признакам и симптомам воспаления, таким как жар, покраснение, отек и боль. Рана начинает выделять текучее вещество, которое служит для того, чтобы удалять дебрис, и происходит высвобождение протеаз в область раны. Белые клетки крови и макрофаги начинают собираться в повреждении для того, чтобы устранять дебрис: факторы роста, высвобождаемые макрофагами, стимулируют фибробласты. Во время этой фазы происходит образование внеклеточного матрикса. Воспаление присутствует всегда, пока исходные бактерии могут перейти от колонизации к клинической инфекции, чтобы обострять какую-либо задержку в разрешении воспалительной фазы.

3) Пролиферация обычно продолжается после воспалительной фазы и отличается пролиферацией и миграцией фибробластов и образованием соединительной ткани. Она начинается приблизительно через 4 суток после возникновения травмы и продолжается в течение 2-3 недель в обычно заживающей закрытой ране. Эта фаза может значительно продлеваться в открытой ране с тяжелым повреждением ткани, где полное закрытие будет требовать образования большого количества соединительной ткани. Во время этой фазы имеют место неоваскуляризация, эпителизация, стягивание раны и образование коллагена.

4) Ремоделирование (также называемое созреванием, замедлением или фазой рубцевания) начинается через 2-3 недели после закрытия раны, хотя оно не начинается в открытых ранах до заживления раны. Типично оно продолжается в течение нескольких недель, месяцев или даже лет после этого. Созревание включает стягивание раны, рост новой эпителиальной ткани, покрывающей грануляционную ткань, и возможно формирование рубца. Во время этой фазы из фибробластов развиваются миофибробласты и постепенно созревают и становятся относительно более организованными волокна коллагена.

Для оптимального заживления раны, все четыре фазы должны протекать в надлежащей последовательности и временных рамках. Различные части раны могут заживать с различными скоростями, так что некоторые части нормальной раны могут находиться на более продвинутом этапе заживления, чем другие.

Замедленное заживление ран и хронические или незаживающие раны и язвы

Многие факторы могут вызывать анормальное или ослабленное заживление ран, в том числе длительную неспособность заживать (незаживающие раны). Такие раны в целом не способны проходить через нормальные этапы заживления и часто входят в состояние патологического воспаления из-за за отсроченного, неполного или нескоординированного процесса заживления. Эти раны типично колонизирует или инфицирует один или несколько видов бактерий, которые усиливают и продлевают воспаление и вносят вклад в задержку заживления.

Большинство хронических ран представляют собой язвы, которые связаны с ишемией, сахарным диабетом, венозным застоем или давлением. Незаживающие раны поражают больше чем 1% популяции индустриализированного мира. В Соединенных Штатах они могут поражать вплоть до 6 миллионов человек, из них приблизительно 85% представляют собой пожилых людей в возрасте 65 лет или старше. Незаживающие раны ведут к огромным расходам на медицинскую помощь, в Соединенных Штатах оценочные суммарные расходы составляют больше чем 3 миллиарда долларов в год.

Со старением популяции и ростом числа индивидуумов с сахарным диабетом ожидается рост распространенности. Хронические язвы снижают качество жизни и работоспособность пациента и составляют существенное финансовое бремя для системы здравоохранения.

Язвы нижних конечностей, в частности, те, которые объясняют сахарным диабетом или венозной или артериальной недостаточностью, включают существенную долю хронических язв. Приблизительно у 15-25% индивидуумов с сахарным диабетом развивается язва стопы в определенный момент их жизни и оценочно 12% этих пациентов необходима ампутация нижней конечности. Заживление осложняется диабетической невропатией, а восприимчивость к инфицированию возрастает существенно. На венозные заболевания приходится большинство хронических язв нижних конечностей. Вторичная венозная гипертензия, обусловленная различными причинами, может повреждать стенки кровеносных сосудов и в конечном итоге ведет к разрушению кожных покровов. Артериальные язвы встречаются не так часто и являются результатом ослабленной циркуляции, которая может неблагоприятно влиять на заживление и вести к образованию язв.

Роль бактериальной колонизации и инфекции при хронических язвах

В фазе воспаления при ослабленном заживлении ран, бактерии всегда контаминируют язву в процессе, который переходит через колонизацию и критическую колонизацию к инфицированию. Критическая колонизация не всегда связана с очевидными признаками инфекции, но может вести к неспособности к заживлению, грануляционной ткани низкого качества, повышенной рыхлости раны и усиленной экссудации (Frank C et al., 2005). Известно, что микрофлора хронических ран, таких как язвы, наиболее часто имеет фенотип биопленки и значительно ослабляет развитие нормального заживления (Smith DM et al., 2010). Стандартное лечение включает использование топических противомикробных средств (препаратов йода и серебра) или топических антибиотиков (мупироцин, фусидовая кислота, аминогликозиды, бацитрацин, полимиксин B, грамицидины и метронидазол, отдельно или в различных комбинация) в течение двух недель или около того. После этого может следовать прием релевантных пероральных антибиотиков.

Типы бактерий, вовлеченных в хронические кожные язвы

Типы бактерий, вовлеченных в колонизацию и инфекцию хронических кожных язв типично включают те, которые присутствуют на контралатеральной или окружающей интактной коже, но демонстрируют значительно увеличенное присутствие определенных родов бактерий, включая, например, Corynebacterium, Pseudomonas, Streptococcus, Escherichia, Shigella и Serratia, при исследовании диабетических язв (Gontcharova V et al., 2010). Также часто встречаются анаэробные роды, такие как Finegoldia и Peptoniphilus. Несмотря на то, что Staphylococcus не представлены как род, к инфекциям хронических ран S. aureus следует относиться серьезно. При анализе пролежней идентифицированы наиболее распространенные роды бактерий Streptococcus, Corynebacterium, Staphylococcus, Finegoldia, Anaerococcus, Pseudomonas и Peptoniphilus. Обнаружено, что многие функционально эквивалентные патогруппы (симбиотические колонии в остальном непатогенных видов, которые действуют синергически для того, чтобы содействовать своей собственной выживаемости за счет организма-хозяина) колонизируют хронические раны и существуют в них в виде патогенной биопленки, которую считают основным инфекционным агентом в хронических ранах (Smith DM et al., 2010).

Стандартное лечение незаживающих ран и язв

Стандартное лечение всех незаживающих ран и язв включает санацию раневой полости от некротизированной ткани, контроль инфекции и локальный уход за раной. Для каждой категории незаживающих ран следует применять специализированные модальности лечения. Для диабетической язвы стопы, например, следует уделять внимание механической разгрузке, строгому контролю глюкозы крови и обучению пациента уходу за стопой. Для венозных язв специальные меры типично включают механическую компрессию и подъем конечности для того, чтобы обратить отек тканей и улучшить ток венозной крови. Уход за язвами, обусловленными артериальной недостаточностью, сосредоточен на восстановлении потока крови и минимизации дальнейшего снижения перфузии тканей. Для пролежней способы или устройства для разгрузки являются золотым стандартом лечения.

Если язвы не в достаточной мере заживают при стандартном лечении, могут требоваться дополнительные модальности лечения, которые часто обозначают как «терапия запущенных ран». Разработан большой и разрастающийся массив способов терапии запущенных ран с различными составами и показаниями. Для существенного числа этих способов терапии точно не установлены их эффект, сравнительная эффективность и нежелательные эффекты. Таким образом, несмотря на то, что в области лечения для заживления ран имели место экстенсивные исследования, заживление ран и язв все еще остается сложной задачей, в частности, в популяции пожилых или больных людей.

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) является членом семейства колониестимулирующих факторов (CSF), которые представляют собой гликопротеины, которые стимулируют пролиферацию и созревание гематопоэтических клеток-предшественников и повышают функциональную активность зрелых эффекторных клеток. Вкратце, при определенном уровне незрелых клеток CSF обеспечивают самоподдержание основного пула и активируют первый этап гематопоэтической дифференцировки. На следующем этапе, когда клеточная пролиферация связана с прогрессирующим приобретением характеристик зрелых клеток, они чрезвычайно увеличивают число дифференцирующихся клеток. На конечном этапе они стимулируют циркуляцию и активацию зрелых клеток.

Показано, что GM-CSF оказывает положительный эффект на заживление ран, облегчая стягивание раны, вызывая локальное рекрутирование воспалительных клеток и индуцируя пролиферацию кератиноцитов. GM-CSF также активирует мононуклеарные фагоциты, способствует миграции эпителиальных клеток и дополнительно регулирует образование цитокинов в процессе заживления.

Зрелый GM-CSF представляет собой мономерный белок из 127 аминокислотных остатков с несколькими участками потенциального гликозилирования. Переменная степень гликозилирования ведет к диапазону молекулярных масс между 14 кДа и 35 кДа. Негликозилированный и гликозилированный GM-CSF проявляет схожую активность in vitro (Cebon J et al., 1990). Кристаллографический анализ GM-CSF выявил бочкообразную структуру, состоящую из четырех коротких α-спиралей (Diederichs K et al., 1991). Существует два известных варианта последовательности GM-CSF. Активную форму белка GM-CSF in vivo находят вне клеток в виде гомодимера.

GM-CSF проявляет свою биологическую активность посредством связывания со своим рецептором. Наиболее важными местами экспрессии рецептора GM-CSF (GM-CSF-R) является клеточная поверхность миелоидных клеток, таких как макрофаги типов I и II, эпителиальные клетки и клетки эндотелия, тогда как лимфоциты являются отрицательными по GM-CSF-R. Нативный рецептор состоит из α- и β-субъединиц. α-субъединица придает лигандную специфичность и связывает GM-CSF с наномолярной аффинностью. β-субъединица также является частью рецепторных комплексов интерлейкина-3 и интерлейкина-5 и, в сочетании с α-субъединицей GM-CSF-R и GM-CSF, ведет к формированию комплекса с пикомолярной аффинность связывания (Hayashida K et al., 1990). Картированы связывающие домены на GM-CSF для рецептора: GM-CSF взаимодействует с β-субъединицей своего рецептора через очень ограниченную область в первой α спирали GM-CSF (Shanafelt AB et al., 1991 a;b; Lopez AF et al., 1991). Связывание с α-субъединицей может быть картировано на третьей α-спирали, спирали C, начальных остатках петли, соединяющей спирали C и D, и на карбоксиконцевом хвосте GM-CSF (Brown CB et al., 1994).

