Биомедицинский клеточный продукт для лечения нервных болезней и психических расстройств, способ его получения и его применение

Группа изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к биомедицинскому клеточному продукту (БМКП) для регенерации нервной ткани, способу его получения и применения. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для регенерации нервной ткани содержит аутологичные или иммуносовместимые аллогенные очищенные мобилизованные мононуклеарные клетки (МНК) лейконцентрата (ЛК) периферической крови (ПК) человека (компонент А), содержащие гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) в количестве 1-2% от общего числа МНК и мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСКП) в количестве 1-1,5% от общего числа клеток МНК, линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК), предобработанных в биологически стабильной среде, индуцирующей их нейральную дифференцировку (компонент Б), и вспомогательное вещество в виде стерильной трансфузионной среды при следующих концентрациях клеток на 1 мл вспомогательного вещества: компонент А (МНК) - 1,75×10⁵ - 4×10⁶ клеток; компонент Б (МССК) - 3×10⁵ - 1,5×10⁶ клеток. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, более конкретно, к нейрологии и медицинским биотехнологиям, а именно к биомедицинскому клеточному продукту (БМКП) под торговым названием «НейроКомб», способу его получения и его применению. Этот БМКП может быть использован для регенерации и восстановления поврежденной нервной ткани человека при лечении широкого круга нервных и психических заболеваний и повреждений головного и спинного мозга человека.

В настоящее время проблема лечения заболеваний и повреждений головного мозга (ГМ) и спинного мозга (СМ) крайне актуальна. По данным Всемирной организации здравоохранения (2013) каждый третий житель планеты Земля страдает нервно-психическими заболеваниями. Резкое старение населения в США и Европе привело к увеличению количества больных со слабоумием и болезнью Альцгеймера, По данным Института здорового старения (США, 2012) к 2050 году каждый из 85 человек в мире будет страдать болезнью Альцгеймера. Нет ни одной болезни мозга, при которой неврологи и психиатры могли бы реально восстановить органическое повреждение мозга пациента и вылечить от этого недуга. За последние 100 лет количественные показатели эффективности лечения неврологических и психических заболеваний во всем мире практически не изменились, однако финансовые расходы на лечение выросли в 200 раз. Например, только расходы Евросоюза на лечение болезней мозга составляют 80 млрд. евро в год (Human Brain Project., 2012).

Одним из путей выхода из создавшейся сложной социально-экономической ситуации в нейронауках и обществе является разработка инновационных клеточных биотехнологий и создание нового класса медицинских биотерапевтических средств, способных осуществлять полную или частичную регенерацию поврежденной нервной ткани ГМ и СМ человека и млекопитающих. Различают два вида регенерации - физиологическую и репаративную. Восстановление органов, тканей, клеток или внутриклеточных структур после разрушения их в процессе жизнедеятельности организма называют физиологической регенерацией. Восстановление структур после травмы или действия других повреждающих факторов называют репаративной регенерацией. При регенерации происходят такие процессы, как детерминация, дифференцировка, рост, интеграция и др., сходные с процессами, имеющими место в эмбриональном развитии. Однако при регенерации все они идут уже вторично, т.е. в сформированном организме. Осуществляется регенерация путем прямого и непрямого деления клеток, внутриклеточных органелл и их размножения. Универсальными формами регенерации являются обновление внутриклеточных структур и их гиперплазия.

Многие годы существовала научная догма о том, что регенерация в ГМ и СМ человека и высших млекопитающих невозможна по определению. Считалось, что «мозг» и «регенерация» понятия якобы не совместимые. Этой точки зрения придерживались и придерживаются даже сейчас очень многие зарубежные и отечественные академические школы нейроученых и преподавателей университетских кафедр и департаментов нейробиологии, психоневрологического и нейрохирургического профиля. Экспериментально обоснованная точка зрения всех современных нейронаук на научный факт о том, что «регенерация головного и спинного мозга у человека и млекопитающих отсутствует и в принципе невозможна» берет свое начало со времен фундаментальных нейроисследований Лауреата Нобелевской премии по физиологии и медицине за 1906 год, испанского врача и гистолога, (исп.Santiago у Cajal). Изучая нейрогенез в мозге человека и животных в конце 19 века, Рамон-и-Кахаль сформулировал свою «нейронную теорию» устройства мозга и доказал в эксперименте ряд ее базовых постулатов - нейрогенез во взрослом мозге невозможен, нервные клетки не восстанавливаются, регенерация в мозге человека и млекопитающих не возможна по определению, главной структурной единицей в мозге является нейрон и т.д. С этого времени и почти до конца 20 века подобные научные представления о нейрогенезе и процессах регенерации в мозге были доминирующими в неврологии, нейрохирургии и психиатрии.

Первыми о регенерации нервной ткани в мозге заговорили советские ученые в середине XX века. Гипотеза регенерации во взрослом мозге впервые в мире была высказана в 1954 году в СССР нейрофизиологом профессором А. Л. Поленовым. В 1962-1963 годах профессор Л.В. Полежаев и его сотрудница Э. Н. Карнаухова осуществили пересадку кусочка мозга от одной крысы к другой, используя для трансплантации растертую, бесклеточную нервную ткань. Опыт оказался удачным - ткань мозга у животных на месте дефекта восстановилась. В продолжение исследований была обнаружена в эксперименте и продемонстрирована в опыте способность центральной нервной системы (ЦНС) холоднокровных позвоночных (рыб, амфибий, рептилий) к репаративной и физиологической регенерации нервной ткани (Полежаев, 1968, 1982; Полежаев, Резников, 1973). В англоязычном мире первое сообщение о возникновении новых нейронов в ГМ появилось в 1962 году в статье «Формируются ли новые нейроны в мозге взрослых млекопитающих?», которая была опубликована в престижном научном журнале «Science». Ее автор, американский профессор Джозеф Альтман (Joseph Altaian) из Университета Пердью (США), с помощью электрического тока разрушил часть мозга крысы (латеральное коленчатое тело) и вводил туда меченный тритием тимидин - вещество, проникающее во вновь возникающие клетки и являющееся частью их ДНК и РНК. Через несколько месяцев ученый обнаружил новые радиоактивные нейроны в таламусе (участок переднего мозга) и коре ГМ. В 1974 году профессор анатомии и нейробиологии Медицинской школы Университета Мэриленда Майкл С.Каплан (Michael S. Kaplan) начал поиск доказательств нейрогенеза в мозге взрослых млекопитающих. Ему удалось обнаружить присутствие молодых нейронов в зрительной коре, обонятельной луковице, а также факт увеличения числа нейронов в гиппокампе крыс. Наличие нейрогенеза в области обонятельного эпителия и обонятельной луковицы человека и животных в начале 80-х XX века годов подтвердил профессор Джеффри Райзман (Geoffrey Raisman) и его команда из лондонского Национального института медицинских исследований (National Institute of Medical Research (UK). В 1998 году американец Фред Гейдж (Fred Geige) и швед Петер Эрикссон (Peter Eriksson (1959-2007) вновь обнаружили и объявили, что вопреки существующим догмам, человеческий мозг производит новые нервные клетки во взрослом возрасте. Эта публикация явилась решающей для переосмысления процесса нейрогенеза во взрослом ГМ. В более поздних исследованиях Петер Эрикссон также представил доказательства в пользу существования миграционного пути для нейробластов и нейрональных стволовых клеток (НСК) от субвентрикулярной зоны (места их происхождения) в обонятельной луковице.

Развитие нейробиологии в начале 1990-х годов привело к неоспоримому доказательству зарождения «новых» нейронов в головном мозге взрослых крыс и мышей. В центральной нервной системе (ЦНС) человека регенеративная способность к митотическому делению клеток отсутствует, структурное и функциональное восстановление после повреждения достигается исключительно или почти исключительно за счет увеличения массы органелл в сохранившихся клетках и гипертрофии последних, т.е. восстановительная способность выражается только в форме внутриклеточной регенерации.

Важное место в исследованиях механизмов регуляции регенерации занимает изучение роли стволовых клеток (СК) различных отделов нервной системы. Открытие СК у млекопитающих и человека было совершено в США еще в 1905 году русским эмигрантом и одним из создателей унитарной теории кроветворения профессором А.А. Максимовым. Это открытие стало революционизирующим событием конца XIX века и первого десятилетия XX века. Однако только через 100 лет человечество смогло осознать и понять грандиозность и фантастичность этого открытия.

В настоящее время изучены все основные пути и механизмы регенеративного действия, которыми СК способны восстановить поврежденные клетки (ПовК) и ткани организма человека: 1) путь функционального и морфологического замещения ПовК стволовыми клетками в зоне повреждения и направленная дифференцировка СК в фенотип ПовК или группы ПовК; 2) путь слияния цитогенетического биоматериала СК с аналогичным биоматериалом ПовК для ее регенерации и реставрации; 3) путь регуляции и управления путями внутриклеточной сигнальной трансдукции ПовК молекулярнонацеленными биологически активными веществами (микроРНК, ДНК, белками), содержащимися в продуцируемыми СК микровизикулах и экзосомах, которыми обмениваются СК и ПовК при межклеточном взаимодействии (Yamaguchi S. et al., 2006; Брюховецкий А.С., 2014).

На данный момент для целого ряда серьезных заболеваний клеточные препараты, содержащие СК, являются практически единственным возможным способом лечения. Кроме того, применение этих клеточных препаратов повышает эффективность традиционных методов лечения, существенно облегчает течение заболевания и приближает момент выздоровления. В настоящее время для целей получения клеточных препаратов используются различные типы тканеспецифичных СК (тсСК) взрослого организма - гемопоэтические СК (ГСК), являющиеся предшественниками клеток крови (патент RU 2283119, 2006 г., МПК А61К 35/14, А61Р 25/00), нейрональные СК (НСК), являющиеся предшественниками клеток нервной ткани (патент RU 2394593, 2010 г., МПК А61К 38/39, А61К 35/12, А61К 35/14, А61Р 25/00), мезенхимальные стромальные СК (МССК), способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения (патент RU 2252252, 2005 г., МПК C12N 5/08), а также СК других зародышевых листков.

Клеточные препараты из тсСК позволяют восполнить недостаточную функциональную активность специализированных тканей и регенерировать ПовК тканей и органов. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют тсСК, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов (Тепляшин А.С., 2005). Значение роли СК в практическом лечении абсолютно некурабельных болезней человека огромное. Как утверждается в руководстве Blood Stem Cell Transplantation под редакцией J. Reiffers, J.M. Goldman, J.O. Armitage (1998), использование ГСК для трансплантации костного мозга в 1961 году было самым первым удачным опытом противоопухолевой терапии, позволившим в 90% случаев полностью излечить пациентов от острого и хронического миелолейкоза. Уже в 60-70-х годах прошлого века эта терапия стала «золотым стандартом» в онкогематологии. Путем трансплантации ГСК костного мозга донора удалось «заместить» все клетки гемопоэза реципиента и полностью излечить больного, страдающего лейкозом. Сегодня очевидно, что ГСК имеют важнейшую регуляторную и системообразующую функцию в организме.

Одной из важнейших проблем применения СК в клинике является определение разовой и курсовой дозы количества СК в клеточном продукте. Это связано с тем, что в естественных условиях количество СК в органах и тканях млекопитающих и человека составляет сотые доли процента от общего количества всех клеточных систем в хорошо регенерирующих тканях (кровь, печень, селезенка, почки и т.д.) и тысячные доли процента в слабо регенерирующих тканях (нервная ткань, мышечная ткань, соединительная ткань и т.д.) (Брюховецкий А.С. с соавт., 2015). При формировании острой патологии (воспаления, ишемии, кровоизлиянии и т.д.) количество СК в крови и ткани пострадавшего органа нарастает в сотни и даже тысячи раз в течение очень небольшого интервала времени (часы, дни, недели). При хронических заболеваниях количество СК увеличивается очень медленно и незначительно (месяцы и годы). В большинстве случаев именно время достижения необходимой концентрации СК в патологической ткани поврежденного органа зачастую является основным патогенетическим фактором формирования или предотвращения развития органической патологии тканей органа. Несвоевременность появления СК в патологической зоне является основной причиной формирования морфофункциональных дефектов в ткани, приводящих к утрате трудоспособности и инвалидизации пациента.

В июле 2016 года в России принят Федеральный закон №180 ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах», который на государственном уровне регулирует разработку и создание БМКП, доклинические исследования и ограниченные клинические испытания БМКП, оборот БМКП и их широкое применение в клинике на людях. Поэтому актуальность создания новых клеточных продуктов очевидна, так как до настоящего времени в России говорили преимущественно о клеточных технологиях и СК, а не о БМКП. Под биомедицинским клеточным продуктом указанный закон понимает комплекс, состоящий из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ, либо из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ в сочетании с прошедшими государственную регистрацию лекарственными препаратами для медицинского применения и (или) медицинскими изделиями.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) настоящего изобретения принят препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации при поражении нервной системы (патент RU 2283119, 2006 г., МПК А61К 35/14, А61Р 25/00). Этот известный препарат в виде аутологичного лейконцентрата, содержащего не менее 1-2% аутологичных ГСК и 1-1,5% МССК, успешно применялся и применяется до сих пор в терапии целого ряда нервных болезней и травматических повреждений нервной системы с 2003 г. Уникальной особенностью этого клеточного препарата было то, что в отличие от классического варианта стимуляции ГСК, в котором стимуляцию ГСК с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) проводят в течение 6-7 дней (классический вариант стимуляции ГСК), применяли стимуляцию в течение только 4 дней и в результате забора мобилизованной периферической крови (ПК) на 5-й день стимуляции получали из ПК преимущественно гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) с маркерами CD34+, CD133+, CD45-, HLA DR- и мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСКП) с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117-. Применение этого клеточного препарата показало одну важную особенность его влияния на регенерацию нервной ткани пациента. Клиническая эффективность была выше в тех случаях, когда количество ГСК было максимальным, то есть превышала 1,5% или было ближе к 2%. В тех же случаях, когда концентрация ГСК в лейконцентрате была ниже 0,5%, восстановительные эффекты регенерации поврежденной нервной ткани были смазаны или вообще отсутствовали. При этом роль МССК в этом препарате практически не учитывалась, весь приоритет его клинической эффективности возлагался на ГСК. Однако по мере накопления новых знаний стала очевидной значительная роль МССК в эффектах нейрореставрации. Изолированное применение МССК при инсультах показало их отчетливый нейровосстановительный потенциала (Kaplan D., 2012-2015, Choop М. et al., 2010-2016). Поэтому сейчас этот известный препарат представляется недостаточно сбалансированным по клеточному составу при том, что в настоящее время требуется более высокая эффективность БМКП такого типа.

