Способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов
Владельцы патента RU 2719402:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к области медицины и микробиологии. Раскрыт способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов путем создания микробной биопленки, в котором биопленку формируют под предметным стеклом, расположенным под углом 30° в чашке Петри, окрашивают любым из доступных методов и визуализируют структуру биопленки с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай), подвергают ее морфометрическому исследованию в программе Scope Photo х86, 3.1.312 (США) для оценки морфологических особенностей структуры биопленки микроорганизмов и измерения размеров отдельных ее структурных компонентов, с последующим сохранением результата на электронном носителе в формате файлов jpg. Изобретение обеспечивает повышение информативности способа, возможность изучения структурных особенностей пленок при разных методах их окраски и биопленкообразующей способности практически всех известных микроорганизмов. 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии и может быть использовано для изучения действия химических веществ и физических факторов на биопленку и биопленкообразующую способность разных микроорганизмов.
Биопленки - высокоорганизованные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества микроорганизмов, состоящие, как правило, из клеточной части и, преимущественно полисахаридного, матрикса, обеспечивающего защиту от неблагоприятных внешних факторов, в том числе эффекторов иммунитета и антибиотиков (Сидоренко С.В. и соавт., 2017). Существующие методы визуализации биопленки не предусматривают дифференцированной окраски ее компонентов, т.к. нет возможности установить субстрат, окрашиваемый, например генцианвиолетом, поскольку этот краситель может формировать комплексы, как с внутриклеточными, так и внеклеточными структурами. В целом, имеющиеся подходы не позволяют адекватно оценивать антибиопленочные эффекты препаратов, в то время как результаты изучения взаимодействия лекарственных средств с компонентами биопленки могут обеспечивать их наиболее корректный выбор.
Известен способ оценки биопленокоообразующей способности микроорганизмов при экспозиции в течение 40 минут в 0,1% водном растворе генцианвиолета с последующей его экстракцией спиртом в течение 10 минут [O'Toole, G.A. Microtiter dish biofilm formation assay. J. Vis. Exp.2011; 47: 2437].
Недостатки прототипа: недостаточная точность способа из-за отсутствия возможности визуализации и дифференцировки отдельных структурных компонентов микробной биопленки, невозможность проведения морфометрических исследований, отсутствие возможности сохранения результатов исследований на электронных носителях.
Технический результат: повышение информативности способа за счет дифференцировки и визуализации отдельных структурных компонентов биопленки, возможность изучения структурных особенностей пленок при разных методах их окраски, сохранение результатов исследования в виде файлов формата jpg, доступность способа для изучения биопленкообразующей способности практически всех известных микроорганизмов.
Сущность метода заключается в том, что для оценки морфологической структуры биопленки используют двухэтапный подход, позволяющий на первом этапе культивировать штаммы на границе раздела двух сред «воздух-жидкость» для создания условий для биопленкообразования, а на втором - визуализировать отдельные структурные компоненты биопленки и провести их морфометрическое исследование с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай) в программе ScopePhoto х86, 3.1.312 (США) с последующим сохранением результата на электронных носителях в формате файлов jpg. Такой способ дает возможность определять точки действия лекарственных препаратов и повышать терапевтический эффект за счет комбинации лекарственных средств, с различными мишенями действия.
Способ осуществляют следующим образом:
Биопленки исследуемых культур микроорганизмов формируют в стерильной чашке Петри, в которую помещают предметное стекло под углом 30° и в пространство под ним наливают питательный бульон с предварительно подготовленной микробной взвесью. Для создания оптимальных условий биопленкообразования в чашку Петри помещают стерильный тампон, смоченный дистиллированной водой. По окончании 24 часовой инкубации стекло извлекают и аккуратно промывают забуференным физиологическим раствором, после чего подсушивают на воздухе. Далее после фиксации препарата в пламени спиртовки можно использовать любой из доступных методов окраски, например, метод Грама [Silhavy T.J., Kahne D., Walker S. The Bacterial Cell Envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2010. 2 (5).]. В последующем при микроскопии препаратов с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай) и программы Scope Photo х86, 3.1.312 (США) оценивается морфологическая структура биопленки: наличие каналов и камер, количество и толщина слоев матрикса, выраженность клеточного компонента. Далее полученные результаты фиксируют на электронном носителе (например, HDD, съемные USB-носители и др.) в виде файлов jpg.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 произвели визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, с последующим сохранением результатов морфометрических исследований на электронном носителе в формате файлов jpg.
При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка имеет три слоя матрикса, продольный канал и в нижней части -область локализации клеток стафилококка.
Пример 2. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. После этого в жидкую часть добавляли раствор цефтазидима (10 мкг/мл). Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 производили визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, результаты морфометрических исследований сохраняли на электронном носителе в формате файлов jpg.
При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка после действия антибиотика имеет те же три слоя матрикса, продольный канал и в нижней части область локализации клеток стафилококка. Однако было выявлено, что диаметр канала существенно сужен, а толщина слоев матрикса в несколько раз больше, чем в аналогичных пробах, но без антибиотика. Можно сделать заключение, что при использовании такой дозы антибиотика тест-штамм усиливает свою биопленкообразующую активность, что выражается в увеличении толщины слоев, а также в сужении просвета канала, по которому возможно поступление антибиотика в глубжележащие слои биопленки.
Пример 3. В чашку Петри поместили предметное стекло под углом 30° и заполнили пространство под ним мясо-пептонным бульоном с взвесью Staphylococcus aureus. После этого в жидкую часть добавляли 150 мкл свежеполученной плазмы крови от практически здорового донора. Для создания условий влажной камеры в чашку Петри поместили стерильный ватный тампон, смоченный дистиллированной водой. После 24 часовой инкубации стекло извлекли и промыли забуференным физиологическим раствором и после непродолжительного подсушивания фиксировали в пламени спиртовки с последующей окраской по методу Грама. С помощью видеоокуляра DCM 310 и программы Scope Photo х86, 3.1.312 производили визуализацию биопленки и морфометрическую оценку отдельных структурных компонентов биопленки, результаты морфометрических исследований сохраняли на электронном носителе в формате файлов jpg.
При микроскопии окрашенного препарата было установлено, что биопленка имеет слабо выраженный слой матрикса, продольный канал практически отсутствует или сужен до крайней степени. В слоях биопленки наблюдаются полости и каверна-подобные образования. Можно сделать заключение, что факторы свежеполученной плазмы, обладая бактерицидным эффектом, нарушают жизнедеятельность и функционирование бактериальных клеток, в результате чего биопленка имеет существенные структурные изменения.
Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов позволяет отдифференцировать отдельные структурные части биопленки, изучить их размеры и расположение, обеспечивая получение дополнительной информации, способствующей повышению эффективности антимикробной терапии.
Способ оценки морфологической структуры биопленок микроорганизмов путем создания микробной биопленки, отличающийся тем, что биопленку формируют под предметным стеклом, расположенным под углом 30° в чашке Петри, окрашивают любым из доступных методов и визуализируют структуру биопленки с помощью видеоокуляра DCM 310 (Китай), подвергают ее морфометрическому исследованию в программе Scope Photo х86, 3.1.312 (США) для оценки морфологических особенностей структуры биопленки микроорганизмов и измерения размеров отдельных ее структурных компонентов, с последующим сохранением результата на электронном носителе в формате файлов jpg.