Формирование тримерного рецепторного комплекса GM-CSF ведет к активации сложных каскадов передачи сигналов, включающих молекулы семейств JAK/STAT, She, Ras, Raf, MAP киназы, фосфатидилинозитол-3-киназу и NFkB, наконец приводя к транскрипции c-myc, c-fos и c-jun. Активацию преимущественно индуцирует β-субъединица рецептора (Hayashida K et al., 1990; Kitamura T et al., 1991; Sato N et al., 1993). Общая β-субъединица также отвечает за перекрывающиеся функции, проявляется IL-3, IL-5 и GM-CSF (рассмотрено у de Groot RP et al., 1998).

В дополнение к его стимулирующей активности в отношении гематопоэтического роста и дифференцировки, GM-CSF выполняет функцию провоспалительного цитокина. GM-CSF активирует макрофаги, например, макрофаги типов I и II, и моноциты, а также нейтрофилы и эозинофилы, что ведет к высвобождению других цитокинов и хемокинов, а также протеаз, разрушающих матрикс, и к повышенной экспрессии HLA и молекул клеточной адгезии или рецепторов для CC-хемокинов. Это в свою очередь ведет к увеличенному хемотаксису воспалительных клеток в воспаленную ткань.

Известно, что макрофаги в ранах высвобождать множество биологически активных веществ, которые служат в качестве хемоаттрактантов как для моноцитов, так и для фибробластов, таких как трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Активированные макрофаги расщепляют нежизнеспособный коллаген и сгусток фибрина. Растворение сгустка делает возможным формирование грануляционной ткани в месте раны во время второй фазы заживления раны.

Использование GM-CSF для стимуляции заживления ран

Активности GM-CSF, которые описаны выше, не только стимулируют клеточную пролиферацию, созревание и активности, которые вовлечены в этапы воспаления и пролиферации при заживлении ран, но также, посредством того же процесса, усиливают врожденные механизмы защиты против бактериальной инфекции. Систематически рассмотрено использование топически применяемого рекомбинантного GM-CSF человека для ускорения заживления хронических ран и язв различных типов и сделано заключение о полезности для глубоких ожогов второй степени, хронических язв на ногах и язв прокаженных, при некоторых свидетельствах о положительном эффекте для пролежней и язв, связанных со злокачественной опухолью (Hu X et al., 2011).

У крыс обнаружено, что топически применяемый GM-CSF на экспериментальных ранах, инфицированных Escherichia coli, стимулирует врожденную защиту от инфекции, что наблюдают по сниженному числу бактерий в сочетании с ускоренным закрытием раны (Robson M et al., 1994).

Использование топических антибиотиков для того, чтобы контролировать бактериальную инфекцию при хронических ранах и язвах

Современное использование топических микробных средств и антибиотиков при стандартом уходе за хроническими ранами и язвами описано выше. Топические противомикробные средства, такие как препараты на основе йода или серебра, в целом могут быть связаны с антисептиками: хотя они могут иметь мощное бактерицидное действие, они также оказывают значительные токсические эффекты на живые клетки, которые необходимы для процесса заживления ран. Баланс между локальным бактерицидным эффектом и токсичностью для тканей организма-хозяина является важным вопросом. Этот баланс может быть более благоприятным для содействия заживлению в случае упомянутых антибиотиков, но эти антибиотики также могут иметь значительное цитотоксическое действие при достижении определенных локальных концентраций. Очевидно, что благоприятно выбирать антибиотик или комбинацию антибиотиков, которые обладают сильным бактерицидным действием, но имеют небольшую или нулевую токсичность по отношению к клеткам, участвующим в заживлении ран. Дополнительное соображение состоит в том, что антибиотик должен быть активен против главных видов бактерий, о которых известно, что они встречаются в инфицированных ранах и язвах. Кроме того, это большое преимущество, если антибиотик в настоящее время активен против многих бактериальных штаммов со множественной лекарственной устойчивостью, преобладание которых в последние годы выросло. Наконец, это преимущество, если отсутствует ощутимое увеличение бактериальной устойчивости к лекарственному средству в течение длительного периода времени, чтобы было уместно обоснованное ожидание того, что бактериальная устойчивость к нему будет

Фосфомицин

Фосфомицин представляет собой международное непроприетарное название антибиотика широкого спектра, выделенного и охарактеризованного в 1969 для штаммов Streptomyces fradiae под названием фосфомицин или фосфономицин (Hendlin D et al., 1969). Определено, что его структура представляет собой (-)(1R,2S)-1,2-эпоксипропилфосфоновую кислоту (Christensen BG et al., 1969) с систематическим названием (по IUPAC) [(2R,3S)-3-метилоксиран-2-ил]фосфоновая кислота и молекулярной массой по формуле соединения 138,1 Да. Фосфомицин является бактерицидным средством и ингибирует биосинтез бактериальной клеточной стенки посредством инактивации фермента UDP-N-ацетилглюкозамин-3-енолпирувилтрансферазы, также известного как MurA (Brown ED et al., 1995). Этот фермент катализирует обязательную стадию биосинтеза пептидогликанов, лигирование фосфоенолпирувата с 3'-гидроксильной группой в UDP-N-ацетилглюкозамине для того, чтобы формировать N-ацетилмурамовую кислоту. Фосфомицин представляет собой аналог фосфоенолпирувата, который ингибирует MurA посредством алкилирования остатка цистеина в активном центре. Антибиотик попадает в бактериальную клетку через переносчик глицерофосфата.

С учетом этого механизма действия, фосфомицин имеет широкий бактерицидный спектр, активен против аэробных родов, таких как Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Escherichia, Proteus (индол-отрицательные), Serratia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Haemophilus и Vibrio, менее активен против индол-положительных Proteus spp., Klebsiella и Enterobacter spp. Известно, что он активен против анаэробных родов Peptostreptococcus (включая Peptoniphilus, Finegoldia и Anaerococcus) и Fusobacterium. Видно, что этот спектр активности содержит большое число родов, значимых для критической колонизации и инфекции хронических кожных язв.

В обществе мало распространена бактериальная устойчивость к фосфомицину, а исследования распространенности устойчивых бактерий после включения фосфомицина показывают или нулевой или только умеренное увеличение распространенности устойчивых организмов. Однако, длительное воздействие антибиотика может позволять бактериям развивать устойчивость посредством отбора мутантов, у которых нет пути переносчика глицерофосфата. Альтернативные механизмы устойчивости включают утрату индуцибельного переносчика гексозофосфата, мутацию Cys-Asp в MurAS или приобретение плазмид, кодирующих ферменты fosA и fosB, инактивирующие фосфомицин (в дополнение к хромосомному fosX у Listeria monocytogenes). Однако мутантные штаммы также могут демонстрировать сниженную патогенность (Karageorgopoulos DE et al., 2012). Это может объяснять, почему возникновение бактериальной устойчивости наблюдают при пролонгированном воздействии in vitro, но значительно менее часто in vivo. Появление устойчивых бактериальных штаммов в контролируемых клинических исследованиях перорально или внутривенно вводимого фосфомицина составляло 3,0% в целом, при максимуме 15% для Pseudomonas aeruginosa. В целом видно, что фосфомицин является полезной добавкой для терапевтического арсенала против организмов с множественной лекарственной устойчивостью. Опыт развития устойчивости к фосфомицину во время лечения хронических язв, инфицированных бактериями, отсутствует.

Доказано, что фосфомицин не обладает токсичностью в отношении клеток и органов млекопитающих, хотя фосфомицин динатрия использовали во внутривенных дозах вплоть до 0,5 г/кг/сутки в пациентов-людей. Здесь лимитирующим фактором является перегрузка противоионом, а не какой-либо токсический эффект антибиотика. В действительности, обнаружено, что фосфомицин проявляет защитный эффект против токсического действия других антибиотиков, иммуносупрессорных или химиотерапевтических средств, таких как аминогликозиды, ванкомицин, амфотерицин B, полимиксин, циклоспорин и цисплатин (Gobernado M, 2003). В качестве дополнительных эффектов он обладает способностью содействовать фагоцитозу и действовать в качестве иммуномодулятора. Его накапливают полиморфно-ядерные лейкоциты до достижения концентрации, которая в два раза превышает таковую во внеклеточной жидкости, но он не влияет на их клеточные функции, при этом проявляя бактерицидный эффект в отношении Staphylococcus aureus. Главными нежелательными эффектами являются раздражение желудка при пероральном введении фосфомицина динатрия, признаки аллергии в форме мимолетной сыпи (0,3% случаев) и эозинофилия (0,2%) и временное повышение ферментов печени (0,3% случаев) (Gobernado M, 2003).

Использование фосфомицина в комбинации с другими антибиотиками

Фосфомицин проявляет существенный синергизм бактерицидного эффекта, оказываемого на большое число штаммов организмов из отмеченных восприимчивых родов, когда его используют в комбинации с большим числом антибиотиков из рядов пенициллина, цефалоспорина, аминогликозида, макролидов и линкозамидов. Хотя ранние исследования показывали синергический эффект приблизительно на 70-100% тестированных штаммов для различных комбинаций антибиотиков, последующие более экстенсивные исследования показали уровень синергии 36-74%. Остальные штаммы демонстрировали лишь аддитивные эффекты и ингибирующий эффект наблюдали только в одной или двух комбинациях отдельных антибиотиков на отдельном бактериальном штамме (Gobernado M, 2003). Тот факт, что фосфомицин демонстрирует синергию с многими отдельными антибиотиками и в действительности устраняет токсичность многих других антибиотиков, в том числе нефротоксичность и ототоксичность аминогликозидов, способствует использованию фосфомицина в комбинации с другими антибиотики для создания мощного бактерицидного действия и компенсации развития какой-либо устойчивости к фосфомицину в течение более длительного лечения.