Задачей настоящего изобретения является создание нового БМКП на основе линий СК, который был бы сбалансирован по клеточному составу и имел высокую эффективность в регенерации и восстановлении поврежденной нервной ткани человека.

Решение указанной задачи достигается тем, что предложен БМКП, содержащий аутологичные или иммуносовместимые аллогенные очищенные мобилизованные мононуклеарные клетки (МНК) лейконцентрата (ЛК) ПК человека (компонент А), содержащие ГКП в количестве 1-2% от общего числа МНК и МСКП в количестве 1-1,5% от общего числа клеток МНК, линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК, предобработанных в биологически стабильной среде, индуцирующей их нейральную дифференцировку (компонент Б), и вспомогательное вещество в виде биологически стабильной и стерильной трансфузионной среды при следующих концентрациях клеток на 1 мл вспомогательного вещества:

компонент А (МНК) - 1,75×10⁵ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (МССК) - 3×10⁵ - 1,5×10⁶ клеток.

Для интратекального, интравентрикулярного, интрацеребрального или интраспинального введения предложенного БМКП в качестве вспомогательного вещества использован биодеградируемый полимерный матрикс при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 2,6×10⁵ - 1×10⁶ клеток;

компонент Б (МССК) - 0,5×10⁶ - 1,5×10⁶ клеток;

или 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 1,75×10⁵ - 5×10⁵ клеток;

компонент Б (МССК) - 3×10⁵ - 7,5×10⁵ клеток.

Для внутривенного и внутриартериального введения предложенного БМКП в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 3,75×10⁶ - 4×10⁶ клеток;

компонент Б (МССК) - 1×10⁶ - 1,25×10⁶ клеток.

Аллогенные МНК и МССК в предложенном БМКП иммуносовместимы по группе крови, резус-фактору и иммунофенотипу крови.

Решение вышеуказанной задачи достигается также тем, что предложен способ получения ex tempore предложенного БМКП, включающий в себя:

получение аутологичных или иммуносовместимых аллогенных очищенных МНК лейконцентрата ЛК ПК человека (компонент А), содержащих ГКП в количестве 1-2% от общего числа МНК и МСКП в количестве 1-1,5% от общего числа МНК, путем их выделения из ЛК ПК посредством лейкоцитофереза с использованием подкожного введения Г-КСФ донору и/или пациенту или из костного мозга посредством трепанбиопсии из грудины и подвздошных костей с последующим получением суспензии МНК из ЛК и биоматериала костного мозга методом градиентного фракционирования;

получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК путем их выделения из костного мозга или ЛК ПК, дальнейшего культивирования в ростовой среде и последующей обработки в биологически стабильной среде, индуцирующей нейральную дифференцировку МССК, и

смешивание ex tempore компонентов А, Б и вспомогательного вещества в виде биологически стабильной и стерильной трансфузионной среды.

Полученные компоненты А, Б преимущественно криоконсервируют, а перед их смешиванием ex tempore со вспомогательным веществом размораживают.

В качестве среды, индуцирующей нейральную дифференцировку МССК, используют среду, состоящую из DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), телячьей эмбриональной сыворотки (FBS), белков группы поликомб (PCG), диметилсульфоксида, основного фактора роста фибробластов (bFGF) и политрансретиноевой кислоты.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложено применение вышеописанного БМКП по настоящему изобретению для лечения и профилактики неврологических заболеваний, а также повреждений головного и спинного мозга.

В настоящем изобретении основное терапевтическое действие предложенного БМКП основано на применении хорошо охарактеризованной по клеточным маркерам линии взрослых аллогенных и аутологичных или гаплоидентичных (близкородственных) ГСК и МССК, находящихся в ЛК мобилизованной ПК человека для активации регенерации в нервной ткани человека. Препарат ГСК применялся ранее в клинике нервных болезней различным неврологическим и нейроонкологическим больным интратекально (введение в спинномозговую жидкость), интравентрикулярно (инфузии в желудочковую систему ГМ), внутривенно и внутриартериально. Авторы изобретения полагают, что наиболее научно обоснованными и клинически привлекательными для воздействия на патологический очаг в организме человека представляются именно аутологичные и гаплоидентичные ГСК (Брюховецкий А.С., 2005-2016), так как на фоне их многолетнего системного применения был отмечен убедительный нейрореставрационный морфологический и клинический эффект (57-61,2% случаев) и практически не было не одной жизнеугрожающей ситуации и грозных осложнений у пациентов (Авдейкин С.Н., Брюховецкий А.С., 2012). ГСК и МССК, содержащиеся в ЛК мобилизованных клеток костного мозга, уже получили свой вектор дифференцировки, и риск формирования из них клеток иммунной системы и клеток другого ряда (мезенхимального или нейрального) минимален, а технологии их получения не представляют опасности при сборе ГСК у пациента или донора.

Надо отметить, что ГСК в организме человека являются универсальными регуляторами гомеостаза, так как имеют самый большой период жизненного клеточного цикла (около 365 дней). В свете современных концепций системного подхода к управлению, очевидно, что в любом биохимическом процессе в организме человека и животных управляющей является самая медленная фаза. В этой связи ГСК в организме человека обладают доминирующими управляющими свойствами среди всех клеточных систем организма и их регуляторные функции являются системообразующими (Брюховецкий А.С., 2010). Известно, что ГСК в зависимости от органных потребностей тканей организма человека в экстремальных условиях способны под влиянием сигналов микроокружения трансформироваться как в НСК, так и МССК, что с позиций теории клеточного замещения является крайне важным для реставрации поврежденных тканей. ГСК обладают уникальной способностью направленного трансфера в зону повреждения тканей органа, мигрируя на градиент концентрации воспаления (патотропизм или хоуминг СК) (Брюховецкий А.С., 2013). ГСК, попадая в ГМ и СМ, являются мощным индуктором синапсогенеза в них или участвуют в формировании новых межклеточных контактов в тканях солидных органов (Брюховецкий А.С., 2010, 2013; Баклаушев В.П. с соавт., 2015). Показано, что при пересадке ГСК в различные органы (почки, мозг, печень и т.д.) не наблюдалась их прямая дифференцировка в специализированные клетки (кардиомиоциты, миоциты или клетки кожи) этих органов, а трансплантация ГСП в сердце не приводила к формированию нейронов или секреторных клеток кишечника. Локальная дифференцировка in situ, как правило, контролировалась «сигналами» микроокружения. Многолетние клинические наблюдения также подтвердили отсутствие аномалий дифференцировки ГСК в трансплантате. В то же время ГСК имеют направленную миграцию к зонам повреждения в ГМ человека и млекопитающих, так же как и НСК и МССК. Новым направлением в разработке этой проблемы является изучение иммунологической регуляции ГСК в процессах регенерации, в частности установление факта переноса лимфоцитами «регенерационной информации», стимулирующей пролиферативную активность клеток различных внутренних органов.

Установлено, что трансплантированные клетки ЛК мобилизованных МНК формировали кластеры ГСК, ГПК и МССК в тканях поврежденного органа (Ono К. et al., 1999). Этот феномен может быть ключевым не только в решении вопроса регенерации повреждений органов и тканей, в том числе и мозга, но и в разработке и создании клеточных препаратов, способных увеличить регенераторный потенциал нервной ткани на основе ГСК. Стандартная и необходимая концентрация ГСК (CD34+, CD133+) в ЛК мобилизованных МНК ПК составляет 1-2% от общего количества всех клеток в нем. Количество ГСК в препарате имеет принципиальное значение для успешности и эффективности трансплантации, но при этом как бы не учитывается общее количество МНК в трансплантате. Применение только очищенных ГСК (CD34+, CD133+, CD45+) для восстановления нарушенного гемопоэза после химиотерапии или лучевой терапии при трансплантации костного мозга у онкологических больных оказалась абсолютно неэффективным, и все больные, получавшие только очищенные ГСК (CD34+, CD133+, CD45+) умирали, так как эти клетки не приживались в костном мозге реципиента, и чистая культура клеток ГСК была не способна обеспечить восстановление поврежденного гемопоэза (J. Reiffers, J.M. Goldman, J.О. Armitage, 1998). Именно поэтому изолированное применение только одних очищенных ГСК (CD34+, CD133+, CD45+) для восстановления нарушенного гемопоэза считается методически ошибочным и неверным (Мхеидзе Д.М., с соавт., 2000). В то же время, если общее количество ГСК в трансплантируемом материале лейкоферезного продукта или костного мозга менее 1%, то риск неблагоприятного исхода восстановления нарушенного кроветворения после трансплантации костного мозга увеличивается в 2 раза (Долгополов И.С. с соавт., 2005, 2010). По-видимому, роль клеток микроокружения ГСК в восстановлении нарушенного гемопоэза является определяющей для уровня функциональной активности ГСК как в нише костного мозга, так и для ГСК, трансплантируемых в кровь и ликвор в составе мультиклеточного кластера костно-мозговых клеток.

В этой связи авторы изобретения полагают, что для того, чтобы получить требуемый функциональный (регуляторный, нейрорегенеративный) эффект от ГСК в организме человека, целесообразно использовать их именно в составе лейконцентрата, содержащего весь спектр клеток микроокружения костно-мозговой ниши. В микроокружении мобилизованных ГСК важное значение для поддержания их функциональной активности имеют мобилизованные МССК. Именно поэтому в клинике нервных болезней авторы изобретения широко использовали именно этот подход введения ЛК мобилизованных МНК ПК, содержащих ГСК и МССК, в организм неврологического пациента путем интравентрикулярной или интратекальной трансфузии.

Хорошо известно, что в условиях спокойного, неповрежденного гемопоэза в ПК человека обязательно циркулируют ГСК, однако, их концентрация столь ничтожна (менее 0,01%), что делает их детальное изучение или, тем более, использование для целей трансплантации практически невозможным. Общее количество ГСК, находящихся в нишах органов гемопоэза (костный мозг, вилочковая железа, толстый кишечник), составляет всего 30000 клеток (А.И. Воробьев, А.Н. Смирнов, 2010; А.В. Полевщиков, 2016). Их мобилизация (деление ГСК и выход в ПК) и выход из центральных органов гемопоэза наблюдается при повреждении, воспалении и ишемии в различных органах после травмирования гемопоэза (чаще всего, как результат химиотерапии и лучевой терапии), а также под действием колониестимулирующих факторов. В клинике наибольшее распространение получили Г-КСФ и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Под действием этих факторов концентрация ГСК, ГКП и МССК крови возрастает в 100-1000 раз, и их в циркулирующей крови становится около 1,5-2 млн. в 1 литре (всего до 10 млн ГСК в 4,5-5 л крови), что позволяет собрать эти клетки и использовать их для трансплантации в клинике. Как правило, этот объем клеточной массы лейкофереза при подготовке для интратекального введения делили на 20-25 аликвот по 1-2 мл в каждой. Содержание мобилизованных МНК крови в этом объеме составляло около (5-5,5)×10⁶, наличие ГСК в них составляло около 75000 клеток и МССК около 50000 клеток в каждой. Как было отмечено выше, мобилизованные МНК костного мозга являются важной частью костномозговой ниши, в которой располагаются ГСК и МССК, и клетки микроокружения даже в ПК сопровождают ГСК и МССК и имеют важнейшее значение в поддержании активности и функциональности ГСК и МССК в ПК. Именно МНК формируют тканеспецифический костно-мозговой клеточный кластер вокруг ГСК и МССК в ПК, ГСК и МССК. При внутривенном, внутриартериальном или интратекальном введении человеку эти клетки движутся в биологических жидкостях организма в виде организованного кластера. Также в виде организованного кластера эти СК движутся внутри ткани и заселяют поврежденные участки органов и тканей.

Возникает вопрос, почему мобилизованные клетки костного мозга (МНК, ГСК, МССК и т.д.), введенные в кровь, не распределяются по всему объему циркулирующей массы крови или ликвору, а формируют организованный мультиклеточный костномозговой кластер? По-видимому, клетки естественного микроокружения в виде МНК обеспечивают активность и системную функциональность ГСК и МССК в организме пациента. Именно СК выступали в роли глобальной навигационной системы всего кластера трансплантированных клеток и определяли основные маршруты движения костно-мозгового клеточного кластера. В этой связи и при других нозологических заболеваниях ГСК целесообразно использовать совместно с МССК и клетками их ближайшего микроокружения (Брюховецкий А.С., 2013). Сегодня не представляет труда разделить мобилизованные МНК на различные клеточные группы. Однако, пока что неизвестно, какие именно клетки микроокружения являются определяющими в функциональной активности ГСК и МССК, поэтому в предложенном БМКП используется весь спектр МНК костно-мозгового кластера мобилизованной ПК.

