Штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген mbl-ct666 chlamydia trachomatis, способ его получения, иммуногенная композиция для защиты от урогенитального хламидиоза человека
Владельцы патента RU 2721123:
федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующего химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis после его введения в организм субъекта. Получен штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, несущий в составе экспрессирующей конструкции нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, который после введения в организм субъекта продуцирует химерный белок MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в виде аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, индуцирующий защиту от урогенитального хламидиоза человека. Способ получения штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующего химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, заключается в том, что штамм получают путем гомологичной рекомбинации в клетках E. coli штамма BJ5183 между плазмидой pShuttle-CMV (#240007 , pShuttle-CMV vector, Agilent, US), несущей кассету с химерным геном MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, переклонированным из плазмиды pAL2-T, и ДНК аденовируса человека 5 серотипа с делецией в области E1 и Е3 генома аденовируса, причем сборку рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц проводят в клетках линии HEK293, Human embryonic kidney 293, после трансфекции рекомбинантной ДНК pAd-MBL-CT666, при этом в результате конструирования экспрессирующая кассета содержит CMV-промотор цитомегаловируса человека, целевой ген - химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, пА-сигнал полиаденилирования и находится в области делеции E1 генома аденовируса, при этом используют полимеразную цепную реакцию со специфическими праймерами, получена иммуногенная композиция, содержащая штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, для применения в количестве не менее 2×108 БОЕ/мл, при этом она содержит фармацевтически приемлемый буферный раствор до 0,5-1,0 мл, объем дозы составляет 0,5-1,0 мл во флаконе, Изобретение позволяет применить иммуногенную композицию, содержащую штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, в качестве прайм-компонента вакцины против хламидиоза для защиты от урогенитального хламидиоза человека. 4 н.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 7 пр.
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis после его введения в организм субъекта. Предложенный штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, может применяться в качестве иммуногенного компонента для изготовления вакцин с целью профилактики урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis.
Предшествующий уровень техники
Хламидийная инфекция - самое распространенное бактериальное инфекционное заболевание, передаваемое половым путем. По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно в мире диагностируется более 100 миллионов новых случаев заболевания, заболеваемость продолжает расти даже в развитых странах и составляет более 500 случаев заболевания на 100 тысяч населения в год (WHO "Initiative for Vaccine Research (IVR), Sexually Transmitted Diseases." 2012.). В группе риска, 14-25 лет, заболеваемость достигает 11%. Существующая статистика не отражает истинного положения, т.к. до 90% у женщин и до 50% у мужчин хламидийная инфекция протекает бессимптомно. Такие случаи не диагностируются, не лечатся, но способствуют распространению инфекции.
Особенно тяжелые осложнения и последствия хламидии способны вызывать у женщин. Так, восходящее течение инфекции приводит к развитию воспалительных заболеваний органов малого таза, развитию бесплодия, на фоне воспаления возрастает риск патологии беременности (Haggerty C.L. et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women // J. Infect. Dis. 2010. V. 201. №2. P. 134-155; Кисина В.И., Колиева Г.Л. Урогенитальный хламидиоз // Гинекология. 2003. Т. 5. №2. С. 82-86.).
Научно-обоснованным методом профилактики хламидиоза является вакцинация. Согласно литературным данным, при моделировании ситуации установлено, что эффективная вакцинация позволила бы устранить эпидемию хламидиоза в течение 20 лет, а частично эффективная - может снизить заболеваемость, как у мужчин, так и у женщин. Также отмечено, что экономически более эффективной была бы вакцинация только женщин (Gray R.T., Beagley K.W., Timms P., Wilson D.P. Modeling the impact of potential vaccines on epidemics of sexually transmitted Chlamydia trachomatis infection // J. Infect. Dis. 2009. №199. Р. 1680-8.).