Сущность изобретения

Соответственно, настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции для топического лечения ран, хронических язв и пролежней или кожи и слизистых оболочек, которые демонстрируют замедленное заживление или не заживают и критически колонизированы или инфицированы бактериями, указанные композиции по существу содержат

1. Фармацевтическая композиция, которая содержит

a) гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или его фрагмент или вариант и

b) фосфомицин в форме его неорганической или органической соли.

2. Фармацевтическая композиция согласно 1, приведенному выше, которая содержит один или несколько дополнительных антибиотиков или противомикробных средств.

Преимущество объединения GM-CSF с фосфомицином или фосфомицином в комбинации с другими антибиотиками состоит в использовании известного эффекта GM-CSF, когда он содействует заживлению ран и врожденным механизмам защиты против бактериальных инфекций, при этом дополнительно ускоряя заживление ран посредством более быстрой элиминации инфицирующих бактерий посредством бактерицидного действия фосфомицина, который не имеет токсического действия на гранулоциты, макрофаги и другие клетки, через которые проявляется заживляющий эффект GM-CSF. Эффект состоит в достижении более высокой скорости заживления ран и язв, демонстрирующих замедленное заживление или не заживающих, чем так, которую достигают с помощью существующего лечения или с помощью отдельно одного из топического GM-CSF или топического фосфомицина, с использованием дополнительного антибиотика или без него.

В следующем подробном описании изобретения приведены подробности относительно объема изобретения и значения используемых терминов, вместе с подробностями относительно практического осуществления изобретения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает композиции, которые содержат гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или его фрагмент или вариант, фосфомицин в форме его неорганической или органической соли и, в дополнительном варианте осуществления, дополнительный антибиотик или противомикробное средство, и в еще одном дополнительном варианте осуществления дополнительное средство, у которого обнаружено, что оно содействует заживлению ран. Такие композиции можно использовать для лечения ран, язв, пролежней и повреждений кожи и слизистых оболочек других типов, и они предназначены для топического применения различными способами, который будут описаны дополнительно. Композиции и способы по настоящему изобретению также можно в некоторых вариантах осуществления использовать в способах лечения.

Препараты GM-CSF

Для практических целей препараты GM-CSF, подлежащие использованию в настоящем изобретении, представляют собой не очищенный нативный GM-CSF человека, который конечно можно использовать, если он доступен в достаточном количестве и решены проблемы возможной вирусной контаминации, а GM-CSF человека, полученный in vitro посредством технологии рекомбинантных ДНК. Описано получение рекомбинантного GM-CSF человека (hrGM-CSF) в клетках млекопитающих (Wong GG et al., 1985; Kaushansky K et al., 1986). Подобная работа привела к продуцированию hrGM-CSF с непроприетарным названием реграмостим в клетках яичника китайского хомячка (CHO) (первыми сообщили Moonen P et al., 1987). Об экспрессии hrGM-CSF в Saccharomyces cerevisiae сообщали Cantrell MA et al. (1985), что привело к препарату, известному под непроприетарным названием сарграмостим.

Сарграмостим отличается от эндогенного GM-CSF человека наличием остатка лейцина взамен остатка пролина в положении 23 пропептида и является менее гликозилированным, чем эндогенный GM-CSF человека или реграмостим (Armitage JO, 1998). Об экспрессии hrGM-CSF у Escherichia coli сообщали Burgess AW et al. (1987), что привело к препарату, известному под непроприетарным названием молграмостим, который не гликозилирован. Все три препарата hrGM-CSF, реграмостим, сарграмостим и молграмостим, можно использовать в настоящем изобретении, но только последние два доступны в настоящее время.

«Функциональный гомолог» GM-CSF человека в настоящем документе определяют как полипептид, который обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с известной и встречающейся в природе последовательностью и вариантами последовательности GM-CSF человека и имеет одну или несколько функций белка, встречающегося в природе. Эти функции включают следующее: стимулирование роста и дифференцировки гематопоэтических клеток-предшественников из различных линий дифференцировки, включая гранулоциты, макрофаги и моноциты, усиление функциональной активности зрелых эффекторных клеток, участвующих в презентации антигена и клеточно-опосредованном иммунитете, включая нейтрофилы, моноциты, макрофаги и дендритные клетки. Функции также включают то, что конкретно значимо для заживления ран, например, содействие стягиванию раны, инициация локального рекрутирования воспалительных клеток, усовершенствование рекрутирования нейтрофилов, индукция пролиферации кератиноцитов, активация мононуклеарных фагоцитов, содействие миграции эпителиальных клеток и дополнительная регуляция продукции цитокинов в процессе заживления. Реграмостим, сарграмостим и молграмостим могут представлять собой так называемые функциональные гомологи встречающегося в природе GM-CSF человека.

Эволюционную консервативность между гомологами GM-CSF различных близкородственных видов, как оценивают посредством выравнивания аминокислотных последовательностей, можно использовать для точного определения степени эволюционного давления на отдельные аминокислотные остатки. Предпочтительно, последовательности GM-CSF сравнивают между видами, где функция GM-CSF консервативна, например, но не ограничиваясь этим, млекопитающие, включая грызунов, мартышки и человекообразные обезьяны.

Остатки под сильным давлением отбора более вероятно представляют необходимые аминокислотные остатки, которые нельзя легко заменить, в отличие от остатков, которые изменяются между видами. Из приведенного выше видно, что можно выполнять обоснованное множество модификаций или изменений последовательности GM-CSF человека, не оказывая влияния на активность молекулы GM-CSF в соответствии с изобретением. Такие молекулы GM-CSF в настоящем документе обозначают как функциональные гомологи GM-CSF человека и они могут представлять собой такие варианты и фрагменты нативного GM-CSF человека, как описано ниже.

Как используют в настоящем документе, экспрессионный «вариант» относится к полипептиду или белку, который гомологичен эталонному белку, который представляет собой встречающийся в природе GM-CSF человека, в данном случае, но который отличается от эталонного белка тем, что один или несколько аминокислотных остатков в последовательности эталонного белка заменяют на другие аминокислотные остатки. Эти замены можно рассматривать в качестве «консервативных», когда аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток с приблизительно схожими свойствами, и «неконсервативных», когда аминокислотный остаток заменяют на остаток другого типа. Говоря в общем, меньше неконсервативных замен будет возможно без изменения биологической активности полипептида.

Специалисту в данной области известно, как создавать и оценивать «консервативные» аминокислотные замены, посредством которых один аминокислотный остаток заменяют на другой, обладающих одной или несколькими общими химическими и/или физическими характеристиками. Консервативные аминокислотные замены менее вероятно влияют на функциональность белка. Аминокислоты можно группировать в соответствии с их общими характеристиками. A консервативная аминокислотная замена представляет собой замену одной аминокислоты в пределах предварительно определяемой группы аминокислот на другую аминокислоту в пределах той же группы, в пределах которой аминокислоты проявляют схожие или по существу схожие характеристики. В пределах значения термина «консервативная аминокислотная замена», как применяют в настоящем документе, одну аминокислоту можно заменять на другую в пределах групп аминокислот, которые отличаются тем, что имеют

i) полярные боковые цепи (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr и Cys)

ii) неполярные боковые цепи (Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Trp, Pro и Met)

iii) алифатические боковые цепи (Gly, Ala Val, Leu и lie)

iv) циклические боковые цепи (Phe, Tyr, Trp, His и Pro)

v) ароматические боковые цепи (Phe, Tyr и Trp)

vi) кислые боковые цепи (Asp и Glu)

vii) основные боковые цепи (Lys, Arg и His)

viii) амидные боковые цепи (Asn и Gin)

ix) гидроксильные боковые цепи (Ser и Thr)

x) серусодержащие боковые цепи (Cys и Met)

xi) аминокислоты, которые представляют собой моноаминодикарбоновые кислоты или моноаминомонокарбоновые моноамидокарбоновые кислоты (Asp, Glu, Asn и Gin).

Функциональный гомолог в пределах объема настоящего изобретения представляет собой полипептид, который обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей со встречающейся в природе формой GM-CSF человека, например, по меньшей мере 60% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 91% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 91% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 92% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 93% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 94% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 96% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 97% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей, например, 99% идентичностью последовательностей со встречающейся в природе формой GM-CSF человека.

Идентичность последовательностей можно вычислять с использованием множества общеизвестных алгоритмов и применяя множество различных штрафов за пропуски. Можно использовать любой алгоритм выравнивания последовательностей, такой как, но не ограничиваясь этим, FASTA, BLAST или GETSEQ, для поиска гомологов и вычисления идентичности последовательностей. Кроме того, когда уместно, в алгоритме поиска можно применять любую общеизвестную матрицу замен, такую как, но не ограничиваясь этим, матрицы PAM, BLOSSUM или PSSM. Например, PSSM (position specific scoring matrix) можно применять с помощью программы PSI-BLAST. Кроме того, выравнивание последовательностей можно осуществлять с использованием диапазона штрафов для открытия и продолжения пропуска. Например, алгоритм BLAST можно использовать со штрафом за открытие пропуска в диапазоне 5-12 и штрафом за продолжение пропуска в диапазоне 1-2.

Соответственно, вариант или его фрагмент в соответствии с изобретением может содержать, в пределах того же варианта последовательности или его фрагментов или среди различных вариантов последовательности или их фрагментов, по меньшей мере одну замену, например, множество замен, введенных независимо друг от друга.

Из описанного выше ясно, что один и тот же вариант или его фрагмент может содержать больше чем одну консервативную аминокислотную замену из больше чем одной группы консервативных аминокислот, как определено выше в настоящем документе.