Клиническая эффективность применения ГСК и ГКП определяется их функциональным состоянием, которое оценивалось по 31 маркеру клеточной поверхности ГСК. Так при ряде аутоиммунных заболеваний нервной системы (боковом амиатрофическом склерозе и рассеянном склерозе) было обращено внимание на то, что часть антигенов маркеров клеточной поверхности изменена или критически снижена (CD38+, CD71+, CD90+, CD117+). Возможно, что именно дисбаланс на уровне поверхностных антигенов ГСК отражает тонкие молекулярно-биологические расстройства на уровне путей внутриклеточной трансдукции сигнала в этих клетках и, с одной стороны, становится причиной воспаления в нервной ткани, нарушением функционирования регуляторных клеток, а в целом является истинной причиной аутоиммунных проявлений болезни. Поэтому, количества ГСК в ЛК даже мобилизованной ПК, явно недостаточно для реализации целей реставрации поврежденной ЦНС. По-видимому, именно этими факторами объясняется ограниченная эффективность известного клеточного препарата, принятого в качестве прототипа настоящего изобретения, для терапии части больных с органическим поражением нервной системы. Поэтому необходимо дополнительное обогащение известного препарата стволовыми клетками (ГСК и МССК в МНК) для повышения его эффективности, что и было реализовано в предложенном БМКП.

Экспериментальные исследования, проведенные с участием авторов настоящего изобретения, показали наличие эффекта горизонтального информационного обмена переноса микро- и наночастей цитоплазмы (микровезикул и экзосом) СК в опухолевые клетки (ОК) и опухолевые стволовые клетки (ОСК) и наоборот, а также перенос части цитоплазмы из СК в патологическую клетку. Было доказано, что горизонтальный информационный обмен между этими клеточными системами является основным инструментом регуляции ГСК и осуществляется путем секреции ГСК мультивезикулярных пузырьков различного диаметра (10-1000 нм), обладающих мощным противоопухолевым (антипролиферативным, антимиграционным, антирепродуктивным и т.д.), а также выраженным нейровосстановительным и регенеративным потенциалами. Была поставлена задача проследить за перемещениями белков и РНК между ГСК, ОК и ОСК. Очевидно, что белки и РНК, после того как их поглотит клетка-мишень, можно определить только пометив их с помощью специальных флуоресцентных меток, позволяющих отслеживать такие перемещения с помощью флуоресцентной микроскопии. Поэтому цитоплазму ОК, ОСК и ГСК помечали флюоресцентными красителями. Было впервые в мире показано, что при соотношении 3 ГСК к одной ОК или одной ОСК (3:1) в патологическом очаге происходит полное блокирование основных функций ОСК (репродукции, митоза, миграции и т.д.). Это полностью было подтверждено на МССК. Эксперименты показали блокирование функционирования и репродукции ОК и ОСК за счет регуляторного ингибиторного воздействия регуляторных белков и РНК этих ГСК или МССК при опухоли. Однако при взаимодействии ГСК с ПовК (неопухолевыми) при соотношении 2 ГСК к 1 ПовК запускаются противоположные опухолевым саногенетические процессы регенерации и реставрации ПовК (Брюховецкий И.С., с соавт., 2016; Bryukhovetskiy I.S. et al, 2016).

Поэтому наличие в известном клеточном препарате-прототипе только ГКП (CD34+, CD45+, CD45-, HLA DR-) и МСКП (CD10-, CD13+, CD44-, CD90+, (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45-. CD117-, CD29-), содержащихся в ЛК мобилизованных МНК ПК пациента, явно недостаточно не только для регенерации и восстановления ПовК (ГСК:ПовК=1:2), но тем более и для получения противоопухолевого эффекта (ГСК:ОСК или ОК=3:1). Для целей регенерации необходимо было увеличить количества СК в клеточном препарате, что позволило бы значительно повысить эффективность и при этом обеспечить безопасность его использования.

В настоящее время применение дополнительно изолированных из костного мозга или ЛК аутологичных или аллогенных ГСК для обогащения клеточного препарата, во-первых, технологически очень дорого и трудоемко, а во-вторых, при введении их в кровь может иметь непредсказуемые воздействия на физиологическую регенерацию форменных элементов крови в естественном процессе кроветворения в организме. Как отмечалось выше, в мобилизованной ПК максимальное количество ГСК не превышает 1,5-2 миллионов в 1 литре. В организме при мобилизации костного мозга их количество может быть увеличено только до 10 млн. ГСК в 4,5-5 л крови. По-видимому, количество ГСК в крови большее 10 млн является критическим для организма и его превышение может стать причиной серьезных нарушения физиологической регенерации и нарушения образования новых форменных элементов крови. Поэтому ятрогенно созданный дисбаланс в количестве ГСК в крови может иметь очень неблагоприятные последствия для системы кроветворения пациента. Решением проблемы могут стать МССК. Основным источником МССК (как и ГСК) является костный мозг человека или млекопитающих, где ГСК постоянно дифференцируются в клетки крови и иммунной системы, тогда как МССК (CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45-, CD117-) представлены немногочисленной популяцией фибробластоподобных клеток стромы костного мозга и способствуют сохранению недифференцированного состояния ГСК. Технология получения биоматериала для производства МССК относительно недорога, а выход клеточного продукта значительный. Забирая у пациента или донора 50 мл костного мозга, через 5-6 недель можно нарастить в культуральных условиях сотни миллионов МССК (CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45-, CD117-). При посеве на культуральную среду в условиях низкой плотности посадки МССК костного мозга формируют колонии адгезивных клеток, которые собственно и являются фибробластоподобными мультипотентными МСКП. Некоторые исследователи полагают, что в костном мозге депонируются некоммитированные МССК, которые, благодаря способности к самообновлению и высокому дифференцировочному потенциалу, обеспечивают все ткани организма мезенхимальными предшественниками стромальных элементов на протяжении всей жизни организма млекопитающих. В костном мозге стромальные клеточные элементы формируют сеть, заполняющую пространство между синусоидами и костной тканью. Содержание дормантных МССК в костном мозге взрослого человека сопоставимо с количеством ГСК и не превышает 0,01-0,001%. МССК, выделенные из костного мозга и не подвергавшиеся культивированию, лишены адгезивных молекул. Такие МСК не экспрессируют CD34, ICAM, VCAM, коллаген I и III типов, CD44 и CD29. Следовательно, in vitro на подложке культуры фиксируются не МССК, а более продвинутые прогениторные производные, уже сформировавшие компоненты цитоскелета и рецепторного аппарата молекул клеточной адгезии. Стромальные клетки с фенотипом CD34+ обнаружены даже в ПК, хотя в костном мозге их значительно меньше, чем CD34-позитивных мононуклеаров. Выделенные из крови и переведенные в культуру CD34-клетки прикрепляются к подложке и образуют колонии фибробластоподобных клеток. Среди регионарных СК особое место занимают МССК, производные которых составляют стромальную матрицу всех органов и тканей организма человека, в том числе ГМ и СМ. Поскольку стромальные СК костного мозга отличаются высокой способностью к самообновлению и многоплановостью дифференцировки в пределах одной клеточной линии, они получили название мультипотентных МСКП.

Хорошо известна перекрестная взаимозаменяемость МССК, но ее признают далеко не все исследователи, а возможность клинического использования МССК в качестве источника для клеточной трансплантации и клеточного вектора генетической информации уже никем не оспаривается, как и не оспаривается мультипотентность МССК костного мозга, которые можно относительно легко изолировать и размножить в культуре in vitro. В то же время в научной литературе продолжают появляться сообщения о потенциальной плюрипотентности СК стромы костного мозга. В качестве доказательства приводятся протоколы исследований, в которых под воздействием специфических индукторов трансдифференцировки МССК преобразуются в нервные клетки, кардиомиоциты и гепатоциты. Хорошо известно, что МССК могут дифференцироваться на мезодермальные производные, такие как костная, хрящевая и жировая ткани (Neuhuber et al, 2004; Prockop, 1997; Sekiya et al, 2002; Kaplan D., 2015). Последние сообщения убедительно доказали, что МССК способны дифференцироваться на нейральные клетки, и предположительно могут стать источником для терапевтической трансплантации клеток при нарушениях ЦНС. Действительно, в ряде публикаций уже давно сообщается о способности МССК дифференцироваться на нейроны in vitro (Deng et al, 2001; Jin et al, 2003; Kim et al, 2002; Kohyama et al., 2001; Sanchez-Ramos et al., 2002; Woodbury et al, 2000). Экспериментальные исследования на животных in vivo также показали, что трансплантированные МССК мигрируют к областям повреждения, выделяют нейрональные фенотипы, и приводят к терапевтическому улучшению при повреждениях ЦНС (Chen et al, 2002; Chopp et al, 200; Kopen et al, 1999; Lee et al, 2003, 2004; Mahmood et al, 2001; Ohta et al 2004; Shichinohe et al, 2004; Wu et al., 2003). Хотя точный механизм пока остается неизвестным, существует ряд гипотез, которые объясняют терапевтическое воздействие МССК. Прежде всего, считается, что МССК как таковые могут дифференцироваться на нейральные клетки в ГМ или СМ хозяина (теория трансдифференциации) (Deng et al, 2001; Jin et al, 2003; Kim et al, 2002; Kohyama et al, 2001; Sanchez-Ramos et al, 200; Woodbury et al, 2000). Эта теория основывается на находках, свидетельствующих о том, что МССК стимулируют морфологию нейронов и выделяют специфические нейрональные протеины после индукции в экспериментах in vitro или in vivo по трансплантации. Недавно появились сообщения о слиянии МССК с клетками хозяина и «трансдифференциации» на клетки хозяина (теория слияния клеток) (Terada et al, 2002; Ying et al, 2002). Согласно другой версии предполагается, что МССК выделяют определенные цитокины, обладающие нейротропным и/или нейропротекторным действием и способствуют выживанию клеток хозяина (теория кормления) (Chen et al, 2002; Lou et al, 2003; Wu et al, 2003; Zhong et al, 2003).

Хорошо известен опыт трансдифференцировки МССК в НСК под действием ретиноевой кислоты (Kaplan D., 2005). Японские нейробиологи (Yamaguchi S. et al, 2006) из университета г. Осако детально изучили этот процесс с использованием микрочипового полнотранскриптомного анализа экспрессии генов МССК и продемонстрировали механизм модификации транскриптомного профиля НСК под действием ретиноевой кислоты и получения культуры НСК-подобных клеток из МССК с применением ретиноевой кислоты. Они получили МССК мыши и культивировали их в среде, дополненной ДМСО, ретиноевой кислотой и основным фактором роста фибробластов, и оценивали их морфологию и экспрессию нейрональных маркеров. Затем, при помощи микроматричного анализа и ПЦР-РВ проанализировали изменения профиля генной экспрессии, вызванные обработкой. После воздействия индуцирующей среды МССК симулировали нейроноподобную внешность и увеличили иммунореактивность к нестину и Tuj-1. Микроматричный анализ показал, что МССК как таковые выделяют гены клеток разных линий, включая гены, ассоциированные с нейронами. Химическая обработка значительно снизила экспрессию генов, связанных с МССК, и увеличила экспрессию 5 нейрон-ассоциированных генов. Микроматричный анализ и ПЦР-РВ также показали, что МССК выделяют гены к ряду факторов роста, включая NGF-β и BDNF, что указывает на их терапевтическую роль в защите поврежденной ЦНС. Полученные результаты позволили Yamaguchi S. et al (2006) предположить, что, по крайней мере, определенная субпопуляция МССК обладает потенциалом к изменению профиля генной экспрессии в ответ на окружающую среду и возможно способна защищать ткань хозяина, выделяя нейропротекторные факторы.

Опыт применения МССК при инсультах, травме ГМ и рассеянном склерозе (D.Kaplan, 2010; M.Chopp et al, 2016; Брюховецкий А.С., 2013) показал их эффективность и безопасность при трансплантации в поврежденную нервную ткань, отсутствие признаков дифференцировки МССК в кости, мышцы и хрящи в нервной ткани. Было показано, что при трансплантации в спинномозговую жидкость МССК пойдут не на прямую дифференцировку по предназначению (дифференцировка в кость, хрящевую ткань, жир и т.д.), а будут использованы нервной тканью на информационный обмен цитоплазматическими белками между МССК и поврежденными клетками нервной ткани и на слияние с поврежденной нервной клеткой для обмена органеллами. То есть МССК могут стать отличным строительным биоматериалом для реставрации поврежденных клеток нервной ткани. А если МССК предобработать ретиноевой кислотой с ДМСО и основным фактором роста фибробластов (bFGF), то есть задать этим клеткам новый нейральный вектор дифференцировки, то опасность иной трансдифференцировки будет исключена практически полностью. Поэтому в настоящем изобретении для обогащения ЛК, содержащего ГСК (1-2%) и МССК (1-1,5%) предложено использовать МССК, краткосрочно (120 часов) предобработанные химической средой, индуцирующей нейральную дифференцировку ММСК. Главным преимуществом этого будет являться то, что эти клетки будут еще иммунопривиллегированны как МССК, но не смогут превратиться в клетки мезенхимального ряда после трансплантации в организм реципиента и будут способны вырабатывать (секретировать) нейропротекторные факторы и содержать нейрональные белки.