К настоящему времени не зарегистрировано ни одной коммерческой вакцины, направленной на профилактику и лечение заболеваний, вызываемых С. trachomatis. Сложности в создании вакцины объясняются особенностями иммунного ответа при хламидийной инфекции. Считают, что создание эффективной вакцины против хламидийной инфекции предполагает формирование ответа специфических Т-хелперов первого типа (Th1), способных эффективно достигать мест локализации патогена в тканях и органах, и способствовать формированию специфических системных и локальных антител [Beagley K.W., Timms P. Chlamydia trachomatis infection: incidence, health costs and prospects for vaccine development // J Reprod Immunol. 2000. V. 48. №1. P. 47-68.].
Таким образом, из-за особенностей иммунопатогенеза хламидийной инфекции и возникающих из-за этого сложностей в создании высокоэффективных вакцин, получение с помощью современных подходов штаммов и иммуногенных композиций, позволяющих решить существующие проблемы по созданию противохламидийных препаратов, являются актуальной проблемой.
В настоящее время в качестве противохламидийных композиций преобладают разработки на основе белка наружной мембраны (MOMP) C. trachomatis. MOMP индуцирует протективный клеточный и антительный ответ (Farris, 2010), необходимый для элиминации хламидий. Было показано, что иммунизация MOMP индуцировала протективный ответ, подавляющий инфекцию и патологию в исследованиях на животных, включая исследования на мышах, морских свинках, свиньях, коалах и приматах (Berry, 2004; Skelding, 2006; Sun, 2009; Andrew, 2011; Cheng, 2011b; Schautteet, 2011; Kollipara, 2012; Schautteet, 2012). Следует отметить, что, несмотря на свою высокую иммуногенность MOMP обладает высокой вариабельностью в зависимости от серовара C. trachomatis, что затрудняет разработку универсальной вакцины на его основе (Zhang, 1989; Ramsey, 2009; Mossman, 2008).
Кроме MOMP, одним из основных вакцинных кандидатов является высокоиммуногенный белок наружной мембраны, OmcB (наружный мембранный белок B). OmcB C. trachomatis является одним из основных адгезинов, обеспечивающих специфическую адгезию хламидий на мембране эукариотической клетки (Moelleken, 2008). OmcB является иммунодоминантным белком и вызывает выраженный иммунный ответ как у человека, так и у животных. Благодаря тому, что этот белок хорошо представлен в составе клеточной стенки и обладает иммуногенными свойствами OmcB служит эффективной мишенью при серодиагностике и рассматриватся в качестве перспективного целевого гена при создании субъединичных вакцин (Fadel, 2007; Hou, 2012).
Белок CPAF - протеаза с протеасомо-подобной активностью также изучается в качестве вакцинного препарата. Использование рекомбинантного белка CPAF в сочетании с IL-12 в качестве адъюванта снижало бактериальную нагрузку в генитальном тракте и приводило к быстрой элиминации C. trachomatis по сравнению с контрольной группой животных. Более того, у животных, иммунизацированных rCPAF+IL-12, наблюдали подавление развития гидросальпинкса и патологии маточных труб (Murthy, 2009; Zhong, 2001).
Таким образом, белки наружной мембраны хламидий и секретируемые белки представляются хорошими кандидатами в создании вакцин, способных индуцировать протективный иммунитет. Однако стало очевидным, что субъединичные вакцины обладают недостаточной иммуногенностью и, как следствие, использование таких вакцин подразумевает необходимость многократной вакцинации и применения адъювантов.
Известно техническое решение по патенту EP2976355A1. Действующим веществом описанной противохламидийной вакцины является рекомбинантный белок CTH522, состоящий из сегментов основного хламидийного белка наружной мембраны (MOMP), включающего иммуногенные повторы фрагментов аминокислотных последовательностей от четырех сероваров C. trachomatis (D, E, F и G). Рекомбинантый белок CTH522 получен методами генной инженерии и для приготовления препарата наращивается с использованием E.coli.
В 2019 году были обнародованы данные об успешном проведении 1 фазы клинических испытаний кандидатной вакцины. (S. Abraham, H. Juel et.al. Safety and immunogenicity of the chlamydia vaccine candidate CTH522 adjuvanted with CAF01 liposomes or aluminium hydroxide: a first-in-human, randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 trial // Published online August 12, 2019 http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(19)30279-8).