Помимо двадцати стандартных аминокислот и двух специальных аминокислот, селеноцистеин и пирролизин, существует большое число «нестандартных аминокислот», которые не встраиваются в белок in vivo. Примеры нестандартных аминокислот включают серусодержащий таурин и нейропередатчики GABA и дофамин. Другими примерами являются лантионин, 2-аминоизомасляная кислота и дегидроаланин. Дополнительными нестандартными аминокислотами являются орнитин и цитруллин.

Нестандартные аминокислоты обычно создают через модификации стандартных аминокислот. Например, таурин можно создавать посредством декарбоксилирования цистеина, тогда как дофамин синтезируют из тирозина, а гидроксипролин получают посредством посттрансляционной модификации пролина (обычно в коллагене). Примерами неприродных аминокислот являются те, которые перечислены, например, в 37 C.F.R. раздел 1.822(b)(4), все они включены в настоящий документ посредством ссылки.

Как стандартные, так и нестандартные аминокислотные остатки, описанные в настоящем документе, могут быть в «D» или «L» изомерной форме.

Предусмотрено, что функциональный эквивалент в соответствии с изобретением может содержать какую-либо аминокислоту, включая нестандартные аминокислоты. В предпочтительных вариантах осуществления функциональный эквивалент содержит только стандартные аминокислоты.

Стандартные и/или нестандартные аминокислоты могут быть связаны пептидными связями или непептидными связями. Термин пептид также охватывает посттрансляционные модификации, введенных с помощью химических или ферментативных каталитических реакций, как известно в данной области. Такие посттрансляционные модификации можно вводить перед распределением, при желании. Аминокислоты, как точно определено в настоящем документе, предпочтительно находятся в L-стереоизомерной форме. Аналоги аминокислот можно использовать вместо 20 встречающихся в природе аминокислот. Известно несколько таких аналогов, в том числе фторфенилаланин, норлейцин, азетидин-2-карбоновая кислота, S-аминоэтилцистеин, 4-метилтриптофан и т. п.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, вариант GM-CSF содержит конъюгат, способный продлевать время полужизни активного ингредиента, например, такого как альбумин или жирная кислота.

Подходящие варианты должны быть по меньшей мере на 60% идентичны, предпочтительно по меньшей мере на 70%, и, соответственно, варианты предпочтительно обладают по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 91% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 91% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 92% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 93% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 94% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 96% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 97% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей, например, 99% идентичностью последовательностей с ранее определенной последовательностью встречающейся в природе формы GM-CSF человека.

Функциональные гомологи дополнительно могут содержать химические модификации, такие как убиквитинилирование, мечение (например, радионуклидами, различными ферментами и т. д.), пегилирование (получение производных с использованием полиэтиленгликоля) или посредством инсерции (или замены посредством химического синтеза) аминокислот, таких как орнитин, которые обычно не встречаются в белках человека.

В дополнение к пептидильным соединениям, описанным в настоящем документе, можно создавать стерически схожие соединения для того, чтобы имитировать ключевые части пептидной структуры, и такие соединения также можно использовать аналогичным образом, как и полипептиды по изобретению. Этого можно достигать способами моделирования и химического конструирования, известными специалистам в данной области. Например, этерификацию и другое алкилирование можно использовать для того, чтобы модифицировать аминоконец (N-конец), например, диаргининового пептидного остова, чтобы имитировать тетрапептидную структуру. Понятно, что все такие стерически схожие конструкции попадают в объем настоящего изобретения.

Пептиды с N-концевым алкилированием и C-концевой этерификацией также находятся в объеме данного изобретения. Функциональные эквиваленты также содержат гликозилированные и ковалентные или агрегационные конъюгаты, сформированные с теми же молекулами, включая димеры, или неродственными химическими фрагментами. Такие функциональные эквиваленты получают посредством связывания функциональностей с группами, которые находят во фрагменте, который включает какое-либо одно или оба из N- и C-концов, с помощью средств, известных в данной области.

Термин «его фрагмент» может относиться к какой-либо части данной аминокислотной последовательности. Фрагменты могут содержать больше чем одну часть внутри полноразмерного белка, которые соединены вместе. Подходящие фрагменты могут представлять собой мутанты с делециями или добавлениями. Добавление по меньшей мере одной аминокислоты может представлять собой добавление предпочтительно от 2 до 250 аминокислот, например, от 10 до 20 аминокислот, например, от 20 до 30 аминокислоты, например, от 40 до 50 аминокислот. Фрагменты могут содержать небольшие участки из белка или их комбинации. Делеция и/или добавление, независимо друг от друга, может представлять собой делецию и/или добавление в внутри последовательности и/или на конце последовательности.

Мутанты с делециями подходящим образом содержат по меньшей мере 20 или 40 последовательных аминокислот и более предпочтительно по меньшей мере 80 или 100 последовательных аминокислот в длину. Соответственно, такой фрагмент может представлять собой более короткую последовательность, взятую из последовательности GM-CSF человека, которая содержит по меньшей мере 20 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 30 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 40 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 50 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 60 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 70 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 80 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 90 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 95 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 100 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 105 аминокислот, например, по меньшей мере 110 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 115 последовательных аминокислот, например, по меньшей мере 120 последовательных аминокислот, в которых указанные мутанты с делециями предпочтительно обладают по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 91% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 91% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 92% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 93% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 94% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 96% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 97% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей, например, 99% идентичностью последовательностей со встречающейся в природе формой GM-CSF человека.

Предпочтительно функциональные гомологи GM-CSF содержат самое большее 500, более предпочтительно самое большее 400, даже более предпочтительно самое большее 300, еще более предпочтительно самое большее 200, например, самое большее 175, например, самое большее 160, например, самое большее 150 аминокислот, например, самое большее 144 аминокислот.

Существует два известных варианта GM-CSF человека: замена T1151 в варианте 1 и замена 1117T в варианте 2. Соответственно, в одном из вариантов осуществления изобретения функциональный гомолог GM-CSF содержит последовательность с высокой идентичностью последовательностей с GM-CSF человека № 1 или каким-либо из вариантов сплайсинга.

Аналоги GM-CSF описаны, например, в патентах США №№ 5229496, 5393870 и 5391485. Такие аналоги также представляют собой функциональные эквиваленты, содержащиеся в настоящем изобретении.

В одном из вариантов осуществления GM-CSF используют в соответствии с настоящим изобретением в гомо- или гетеромерной форме. Гомо- и гетеромерные формы GM-CSF могут содержать один или несколько мономеров GM-CSF или функциональных гомологов GM-CSF, как определено выше в настоящем документе. Гомо- и гетеромеры включают димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры, гептамеры, октамеры, нонамеры и декамеры.

В одном из вариантов осуществления используют гомодимер, тример или тетрамер GM-CSF.

Аминокислотная последовательность формы предшественника GM-CSF от Homo sapiens (содержащей сигнальный пептид) (SEQ ID № 1) представляет собой:

MWLQSLLLLG TVACSISAPA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA

AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH

YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE.

Аминокислотная последовательность соответствующего зрелого белка (SEQ ID № 2) представляет собой:

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ

EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI

ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE

Функциональные гомологи встречающейся в природе формы GM-CSF человека в соответствии с настоящим изобретением могут быть коммерчески доступны, например, сарграмостим (Leukine®; Immunex, Seattle, WA, USA).

Рекомбинантное получение GM-CSF

GM-CSF или его функциональные варианты или гомологи можно получать различными способами, такими как выделение, например, из сыворотки человека или животного, или посредством экспрессии в клетках, таких как прокариотические клетки, дрожжевые клетки, клетки насекомых, клетки млекопитающих или в бесклеточных системах.

В одном из вариантов осуществления изобретения GM-CSF получают рекомбинантным путем с помощью клеток-хозяев. Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения GM-CSF получают с помощью клеток-хозяев, содержащих первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует GM-CSF, функционально связанную со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, способной управлять экспрессией в указанных клетках-хозяевах. Вторая последовательность нуклеиновой кислоты, таким образом, может содержать или даже состоять из промотора, который будет направлять экспрессию белка, представляющего интерес, в указанных клетках. Специалист легко сможет идентифицировать эффективную вторую последовательность нуклеиновой кислоты для использования в данной клетке-хозяине.

Процесс получения рекомбинантного GM-CSF в целом включает стадии

- предоставление клетка-хозяин

- получение генетической экспрессионной конструкции, содержащей первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует GM-CSF, функционально связанной со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, способной управлять экспрессией указанного белка, представляющего интерес, в клетке-хозяине

- трансформирование клетки-хозяина с использованием конструкции

- культивирование клетки-хозяина, тем самым достигая экспрессии GM-CSF.

Рекомбинантный GM-CSF, получаемый таким образом, можно выделять каким-либо стандартным способом, таким как любой из способов выделения белка, описанных далее в настоящем документе. Специалист сможет идентифицировать подходящие стадии выделения белка для очистки GM-CSF.

В одном из вариантов осуществления изобретения клетки-хозяева экскретируют рекомбинантно получаемый GM-CSF. Когда происходит экскреция GM-CSF, процесс получения рекомбинантного белка, представляющего интерес, может включать стадии

- предоставление клетки-хозяина

- получение генетической экспрессионной конструкции, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует GM-CSF, функционально связанную со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, способной управлять экспрессией указанного белка, представляющего интерес, в указанной клетке-хозяине

- трансформирование указанной клетки-хозяина с использованием конструкции

- культивирование клетки-хозяина, тем самым достигая экспрессии GM-CSF и секреции GM-CSF в среду для культивирования

- тем самым получая среду для культивирования, которая содержит GM-CSF.

Композиция, которая содержит GM-CSF и нуклеиновые кислоты, таким образом, в этом варианте осуществления изобретения может представлять собой среду для культивирования или композицию, полученную из среды для культивирования.

В другом варианте осуществления изобретения указанная композиция представляет собой экстракт, полученный из животных, их частей или клеток, или выделенную фракцию такого экстракта.