Таким образом, основной технический результат, получаемый при осуществлении настоящего изобретения, заключается в повышении нейровосстановительной эффективности БМКП "НейроКомб" путем обеспечения сбалансированности его клеточного состава и обработки МССК средой, индуцирующей их нейральную дифференцировку.

Если количество МНК мобилизованной ПК и содержание ГСК (1-2%), в клеточном продукте уже давно проверено временем и многолетним клиническим применением в лечении нервных и психических болезней, то количество МССК применяемых в подобном препарате подлежит обсуждению и объяснению. Во-первых, в ЛК всегда присутствуют МССК в количестве 1-1,5%. Для целей восстановления нормального кроветворения при трансплантации костного мозга количество ГСК является критическим, а количество МССК в известном препарате игнорируется. В настоящем изобретении роль МССК в регуляции функции нейровосстановления и нейропротекции ткани мозга имеет решающее значение и поэтому учет МССК также крайне важен. Во-вторых, авторы изобретения исходили из экспериментально подтвержденного научного факта, что регенерация в нервной ткани ГМ и СМ возможна только при соотношении СК:ПовК=2:1. Поэтому расчет минимального количества МССК для интратекального введения или внутривенного (внутриартериального) введения препарата должен складываться из учета МСКП, имеющихся в ЛК (в компоненте А) и учета количества МССК, используемого для обогащения клеточного продукта (в компоненте Б). С другой стороны, чрезмерное и избыточное количество СК в препарате будет создавать высокий риск формирования неопластических мутаций во введенных СК и соответственно повышать риск возникновения солидных опухолей. Учитывая, что количество нейронов в нервной ткани находится в соотношении 3 клетки глии к 1 нейрональной клетке, очевидно, что потенциал слияния СК (поглощения СК) с другими ненейрональными клетками ткани будет в три раза ниже. Поэтому целесообразно, чтобы в мононуклеарном кластере клеточного продукта, однократно вводимого в организм пациента, количество собственно СК не превышало 25-30% от общей клеточной массы кластера.

Это позволяет создать сбалансированную эффективную терапевтическую композицию основных (клеточных) компонентов в предложенном БМКП под торговым названием «НейроКомб», состоящую из мобилизованных МНК ЛК ПК (компонент А), содержащих 1-2% ГКП с маркерами клеточной поверхности CD133+, CD34+, CD45+ и 1-1,5% МСКП с маркерами клеточной поверхности CD10^low, CD34-, CD45-, CD44+, CD90+, CD105+, и линии МССК (компонент Б) с маркерами клеточной поверхности CD10-, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+. CD34-, CD45-, CD117-, CD29-, предобработанных в течение 5 дней индукционной средой для нейральной дифференцировки и поэтому экспрессирующих нейрональные маркеры клеточной поверхности - нестин и Tuj-1. Количество компонента Б не превышает 25-30% от общего количества клеточных компонентов А и Б.

Чтобы преодолеть проблему гистосовместимости между донором и реципиентом при использовании предложенного БМКП необходимо подобрать донора для получения МНК с ГКП и МСКП, совместимого с пациентом по группе крови, резус-фактору и иммунофенотипу крови, как это стандартно делается при подборе донора для переливания компонентов крови. Основным источником ГКП CD34+ CD45- и МССК является ЛК МНК, мобилизованных в кровеносное русло пациента. Стандартная аликвота ЛК для интратекального введения в 2 мл препарата содержит в среднем 5,25×10⁶ - 6,5×10⁶ МНК. Согласно собственным ранее опубликованным данным, авторов изобретения количество ГКП в ЛК находится в пределах 1-2%, а МСКП CD10^low, CD34-, CD45-, CD44-, CD90+, CD105+ в пределах 1-1,5%, что в значительной мере определяется особенностями метода получения (от 0,5 до 5%). Если принять количество ГКП и МКП, как более стандартный параметр содержания СК в лейконцентрате МНК, то одна аликвота ЛК содержит 5,25×10⁴ - 1×10⁵ ГКП и 5,25×10⁴-8,5×10⁴ МСКП, в то время как для блокирования функций ПовК необходимо иметь в одной дозе препарата МССК в 100 раз больше. Это диктует необходимость получения МНК в количестве:

Таким образом, количество МНК составит 15×10⁶ клеток (15 млн. МНК). Если вводить ЛК в кровь, то эту дозу легко набрать путем трех доз ЛК. Но введение в ликвор таких больших доз МНК может иметь негативные последствия. Поэтому недостающее количество ГСК в одной аликвоте ЛК с ГСК можно дополнить донорскими МССК 1×10⁶ - 2×10⁶, предобработанными в течение 120 часов в индукционной среде нейральной дифференцировки.

Таким образом, была рассчитана курсовая доза МССК для интратекальной терапии предложенным БМКП, которая должна быть реализована за 4-5 введений с интервалом в одну неделю. То есть доза МССК в препарате должна быть разделена на 4-5 частей для однократного введения. В этом случае максимальная разовая доза МССК в БМКП может быть определена из расчета числа введений и максимальной суммарной дозы и составляет 2,15×10⁶ МССК на одно введение. Таким образом, к каждой дозе ЛК необходимо добавить 2×10⁶ МССК, индуцированных на нейральную дифференцировку. Сочетание МНК мобилизованной ПК, содержащей ГКП и МСКП, с предобработанными на нейральную дифференцировку донорскими МССК способно стать решением проблемы недостаточной эффективности терапий только аутологичными клеточными системами ГСК. Терапевтическая и регуляторная роль мобилизованных ГКП и МСКП и донорских МССК была недооценена, поэтому их дополнительное присутствие в предложенном БМКП усилит его регенеративный потенциал, а также мобилизует реконструктивно-восстановительные возможности репарации поврежденных тканей и органов человека.

Предложенный БМКП «НейроКомб» на основе физиологического раствора может вводиться интератекально, интравентрикулярно или внутривенно, а на основе биодеградируемого полимерного матрикса может вводиться в паренхиму тканей путем внутритканевых инъекций и имплантаций.

Получение БМКП «НейроКомб» практически реализуется путем получения и смешивания ex tempore (перед применением) размороженных на водяной бане клеточных компонентов А и Б с компонентом В.

Получение, стандартизация и криоконсервация компонента А для БМКП «НейроКомб»

Мобилизация ГКП и МСКП в ПК. С целью увеличения количества СК в ПК донор или пациент получает 8 инъекций Г-КСФ подкожно с интервалом в 10-12 часов в течение 4 дней. Г-КСФ представляет собой медицинский препарат, полученный путем генной инженерии, и является абсолютным аналогом человеческого фактора. В первые три дня доза препарата составляет 2,5 мкг/кг, в последний день доза удваивается. Ежедневно производят общий анализ крови и на 4-5 день делается УЗИ брюшной полости и фиброгастроскопия.

Сбор мобилизованных URG и МСКП. Сбор осуществляют на 5 день от начала стимуляции Г-КСФ на сепараторе крови COBE-Spectra с использованием одноразовой системы для сепарации и стандартных растворов. Длительность процедуры 3-4 часа в зависимости от скорости процедуры, веса донора и параметров анализа крови. Процедура проводится путем забора крови из одной вены, обработки ее внутри сепаратора, забора определенного объема СК и возврата остальных компонентов крови донору через другую вену. Венозный доступ осуществляется путем пункции 2-х периферических вен или через 2-х просветный центральный катетер, установленный в подключичную вену на время проведения сеанса. Средний объем собранного материала 300-400 мл. Собранный материал оценивают по двум параметрам - по общему количеству ядерных клеток в сепарате и по количеству CD34⁺ клеток на килограмм веса больного. Ядерные клетки в сепарате определяются путем подсчета в камере Горяева до проведения каких-либо манипуляций. Процент CD34⁺ клеток в клеточной суспензии, полученной в ходе цитофереза, определяют методом проточной цитофлуориметрии.

Определение ГКП. Установление субпопуляционного состава CD34+ клеток проводится цитофлуориметрически с применением метода тройной метки (одновременная окраска клеток антителами к 3 разным антигенам, нагруженным различными флуорохромными красителями).

Стандартизация компонента А. Определение количества клеток-предшественниц проводится цитофлуориметрически в прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Проводится метод двойной метки с одновременным окрашиванием клеточного субстрата моноклональными антителами к антигену CD34+ как основному маркеру клеток пула ГКС и к молекуле CD45-, лейкоцитарному антигену, определяющему ГСК. Подобная методика позволяет сразу рассчитать соотношение количества CD34 +клеток и всех ГСК (CD45+) в материале. Для оценки уровней неспецифического связывания часть клеток окрашивают изотипическими контролями. В качестве изотипических контролей стандартно применяются мышиные иммуноглобулины IgG1 изотипа (IgG1), меченные красителями, аналогичными метке используемых моноклональных антител (РЕ, FITC, PerCP).

Подготовка клеточных проб. Перед постановкой реакции клетки ПК и цитоферезного продукта освобождают от примеси эритроцитов путем стандартной процедуры лизиса и последующей отмывки в ЗФР-БСА центрифугированием при 1000 g в течение 5 минут. ЗФР-БСА может быть заменен средой Хенкса или 199.

Методика лизиса эритроцитов:

1. Добавить 2 мл лизирующего раствора к 0,2-0,5 мл клеточного осадка, перемешать, инкубировать до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (лаковым).

2. Отмыть клетки два раза средой 199 при центрифугировании (1000 g, 5-7 мин).

С выделенными клетками проводят прямую РИФ в 96-луночном планшете, при этом для определения количества клеток в любом материале используется панель из трех лунок - 1) неокрашенные клетки; 2) клетки, окрашенные изотипическими контролями с меткой, соответствующей метке использованных моноклональных антител (МКА); 3) клетки, окрашенные одновременно МКА к антигенам CD34 и CD45.

Следует обратить особое внимание, что МКА к CD34+ предпочтительнее использовать с фикоэритриновой (РЕ) или перидининхлорофиловой (PerCP) метками. Данные флуорохромы имеют более высокий уровень специфического сигнала по сравнению с флуоресцеинизотиоционатом (FITC).

Для определения количества CD34+ клеток оптимальными являются антитела к антигену CD34 клона НРСА-2 (8G12), изотипа IgG1.

Таким образом, стандартная панель имеет вид

1. контроль IgG1 РЕ + контроль IgG1 FITC

2. контроль IgG1 РЕ + МКА к CD45 FITC

3. МКА к CD34 РЕ (НРСА-2) + МКА к CD45 FITC

Постановка РИФ:

1. В лунки вносят клетки в количестве не менее 500000 на лунку.

2. Далее в каждую лунку вносят коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспендируют пипеткой. Каждое МКА берут в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке - 20 мкл.

3. Клетки инкубируют с антителами в течение 30 минут при 4°С (нижняя полка обычного холодильника).

4. По окончании времени инкубации клетки дважды отмывают от не связавшихся антител путем центрифугирования в течение 5-7 минут при 1000 g.

5. Клетки переносят в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре.

6. Объем клеточной суспензии в каждой пробирке доводят до 200-500 мкл путем добавления к клеткам ЗФР-БСА.

Счет должен быть осуществлен сразу после постановки реакции.

Анализ и запись на проточном цитофлуориметре. Оценку реакции проводят на проточном 5-параметровом цитометре. Данная схема применима для проточного цитофлуориметра любой конфигурации. CD34+ клетки в ПК представляют собой малую клеточную популяцию. Даже в условиях предварительной стимуляции кроветворения максимальный процент данных клеток составляет 1-3%. Поэтому при подсчете данных клеток в каждой анализируемой пробе следует накапливать не менее 20000 клеточных событий.

Сбор и анализ клеток осуществляется в гейте CD45+ клеток, который включает все ГСК. В данном контексте гейт подразумевает область накопления событий, ограниченную определенными параметрами. В данном случае SSC/ FL-1 (CD45 FITC). То есть, по оси абсцисс (FL-1) на точечной цитограмме будут видны все CD45+ события. По оси ординат (параметр SSC - боковое светорассеяние) клеточные события будут расположены в соответствии с их гранулярностью (цитометрический, а не морфологический термин). Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток в 1 мкл крови и цитоконцентрата проводили на основании числа лейкоцитов в гемограмме на день исследования.

Криоконсервирование СК крови и ГПК. Традиционный метод криоконсервирования заключается в добавлении ДМСО к клеточной суспензии в конечной концентрации 10% и стандартного замораживании на 1 градус в минуту до -80°С или -120°С с использованием стандартных программ электронного программного замораживателя и хранении в жидком азоте или парах жидкого азота.

Выделение клеточной фракции Сепарированные клетки концентрируются путем центрифугирования при скорости вращения центрифуги 2000 оборотов в минуту в течение 10 мин при +18°С.С помощью ручного плазмоэкстрактора из контейнера максимально удаляется плазма, клетки остаются в объеме 40-60 мл.

Добавление криопротектора. В качестве криопротектора кроветворных клеток используется высокоочищенный ДМСО. К полученным клеткам добавляют при постоянном перемешивании равный объем полиглюкина с ДМСО. Смешивание ДМСО с полиглюкином происходит по типу экзотермической реакции с выделением умеренного количества тепла. Концентрация ДМСО в полиглюкине - 10-12%. Таким образом, его конечная концентрация в замораживаемом материале составит 5-6%.

Применение полиглюкина позволило снизить количество ДМСО вдвое, до 5-6% конечной концентрации, так как полиглюкин обладает следующими свойствами: - во-первых, способностью дезагрегировать клетки и тем самым улучшать проникновение криофилактика в клетки, во-вторых, полиглюкин (6% декстран) сам по себе является криофилактиком.

