Способ конвективного высушивания высокодисперсных биоматериалов
Владельцы патента RU 2720175:
Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способа получения сухих биоматериалов высушиванием конвективным методом. Сущность изобретения заключается в том, что содержащие действующие вещества биологической природы в жидкой фазе высокодисперсные биоматериалы высушивают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С и относительной влажности воздуха 20-80%. Техническим результатом заявляемого изобретения является снижение инактивации действующих веществ биологической природы в процессе высушивания высокодисперсных биоматериалов, повышение концентрации действующих веществ, а также снижение инактивации действующих веществ при хранении сухих материалов. 1 табл., 5 пр.
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается способа высушивания конвективным методом биологических материалов, находящихся в высокодисперсном состоянии и содержащих бактерии, вирусы, иммуноглобулины и другие действующие вещества биологической природы.
Известен способ сушки биологических материалов, в соответствии с которым обезвоживание осуществляют в два этапа: на первом этапе частичное обезвоживание материала осуществляют за счет смешивания его с безводной лактозой, при этом лактоза превращается в кристаллогидрат, что в последующем облегчает процесс удаления влаги до требуемой остаточной влажности материала (от 2 до 4%); на втором этапе производят досушивание материала вакуумным испарением влаги при разрежении, исключающем самозамораживание, при подогреве не выше 25°С (1).
Основным недостатком известного аналога является невозможность его использования для обезвоживания высокодисперсных материалов.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения сухих бактериальных препаратов, в соответствии с которым суспензию микроорганизмов смешивают с сорбентом - сухим высокодисперсным порошком диоксида кремния, в соотношении 2:1, сушку ведут в термостате при 27-32°С или на воздухе и полученную смесь диспергируют до тонкодисперсного состояния (2).
По сути известный способ предполагает комбинированное обезвоживание суспензии микроорганизмов: на первом этапе удаление части влаги сорбентом - порошком диоксида кремния, на втором - удаление оставшейся влаги из материала (и сорбента) в термостате при 27-32°С или на воздухе.
Основными недостатками прототипа являются большая инактивация действующих веществ биологической природы в процессе обезвоживания биоматериалов и их хранения и невозможность получения сухих материалов с высокой дисперсностью. Кроме того, способ не учитывает влияние относительной влажности на результат процесса высушивания.
Общим признаком заявляемого изобретения и прототипа является удаление влаги при атмосферном давлении (на воздухе) за счет конвективного подвода тепла к высушиваемому материалу из окружающей среды.
Технической проблемой, решаемой при создании изобретения, является разработка способа конвективного высушивания высокодисперсных биоматериалов, содержащих действующие вещества биологической природы, позволяющего снизить инактивацию действующих веществ в процессе высушивания и последующего хранения, а также повысить концентрацию действующих веществ в материале.
Техническим результатом заявляемого изобретения является тот факт, что заявленный конвективный способ высушивания по сравнению с прототипом, позволяет снизить инактивацию действующих веществ биологической природы в процессе высушивания на 16-40%, в процессе хранения сухих материалов на 13-42%, а высокодисперсные биоматериалы, полученные при реализации заявленного способа, обладают в 1,5-9,4 раз большей концентрацией действующих веществ по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом.
Сущность изобретения заключается в том, что содержащие действующие вещества биологической природы в жидкой фазе высокодисперсные биоматериалы обезвоживают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С и относительной влажности воздуха 20-80%.
Стабилизация микрокапельного состояния жидкой фазы в препарате достигается при соотношении жидкой фазы и сухого высокодисперсного гидрофобного аэросила от 10:1,5 до 10:6 (3).