В одном из вариантов осуществления изобретения GM-CSF получают рекомбинантным путем in vitro в клетках-хозяевах и выделяют из клеточного лизата, клеточного экстракта или из супернатанта культуры ткани. В более предпочтительном варианте осуществления GM-CSF получают с помощью клеток-хозяев, которые модифицируют таким образом, что они экспрессировали релевантный GM-CSF. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные клетки-хозяева трансформируют, чтобы они продуцировали и экскретировали релевантный GM-CSF.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут содержать GM-CSF или его функциональные варианты или гомологи в концентрации of 1 мкг/мл до 10 мг/мл, более предпочтительно от 5 мкг/мл до 500 мкг/мл и даже более предпочтительно от 10 мкг/мл до 200 мкг/мл.

Препараты фосфомицина

Препараты фосфомицина, которые попадают в объем настоящего изобретения, представляют собой соединения и соли соединений, которые содержат структуру (-)(1R,2S)-1,2-эпоксипропилфосфоновой кислоты, систематическое название [(2R,3S)-3-метилоксиран-2-ил]фосфоновая кислота, молекулярная масса по формуле соединения 138,1 Да. Несмотря на то, что форму свободной кислоты этой структуры используют в качестве основы для вычисления эффективных количеств и концентраций фосфомицина, свободная кислота нестабильна, и антибиотик для клинического использования представляют в виде неорганической или органической соли. Неограничивающие примеры неорганических противоионов солей фосфомицина в пределах объема настоящего изобретения представляют собой натрий, кальций, калий, литий, аммоний, магний. Неограничивающие примеры органических противоионов солей фосфомицина в пределах объема настоящего изобретения представляют собой трометамол (также известный как трометамин или трис, систематическое название 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол), фенилэтиламин и большое число других биологически совместимых органических аминов. Принципиальные формы фосфомицина, которые используют в настоящее время и которые входят в объем данного изобретения, представляют собой:

i) Фосфомицин динатрия, молекулярная масса по формуле соединения 182,0 Да, pH 5% раствора 9,0-10,5. Эта соль хорошо растворима в воде, раздражает желудок и в основном ее используют для внутривенных инъекций.

ii) Моногидрат фосфомицина кальция, молекулярная масса по формуле соединения 194,1 Да, pH 0,4% раствора 8,1-9,6. Эта соль умеренно растворима в воде, но меньше раздражает желудок, и ее используют для перорального лечения. Его биодоступность может составлять всего лишь 12% (Bergan T, 1990).

iii) Трометамол фосфомицина, молекулярная масса по формуле соединения 259,2 Да, pH 5% раствора 3,5-5,5. Эта соль обладает высокой растворимостью в воде, хорошо переносится при пероральном использовании, и используется, в частности, в качестве однодозового перорального лечения для инфекции нижних мочевыводящих путей, демонстрируя биодоступность приблизительно 40%.

Общим для этих препаратов является то, что они стабильны в течение по меньшей мере 3 лет в виде сухих порошков при 25°C, но демонстрируют pH-зависимую нестабильность в водном растворе при 25°C, утрачивая 10% активности фосфомицина за 10 ч при pH 3, 2 месяца при pH 6,5 и 2 лет при pH 9,75. Сниженная стабильность при низком pH следует принимать в расчет при формулировании водных композиций для топического нанесения с подходящим сроком хранения.

Комбинация с другими противомикробными средствами

Композиция по настоящему изобретению также может содержать одно или несколько дополнительных противомикробных средств, чтобы усиливать их бактерицидное действие, оказываемое на важные патогенны, такие как Staphylococcus aureus или Pseudomonas aeruginosa, предотвращать чрезмерный рост любых штаммов, которые развивают устойчивость при длительном лечении или расширять противомикробный спектр, чтобы включить небактериальные патогены, включая в качестве неограничивающих примеров грибы. Неограничивающие примеры противомикробных средств, которые можно включать в композицию, представляют собой: фусидовую кислоту или фузидат натрия, пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, макролиды, ванкомицин, линкомицин, клиндамицин, фторхинолоны, мупироцин, бацитрацин, полимиксин B, грамицидины, метронидазол, клотримазол, кетоконазол и нистатин. В частности, подходящими для включения являются средства, которые демонстрируют синергическое бактерицидное действие с фосфомицином, их неограничивающими примерами являются: пенициллин, ампициллин, карбенициллин, метициллин, оксациллин, мезлоциллин, пиперациллин, азтреонам, имипенем, цефалексин, цефалотин, цефамандол, цефокситин, цеметазол, цефотаксим, цефазолин, цефоперазон, цефсулодин, цефтадизим, цефепим, стрептомицин, гентамицин, канамицин, нетилмицин, тобрамицин, амикацин, эритромицин, мидекамицин, ванкомицин, линкомицин, клиндамайцин, тейкопланин, даптомицин, ципрофлоксацин, офлоксазин, левофлоксазин, перфлоксацин, спарфлоксацин. В водном растворе с фосфомицином несовместимы определенные антибиотики, такие как ампициллин, метампициллин, цефалоридин, цефалотин, стрептомицин, гентамицин, канамицин, признак, который может делать их неподходящими для водных композиций в пределах объема по данному изобретению.

В одном из вариантов осуществления дополнительный антибиотик или антибактериальное средство выбирают из списка из арбекацина, азтреонама, цефокситина, цефоперазона, цефалексина, клиндамицина, флуклоксациллина, меропенема, метронидазола, мезлоциллина или ванкомицина. Выбор клиндамицина или меропенема или метронидазола, в частности, предназначен для лечения ран, в отношении которых предполагают или знают, через подходящую бактериальную культуру, что они инфицированы анаэробными бактериями, в том числе видами Bacteroides.

В другом варианте осуществления дополнительный антибиотик представляет собой по меньшей мере комбинацию азтреонама и арбекацина. В частности, она предназначена для лечения ран, в отношении которых предполагают или знают, через подходящую бактериальную культуру, что они инфицированы Pseudomonas aeruginosa.

Поскольку все приведенные выше соединения известны специалисту, то специалисту не составит слишком большого труда выбрать из списка соединений, какое соединение(соединения) комбинировать с лечением GM-CSF и фосфомицином на основании данных тестов на отличительные черты инфекционных организмов, которые подлежат лечению.

Дополнительные ингредиенты фармацевтической композиции

Витамин A и антиоксиданты дополнительно могут оказывать стимулирующий эффект на ткань во время процесса заживления. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция, как определено в настоящем документе, дополнительно содержит витамин A и/или антиоксидант, неограничивающие примеры которого включают: витамин E (в форме α-токоферола), убихинон, идебенон, каротиноиды, такие как ликопен, аскорбиновая кислота или аскорбаты и никотинамид.

Доза

Под «эффективным количеством» фармацевтических композиций по настоящему изобретению понимают дозу, которая при введении нуждающемуся в этом субъекту достигает концентрации, которая имеет полезный биологический эффект, т. е. посредством лечения, предотвращения или облегчения раздражения или повреждения, такого как раны, язвы и другие повреждения кожи, слизистых оболочек или соединительной ткани организма. Такое эффективное количество может определять лечащий врач пациента или ветеринар, а также легко устанавливать специалист в данной области. Факторы, которые влияют на то, каким будет терапевтически эффективное количество, включают следующее:

i) специфическая активность используемого терапевтического средства,

ii) тип повреждения (механическое или тепловое, глубокое или поверхностное и т. д.)

iii) размер повреждения

iv) глубина повреждения (если глубокое)

v) присутствие инфекции и тип инфекции

vi) время, которое прошло с момента нанесения повреждения

vii) наличие других состояний заболеваний

viii) возраст, физическое состояние и пищевой статус пациента

Другое лечение, которое может получать пациент, будет влиять на определение терапевтически эффективного количества терапевтического средства для введения.

Тогда как эффективные количества и дозы ингредиентов фармацевтической композиции определяют по отношению к массе тела или площади поверхности тела для системного лечения, для топического нанесения композиции на раны и язвы, эффективные количества и дозы более надлежаще выражают в зависимости от площади раны или язвы, подлежащей лечению, например, выражаемой в квадратных сантиметрах, при условии, что системная абсорбция активных ингредиентов не ведет к нежелательно высокой дозе для пациента.

Эффективное количество GM-CSF или его функционального варианта или гомолога для топического нанесения на рану или язву может составлять от 1 микрограмма (мкг) до 100 мкг на квадратный сантиметр в сутки, например, в диапазоне от 2 мкг до 80 мкг на квадратный сантиметр в сутки и, в частности, в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг на квадратный сантиметр в сутки. Эффективное количество выражают в зависимости от количества полностью функционального гомолога GM-CSF человека, подлежащего приему, такого как молграмостим, и корректируют в соответствии с функциональной активностью используемого гомолога.

В практических терминах, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит GM-CSF или его фрагмент или вариант в концентрации в диапазоне от 1 мкг/мл (или мкг/г) до 10 мг/мл (или мг/г), например, в диапазоне от 5 мкг/мл (или мкг/г) до 500 мкг/мл (или мкг/г) или, например, в диапазоне от 10 мкг/мл (или мкг/г) до 200 мкг/мл (или мкг/г).

Эффективное количество подходящей соли фосфомицина для топического нанесения на рану или язву может составлять от 10 мг до 1000 мкг на квадратный сантиметр в сутки, например, в диапазоне от 20 мкг до 800 мкг на квадратный сантиметр в сутки и, в частности, в диапазоне от 50 мкг до 500 мкг на квадратный сантиметр в сутки. Эффективное количество выражают в пересчете на содержание свободной кислоты фосфомицина в используемом препарате.

В практических терминах фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит соль фосфомицина в концентрации в диапазоне от 100 мкг/мл (или мкг/г) до 30 мг/мл (или мг/мл), например, в диапазоне от 250 мкг/мл (или мкг/г) до 10 мг/мл (или мг/г) в пересчете на свободную кислоту фосфомицина.