Подсчет количества криоконсервируемых клеток. На следующем этапе обязательно производят подсчет ядросодержащих клеток, а также CD34+ клеток, подлежащих заморозке.

Выбор оптимального объема замораживаемого материала. При криоконсервировании для создания наилучших условий важное значение имеют соотношение объема пластикового контейнера к объему замораживаемого в нем материала и концентрация замораживаемых клеток. Как было установлено, оптимальная концентрация замораживаемых клеток составляет (40-100)×10⁶ клеток/мл.

Замораживание стволовых клеток ГСК и МССК. В зависимости от конечного объема замораживаемого материала выбирается количество полимерных ампул (20-25) для глубокого программного замораживания. Далее клеточную взвесь переводят в эти термостойкие пластиковые пробирки.

В настоящее время методики криоконсервирования клеточных препаратов предполагают использование электронных программных замораживателей. Для замораживания ампул с клеточной взвесью их помещают в электронный программный замораживатель. Скорость охлаждения биоматериала при температуре от 0°С до -40°С составляет 1,1 градус в минуту, а затем 1 градус в минуту до -80°С или -120°С. После завершения цикла программного электронного замораживания пробирки с замороженным материалом переносят в хранилище для длительного хранения. Затем пробирки с замораживаемым материалом помещают в пары жидкого азота при температуре от -165 до -170°С, где они будут находиться в жидком азоте или его парах до использования.

В этой методике учтены и реализованы основные требования, предъявляемые к биоматериалу, подвергнутому криоконсервированию, а именно максимальное сохранение жизнеспособности СК, минимальный объем (100-120 мл) замораживаемого материала при максимальном количестве содержащихся клеток (до 100×10⁶/мл), для ПК минимальный объем 50-60 мл; минимальное количество объема аутотрансплантата.

Получение компонента Б для БМКП "НейроКомб"

Выделение и культивирование МССК. Их выделяли и изолировали по известным международным протоколам из костного мозга (P.Penfornis, R. Pochampally et al, 2011), но использовали модификацию профессора Коноплянникова А.Г. (2014). Для забора костного мозга осуществляли эксфузию 50 мл костного мозга из гребня подвздошной кости специальными биопсийными иглами.

Пример выделения МССК из костного мозга. Доноры костного мозга должны быть предварительно обследованы на инфекции ВИЧ 1 и ВИЧ 2, синдром иммунодефицита; сифилис, гепатиты В и С; острые инфекционные заболевания. Эксфузия костного мозга производится в операционной посредством пункции дистальной части гребня подвздошной кости под общей или местной анестезией. Пункцию проводят стернальной иглой, забор костного мозга производят шприцем типа «Луер», костномозговую суспензию переносят в мешок с изотоническим антикоагулянтом. Отобранный образец сопровождается документацией, содержащей сведения, характеризующие данный образец (данные о доноре, идентификационный код, источник, время и условия забора, условия хранения). Полученный образец в стерильном биксе и изотермическом транспортном контейнере доставляют в лабораторию для выделения МССК.

Подготовка и хранение клеточного материала

После отстаивания образца костного мозга в течение 1-2 часов при комнатной температуре выделенная верхняя фракция клеток отбирается пастеровской пипеткой и ресуспендируется в ростовой среде. В качестве ростовой среды служит среда RPMI-1640, содержащая пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 20% эмбриональной телячей сыворотки. Культивирование проводится в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см², в которые вносили (2-10)×10⁵ клеток/см² в 8 мл ростовой среды. Флаконы помещаются в СО₂-инкубатор (5% СО₂). Через 48 часов среда с неприкрепившимися клетками удаляется и заменяется на свежую. При достижении конфлюентного монослоя (90-100%) клетки пересевают с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в новые флаконы вначале с площадью дна 75 см², а впоследствии при нарастании клеточной массы - в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см². Такой метод позволяет к концу 5-6 недели добиться получения популяции МССК в количестве (1-2)×10⁸ клеток, что достаточно для трансплантации в организм реципиентов. Изучение специфических маркеров полученных культур МССК методом проточной цитофлюорометрии показало, что они относятся к популяции CD10^low, CD34-, CD45-, CD44+, CD90+, CD 105+ клеток, что характерно для клеток, происходящих из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток взрослого организма. Вся клеточная масса МССК в количестве (1-2)×10⁸ клеток проходит транскриптом-модифицирующую предобработку путем конденционирования культуры МССК со средой, индуцирующей нейральную дифференцировку путем химической индукции.

Протокол химической индукции нейралъной дифференцировки МССК. МССК высевались на культуральные (1,7 см² на лунку) планшеты с 4 лунками, покрытыми фибронектином и 75 см² колбами (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) при плотности 2,9×10⁴ клеток/см². После проверки высеянных клеток на жизнеспособность и прикрепленность ко дну колбы базовая среда сливалась и заменялась индукционной средой, состоящей из DMEM, 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FBS), 1 ед/мл белков группы поликомб (PCG), 2% ДМСО (Wako Pure Chemical industries, Ltd., Osaka, Japan), 1-нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (R&D systems Inc., Minneapolis, MN) и 10-μМ политрансретиноевой кислоты (SIGMA, Saint Louis, Missoruri). Индукционная среда менялась один раз тремя днями позже. Индукционная обработка была завершена через 1-2 дня. В качестве контроля, субкультура МССК инкубировалась с базовой средой параллельно культурам в индукционной среде. Клетки на культуральных планшетах с 4 лунками и 75 см² колбах обрабатывались для иммунноцитохимического анализа и экстракции РНК соответственно. Клетки в культуральных слайдах или колбах визуализировались при помощи инвертированного микроскопа и фотографировались на цифровую камеру типа Olympus (Japan). Затем среда удаляется и заменяется на 0,9% физиологический раствор NaCl. Производится отмывание полученного клеточного биоматериала от среды культивирования тем же 0,9% физиологическим раствором NaCl путем двухкратного центрифугирования клеток при 2000 g, и материал может быть использован сразу для трансплантации. Он отмывается от среды культивирования физиологическим раствором и переводится в 200 мл физиологического раствора с 10 ед/мл гепарина. Если материал планируется для интратекального введения, то он должен быть расфасован на аликвоты по 1×10⁶ МССК в криопробирки по 2 мл и заморожен в программном замораживателе. Если материал будет использоваться для внутривенного или внутриартериального введения, то криоконсервируется весь объем (1-2)×10⁸ МССК в криопробирки по 5-10 мл или специальные мешки для хранения костного мозга.

Использование клеточного материала для трансплантации

1. Материал, предназначенный для трансплантации, отмывается от среды культивирования физиологическим раствором и переводится в 200 мл физиологического раствора с 10 ед/мл гепарина.

2. Транспортировка клеточного материала осуществляется на льду в термоизолированном контейнере.

3. Клеточный материал вводится внутривенно с использованием трансфузионной системы в течение 1 ч. За 10 мин до начала процедуры пациент получает 4 мг метипреда.

Получение компонента В для БМКП «НейроКомб»

В качестве биологически стабильной и стерильной трансфузионной среды для получения БМКП используется стерильный 0,9% раствор NaCl, приготовленный в заводских условиях в ампулах по 10 мл или стерильный раствор во флаконе объемом 200 мл или 400 мл. Эту среду применяют при изготовлении БМКП для цитотранфузий. Для получения формы БМКП для имплантаций применяют гетерогенный биодеградируемый полимерный матрикс, в качестве которого может служить универсальный коллагеновый матрикс для имплантации, описанный в патенте RU 2249462, 2005 г., МПК А61K 38.39, А61K 35/12, являющийся официальным медицинским изделием и разрешенный к клиническому применению в РФ, или его аналог, имеющий разрешение на клиническое использование.

Подготовка к применению и применение БМКП «НейроКомб»

Размораживание компонентов А и Б производится непосредственно перед трансплантацией или трансфузией в процедурном кабинете на водяной бане при температуре 37-40°С до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу. В дальнейшем путем центрифугирования при 1500 об/мин каждый используемый компонент осаждают на дно центрифужной пробирки, отсасывают надосадочную жидкость и заливают 1 мл 0,9% физиологического раствора NaCl или трансфузируют в гетерогенный биополимерный коллагеновый матрикс. Процедуру повторяют дважды. Каждый компонент препарата в размороженном состоянии может применяться в течение 6 часов после приготовления. Если препарат за это время не использован, то он подлежит утилизации.

Интратекальное или интравентрикулярное введение БМКП. Интратекальное и интравентрикулярное введение препарата «НейроКомб» должно производиться только в условиях реанимационного отделения. Трансфузия препарата осуществляется через люмбальный прокол, выполненный в типичном месте (в L3-L4 промежутке) под местной анестезией 1% раствора лидокаина или в вентрикулярный порт, установленный в области боковых желудочков головного мозга. Затем забирают 3 мл ликвора и смешивают с одной или двумя биодозами БМКП (максимальный объем до 3 мл), ресуспензируют клеточный препарат в ликворе и медленно вводят в субарахноидальное пространство или в полость боковых желудочков. Накладывают асептическую повязку. При необходимости повторяют интратекальные трансфузии препарата «НейроКомб», но не ранее чем через 7 дней после цитотранфузии. Для коррекции возможных аллергических реакций с профилактической целью делается однократное внутримышечное введение кортикостероидных препаратов (4 мг дексаметазона).

Основными критериями эффективности проведенного вмешательства является улучшение клинической симптоматики. Срок ожидаемого результата крайне индивидуален для каждого пациента и зависят от объема повреждения органа, давности травмы, степени компенсации нарушенных функций. Эффективность терапии варьирует от 1-3 дней до 12-16 месяцев после трансфузии и оценивается клиническими шкалами и электрофизиологическими методами исследования (ЭКГ, церебральным картированием ЭЭГ, транскраниальной магнитной стимуляцией, соматосенсорными вызванными потенциалами и электонейромиографией, а также комплексным уродинамическим исследованием и т.д.).

Оценка эффективности и безопасности БМКП «НейроКомб»

БМКП «НейроКомб» применялся с 2005 по 2010 год в рамках ограниченных клинических испытаний отраслевой программы «Новые медицинские технологии - медицине» (2003 г. ). С 2009 г. по ноябрь 2013 г. компонент А применяется разработчиками в рамках совместных медицинских исследований с ФГБУ «Российский онкологический научный центр» им Н.Н. Блохина Минздрава РФ. За 9 лет экспериментального и клинического применения изолированного компонента А была оценена его эффективность, которая была основана на клиническом исследовании и ретроспективном многолетнем изучении 2780 историй болезни 458 пациентов с различными органическими заболеваниями ЦНС, проходивших многолетнее стационарное экспериментальное лечение в клинике восстановительной интервенционной неврологии и терапии «НейроВита» (Россия, г. Москва) с сентября 2002 г. по март 2016 г. в рамках отраслевой программы Российской академии медицинских наук «Новые клеточные технологии - медицине» (руководитель программы академик РАМН проф. В.К. Ярыгин, координатор исследований проф. А.С. Брюховецкий). Распределение больных по нозологиям нервных болезней представлено в таблице 1.

Больные с различными неврологическими заболеваниями, включенными в программу, находились под постоянным динамическим наблюдением и изучались в течение 3-8 лет, проходя контрольные стационарные обследования через каждые 3 месяца с обязательным проведением клинического обследования, включающего в себя неврологический осмотр, МРТ с контрастным усилением (у 50 пациентов с травматической болезнью СМ проведена МРТ трактография проводящих путей на основе диффузно-тензорного исследования СМ), нейрофизиологическое обследование в виде электронейромиографии, электронейромиографии с соматосенсорными вызванными потенциалами, тестовые исследования по разным шкалам (шкала ASIA, шкала FIM), рентген-контроль коленных и тазобедренных суставов в соответствии с существующим протоколом научных исследований, утвержденным ученым советом и этическим комитетом Российского государственного медицинского университета им. Н.И. Пирогова (РГМУ). Все промежуточные и заключительные отчеты по данным исследованиям ежегодно предоставлялись в ректорат РГМУ им.Н.И. Пирогова и Министерство здравоохранения РФ. Для лечения разных типов повреждений нервной ткани ГМ и СМ применялись различные виды клеточных препаратов: препарат мобилизованных из костного мозга ГСК и ГКП (CD34+, CD45-) (производитель препарата Российский онкологический научный центр им Н.Н. Блохина Минздрава РФ), препарат НСК (CD133+), выделенных из обонятельной выстилки пациента (производитель - Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского) и препарат МССК, выделенных из костного мозга пациента (производитель - Федеральный научно-клинический центр ФМБА России). Весь клеточный материал был стандартизирован и сертифицирован государственными научно-исследовательскими учреждениями.

Эффективность клеточной терапии во многом зависела от нозологической принадлежности заболевания и целей применения СК. Анализ результатов эффективности при различных нозологиях болезней ЦНС представлен в таблице 4.