Данное техническое решение, описываемое в патенте EP2976355A1 и статье, рассматривается авторами и заявителем как наиболее близкий аналог.
Хотя аналог, содержащий в качестве действующего вещества рекомбинантный белок CTH522, по результатам исследований вызывал образование достаточного противохламидийного иммунного ответа и обладал хорошей переносимостью у людей, у данного технического решения присутствуют значительные недостатки:
- рекомбинантный белок CTH522 в качестве действующего вещества вакцины, требовал для усиления иммунного ответа введение в её состав адъюванта, которым служили либо CAF01, либо гидроксид алюминия. Введение адъювантов сказывается на увеличении производственных затрат и вызывает реактогенность в месте внутримышечной инъекции;
- для создания напряженного иммунитета к C. trachomatis вакцина, содержащая рекомбинантный белок CTH522 в качестве действующего вещества, вводится людям в общей сложности 5 раз - вначале введение осуществляют три раза посредством внутримышечной инъекции, после чего проводят два интраназальных введения препаратом без адъюванта. Предложенная схема очень сложна, длительна и трудоемка к практическому исполнению;
- необходимость поддержания нативной конформации антигена MOMP в составе вакцины создает значительные технологические трудности и делает процесс производства такой вакцины избыточно дорогостоящим (Sun, 2009; Schautteet, 2012).
Кроме того, данный антиген является вариабельным, что также существенно ограничивает эффективность иммунного ответа на него в отношении различных серотипов C. trachomatis (Zhang Y.X. et al. Protective monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis serovar- and serogroup-specific major outer membrane protein determinants. // Infect Immun. 1989.V. 57. №2. P. 636-8; Ramsey, 2009; Mossman D. et al. Genotyping of urogenital Chlamydia trachomatis in Regional New South Wales, Australia. Sex Transm Dis. 2008. 35: 614-616).
Раскрытие изобретения
Задача настоящего изобретения направлена на получение действующего вещества иммуногенной композиции против урогенитального хламидиоза человека - штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, который может быть использован для создания иммуногенной композиции без использования адьювантов, эффективной для однократного введения в качестве праймирующего компонента противохламидийной вакцины человеку, за счет того, что антиген нарабатывается непосредственно в клетках организма человека и обладающей широким спектром действия в отношении различных серотипов C. Trachomatis.
Технический результат достигается за счет того, что получен штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, несущий в составе экспрессирующей констурукции нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, который после введения в организм субъекта продуцирует химерный белок MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в виде аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, индуцирующий защиту от урогенитального хламидиоза человека.
Способ получения штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis заключается в том, что штамм получают путем гомологичной рекомбинации в клетках E.coli штамма BJ5183 между плазмидой pShuttle-CMV (#240007 , pShuttle-CMV vector, Agilent, US, несущей кассету с химерным геном MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, переклонированном из плазмиды pAL2-T, и ДНК аденовируса человека 5 серотипа с делецией в области E1 и Е3 генома аденовируса, причем сборку рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц проводят в клетках линии HEK293, Human embryonic kidney 293, после трансфекции рекомбинантной ДНК pAd-MBL-CT666, при этом в результате конструирования экспрессирующая кассета содержит CMV-промотор цитомегаловируса человека, целевой ген - химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, пА-сигнал полиаденилирования и находится в области делеции E1 генома аденовируса, при этом используют полимеразную цепную реакцию со специфическими праймерами:
на гексон аденовируса:
ADH01 ACTACAAYATTGGCTACCAGG;
ADH02 CAAAACATAAAGAAGKGTGGGC.
на химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis:
CT666-For CAAGGACTGAGAGGCTTGCA;
CT666-Rev TCTCGGTGTTCACAGCTGTC.
Получена иммуногенная композиция, содержащая штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis для применения в количестве не менее 2×108-БОЕ/мл, при этом она содержит фармацевтически приемлемый буферный раствор до 0,5-1,0 мл, объем дозы составляет 0,5-1,0 мл во флаконе.