Эффективное количество дополнительного противомикробного средства для топического нанесения известно в данной области и может быть добавлено в фармацевтические композиции по настоящему изобретению в количестве, которое корректируют с тем, чтобы при введении эффективного количества GM-CSF и фосфомицина, также вводить эффективное количество дополнительного противомикробного средства. На практике это обозначает, например, что фусидовую кислоту следует добавлять в композицию в количестве, схожем с таковым для фосфомицина, тогда как, например, тобрамицин следует добавлять в количестве, которое составляет между 1% и 10% от количества фосфомицина.

Эффективную суточную дозу предпочтительно вводят раз в сутки, но можно вводить разделенными дозами два раза в сутки, три раза в сутки, четыре раза в сутки, пять раз в сутки или шесть раз в сутки.

Длительность дозирования типично находится в диапазоне от 1 суток приблизительно до 4 месяцев, например, в диапазоне от 1 суток до 2 суток, от 2 суток до 3 суток, от 3 суток до 4 суток, от 4 суток до 5 суток, от 5 суток до 6 суток или в диапазоне от 1 недели до 2 недель, от 2 недель до 3 недель, от 3 недель до 4 недель или в диапазоне от 1 месяца до 2 месяцев, от 2 месяцев до 3 месяцев, от 3 месяцев до 4 месяцев, до тех пор пока повреждение остается незажившим.

Трансформация покоящегося макрофага в полностью иммунокомпетентную дендритную клетку после инкубации макрофагов in vitro с GM-CSF занимает приблизительно 10 суток. В одном из вариантов осуществления длительность дозы имеет продолжительность, которая делает возможным указанное трансформирование, таким образом длительность может находиться в диапазоне от 7 суток до 14 суток, например, от 8 суток до 12 суток, например, 8 суток или 9 суток или 10 суток или 11 суток или 12 суток.

Схема дозирования может изменяться между периодами введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением и периодами без введения (пауза в лечении). Период с паузой лечения в такой схеме дозирования может длиться в течение от 5 суток до 10 суток, например, 5 суток или 6 суток или 7 суток или 8 суток или 9 суток или, например, 10 суток или больше, например, от 1 до 4 месяцев.

Примеры схем дозирования могут включать цикл из 10 суток лечения с использованием фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением и 7 суток паузы в лечении. Паузу в лечении можно продлевать до 2 или 3 недель или больше, вплоть до 6 недель, если выполняют замену на альтернативное лечение с использованием препарата, который не содержит антибиотик. Это для того, чтобы предотвращать образование организмов с устойчивостью к антибиотику в отдельной ране.

Превращение покоящихся макрофагов в дендритные клетки можно стимулировать посредством повторения схемы дозирования. Таким образом, схемы дозирования можно повторять один, два, три, четыре, пять или больше раз для того, чтобы добиваться эффективного лечения.

В одном из вариантов осуществления схему дозирования повторяют, например, один раз, два раза, три раза или больше раз, например, повторяют в течение остатка жизни субъекта, нуждающегося в этом.

В другом варианте осуществления пациентов лечат с использованием схемы дозирования из 10 суток лечения фармацевтической композицией в соответствии с настоящим изобретением, после чего в указанном лечении следует пауза 7-20 суток и впоследствии повторение схемы дозирования 2-3 или больше раз.

Составы

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть в форме порошка, спрея с присыпкой, пасты, мази, лосьона, геля, крема, бальзама, эмульсии, суспензии, раствора, спрея, губки, полоски, пластыря, прокладки, повязки или может быть сформулирована в виде пластинки для стомы. Активные ингредиенты композиции можно суспендировать в виде микронизированного порошка в неводных средах или растворять в водных средах.

Присыпка представляет собой предпочтительный состав, поскольку в сухой порошкообразной форме активные ингредиенты композиции совместимы друг с другом и демонстрируют длительную стабильность при комнатной температуре. Состав может содержать порошковую добавку, такую как крахмал стеарат, целлюлоза, лактоза, оксид цинка, диоксид кремния, карбонат магния, тальк или глина.

Мазь, содержащая углеводородные гели без водного компонента, также представляет собой предпочтительный состав, поскольку фосфомицин в микронизированной форме не подвержен разложению посредством гидролиза в присутствии воды при субщелочных уровнях pH и будет иметь подходящий длительный срок хранения. Мазь можно превращать в пасту посредством добавления порошков, таких как крахмал, оксид цинка, тальк или диоксид титана.

В примере 2 приведена композиция мази для предоставления эффективной дозы GM-CSF и фосфомицина за одно ежедневное нанесение.

В примере 3 приведена композиция мази для предоставления эффективной дозы GM-CSF и фосфомицина вместе с клиндамицином за одно ежедневное нанесение, чтобы обеспечивать сильное действие против анаэробных бактерий, а также против метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus (MRSA).

В примере 4 приведена композиция мази для предоставления эффективной дозы GM-CSF и фосфомицина вместе с арбекацином и азтреонамом за одно ежедневное нанесение, чтобы обеспечивать сильное действие против Pseudomonas aeruginosa.

Водные среды, такие как гели, кремы, лосьоны, растворы и суспензии, также можно использовать, но необходимо корректировать pH до значения между pH 7 и pH 10, предпочтительно по меньшей мере до pH 8, чтобы гарантировать обоснованную стабильность компонента фосфомицин и, таким образом, подходящий срок хранения состава. pH водной среды можно корректировать посредством низких концентраций подходящих биологически совместимых буферных ингредиентов, неограничивающие примеры представляют собой трометамин, карбонат и бикарбонат натрия, а также первичный кислый фосфат натрия и вторичный кислый фосфат натрия. Также можно добавлять средства, корректирующие тоничность, например, такие как хлорид натрия, хлорид калия или хлорид кальция.

Можно формулировать композиции в соответствии с настоящим изобретением для улучшенного проникновения и эффекта активных ингредиентов при их прохождении через трансмукозальный барьер или эпидермис. Улучшенного прохождения через трансмукозальный барьер можно достигать с помощью состава, который способен прилипать к слизистой, эпидермису или раневой поверхности. Это является существенной характеристикой предложенного состава мази, но можно добавлять специальные средства, улучшающие проникновение, неограничивающие примеры которых представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид, 1-децилдиметилсульфоксид, N-метилпирролидон, диэтилтолуамид, изопропилмиристат, изопропилпальмитат и сложные эфиры олеиновой кислоты.

Составы в соответствии с настоящим изобретением могут содержать фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты, в том числе микросферы, липосомы, мицеллы, микрокапсулы, наночастицы или тому подобное. Компонент GM-CSF можно формулировать, например, в липосомах с внешним жировым слоем и ядром из водной фазы, в которой растворяют компонент GM-CSF. Липидный слой таких составов преодолевает барьер проницаемости эпидермиса или слизистой оболочки.

Стандартные липосомы типично состоят из фосфолипидов (нейтральных или отрицательно заряженных) и/или холестерина. Липосомы представляют собой везикулярные структуры на основе липидных бислоев, которые окружают водные компартменты. Они могут переменные физикохимические свойства, такие как размер, липидная композиция, заряд поверхности и число и текучесть фосфолипидных бислоев. Наиболее часто используемыми липидами для формирования липосом являются: 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DLPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), 1,2-диолeоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DMPE), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DPPE), 1,2-диолeоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфат (соль мононатрия) (DMPA), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфат (соль мононатрия) (DPPA), 1,2-диолeоил-sn-глицеро-3-фосфат (соль мононатрия) (DOPA), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-[фосфо-rac-(1-глицерин)] (соль натрия) (DMPG), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-[фосфо-rac-(1-глицерин)] (соль натрия) (DPPG), 1,2-диолeоил-sn-глицеро-3-[фосфо-rac-(1-глицерин)] (соль натрия) (DOPG), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-[фосфо-1-серин] (соль натрия) (DMPS), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-[фосфо-1-серин) (соль натрия) (DPPS), 1,2-диолeоил-sn-глицеро-3-[фосфо-1-серин] (соль натрия) (DOPS), 1,2-диолeоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-n-(глутарил) (соль натрия) и 1,1',2,2'-тетрамиристоилкардиолипин (соль аммония). Составы, состоящие из DPPC в комбинации с другими липидами или модификаторами липосом, предпочтительны, например, в комбинации с холестерином и/или фосфатидилхолином.

Эффективный путь получения липосом состоит в ковалентном прикреплении гидрофильного полимера полиэтиленгликоля (PEG) к внешней поверхности липосомы. Некоторые предпочтительные липиды представляют собой: 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-n-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-n-[метокси(полиэтиленгликоль)-5000] (соль аммония), 1,2-диолeоил-3-триметиламмоний-пропан (хлорид соль) (DOTAP).

Возможные липиды, которые можно применять для липосом, поставляют, например, Avanti, Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, USA. Дополнительно суспензия липосом может содержать защищающие липиды средства, которые защищают липиды от свободнорадикального и перекисного повреждения липидов при хранении. Предпочтительными являются липофильные гасители свободных радикалов, такие как α-токоферол, и водорастворимые специфичные хелаторы железа, такие как ферриоксамин.

Доступно несколько способов получения липосом, как описано, например, у Szoka F et al. (1980), в патентах США №№ 4235871, 4501728 и 4837028, все они включены в настоящий документ посредством ссылки. Другим способом получают многослойные везикулы гетерогенных размеров. В этом способе липиды, которые формируют везикулы, растворяют в подходящем органическом растворителе или системе растворителей и сушат под вакуумом или в инертном газе для того, чтобы формировать тонкую липидную пленку. При желании, пленку можно повторно растворять в подходящем растворителе, таком как третичный бутанол, и затем лиофилизировать для того, чтобы формировать более гомогенную смесь липидов, которая принимает более легко гидратируемую порошкообразную форму. Эту пленку покрывают водным раствором направленного лекарственного средства и направляющего компонента и оставляют гидратироваться, типично в течение периода 15-60 минут при встряхивании. Распределение размеров получаемых многослойных везикул может быть сдвинуто в направлении меньших размеров посредством гидратации липидов в условиях более энергичного встряхивания или посредством добавления солюбилизирующих детергентов, таких как дезоксихолат.