По результатам исследований эффективность применения только компонентам А в режиме клеточной терапии составляет от 35 до 56%. Эффективность тканевой инженерии и биоинженерии составляла около 41-49,6%. Повысить эффективность лучения только компонентом А выше 56% не удалось. При этом многолетний опыт показал, что применения данных клеточных препаратов достаточно безопасны. Наиболее вероятно, что основная причина всех существующих проблем, связанных с ограниченными возможностями оценки эффективности и внедрении в клинику клеточных препаратов, содержащих только компонент А, заключается в недостаточном количестве СК в структуре продукта. Добавление к компоненту А компонента Б позволило повысить эффективность применяемого препарата на 9%. Общая эффективность предложенного БМКП «НейроКомб» повысилась до 77,4% случаев, что, по-видимому, связано со стимуляцией регенеративного потенциала организма пациента. С целью объективизации полученных клинических результатов использовали специализированные шкалы: ASIA (Scale American Spinal Injuri Association) - Шкала Американской ассоциации спинальных повреждений) и FIM (Scale Functional Independence - Шкала функциональной независимости (C.Grander,1979; L.Cook, 1994), а также данные МРТ, электронейромиографии, церебрального картирования ЭЭГ, комплексного уродинамического исследования, иммунохимического исследования крови и ликвора. Результаты эффективности БМКП «НейроКомб» представлены в таблице 7.

Эффективность применения БМКП «НейроКомб» можно проиллюстрировать также на конкретных клинических примерах.

Пример 1. Пациентка Ц. 1982 г. р., находилась в клинике (история болезни №2016/0578): с 28.09.2016 г. по 10.10.2016 г. с диагнозом: «Болезнь моторного нейрона, вялая тетраплегия. Вертеброгенная цервикокраниалгия с мышечно-тоническим синдромом паравертебральных мышц шейного отдела позвоночника. ДН - II/ Трахеостома. Искусственная вентиляция легких мобильным устройством». Сопутствующие заболевания: «С-извитость внутренней сонной артерии с двух сторон, гемодинамически незначимая. Хронический цистит, хроническое течение. Гипохромная микроцитарная анемия, снижение железа сыворотки крови».

Жалобы при поступлении: на отсутствие самостоятельного дыхания, нарушение глотания, затруднение глотания твердой и жидкой пищи, периодическую аспирацию дыхательных путей пищей при кормлении, кашель. Отсутствие движений в конечностях, гипотрофия мышц с множественными фасцикулярными подергиваниями на руках, ногах и туловище, быстрая утомляемость и истощаемость, слабость мышц аксиальной и дыхательной мускулатуры.

Анамнез заболевания: Анамнестически прослеживается формирование нарушений двигательного аппарата с февраля месяца 2015 г., когда впервые пациентка обратила внимание на дискоординацию в правой руке, чуть позже слабость мышц в левой ноге. За медицинской помощью не обращалась, связав это со стрессами на работе и переутомлением. В дальнейшем слабость стала постепенно прогрессировать. В г. Воронеж, по месту жительства больной, обратилась за медицинской помощью и направлена на консультацию к неврологу. Было проведенное игольчатое ЭНМГ исследование и заподозрен БАС. Больная была направлена на повторное комплексное обследование в НИИ Неврологии РАН, где был подтвержден нейрональный уровень поражения СМ - поставлен диагноз болезнь моторного нейрона (БАС). В августе 2015 г. отмечено выраженное прогрессирование заболевания, появилась общая слабость: нарастание слабости в конечностях слева, шаткость походки, сложно вставать с кровати, появились выраженные фибрилляции мышц верхних конечностей. При МРТ впервые выявлены дегенеративно дистрофические изменения в грудном, шейном отделах позвоночника в виде дегенерации рогов СМ. Эффект от проводимой терапии был незначительный. В дальнейшем лечении в специализированном лечении больной отказано и рекомендовано симптматическое лечение по месту жительства. Обратилась в клинику для возможности проведения терапии БАС собственными ГСК. Проведены исследования в конце декабря 2015 г. и в январе 2016 г.: на онкомаркеры - результат отрицательный, нейровизуализация в динамике - без динамики. Поступила в клинику для дообследования и продолжения лечения в рамках отраслевой научно-исследовательской программы с использованием аутологичных ГСК. Состояние в результате лечения стабилизировалось, уменьшились фибриллярные подергивания с рук, перестала нарастать слабость. Однако с апреля 2016 г. на протяжении всего времени наблюдения отмечалось постепенное медленное прогрессирование заболевания. В июне 2016 года у пациентки после переохлаждения развилась нижнедолевая двухсторонняя пневмония, больная была госпитализирована в пульмонологическое отделение ГКБ г. Воронеж, где на фоне отека легких переведена на вспомогательную вентиляцию с применением ИВЛ, через трахеостомическое отверстие. Мотивацией перевода на ИВЛ была слабость дыхательной мускулатуры и угнетение кашлевого рефлекса. В дальнейшем с аппаратного дыхания врачи реанимации снять больную не смогли, у больной возникло стойкое отсутствие самостоятельного дыхания за счет паралича дыхательного центра. Муж самостоятельно принял решение не отключать больную от аппарата ИВЛ, купил мобильный ИВЛ и стал самостоятельно ухаживать за больной даже после выписки из стационара домой. Прибыла на аппаратном дыхании ИВЛ на лечение в клинику в августе 2016 г. При обследовании в отделении выявили выраженные изменения в маркерах клеточной поверхности собственных ГСК больной (отсутствует маркер CD38+, резко снижены параметры CD90+, CD33+, CD71+, CD117+, что наиболее вероятно свидетельствует о нарушении регуляторных функций собственных мононуклеаров крови, которые берут свои истоки от мутантной ГСК, хотя изменений формулы крови у больной не отмечено. Было решено применить БМКП «НейроКомб»» аллогенный. Для его изготовления было решено собрать аллогенные клетки здорового донора, кем выступила родная сестра больной. Был собран гаплоидентичный (близкородственный) ЛК мобилизованных клеток крови родной сестры больной, содержащий 1,8% гаплоидентичных здоровых ГСК, он обогащен линией культуры клеток ГСК аллогенного донора и экзосомами донорской ГСК, то есть под конкретную больную специалистами ФГБУ РОНЦ МЗ РФ был создан комбинированный клеточный продукт «НейроКомб»-Аллогенный. Для введения данного препарата больная доставлена санитарным автомобильным транспортом в клинику из Воронежа. Раннее развитие без особенностей - росла и развивалась соответственно возрасту. Аллергоанамнез: пищевая аллергия на мед. Состояние при поступлении - соматический статус: средней степени тяжести, относительно стабильное. Кожа, видимые слизистые чистые, бледные. Дыхание при поддержке ИВЛ, через трахеостому, ЧДД (установлена в режиме) 12-14 в минуту, сатурация кислорода 99%. Аускультативно в легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Тоны сердца приглушенные, ритмичные. АД=110/70 мм. рт.ст., ЧСС=86 в 1 мин. Живот при пальпации безболезненный, доступен глубокой пальпации. Мочеиспускание не нарушено. Стул регулярный.

Неврологический статус: В сознании. Когнитивных нарушений не отмечено. Менингеальных симптомов не выявляю. Контактна. Адекватна. В месте и времени и собственной личности ориентирована (контакт невербальный, через условные знаки, движение губ). Дисфагии нет. ЧМН: Зрачки D-S. Конвергенция сохранена. Объем активных движений глазных яблок в полном объеме. Нистагма нет. Мимические пробы выполняет, при разговоре определяется легкая асимметрия носогубных складок. Язык по средней линии, определяются единичные подергивания. Глоточный рефлекс снижен. Нижнечелюстной рефлекс снижен. Гипотрофия мышц конечностей, тонус снижен, с акцентом в кистях. Ограничение подвижности сгибания на 10-5 гр. в кистях, фалангах пальцев, в левом голеностопном суставе. Сухожильные рефлексы с рук живые, симметричны D=S. Рефлексы с нижних конечностей симметричны, живые. Ахилловы, брюшные рефлексы не вызываются. Смешанная тетраплегия, парез межреберных, мышц живота, диафрагмы. Координаторные пробы не выполняет из-за нарушения движения. Тазовые функции контролирует.

Клинические анализы крови (результаты, протоколы) выданы на руки. ЭЛЕКТРОНЕЙРОМИОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Заключение: По результатам исследования нижних конечностей, на фоне умеренной моторной аксонально-демиелинизирующей выраженной нейропатии выявлены признаки интраспинального поражения, что полностью укладывается в структуру высокой формы БАС. ЭКГ: Синусовый ритм, горизонтальное положение ЭОС. ЧСС - 69 удара в минуту. Диффузные изменения миокарда. Консультация терапевта (08.2016). Заключение: Гипохромная микроцитарная анемия, снижение железа сыворотки. Рекомендовано: полноценное питание - (красное) мясо, печень. Препараты железа: ТОТЕМА 5 мг (1 ампула) 2 раза в день - 1-2 месяца (препарат растворять в воде, соке, чае - пить через трубочку). 29.09.2016 г. Выполнена установка (пункционно) гастростомического дренажа 12F. Лечение: С информированного согласия больной и ее мужа пациентке проведен люмбальный прокол в L3-L4, интратекальное введение двух биодоз продукта «НейроКомб»-Аллогенный (дважды с интервалом в 7 дней), манипуляцию перенесла удовлетворительно. В отделении проведено комплексное лечение: симптоматическая терапия, реабилитационная программа (электромиостимуляция). На фоне проводимого лечения появилось ощущение присутствия кисти правой руки, покалывания и необычные ощущения в ней, появились легкие сгибания пальцев в правой руке, больная значительно окрепла, улучшился эмоциональный фон. Установлена эндоскопически гастростома. Нарос тонус мышц в нижних конечностях, менингеальных знаков и чувствительных нарушений нет. Появились попытки единичных вспомогательных дыхательных движений грудной клетки, которых ранее вообще не было. Выраженное позитивное эмоциональное состояние у больной и ее мужа. Настроены лечиться и начать самостоятельно дышать. Начали делать тренировки самостоятельных вдохов но пока не очень эффективно, так как быстро истощается и устает. Пациентка выписывается в относительно стабильном состоянии, средней степени тяжести под наблюдение невролога, терапевта по месту жительства.

Рекомендовано: Продолжить прием: Таблетки Нейромидин 1 таблетка днем через 60 минут после еды - 2 месяца. Таб. Кардиомагнил 75 мг 1 таблетка вечером после еды - постоянно. Препараты железа: ТОТЕМА 5 мг (1 ампула) 2 раза в день - 1-2 месяца (препарат растворять в воде, соке, чае, пить через трубочку) - 2 месяца.

Рекомендовано продолжить проведение: пассивной, активной лечебной физкультуры, направленной на укрепление аксиальной мускулатуры шейного, поясничного отдела позвоночника, мышц конечностей, дыхательной мускулатуры - без переутомлений. Частыми, непродолжительными подходами.

Повторная госпитализация в клинику для повторного курса интратекальной цитотрансфузии с использованием БМКП «НейроКомб»-Аллогенный через 1 месяц (обязательное условие - отсутствие острых инфекционных заболеваний, обострения очагов хронической инфекции).

Пример 2. Пациент Б. 1984 г.р. находился в клинике (история болезни №2016/0206) с 04.04.2016 г. по 15.04.2016 г. с диагнозом: «Детский церебральный паралич, спастический тетрапарез. Умеренные когнитивные нарушения. Плоскостопие. Расходящееся альтернирующее косоглазие. Дисплазия левого тазобедренного сустава. Проведена операция: «Эндопротезирование левого тазобедренного сустава» (27.04.2015 г., Македония). Состояние: после интратекальных цитотрансфузий MACK. Жалобы: на изменение походки и координацию движений, преимущественно в нижних конечностях. Снижение силы в верхних, нижних конечностях, аксиальной мускулатуры. Анамнез заболевания: Пациент болен с первого месяца от рождения в связи с ятрогенно развившейся гипоксией (диагноз выставлен позже на 18-м месяце жизни). Пациенту проведены реконструктивные операции на аддукторах бедра с двух сторон и тазобедренных суставах нижних конечностей. Анамнез жизни: Родился на 2 месяца ранее запланированного срока (вес при рождении 2,5 кг), закричал сразу. В отделении неонатологии пациента выхаживали в кювезе, без достаточного внимания медицинского персонала - из-за чего, со слов родственников, у ребенка развилась гипертермия и гипоксия. До 6 месяцев жизни мать кормила пациента грудным молоком. В раннем периоде развития пациента - в НПР - родственники отклонений не отмечали. В возрасте 1,5 лет родственники обратили внимание на нарушение координации движений и невозможность ходить самостоятельно. Установлен диагноз Детский церебральный паралич, спастический тетрапарез.

Хронические заболевания внутренних органов отрицает. Травмы головы, полостные оперативные вмешательства, туберкулез, гепатит, малярию и др. инфекционные заболевания отрицает. Аллергологический анамнез: аллергические реакции, вредные привычки - отрицает.