Заявлено применение иммуногенной композиции, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis по в качестве прайм-компонента вакцины против хламидиоза для защиты от урогенитального хламидиоза человека.
Описание фигур
На фигуре 1
представлена нуклеотидная последовательность химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis длиной 717 п.о. (пар оснований), модифицированная для усиленной экспрессии в клетках человека, обозначенная SEQ ID NO: 1.
На фигуре 2
представлена аминокислотная последовательность химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, обозначенная SEQ ID NO: 2.
На фигуре 3
изображена схема штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, полученного на основе аденовирусного генома человека 5 серотипа со вставкой экспрессионной кассеты, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в месте делеции гена Е1 (ΔE1). ΔE3 - удаленный ген E3.
Экспрессионная кассета содержит:
CMV-промотор цитомегаловируса человека,
пА-сигнал полиаденилирования,
Ген C. trachomatis (CT666),
Глицин - сериновый спейсер
Ген маннозо-связывающего лектина Mus musculus (MBL).
На фигуре 4
представлены результаты определения подлинности созданного штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis методом ПЦР. На треках полиакриламидного геля изображены: ПЦР на аденовирусный геном (гексон аденовируса): 1 - отрицательный контроль; 2 - положительный контроль; 3 - образец препарата штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis. ПЦР на химерный ген (MBL-CT666): 5 - отрицательный контроль; 6 - положительный контроль; 7 - образец препарата штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis; М - маркер молекулярного веса.
Детекция осуществлялась с помощью пары специфических праймеров.
- AdH01 / AdH02 на гексон аденовируса (величина амплифицируемого фрагмента 440 п.н.);
- CT666-for / CT666-rev на химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis (величина амплифицируемого фрагмента 478 п.н.).
Наличие генома штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа и целевой химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis подтверждается визуализацией в виде полос молекулярным весом 440 п.н. и 478 п.н., соответственно. Аналогичные полосы присутствуют на треках положительного контроля и отсутствуют на треках отрицательного контроля.
На фигуре 5
представлены результаты анализа экспрессии химерного белка Chlamydia trachomatis методом иммуноблоттинга. Анализ проведен в денатурирующих условиях, в культуре клеток НЕК293 после заражения штаммом рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, в реакции со специфическими антителами к белку CdSf Chlamydia trachomatis (специфичность антител подтверждена на треке 1 связыванием с рекомбинантным белком CdSf Chlamydia trachomatis молекулярной массой около 10 кДа). На иммунореплике присутствует зона специфического взаимодействия белков с молекулярной массой около 24 кДа с кроличьими антителами на треке 2, при этом связывание с отрицательным контрольным образцом отсутствует на треке 3.
На треках блотта расположены:
1 - Положительный контроль - рекомбинантный белок rMBL-CT666 C. trachomatis, стандарт СОП.
2 - Опытный образец, клетки НЕК293 зараженные штаммом рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, образец прогрет при 100°С в присутствии ДТТ.
3 - Отрицательный контроль, клетки НЕК293 незараженные штаммом рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Маркером молекулярного веса служили белковые цветные маркеры молекулярных масс PageRuler™ 10-200 кДа («ThermoScientific», США).
На фигуре 6
изображены результаты оценки специфических антител класса IgG к антигену CdsF на 14 день (А) и 28 день (Б) после интраназальной иммунизации опытной группы мышей иммуногенной композицией, содержащей штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis (Ad-MBL-CT666). Контролями служили группы мышей которым вводили аденовирусный вектор без вставки (Ad-null) и физиологический раствор (ОК).
На фигуре 7
отображены результаты оценки методом ИФА специфических антител класса IgG изотипов IgG2a (А) и IgG1 (Б) к антигену CdsF (СТ666) C. trachomatis в сыворотках крови иммунизированных мышей по схеме «прайм-буст» (Ad-MBL-CT666+rMBL-CT666). Сыворотки крови от иммунизированных по схеме «прайм-буст» мышей были получены на 14 день после бустирования.