Известно, что каплю жидкости в воздухе сжимает лапласовское давление, величина которого возрастает с уменьшением размера капли. Движущей силой процесса обезвоживания капли является разница в давлении пара над поверхностью капли и в окружающем ее газе (воздухе), и чем меньше размер капли, тем выше скорость ее испарения. Схожесть состояния жидкости в аэрозоле и в микрокапельном порошке обусловливает возможность эффективного атмосферного обезвоживания порошка. Однако, в этом случае на биологические компоненты в порошке, как и в аэрозоле, помимо собственно обезвоживания будут оказывать влияние различные действующие факторы, к наиболее существенным из которых следует отнести температуру и относительную влажность окружающего воздуха.
Данные литературы о зависимости инактивации биокомпонентов в аэрозоле от относительной влажности воздуха противоречивы. Так, температура 12-15°С и относительная влажность 50-90% наиболее благоприятны для выживания пастерелл в воздухе (4). Влодавец В.В. обнаружил чрезвычайно быстрое отмирание Е. coli и S. marcescens в аэрозолях при низких показателях относительной влажности (5). Самая высокая выживаемость этих бактерий отмечена при температуре 18,5-21°С и относительной влажности воздуха выше 70%. Он же отмечает, что Staph. albus и Sarcina lutea, адаптированные к условиям внешней среды, хорошо сохраняются в аэрозоле при относительной влажности от 12 до 90% и температуре 18,5-21°С.
Songler J.R. (6), изучая выживаемость при температуре воздуха 23°С некоторых инфекционных агентов, пришел к выводу, что вирус ринотрахеита крупного рогатого скота и бактериофаг Е. coli ВТ3 более устойчивы при относительной влажности 90%, чем при влажности воздуха 10 и 35%, тогда как вирусы болезни Ньюкасла и везикулярного стоматита выживали лучше при относительной влажности более 10%. Изучая выживаемость в аэрозоле вирусов группы Колумбия-SK и Менго-МЕ, авторы (7) установили, что при температуре 16°С скорость инактивации вирусов в первые 5 мин витания в большей степени зависит от влажности воздуха и достигает максимума при высоких (80%) и низких (5%) ее значениях. По данным авторов (8), вирус оспы голубей в аэрозоле устойчив при различных значениях относительной влажности, тогда как вирус саркомы Рауса инактивируется при низкой влажности и довольно стабилен лишь при относительной влажности воздуха выше 70%.
Нашими собственными исследованиями установлено, что наименьшая инактивация ряда биокомпонентов при атмосферном высушивании микрокапельных порошков при температуре 25-45°С происходит в диапазоне относительной влажности воздуха от 20 до 80%.
Важным технологическим преимуществом заявляемого способа является получение «чистого» сухого порошкообразного биологически активного материала, не содержащего влагоемкий сорбент. С одной стороны, это повышает устойчивость при хранении сухих биологически активных веществ, так как исключает возможность нежелательного перераспределения влаги между биокомпонентом и сорбентом при изменении термодинамического состояния системы, происходящем в случае существенных колебаний температуры хранения препарата сорбционно-контактной сушки. С другой стороны, значительно расширяет фармацевтический аспект конструирования биопрепаратов, а именно: увеличивает количество возможных готовых форм, как твердых дозированных (таблетки, капсулы, драже, гранулы), так и мягких (суппозиторий, пасты, мази) лекарственных форм, которые могут быть приготовлены на основе сухого порошка, и в которых наличие влагоемкого сорбента нежелательно или недопустимо.
Согласно изобретению снижение инактивации действующих веществ биологической природы в процессе высушивания высокодисперсных биоматериалов, повышение концентрации действующих веществ и снижение инактивации действующих веществ при хранении сухих материалов обеспечивается тем, что жидкую фазу высушивают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С, относительной влажности воздуха 20-80%.
Заявляемый способ конвективного высушивания высокодисперсных биоматериалов является новым и в литературе не описан.
Жизнеспособность микроорганизмов после воздействия различных факторов очень часто оценивают по их выживаемости (9), но в данном случае эффективность процесса обезвоживания оценивали по инактивации (10) действующих веществ в биоматериалах. Термин инактивация в данном случае является более уместным и универсальным по сравнению с понятием выживаемость, пригодным для описания живых микроорганизмов, так как подходит по смыслу к характеристике гораздо большего числа эффектов, например, потери активности ферментов растительного происхождения или иммуноглобулинов при их переработке, когда термин выживаемость относителен.