С 2013 года по декабрь 2015 года каждые 3 месяца приезжал в клинику для проведения терапии аутологичными ГСК в ЛК. На фоне проводимого комплексного лечения в клинике с применениями ГСК отмечается четкая положительная динамика в виде: увеличение выносливости при занятиях в тренажерном зале, значительно улучшилась координация и объем движений в конечностях, аксиальной мускулатуре - более продолжительное время и более прямо держит осанку, самостоятельно удерживает корпус при вертикализации в коленном упоре, с поддержкой встает с высокого кресла, ходит на тредмиле, с использованием «ходунков». В январе 2016 г. больному проведено интратекальное введение двух биодоз продукта «НейроКомб»-комбинированный (дважды с интервалаом в 7 дней), 27.04.2015 г. в Македонии проведено плановое хирургическое лечение: «Эндопротезирование левого тазобедренного сустава». Пациенту проведена повторная мобилизация и сепарация аутологичных ГСК (09.02.2016 г.). Пациент поступил в плановом порядке для дообследования и продолжения консервативной терапии с применением комбинированного БМКП «НейроКомб»» интратекально. Соматический статус: состояние удовлетворительное, хорошего питания. Кожа и видимые слизистые обычной окраски, влажные. Сохраняется дистопия левого тазобедренного сустава. Поверхностные лимфоузлы не пальпируются. Грудная клетка неправильной формы. Дыхание самостоятельное, адекватное, проводится во все отделы. ЧДД 15 в мин. Пульс ритмичный, удовлетворительного качеств, частота 81 в минуту. АД 135/80 мм. рт.ст. Тоны сердца ясные, ритмичные. Язык розовый, влажный. Живот не вздут, мягкий, не болезненный при пальпации. Почки не пальпируются. Органы чувств и железы внутренней секреции без видимой грубой патологии. Мочеиспускание произвольное. Стул контролирует. Неврологический статус: В сознании. В пространстве, времени, собственной личности ориентирован правильно. Когнитивные функции сохранны (минимальные когнитивные расстройства). Обонятельная функция не нарушена. Зрачки округлой формы, D≤S, фотореакции (прямые и содружественные) живые, симметричные. Движения глазных яблок - среднеразмашистый горизонтальный нистагм при взгляде в стороны, ограничение содружественных движений глазных яблок во всех направлениях. Лицо без признаков асимметрии. Снижения слуха не отмечаю. Мягкое небо подвижное, симметричное. Фонация и глотание не нарушены. Атрофии, парезов, миофасцикуляций трапециевидных и кивательных мышц не выявлено. Язык по средней линии, без атрофий и фасцикуляций. Вкусовая рецепция сохранена. Мышечный тонус в проксимальных группах мышц рук повышен. Сухожильные и периостальные рефлексы рук оживлены, без отчетливой разницы сторон. Сила дистальных, проксимальных мышц верхних конечностей - 5 баллов справа; в левой кисти 4 балла. Тонус мышц в нижних конечностях повышен по пирамидному типу. Сила и амплитуда дыхательных движений межреберных мышц в норме. Брюшные рефлексы вызываются. Сухожильные рефлексы с ног оживлены, симметричны. Нижний спастический парапарез до 4,5 баллов с акцентом в приводящей группе мышц. Нарушений в чувствительной сфере нет. Пролежней нет. Менингиального синдрома нет. Координаторные пробы выполняет с акционным тремором. Стоит самостоятельно при опоре либо с посторонней помощью, значительно легче удерживает баланс. Отмечает, что после последнего введения БМКП «Нейроомб» улучшилась хватка в левой кисти, лучше фиксирует и удерживает тренажеры при интенсивных силовых нагрузках, улучшилась память и внимание, отмечает улучшение мелкой моторики пальцев рук. Определяется S-образный сколиоз шейно-грудного отдела позвоночника. Перкуссия остистых отростков позвонков неболезненна. Пальпация паравертебральных областей неболезненна. ЭКГ. Заключение: Синусовый ритм, нормальное положение ЭОС. ЧСС 69 в минуту. ЭЛЕКТРОЭНЦЕФАЛОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ: Альфа-ритм нерегулярный. Частота: 10-11 кол./сек; амплитуда: до 65 мкВ; индекс выраженности: 75%; зональные различия сглажены, отчетливой латерализации не отмечается. Бета-активность. Частота 19-20 кол./сек, амплитудой до 12 мкВ; отмечается преимущественно в височных отделах с двух сторон. Патологическая медленная активность (дельта, тета): представлена низкоамплитудной активностью в виде единичных тета-колебаний. Пароксизмальные феномены: не регистрируются. Другие ЭЭГ-феномены: отсутствуют. Функциональные пробы: Реакция активации (открывание глаз): адекватная. Фотостимуляция 2-24 Гц: без существенного эффекта. Гипервентиляция (3 мин): изменения картины ЭЭГ не вызывает. Заключение: Эпилептиформной активности не выявлено. Признаков очагового поражения коры головного мозга не отмечается. Значимой межполушарной асимметрии не определяется. Отмечаются умеренные диффузные изменения биоэлектрической активности головного мозга регуляторного характера. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЭЭГ. Методом спектрального анализа выявлены следующие характеристики биоэлектрической активности ГМ: Пик спектральной мощности основного ритма ЭЭГ (альфа-ритм): 10,5 Гц, сглажен, локализован в затылочных областях обеих гемисфер. Асимметрии не отмечается. Полученные данные свидетельствуют в пользу наличия негрубой дисфункции в деятельности глубинных пейсмейкеров церебральной биоэлектрической активности на уровне подкорково-диэнцефальных структур ГМ. СОМАТОСЕНСОРНЫЕ ВЫЗВАННЫЕ ПОТЕНЦИАЛЫ Стимуляция - n. Tibialis на уровне медиальной лодыжки (электрические стимулы длительностью 0,3 мс и частотой 0.5 Гц); Регистрация - 1) Cz - Fpz сенсорная корковая проекция; Консультация терапевта. Заключение: в момент осмотра данных в пользу заболеваний внутренних органов не получено. В отделении проведено комплексное лечение: симптоматическая терапия, реабилитационная программа.

Лечение. Пациенту с предварительного информированного согласия проведено интратекальное введение двух биодоз продукта «НейроКомб»-комбинированный (дважды с интервалом в 7 дней), процедуру перенес удовлетворительно. Также больному с информированного согласия проведено внутрикожное и внутривенное введение 5 доз БМКП с целью активации иммунитета и улучшения общего самочувствия. В отделении проведено комплексное лечение: симптоматическое лечение (ноотропная, сосудистая, метаболическая) ЛФК, массаж, физиотерапия. В клинике пациенту проводились занятия по индивидуально разработанной реабилитационной программе, пациент адаптирован к занятиям в зале ЛФК - в день по 2-2,5 часа. На фоне проводимой комплексной терапии в клинике с использованием индивидуально разработанной реабилитационной программы, симптоматической терапии (ноотропными, церебропротективными, сосудистыми, метаболическими препаратами, а также с использованием интратекального введения БМКП «НейроКомб»-комбинированный отмечается четкая положительная динамика. Расписанную нагрузку пациент переносит удовлетворительно, за все время наблюдений осложнений не отмечалось. Пациент выписывается в удовлетворительном состоянии под наблюдение невролога, терапевта по месту жительства. Рекомендовано: Больному показано наблюдение в динамике травматолога-ортопеда. Продолжать ЛФК на специализированных тренажерах: ежедневно, без переутомлений в несколько подходов, под четким контролем инструктора в условиях реабилитационных центров и специализированных курортно-санаторных комплексов. Пациенту рекомендовано усилить реабилитационную программу за счет занятий в бассейне до 4-5 раз в неделю, что снизит нагрузку на тазобедренные суставы. Продолжить прием лекарственных препаратов: таблетки ПРЕДУКТАЛ МБ 35 мг - 1 таблетка днем - 2 месяца. Таблетки ТАНАКАН 40 мг 1 таблетка 2 раза в день - 1 месяц. Учитывая положительную динамику и хорошую переносимость подобранной программы лечения, больному рекомендована повторная госпитализация в клинику через 2,5-3 месяца сроком на 30 дней для продолжения специализированного лечения в условиях реабилитационно-неврологического стационара для закрепления и улучшения достигнутых положительных результатов.

Пример 3. Пациентка Б., 1942 года рождения, находилась в клинике (история болезни №2015/0640) с 30.11.2015 г. по 12.12.2015 г. с диагнозом: Отдаленные последствия тяжелой закрытой черепно-мозговой травмы (1972 год) с очаговой микросимптоматикой и умеренным астено-невротическим синдромом. Дисциркуляторная энцефалопатия II-Ш ст. на фоне гипертонической болезни III стадии II степени, высокий риск. Атеросклероз брахиоцефальных артерий, гемодинамически незначимый. Вертебробазилярная недостаточность на фоне распространенного остеохондроза, нестабильность шейного отдела позвоночника. Вертеброгенная цервикокраниалгия. Хронические головные боли напряжения с вовлечением перикраниальных мышц, мышц шеи, надплечья. Распространенный генерализованный остеоартрит, подострого течения. Тендиноз сухожилия надостной мышцы, поддельтовидно-подакромиального бурсита левого плечевого сустава, артроза левого ключично-акромиального сочленения; левостороннего трохантерита; деформирующего артроза, кисты Бейкера левого коленного сустава. Сопутствующие заболевания: Ишемическая болезнь сердца: атеросклеротический кардиосклероз. НК 0 ст. Миома матки. Хронический холецистопанкреатит, МКБ. Распространенный генерализованный остеоартрит, наиболее выраженным поражением в мелких суставах кисти. Двухсторонний гонартроз. Киста Бейкера левого коленного сустава. При поступлении жалобы: хронические головные боли в области затылка тянущего, ноющего, жгучего характера, чаще при подъеме артериального давления. Тянущие боли в области шеи. Простреливающие боли в поясничном отделе позвоночника, с эпизодами люмбаго, изменением положения тела в процессе ходьбы. В последнее время часто беспокоят боли в коленных суставах, межфаланговых суставах кистей с двух сторон. Онемение в голени с двух сторон. Наибольшая интенсивность болей в области тазобедренного, коленного, плечевого суставов слева. Чувство боли в области желудка, тошнота, изжога, что было спровоцировано применением дипроспана. Эпизодические подъемы артериального давления. Язвочка на ушной раковине 0,3×0,6 см, не заживающая 1 месяц. Анамнез заболевания: До 1972 года периодически возникали головные боли напряжения после эмоциональной или физической нагрузки. Летом 1972 года была черепно-мозговая травма с потерей сознания (упала рама оконного проема со стеклом). Не лечилась С этого периода головные боли, чаще утренние (обычно в 4 часа), «будильниковые», распирающе-жгучего характера, интенсивностью до 6 баллов по ВАШ, купировавшиеся приемом анальгетиков. Частота головные болей - примерно 1 раз в неделю. Максимум болевой синдром развивался примерно через час после начала болей. Подобные головные боли отмечались у матери. В 1995 году - 2 операции по поводу аппендицита. Крайне тяжело выходила из наркоза, с частыми рвотами в течение нескольких дней. 18 февраля 1998 года после введения кислорода в эпидуральное пространство в течение 5 дней отмечались неукротимые рвоты, не приносящие облегчения, крайне плохо купируемые препаратами (какими - пациентка не помнит). На 5-е сутки впервые поднялось артериальное давление до 240/115 мм.рт.ст.(при нормальном значении 110/80 мм. рт.ст.). После этого отмечаются частые подъемы АД. 16 июля 2005 года впервые, во время просмотра телевизора была потеря сознания длительностью около 20-30 минут. После выхода из синкопального состояния отмечались гиперкинезы головы. Затем было еще 4 эпизода потери сознания. Больная предчувствует синкопы. Длительность синкоп - 1-2 минуты. Потери сознания происходят вне зависимости от положения тела в пространстве. В августе 2005 года проведена операция на левой позвоночной артерии - с положительной динамикой. В последние два месяца боли в суставах усилились. Пациентка получала комплексную терапию с применением дипроспана - внутрисуставное (т/б сустав слева №5) введение, со слабоположительным эффектом. В конце 2005 года описывает эпизод падения с высоты, после чего регулярно отмечается болевой синдром в области поясницы, после курсового лечения с применением НПВС боли регрессировали. Пациентку беспокоят боли в коленных суставах с акцентом слева, на протяжении нескольких лет, максимальная интенсивность болей в начале движения. Ограничение подвижности в мелких суставах пальцев кисти, суставах кисти, что сопровождается болезненными ощущениями. В декабре 2012 года пациентка травмировала правый плечевой сустав, после чего развилось ограничение движения выше горизонтальной линии во всех направлениях. Принимает солпадеин для снятия головных болей около 20 лет, до 10 таблеток в день. В течении последних 15 лет получает с интервалом в 6-12 месяцев интратекальные инъекции аутологичных мобилизованных ГСК для коррекции последствий ЗЧМТ, отмечает значительное улучшение состояния на фоне применения аутологичных ГСК в ЛК, что проявляется снижением интенсивности головной боли, улучшением памяти, внимания, общим укреплением самочувствия, улучшением способностей к умственному труду. Последний год обследовалась амбулаторно по поводу дискомфорта в кишечнике и желудке. Представлены результаты исследования: ФГДС. Заключение: признаки атрофического гастрита, обострение. Колоноскопия. МРТ головного мозга (октябрь 2013 г. ). Заключение: Множественные очаги глиоза полушарий ГМ, возможно как результат нарушения кровообращения по ишемическому типу (посттравматические изменения) в периферических ветвях средних мозговых артерий при выраженном снижении кровенаполнения интракраниальной части правой позвоночной артерии на фоне ее «Кинг-кинг» синдрома. Эктопия миндалин мозжечка в большое затылочное отверстие по типу Аномалии Киари I и выраженное снижение венозного оттока по левому поперечному венозному синусу. Нельзя исключить нестабильность шейного отдела позвоночника с правосторонним подвывихом зубовидного отростка. Рентгенологическое исследование шейного отдела позвоночника (12.2014 г.). Заключение: Высота и форма тел позвонков и межпозвоночных промежутков шейного отдела позвоночника изменены. Особенно это отмечено С5, С6. В этой области отмечается листез С4 кпереди от С5 и С5 кпереди от С6. Значительные краевые остеофиты и протрузии дисков. Последний раз пациентка была госпитализирована в клинику 6 месяцев назад и с информированного согласия больной вместо аутологичных ГСК в ЛК ей было проведено интратекальное введение БМКП «НейроКомб»-комбинированный. Процедуру перенесла удовлетворительно. Отметила за эти полгода выраженный прилив сил, бодрость, повышение общего тонуса, нормализацию АД, а также значительное уменьшение головных болей. Обратила внимание, что при перемене климата и часового пояса значительно легче стала адаптироваться к новому часовому времени и адаптироваться к новым условиям жаркого и влажного климата, что раньше доставляло массу проблем из-за тяжелого состояния при акклиматизации. Несмотря на значительный возраст, отмечает хорошую память и достаточную работоспособность. Госпитализирована в клинику для дообследования и продолжения комплексного лечения в группе консервативной терапии с использованием БМКП «НейроКомб» комбинированный.