Праймирующим компонентом противохламидийной вакцины служила иммуногенная композиция, содержащая штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis (Ad-MBL-CT666), бустирующим - рекомбинантный белок rMBL-CT666 Chlamydia trachomatis с MPLA (monophosphoryl lipid A, монофосфорил липид А). Контролями служили группы мышей которым вводили аденовирусный вектор без вставки (Ad-null) и физиологический раствор (ОК).
На фигуре 8
изображены результаты определения количества Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФγ, методом ELISPOT in vitro.
Первой группе мышей вводили праймирующий компонент противохламидийной вакцины, которым служила иммуногенная композиция, содержащая штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, бустирующий компонент - рекомбинантный белок rMBL-CT666 Chlamydia trachomatis с MPLA. Контролями служили группы мышей которым вводили аденовирусный вектор без вставки (Ad-null) и физиологический раствор (ОК). Представлены три варианта постановки опыта: без стимуляции антигеном, со стимуляцией рекомбинантным белком CdsF и со стимуляцией Chlamydia trachomatis.
На фигуре 9
представлены результаты оценки пролиферации Т-клеток, полученных от мышей, вакцинированных по схеме «прайм-буст» в ответ на стимуляцию антигеном CdsF или С. trachomatis.
А - Пролиферация Аг-специфических CD4+ Т-клеток в ответ на CdsF;
Б - Пролиферация Аг-специфических CD4+ Т-клеток в ответ на C. trachomatis;
В - Пролиферация Аг-специфических CD8+ Т-клеток в ответ на CdsF;
Г - Пролиферация Аг-специфических CD8+ Т-клеток в ответ на C. Trachomatis.
На фигуре 10
отображены патологические изменения в матке и яичниках, оцененные методом прямой визуализации. Вводимые вещества группам мышей:
А. Ad-MBL-CT666+rMBL-CT666 (праймирующий компонент противохламидийной вакцины, которым служила иммуногенная композиция, содержащая штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, бустирующий компонент - рекомбинантный белок rMBL-CT666 Chlamydia trachomatis с MPLA);
Б. Ad-null (отрицательный контроль)
В. C. trachomatis (положительный контроль).
На фигуре 11
представлены результаты оценки подавления хламидийной инфекции в нижних отделах урогенитального тракта после заражения C. trachomatis. А. на 3 день (*p ≤ 0,05); Б. на 6 день (*p ≤ 0,05); В. на 9 день (*p ≤ 0,001); Г. на 15 день (*p ≤ 0,001); Д. на 20 день (*p ≤ 0,001).
Реализация изобретения.
Перспективным в качестве антигена для противохламидийных вакцин является структурный белок CdsF (СТ666) системы секреции третьего типа (ССТТ) Chlamydia trachomatis, являющегося доминирующим фактором патогенности. Являясь основным белком инжектосомы третьей транспортной системы хламидий, белок CdsF концентрируется на внешней мембране хламидийных элементарных телец (ЭТ) и ретикулярных телец (РТ) и формирует поверхностную структуру, обозначаемую как «игла» (Dai W., Li Z. Conserved type III secretion system exerts important roles in Chlamydia trachomatis // Int J Clin Exp Pathol. 2014. Vol. 7(9). P. 5404-5414.). Во время контакта с эукариотической клеткой происходит полимеризация белка CdsF и, как следствие, активация (сборка) инжектосомы. Формирование иммунного ответа против этого ключевого компонента ССТТ хламидий представляется крайне перспективным. Будучи структурным белком ССТТ, CdsF экспрессирован на мембране хламидий на всех стадиях развития патогена, в том числе, как при острой, так и при хронической инфекциях. Кроме этого, хламидийный белок «иглы» CdsF ССТТ содержит остатки цистеина, которые являются уникальными для белков «иглы» ССТТ (Betts H.J. et al. Bioinformatic and biochemical evidence for the identification of the type III secretion system needle protein of Chlamydia trachomatis // J. Bacteriol. 2008. V. 190, P. 1680-1690). Дисульфидные связи в полимеризованной «игле» ССТТ связаны со степенью окисления оболочки хламидий и стадиями развития патогена (Betts H.J. and Fields K.A. The Chlamydial Type III Secretion Mechanism: Reveiling Cracks in a Tough Nut // Front Microbiol. 2010. V. 1. P. 114). Дисульфидные связи, обнаруженные у CdsF, локализованного у элементарных телец (ЭТ), участвовуют в функционировании секреторного аппарата хламидий.