Чтобы гарантировать достаточный срок хранения для компонентов дерматологического состава, в частности, для фосфомицина, который нестабилен в водных средах при физиологическом pH, при этом одновременно предоставляя состав, который приемлем для пациента в отношении раздражения в месте применения, вариант осуществления изобретения включает снабжение активными компонентами в наборе в виде отдельных частей, подлежащих смешиванию незадолго перед использованием. Набор дополнительно может содержать среду, в которой компоненты можно смешивать перед топическим нанесением на рану. Среда может содержать, в дополнение к другим ингредиентам, буферные средства, такие как те, которые указаны выше, чтобы гарантировать что pH состава подходит для дерматологического использования, когда все ингредиенты смешаны.

Показания

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтические композиции для использования при лечении ран, язв, пролежней, ожогов или других повреждений кожи, слизистых оболочек или соединительной ткани организма, которые могут быть острыми или хроническими. Такие повреждения могут быть обусловлены широким спектром событий и/или могут быть связаны с другими заболеваниями. Повреждения, подлежащие лечению, включают те, которые связаны с разрезами, разрывами, истиранием, волдырями, гематомой, проколом, проникновением, выстрелом, электричеством, облучением, химическим веществом, травмой, сжатием, укусом, ожогом, холодом, хирургическим вмешательством, первичной злокачественной опухолью или метастазами, доброкачественной опухолью, акне, инфекциями, такими как бактериальная инфекция (которая может быть комбинирована с грибковой или вирусной или паразитарной инфекцией), повреждениями, связанными со сниженной циркуляцией крови, такими как язвы ног и язвы стоп, связанные с венозной недостаточностью или артериальной недостаточностью, пролежнями и повреждениями, связанными с сахарным диабетом.

Хронические раны, теперь в целом называемые «незаживающими ранами», или повреждения, раны или язвы возникают, когда рана не может пройти подходящий своевременный процесс заживления, чтобы достичь нормальной длительной и стабильной анатомической и функциональной целостности зажившей ткани. Говоря в общем, кожное повреждение, которое не может выполнить существенный прогресс в направлении заживления в течение периода в три месяца или которое стало стабильным в частично зажившем состоянии в течение больше чем трех месяцев, можно классифицировать как хроническую или «незаживающую» рану. Это общее определение не обладает универсальной применимостью, поскольку возраст и физическое состояние пациента, а также другие факторы, такие как заболевания или нарушения, которыми страдает пациент (например, нарушения циркуляции), могут значительно удлинять нормальный процесс заживления. В таких случаях повреждение кожи, которое не заживает после шести месяцев, можно классифицировать как «незаживающую» рану.

«Незаживающая» рана или хроническое повреждение кожи является язвенным, когда оно включает очаговую утрату эпидермиса и по меньшей мере части дермы. Хроническое язвенное повреждение кожи обычно сопровождают другие симптомы, помимо невозможности нормального процесса заживления. Типичные сопроводительные признаки и симптомы включают одно или несколько из следующего: боль, экссудация, плохой запах, экскориация, распространение раны, некроз тканей, раздражение и гиперкератоз. Такие симптомы могут быть чрезвычайно изнуряющими и мешающими для пациентов и могут серьезно снижать качество жизни пациента. В тяжелых случаях они могут делать неизбежной ампутацию конечностей или даже вести к смерти.

Озлокачествленное или предопухолевое хроническое язвенное повреждение кожи может возникать в связи с первичной злокачественной опухолью кожи или с метастазами в кожу из локальной опухоли или из опухоли в отдаленном месте. Они могут иметь или не иметь отделяемое. Они могут, например, принимать форму полости, открытой области на поверхности кожи, кожных узелков или узелкового роста, идущего от поверхности кожи.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения всех указанных выше незаживающих ран или хронических язвенных повреждений кожи и, таким образом, снижать или предотвращать один или несколько симптомов, сопровождающих такие повреждения.

Варианты осуществления

1. Фармацевтическая композиция, которая содержит

a. гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) или его фрагмент или вариант, и

b. фосфомицин в форме его неорганической или органической соли.

2. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 1, которая содержит один или несколько дополнительных антибиотиков или противомикробных средств.

3. Композиция согласно варианту осуществления 2, в которой один или несколько дополнительных антибиотиков или противомикробных средств выбирают из списка из фусидовой кислоты, пенициллинов, цефалоспоринов, аминогликозидов, макролидов, ванкомицина, линкомицина, клиндамицина, фторхинолонов, мупироцина, бацитрацина, полимиксина B, грамицидинов, метронидазола, клотримазола, кетоконазола и нистатина.

4. Композиция согласно варианту осуществления 2 или 3, в которой один или несколько дополнительных антибиотиков или противомикробных средств выбирают из списка из пенициллина, ампициллина, карбенициллина, метициллина, оксациллина, флуклоксациллина, мезлоциллина, пиперациллина, азтреонама, имипенема, цефалексина, цефалотина, цефамандола, цефокситина, цеметазола, цефотаксима, цефазолина, цефоперазона, цефсулодина, цефтадизима, цефепима, стрептомицина, гентамицина, канамицина, нетилмицина, тобрамицина, амикацина, эритромицина, мидекамицина, ванкомицина, линкомицина, клиндамайцина, тейкопланина, даптомицина, ципрофлоксацина, офлоксазина, левофлоксазина, перфлоксацина, спарфлоксацина, цефтриаксона, арбекацина или ванкомицина.

5. Композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, в которой рану или повреждение инфицирует стафилококк, такой как Staphylococcus aureus, или Pseudomonas, такой как Pseudomonas aeruginosa.

6. Композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, в которых композиция не находится в водном растворе и в которых дополнительный антибиотик или микробное средство представляет собой любое одно из ампициллина, метампициллина, цефалоридина, цефалотина, стрептомицина, гентамицина или канамицина.

7. Композиция по любому одному из предшествующих вариантов осуществления, в которых композиция дополнительно содержит одно или несколько из следующего: витамин A, антиоксидант, такой как одно или несколько из следующего: витамин E (в форме α-токоферола), убихинон, идебенон, каротиноиды, например, ликопен, аскорбиновая кислота или аскорбаты или никотинамид.

8. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которых композиция предназначена для лечения, облегчения или ускорения заживления повреждения, такого как рана, язва, пролежень или ожог любого одного из кожи, слизистых оболочек или соединительной ткани, лежащей под повреждением.

9. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которых повреждение является хроническим.

10. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из вариантов осуществления 1-11, в которых повреждение является острым.

11. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которых повреждение связано с колонизацией или инфекцией бактериями, грибами, вирусами или паразитами.

12. Композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которых повреждение инфицировано бактериями из любого одного из родов Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Escherichia, Proteus, Serratia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Haemophilus и Vibrio, Proteus spp., Klebsiella и Enterobacter spp., Peptostreptococcus (в том числе Peptoniphilus, Finegoldia и Anaerococcus) и Fusobacterium.

13. Композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которых активные компоненты предоставляют в наборе в виде отдельных частей, подлежащих смешиванию незадолго перед использованием.

14. Набор согласно варианту осуществления 13, в котором набор дополнительно содержит среду, в которой компоненты можно смешивать перед топическим нанесением на рану.

15. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которых повреждение связано с сахарный диабет.

16. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которых повреждение связано со сниженной циркуляцией крови, например, венозные язвы ноги, венозные язвы стопы, артериальные язвы ноги, артериальные язвы стопы и пролежни.

17. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, сформулированная для топического нанесения в виде порошка, пасты, мази, лосьона, геля, крема, бальзама, эмульсии, суспензии, раствора, спрея, губки, полоски, пластыря, прокладки, повязки или сформулированная в виде пластинки для стомы.

18. Композиция согласно любому одному из предыдущих вариантов осуществления, в которой GM-CSF и фосфомицин предназначены для топического введения, а дополнительное противомикробное лекарственное средство предназначено для нетопического введения.

19. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из вариантов осуществления с 1 до 14, в которых GM-CSF находится в составе липосом или мицелл или микрокапсул или наночастиц.

20. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, в которых вариант GM-CSF по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID № 1 или 2.

21. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, в которой фрагмент GM-CSF содержит по меньшей мере 50 непрерывных аминокислотных остатков из любой одной из SEQ ID № 1 или 2.

22. Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 21, в которой фрагмент по меньшей мере на 70% идентичен SEQ ID № 1 или 2 в диапазоне перекрытия.

23. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, которая содержит GM-CSF или его фрагмент или вариант в концентрации от 1 мкг/мл до 10 мг/мл.

24. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, которая содержит GM-CSF или его фрагмент или вариант в концентрации от 5 мкг/мл до 500 мкг/мл.

25. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, которая содержит GM-CSF или его фрагмент или вариант в концентрации от 10 мкг/мл до 200 мкг/мл.

26. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, которая содержит соль фосфомицина в концентрации от 100 мкг/мл до 10 мг/мл в пересчете на свободную кислоту фосфомицина.

27. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, которая содержит соль фосфомицина в концентрации от 250 мкг/мл до 1 мг/мл в пересчете на свободную кислоту фосфомицина.

28. Фармацевтическая композиция согласно вариантам осуществления 17 и 18, в которых соль фосфомицина представляет собой фосфомицин динатрия или фосфомицин кальция или трометамол фосфомицина, также известный как трометамин фосфомицина.

29. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, которая дополнительно содержит один или несколько дополнительных антибиотиков или противомикробных средств.

30. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, которая дополнительно содержит витамин A и/или антиоксидант.

31. Фармацевтическая композиция согласно любому одному из предшествующих вариантов осуществления, в которой вариант GM-CSF содержит конъюгат, способный продлевать время полужизни GM-CSF.