Расчет инактивации действующих веществ осуществляли по формуле
И=100-В,
где И - инактивация действующих веществ, %;
В - выживаемость, %.
Выживаемость микробных клеток в процессе получения микрокапельных порошков рассчитывали по формуле
В=БКмп×(1+γ)×100/БКбс,
где БКмп - концентрация клеток в микрокапельном порошке, КОЕ/г;
БКбс - концентрация живых клеток в биосуспензии, КОЕ/мл;
γ - отношение массы аэросила к массе биосуспензии в микрокапельном порошке.
Выживаемость микроорганизмов при обезвоживании микрокапельного порошка до промежуточной влажности или в отделенном рассевом сухом порошке определяли по выражению
В=БКс(п)×(100-Wмп)×100/БКмп×(100-Wc(п)),
где БКс(п) - концентрация клеток в обезвоженном микрокапельном порошке или отделенном порошке, КОЕ/г;
Wc(п) - остаточная влажность обезвоженного микрокапельного порошка или отделенного рассевом порошка, %;
Wмп - относительная влажность микрокапельного порошка.
Выживаемость микроорганизмов при приготовлении сухого препарата сорбционным обезвоживанием рассчитывали по формуле
В=БКп×Мп×100/БКмп×Ммп,
где БКп - концентрация микробных клеток в сухом препарате, КОЕ/г;
Мп - масса сухого препарата, г;
Ммп - масса микрокапельного порошка, взятого для приготовления сухого препарата, г.
Количество жизнеспособных энтеробактерий рассчитывали по формуле
БК=N×10п-1×V/P,
где БК - биологическая концентрация клеток в материале, КОЕ/г, КОЕ/мл;
N - среднее арифметическое числа колоний в пробирках;
п - степень последнего разведения;
V - объем разводящей жидкости, мл;
Р - навеска сухого (г) или объем жидкого (мл) материала.
Биологическую концентрацию живых аэробных микроорганизмов определяли по выражению
БК=N×10п+1×V/P,
где БК - биологическая концентрация клеток в материале, КОЕ/г, КОЕ/мл;
N - среднее арифметическое числа колоний на чашках;
п - степень разведения;
V - объем разводящей жидкости, мл;
Р - навеска сухого (г) или объем жидкого (мл) материала.
Биологическую активность препаратов иммуноглобулинов характеризовали противосальмонеллезной активностью (в титрах РПГА) (11). Концентрацию вакцинного штамма La-Sota вируса болезни Ньюкасла определяли культивированием в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, а биологическую активность вируса оценивали по эмбриональной инфицирующей дозе (ЭИД50), которую рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина (12). Стерилизацию гидрофобного аэросила проводили в сухожаровом шкафу SUP-4 при температуре 120°С с выдержкой в установившемся тепловом режиме не менее 2 часов. Относительную влажность воздуха в помещениях измеряли гигрометром М-19.
Осуществление способа изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих снижение инактивации действующих веществ биологической природы в процессе высушивания биоматериалов, повышение концентрации действующих веществ и снижение инактивации действующих веществ при хранении сухих материалов при реализации способа.
Пример 1. Объект высушивания готовили смешением суспензии микроорганизмов Serratia marcescens шт. ВКМ-851 с лактозной защитной средой в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в электромагнитном диспергаторе. Микрокапельный порошок тест-культуры для проверки фильтров очистки воздуха с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 45,9×109 КОЕ/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 20%.
Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.
Пример 2. Объект высушивания готовили смешением суспензии микроорганизмов Bifidobacterium bifidum шт. 1С с сахарозо-молочной защитной средой в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок пробиотического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 1,3×109 КОЕ/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 80%.
Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.