Ввиду консервативности структур системы ССТТ у всех представителей рода Chlamydia, белок CdsF, введенный в качестве антигена вакцины, или иммуногенной композиции, будет индуцировать иммунитет широкого спектра действия (Зигангирова Н.А., Заякин Е.С. и др. Создание ингибиторов системы секреции типа III C. trachomatis, подавляющих развитие острой и хронической хламидийной инфекции // Acta naturae, T.4, №2(13), 2012, стр. 90-100).
Совокупность указанных данных делает белок CdsF (СТ666 Chlamydia trachomatis) обусловленно примененимым в качестве антигена для иммуногенных композиций против урогенитального хламидиоза.
Поскольку антигены, обладающие наибольшим протективным потенциалом, не всегда являются высокоиммуногенными, разработка эффективных и безопасных систем доставки, разрешенных в клинической практике, является крайне актуальной задачей.
Вирусные векторы являются перспективным подходом к разработке эффективных и безопасных систем доставки. Из них наиболее широко используемыми и изученными являются аденовирусы. Вакцины на основе таких векторов в настоящее время прошли или проходят клинические исследования.
Применение аденовирусных векторов в качестве платформы для создания вакцин и иммуногенных композиций против хламидийной инфекции обусловлено тем, что иммунизация такими препаратами эффективно активируют цитотоксические Т-лимфоциты, что особенно важно при вакцинации против внутриклеточных патогенов. К тому же, их особенностью является способность доставлять антиген через слизистые оболочки, что является значимым против инфекций, передающихся половым путем (ИППП). [Schagena F.H.E. et al. Immune responses against adenoviral vectors and their transgene products: a review of strategies for evasion, Critical Reviews. // Oncology/Hematology. 2004. V. 50. №1. P. 51-70. ]
Они обладают рядом преимуществ. Рекомбинантные аденовирусные векторы являются репликативно - дефектными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусов человека пятого серотипа с делетированными Е1 и Е3 областями генома подтверждается клиническими испытаниями различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе. Они не требуют многократных дополнительных введений, так как экспрессия целевого антигена происходит непосредственно в организме иммунизированного субъекта. Также важным при урогенитальном хламидиозе является то, что при проведении интраназальной иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами индуцируется образование мукозального иммунного ответа, в том числе, на слизистых оболочках полового тракта.
Рекомбинантные аденовирусные векторы по сравнению с рекомбинантными белками, получаемыми в культуре эукариотов, более дешевы и высокоиммуногенны, так как их небольшая доза позволяет продуцировать в организме значительные количества белка. Разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусных векторов, позволяющие реализовывать на одной технологической линии масштабное производство различных кандидатных вакцин на их основе.
Примеры осуществления заявленного изобретения
Примеры приведены для более подробной иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают объем изобретения:
Пример 1.
Создание химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 2.
Конструирование штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 3.
Изучение экспрессии химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis штаммом рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 4.
Получение иммуногенной композиции, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 5.
Изучение иммуногенных свойств штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 6.
Иммуногенные свойства вакцины против урогенитального хламидиоза, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в качестве прайм-компонента.
Пример 7.
Протективные свойства вакцины против урогенитального хламидиоза, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в качестве прайм-компонента.
Пример 1.
Создание химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis
В данном примере рассмотрен процесс получения химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis методом in silico, необходимого для дальнейшего встраивания в рекомбинантную псевдоаденовирусную частицу в качестве целевого антигена, способную индуцировать при введении в организм специфические гуморальный и клеточный иммунитет к Chlamydia trachomatis.