32. Фармацевтическая композиция согласно предшествующему варианту осуществления, в которой конъюгат, способный продлевать время полужизни варианта GM-CSF, представляет собой альбумин или жирную кислоту.

33. Фармацевтические композиции согласно любому одному из предшествующих пп. также можно использовать в способах лечения.

Примеры

Следующие неограничивающие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1: Последовательности

SEQ ID № 1 - предшественник GM-CSF человека

>sp|P04141 |CSF2_HUMAN Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor OS=Homo sapiens

MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETV EVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCA TQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE

SEQ ID № 2 - зрелый GM-CSF человека

>sp|P04141118-144

APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQT RLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLV IPFDCWEPVQE

Пример 2: Мазь для лечения ран, язв, пролежней или ожогов кожи

Микронизированный молграмостим	0,5 мг	0,05%
Микронизированный трометамол фосфомицина	5 мг	0,5%
Хлорбутанол, безводный	5 мг	0,5%
Минеральное масло	50 мг	5%
Белый вазелин	До 1 г	До 100%

Эта композиция может особенно подходить для язв ног из-за венозной недостаточности, которые не демонстрируют клинических признаков сильной бактериальной инфекции.

Пример 3: Мазь для лечения ран, язв, пролежней или ожогов кожи, которая содержит дополнительный антибиотик в дополнение к фосфомицину

Микронизированный молграмостим	0,5 мг	0,05%
Микронизированный трометамол фосфомицина	5 мг	0,5%
Микронизированный фосфат клиндамицина	10 мг	1,0%
Хлорбутанол, безводный	5 мг	0,5%
Минеральное масло	50 мг	5%
Белый вазелин	До 1 г	До 100%

Эта композиция может особенно подходить для лечения ран и язв, в которых инфекцию анаэробными бактериями предполагают или верифицируют с помощью культуры анаэробных бактерий. Также она может подходить для ран, инфицированных метициллин-устойчивым Staphylococcus aureus (MRSA), чувствительность которого к клиндамицину верифицировали с помощью культуры.

Пример 4: Мазь для лечения ран, язв, пролежней или ожогов кожи, которая содержит дополнительных два антибиотика в дополнение к фосфомицину

Микронизированный молграмостим	0,5 мг	0,05%
Микронизированный трометамол фосфомицина	5 мг	0,5%
Микронизированный арбекацина сульфат	2 мг	0,2%
Микронизированный азтреонам	5 мг	0,5%
Хлорбутанол, безводный	5 мг	0,5%
Минеральное масло	50 мг	5%
Белый вазелин	До 1 г	До 100%

Эта композиция может особенно подходить для лечения ран и язв, в которых инфекцию Pseudomonas aeruginosa предполагают или верифицируют посредством бактериальной культуры.

Литература

Armitage JO (1998) Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 92:4491 -4508.

Brown CB, Pihl CE, Kaushansky K. (1994) Mapping of human granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor domains interacting with the human granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-receptor alpha-subunit. Eur J Biochem 225:873-880.

Brown ED, Vivas El, Walsh CT, Kolter R (1995) MurA (MurZ), the enzyme that catalyzes the first committed step in peptidoglycan biosynthesis, is essential in Escherichia coli. J Bacteriol 177:4194-4197.

Burgess AW, Begley CG, Johnson GR, Lopez AF, Williamson DJ, Mermod JJ, Simpson RJ, Schmitz A, DeLamarter JF (1987) Purification and properties of bacterially synthesized human granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Blood 69:43-51.

Cantrell MA, Anderson D, Cerretti DP, Price V, McKereghan K, Tushinski RJ, Mochizuki DY, Larsen A, Grabstein K, Gillis S, et al (1985) Cloning, sequence, and expression of a human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Proc Natl Acad Sci USA 82:6250-6254.

Cebon J, Nicola N, Ward M, Gardner I, Dempsey P, Layton J, Dijhrsen U, Burgess AW, Nice E, Morstyn G (1990) Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity. J Biol Chem 265:4483-4491.

Christensen BG, Leanza WJ, Beattie TR, Patchett AA, Arison BH, Ormond RE, Kuehl FA Jr, Albers-Schonberg G, Jardetzky O (1969) Phosphonomycin: structure and synthesis. Science 166:123-125.

Diederichs K, Jacques S, Boone T, Karplus PA (1991) Low-resolution structure of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor. J Mol Biol 221:55-60.

Frank C, Bayoumi I, Westendorp C (2005) Approach to infected skin ulcers. Can Fam Physician 51:1352-1359.

Gobernado M (2003) Fosfomycin. Rev Esp Quimioter 16:15-40.

Gontcharova V, Youn E, Sun Y, Wolcott RD, Dowd SE (2010) A comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiol J 4:8-19.

de Groot RP, Coffer PJ, Koenderman L (1998) Regulation of proliferation, differentiation and survival by the IL-3/IL-5/GM-CSF receptor family. Cell Signal 10:619-628.

Hayashida K, Kitamura T, Gorman DM, Arai K, Yokota T, Miyajima A (1990) Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci USA 87:9655-9659.

Hendlin D, Stapley EO, Jackson M, Wallick H, Miller AK, Wolf FJ, Miller TW, Chaiet L, Kahan FM, Foltz EL, Woodruff HB, Mata JM, Hernandez S, Mochales S (1969) Phosphonomycin, a new antibiotic produced by strains of streptomyces. Science 166:122-123.

Hu X, Sun H, Han C, Wang X, Yu W (2011) Topically applied rhGM-CSF for the wound healing: a systematic review. Burns 37:729-741.

Karageorgopoulos DE, Wang R, Yu XH, Falagas ME (2012) Fosfomycin: evaluation of the published evidence on the emergence of antimicrobial resistance in Gram-negative pathogens. J Antimicrob Chemother 67:255-268.

Kaushansky K, O'Hara PJ, Berkner K, Segal GM, Hagen FS, Adamson JW (1986) Genomic cloning, characterization, and multilineage growth-promoting activity of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Proc Natl Acad Sci USA 83:3101 -3105.

Kitamura T, Hayashida K, Sakamaki K, Yokota T, Arai K, Miyajima A. Reconstitution of functional receptors for human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): evidence that the protein encoded by the AIC2B cDNA is a subunit of the murine GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci USA 88:5082-5086.

Lopez AF, Vadas MA, Woodcock JM, Milton SE, Lewis A, Elliott MJ, Gillis D, Ireland R, Olwell E, Park LS. (1991) lnterleukin-5, interleukin-3, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor cross-compete for binding to cell surface receptors on human eosinophils. J Biol Chem 266:24741-24747.

Moonen P, Mermod JJ, Ernst JF, Hirschi M, DeLamarter JF (1987) Increased biological activity of deglycosylated recombinant human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells. Proc Natl Acad Sci USA 84:4428-4431.

Robson M, Kucukcelebi A, Carp SS, Hayward PG, Hui PS, Cowan WT, Ko F, Cooper DM (1994) Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on wound contraction. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 3 Suppl 2:S41 -S46.

Sato N, Sakamaki K, Terada N, Arai K, Miyajima A (1993) Signal transduction by the high-affinity GM-CSF receptor: two distinct cytoplasmic regions of the common beta subunit responsible for different signaling. EMBO J 12:4181 -4189.

Shanafelt AB, Miyajima A, Kitamura T, Kastelein RA (1991 a) The amino-terminal helix of GM-CSF and IL-5 governs high affinity binding to their receptors. EMBO J 10:4105-4112.

Shanafelt AB, Johnson KE, Kastelein RA (1991 b) Identification of critical amino acid residues in human and mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and their involvement in species specificity. J Biol Chem 266:13804-13810.

Smith DM, Snow DE, Rees E, Zischkau AM, Hanson JD, Wolcott RD, Sun Y, White J, Kumar S, Dowd SE (2010) Evaluation of the bacterial diversity of pressure ulcers using bTEFAP pyrosequencing. BMC Med Genomics 3:41.

Szoka F Jr, Papahadjopoulos D (1980) Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annu Rev Biophys Bioeng 9:467-508.

Wong GG, Witek JS, Temple PA, Wilkens KM, Leary AC, Luxenberg DP, Jones SS, Brown EL, Kay RM, Orr EC, et al (1985) Human GM-CSF: molecular cloning of the complementary DNA and purification of the natural and recombinant proteins. Science 228:810-815.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Reponex ApS

КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ СОДЕЙСТВИЯ ЗАЖИВЛЕНИЮ КОЖНЫХ ЯЗВ И РАН

<130> P81400330DK00

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 144

<212> Белок

<213> Homo Sapiens

<400> 1

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His

20 25 30

Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp

35 40 45

Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe

50 55 60

Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met

85 90 95

Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser

100 105 110

Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu

130 135 140

<210> 2

<211> 144

<212> Белок

<213> Homo Sapiens

<400> 2

Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His

1 5 10 15

Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp

20 25 30

Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe

35 40 45

Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys

50 55 60

Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met

65 70 75

Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser

80 85 90 95

Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys

100 105 110

Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu

115 120 125

<---

1. Фармацевтическая композиция для: местного применения для лечения, облегчения или ускорения заживления повреждения, такого как рана, язва, пролежень или ожог кожи, слизистой оболочки или соединительной ткани, лежащей под повреждением, содержащая:

a. гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в форме молграмостима или сарграмостима и

b. кальциевую соль фосфомицина,

где концентрация GM-CSF составляет от 1 мкг/г до 10 мг/г, где указаная композиция составлена в виде порошка.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, содержащая один или несколько дополнительных антибиотиков или противомикробных средств.

3. Фармацевтическая композиция по любому одному из пп. 1 или 2, где повреждение связано с колонизацией или инфекцией бактериями, грибами, вирусами или паразитами.

4. Фармацевтическая композиция по любому одному из пп. 1-3, где повреждение связано с сахарным диабетом.

5. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов., которая содержит GM-CSF в концентрации от 5 мкг/г до 500 мкг/г.

6. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов., которая содержит GM-CSF в концентрации от 10 мкг/г до 200 мкг/г.