Пример 3. Объект высушивания готовили смешением суспензии микроорганизмов Lactobacillus acidophilus штаммов 100aш, NK1 и К3Ш24 с сахарозо-молочной защитной средой в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок пробиотического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентрацией жизнеспособных микроорганизмов 0,8×109 КОЕ/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 45°С и относительной влажности воздуха 20%.
Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.
Пример 4. Объект высушивания готовили смешением раствора иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM с глицином (2%) в качестве защитной среды и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок иммунобиологического препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с концентраций белка 40 мг/г и противосальмонеллезной активностью 1:640 в титрах РПГА высушивали при атмосферном давлении при температуре 45°С и относительной влажности воздуха 80%.
Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице.
Пример 5. Объект высушивания готовили смешением суспензии вакцинного штамма La-Sota вируса болезни Ньюкасла с защитной средой на основе обезжиренного молока в соотношении 2:1 и переводили его в микрокапельное состояние в дисковом диспергаторе. Микрокапельный порошок вакцинного препарата с жидкой фазой в микрокапельном состоянии, стабилизированном сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, с содержанием жизнеспособных вирусов 10,7 lg ЭИД50/г высушивали при атмосферном давлении при температуре 32°С и относительной влажности воздуха 50%.
Биологическая концентрация действующего вещества, его инактивация в процессе высушивания и в процессе хранения сухого материала при температуре (4±2°С) в течение 12 месяцев представлены в таблице. 
Как следует из анализа данных, представленных в таблице, инактивация действующих веществ биологической природы в результате процесса по заявленному способу высушивания снизилась на 16-40%. Высокодисперсные биоматериалы, полученные при реализации заявленного конвективного способа высушивания, при одинаковом влагосодержании обладают в 1,5-9,4 раз большей концентрацией действующих веществ по сравнению с препаратами, приготовленными в соответствии с прототипом. Кроме того, инактивация действующего вещества в результате хранения сухих материалов, полученных заявленным способом, меньше на 13-42% инактивации хранившихся материалов по прототипу. Указанное обеспечивается высушиванием жидкой фазы из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С и относительной влажности воздуха 20-80%.
Источники информации
1. RU, заявка 93027480 A, F26B 5/16, 27.10.1996.
2. RU 2104299 С1.
3. RU 2440105 С2.
4. Ярных B.C. Применение аэрозолей в ветеринарии. - М.: Сельхозиздат, 1962. - 240 с.
5. Влодавец В.В. Определение жизнеспособности бактерий в аэрозоле // Журнал микробиологии. - 1963. - №4. - С. 46-50.
6. Songler J.R. Influence of relative humidity on the survival of some air-borne viruses // Appl. Microbiol. - 1967. - Vol. 15, №1. - P. 35-42.
7. Akers T.I., Bond S.N., Goldberg L.J. Effect of temperature and relative humidity on survival of air-born Columbia-SK group viruses // Appl. Microbiol. - 1966. -Vol. 14, №3. - P. 361-364.
8. Webb S.J., Bather R., Hodges R.W. The effect relative humidity and inositol on airborne viruses // Canad. J. Microbiol. - 1963. - Vol. 9, №1. - P. 87-92.
9. Кинетика измельчения биопрепаратов в аппарате на базе плоского двухстореннего индуктора / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин и др. // Медицинская промышленность и биотехнология. Наука-производство-маркетинг. 1992. Вып. 5-6. С. 51-58.
10. RU 2440098 С2.
11. ФС 42-3347-97.
12. Сюрин В.Н., Белоусов Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология. - М.: Колос, 1986.
Способ конвективного высушивания при атмосферном давлении высокодисперсных биоматериалов, содержащих действующие вещества биологической природы в жидкой фазе, отличающийся тем, что жидкую фазу высушивают из микрокапельного состояния, стабилизированного сухим высокодисперсным гидрофобным аэросилом, при температуре 25-45°С и относительной влажности воздуха 20-80%.