Аллергоанамнез: полиаллергия - идиосинкразия к ДИМЕДРОЛ, ЭУФИЛЛИН, ТРЕНТАЛ, АНАЛЬГИН, ДИМЕКСИД, Инстенон. Анамнез жизни: перенесла 2 операции по поводу аппендицита в 1995 году. С детских лет укачивает в транспорте. Объективно: Общее состояние удовлетворительное. Кожные покровы и видимые слизистые чистые, обычной окраски. Дыхание везикулярное, хрипов нет, ЧДД 16 в 1 мин. Пульс 78 уд/мин, ритмичный, АД 130/80 мм рт.ст. Тоны сердца ритмичные. Живот мягкий, безболезненный при пальпации. Узелки на тыльнобоковых поверхностях пальцев кистей рук, дистальных, проксимальных фаланг, сопровождающиеся искривлением пальцев рук. Печень и селезенка не увеличены. Симптом поколачивания отрицательный с обеих сторон. Локально: Раневая поверхность (язвочка) 0,3×0,4 мм и покраснение левой ушной раковины. Неврологический статус: Сознание ясное. Правильно ориентирована в пространстве, времени, собственной личности. Глазные щели D>S, движения глазных яблок в полном объеме. Зрачки D=S, фотореакции живые. Легкий энофтальм слева. Носогубные складки симметричные. Мимические пробы выполняет удовлетворительно. Чувствительных нарушений на лице нет. Места выхода ветвей тройничного нерва безболезненны. Глоточный рефлекс сохранен. Дизартрии, дисфагии, дисфонии нет. Легкий хоботковый рефлекс. Язык по средней линии, без атрофии и фасцикуляций. Мышечная сила - 5 баллов во всех группах мышц (болезненность при определении силы мышц кисти, пальцев из-за выраженного остеоартроза). Атрофии мышц нет. Фасцикуляций нет. Рефлексы живые, симметричные. Патологические рефлексы на ногах не вызываются. С двух сторон вызывается кистевой аналог Россолимо. Чувствительность сохранена. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. Функция тазовых органов не нарушена. Мышечно-тонический синдром перикраниальных мышц, мышц шеи, надплечья, поясницы. Ограничение движения в плечевых суставах во всех направлениях, с акцентом справа, сопровождающееся болевым синдромом. ЭКГ. Заключение: ЧСС 58 в минуту. Синусовая брадикардия. Горизонтальное положение ЭОС. Цитологическое исследование со дна язвы левой ушной раковины. Результат: Диагностический материал не получен - бесструктурное вещество, участки детрита, единичные клетки плоского эпителия с некоторой атипией ядер. Назального эпителия не обнаружено. УЗИ Л/У Протокол: При исследовании паховых областей патологического увеличения лимфоузлов не выявлено. УЛЬТРАЗВУКОВОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛЕЧЕВЫХ СУСТАВОВ. Эхографические признаки тендиноза сухожилия надостной мышцы, поддельтовидно-подакромиального бурсита левого плечевого сустава, артроза левого ключично-акромиального сочленения; левостороннего трохантерита; деформирующего артроза, кисты Бейкера левого коленного сустава.

ЦВЕТОВОЕ ДУПЛЕКСНОЕ СКАНИРОВАНИЕ БРАХИОЦЕФАЛЬНЫХ АРТЕРИЙ. Протокол: Исследованы сонные и позвоночные артерии в экстракраниальном отделе с двух сторон. СПРАВА: Брахиоцефальный ствол проходим. Стенки ОСА не утолщены, уплотнены, КИМ 0,8 мм, ПСС 71,5 см/сек, в проксимальном отделе гемодинамически незначимая S-образная извитость. ВСА и НСА полностью проходимы. ВСА имеет гемодинамически незначимую С-образную извитость, ПСС 55,9 см/сек. Позвоночная артерия диаметром 3,1 мм, проходима, кровоток антеградный, ход в костном канале с S-образной извитостью, ПСС 30,2 см/сек. По подключичной артерии регистрируется магистральный характер кровотока. СЛЕВА: Стенки ОСА не утолщены, уплотнены, КИМ 0.8 мм, ПСС 76,0 см/сек, в проксимальном отделе гемодинамически незначимая S-образная извитость. ВСА и НСА полностью проходимы, в устье ВСА мелкая локальная кальцинированная АСБ. ВСА имеет гемодинамически незначимую С-образную извитость, ПСС 41,4 см/сек. Позвоночная артерия диаметром 4,4 мм, проходима, кровоток антеградный, ход в костном канале с S-образной извитостью, ПСС 30,2 см/сек. По подключичной артерии регистрируется магистральный характер кровотока. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Нестенозирующий атеросклероз БЦА. Гемодинамически незначимые S-образные извитости ОСА с двух сторон, С-образные извитости ВСА с двух сторон. S-образная извитость обеих позвоночной артерии, обусловленная вертеброгенным воздействием. УЛЬТРАЗВУКОВОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ. Протокол: В брюшной полости свободной жидкости нет. Печень в размерах не увеличена: КВР правой доли 120 мм, ККР левой доли 80 мм. Паренхима умерено повышенной эхогенности, однородная, без очаговых изменений. Внутрипеченочные желчные протоки и сосуды не расширены. Воротная вена 10 мм. Холедох 4 мм. Желчный пузырь имеет перегиб, средних размеров - 65×20 мм, стенки не утолщены, камней не выявлено. Поджелудочная железа не увеличена: головка 18 мм, тело 10 мм, хвост 22 мм, контуры ровные, четкие, паренхима однородная, повышенной эхогенности. Вирсунгов проток не расширен - 2 мм. Селезенка не увеличена 85×30 мм, очаговых изменений не выявлено. Почки обычной формы, средних размеров, паренхима толщиной 14-15 мм. Камней и кист не выявлено. ЧЛС не расширены. Брюшной отдел аорты без аневризматических расширений, стенки атеросклеротически изменены. В забрюшинном пространстве вдоль аорты, нижней полой вены, а также вдоль подвздошных сосудов увеличения лимфоузлов не выявлено. Заключение: Диффузные изменения печени и поджелудочной железы, жировая инфильтрация. Атеросклероз брюшной аорты. Консультация ревматолога проф., д.м.н. В.В. Цурко. Заключение: Плечелопаточная периартропатия слева, сакроилеит слева дегенеративно-воспалительного характера, боли до 2 баллов по ВАШ. Распространенный остеоартроз с вовлечением коленных, тазобедренных, фасеточных суставов, спондилез. Нарушение функции сустаов II степени. Рекомендовано: ЛФК - регулярно длительно с постепенным увеличением нагрузок в течении 3 месяцев. При усилении болей в области крестцово-подвздошного сочленения в амбулаторных условиях использовать пластырь с лидокаином (версатис). На лучезапястные, плечевые и суставы кистей использовать гель Кармолис с охлаждающим эффектом. Консультация терапевта. Заключение: Гипертоническая болезнь II ст. III ст. высокого риска, кризовое течение. Дислипидемия леченная статинами. Анемия легкой степени тяжести (на фоне миомы?). Миома матки. Хронический холецистопанкреатит, МКБ. Распространенный генерализованный остеоартрит, наиболее выраженный поражением в мелких суставах кисти. Двухсторонний гонартроз. Киста Бейкера левого коленного сустава. Лечение: В отделении проведено обследование и лечение согласно Московским городским стандартам оказания стационарной медицинской помощи для взрослого населения, после предварительного обсуждения программа откорректирована с учетом пожелания пациентки. Схема 1 - Арифон 1,5 мг утром. Престариум 5 мг утром, Атенолол 50 мг утром (при урежении пульса ниже 55 в мин уменьшить до 25 мг). Нормодипин 10 мг вечером. Теветен 1 таблетка вечером. Липримар 10 мг вечером. Тромбо Асс 100 мг вечером. Схема 2 - Арифон 1,5 мг утром. Атенолол 50 мг утром (при урежении пульса ниже 55 в мин. уменьшить до 25 мг). ЭКСФОРЖ - 10/160 мг в обед 1 раз в день (возможно начать с дозы 5/80 или 5/160). Липримар 10 мг вечером. Тромбо Асс 100 мг вечером. С предварительного информированного согласия пациентке было выполнено введение (1 биодоза) БМКП «НейроКомб» (комбинированный) посредством люмбальной пункции и однократная цитотрансфузия парентерально. Процедуры пациентка перенесла удовлетворительно. Пациентка в удовлетворительном, относительно стабильном состоянии выписывается для продолжения лечения под наблюдением терапевта, невролога по месту жительства. Рекомендована повторная госпитализация в клинику «НейроВита» через 6 мес.

Перечень используемых сокращений

DMEM - модифицированная по способу Дульбекко среда Игла

FBS - телячья эмбриональная сыворотка

PCG - белки группы поликомб

БАС - боковой амиотрофический склероз

БМКП - биомедицинский клеточный продукт

ГКП - гемопоэтические клетки-предшественники

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ - головной мозг

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ДМСО - диметилсульфоксид

ДЦП - детский церебральный паралич

ЛК - лейкоконцентрат

МГБ - мультиформная глиобастома

МНК - мононуклеарные клетки

МССК - мезенхимальные стромальные стволовые клетки

МСКП - мезенхимальные стромальные клетки-предшественники

НСК - нейральные стволовые клетки

ОК - опухолевые клетки

ОСК - опухолевые стволовые клетки

ПК - периферическая кровь

ПовК - поврежденные клетки

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

СК - стволовые клетки

СМ - спинной мозг

тсСК - тканеспецифичные стволовые клетки

ЦНС - центральная нервная система

1. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для регенерации нервной ткани, содержащий аутологичные или иммуносовместимые аллогенные очищенные мобилизованные мононуклеарные клетки (МНК) лейконцентрата (ЛК) периферической крови (ПК) человека (компонент А), содержащие гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) в количестве 1-2% от общего числа МНК и мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСКП) в количестве 1-1,5% от общего числа клеток МНК, линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК), предобработанных в биологически стабильной среде, индуцирующей их нейральную дифференцировку (компонент Б), и вспомогательное вещество в виде стерильной трансфузионной среды при следующих концентрациях клеток на 1 мл вспомогательного вещества:

компонент А (МНК) - 1,75×10⁵-4×10⁶ клеток;

компонент Б (МССК) - 3×10⁵-1,5×10⁶ клеток.

2. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его интратекального, интравентрикулярного, интрацеребрального или интраспинального введения в качестве вспомогательного вещества использован биодеградируемый полимерный матрикс при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 2,6×10⁵-1×10⁶ клеток;

компонент Б (МССК) - 0,5×10⁶-1,5×10⁶ клеток.

3. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его интратекального, интравентрикулярного, интрацеребрального или интраспинального введения в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 1,75×10⁵-5×10⁵ клеток;

компонент Б (МССК) - 3×10⁵-7,5×10⁵ клеток.

4. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что для его внутривенного и внутриартериального введения в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl при следующих концентрациях клеток на 1 мл матрикса:

компонент А (МНК) - 3,75×10⁶-4×10⁶ клеток;

компонент Б (МССК) - 1×10⁶-1,25×10⁶ клеток.

5. БМКП по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что аллогенные МНК и МССК иммуносовместимы по группе крови, резус-фактору и иммунофенотипу крови.

6. Способ получения ex tempore биомедицинского клеточного продукта по любому из пп. 1-5, включающий в себя:

получение аутологичных или иммуносовместимых аллогенных очищенных мобилизованных мононуклеарных клеток (МНК) лейконцентрата (ЛК) периферической крови (ПК) человека (компонент А), содержащих гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) в количестве 1-2% от общего числа МНК и мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСКП) в количестве 1-1,5% от общего числа МНК, путем их выделения из лейкоконцентрата периферической крови посредством лейкоцитофереза с использованием подкожного введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора донору и/или пациенту или из костного мозга посредством трепанбиопсии из грудины и подвздошных костей с последующим получением суспензии МНК из лейкоконцентрата и биоматериала костного мозга методом градиентного фракционирования;

получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК) путем их выделения из костного мозга или ЛК ПК, дальнейшего культивирования в ростовой среде и последующей обработки в среде, индуцирующей нейральную дифференцировку МССК (компонент Б), и

смешивание ex tempore компонентов А, Б и вспомогательного вещества в виде стерильной трансфузионной среды.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что полученные компоненты А, Б криоконсервируют, а перед их смешиванием ex tempore со вспомогательным веществом размораживают.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что в качестве среды, индуцирующей нейральную дифференцировку МССК, используют среду, состоящую из DMEM (Dolbecco`s Modified Eagle`s Medium), телячьей эмбриональной сыворотки (FBS), белков группы поликомб (PCG), диметилсульфоксида, основного фактора роста фибробластов (bFGF) и политрансретиноевой кислоты.

9. Применение биомедицинского клеточного продукта по любому из пп. 1-5 для лечения и профилактики неврологических заболеваний.

10. Применение по п. 9, отличающееся тем, что биомедицинский клеточный продукт применяют для лечения повреждений головного и спинного мозга.