Для этого in silico была разработана уникальная последовательность химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis SEQ ID NO: 1, состоящего из нескольких частей:
1) Сайт Bsu15I (ATCGAT) и метилированный XbaI (TCTAGA);
2) 133 N-концевых аминокислоты маннозо-связывающего лектина (MBL) (аминокислотная последовательность № P11226 взятые из открытой базы данных последовательностей белков UniProtKB, нуклеотидная - NCBI ID CAA33462.1). Данный коллагеновый домен олигомеризует (восьмиугольники шести тримерных субъединиц) антиген для усиления иммуногенных свойств химерного белка Chlamydia trachomatis, а также помогает секретировать его из клетки.
3) Спейсер (гибкий глицин-сериновый). Служит для разделения двух функциональных доменов и, следовательно, правильного фолдинга белка.
4) Сайт рестрикции BcuI (ACTAGT);
5) Собственно антиген CT666 Chlamydia trachomatis (аминокислотная последовательность по № O84673 взята из открытой базы данных UniProtKB). Работу проводили с кодирующей ее нуклеотидной последовательностью;
6) Стоп - кодон - TAA;
7) Сайт рестрикции XbaI (TCTAGA).
Для улучшения в дальнейшем экспрессии химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, сначала была взята нуклеотидная последовательность, состоящая из 7 составных частей, указанных выше, кодоны которой модифицировали для усиленной экспрессии в клетках Homo sapiens, с сохранением сайта BcuI (ACTAGT).
Таким образом, в результате конструирования была получена нуклеотидная последовательность химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis длиной 717 п.о. (пар оснований), модифицированная для усиленной экспрессии в клетках человека, обозначенная SEQ ID NO: 1 (Фигура 1). Продуцируемый штаммом рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы химерный белок MBL-CT666 Chlamydia trachomatis имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (Фигура 2).
Далее нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 модифицированного химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis была синтезирована химически и получена в составе плазмиды pAL2-T (Евроген, РФ) и применялась при конструировании штамма.
В результате, с помощью метода in silica была разработана нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 (кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2) химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, которая была необходима для встраивания в рекомбинантную псевдоаденовирусную частицу в качестве целевого гена, для получения заявленного штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 2.
Конструирование штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis
В примере рассмотрен процесс конструирования рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы (РПАН), со вставкой химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в области делеции E1 генома аденовируса человека 5 серотипа.
Количественную оценку (титр) полученных в работе рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц определяли методом бляшкообразования на клеточной линии 293-HEK (клетки почки эмбриона человека, human embryo kidney), оценка титра велась по БОЕ (бляшкообразующие единицы).
Процесс получения штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis состоял из нескольких основных этапов, суть которых известна специалисту данной области, основывался на общеизвестных методиках (например, Sambrook J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Russell, 2001, том 1, 2, 3 - Молекулярное клонирование - лабораторное руководство) и поэтому в данном примере подробно не рассматривается, указывая лишь на самые основные этапы.
Штамм был получен путем гомологичной рекомбинации в клетках E.coli штамма BJ5183 (например, #200154, Skygen, РФ) между плазмидой pShuttle-CMV (#240007 (pShuttle-CMV vector, Agilent, US) несущей кассету с химерным геном MBL-CT666 Chlamydia trachomatis (переклонированном из плазмиды pAL2-T), и ДНК аденовируса человека 5 серотипа с делецией в области E1 и Е3 генома аденовируса. Сборка рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц проводилась в клетках линии HEK293 (Human embryonic kidney 293) после трансфекции рекомбинантной ДНК pAd-MBL-CT666. Трансфекцию проводили реагентом Lipofectamin (Invitrogen, США) согласно прилагаемому руководству в 24-луночном планшете на клетках линии HEK293 с 90%-ной конфлюэнтностью. Схема полученной конструкции изображена на фигуре 3. В результате конструирования экспрессирующая кассета содержала CMV-промотор цитомегаловируса человека, целевой ген - химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, пА-сигнал полиаденилирования и находилась в области делеции E1 генома аденовируса.
Через десять суток после трансфекции наблюдали цитопатическое действие (ЦПД) вируса. Полученные вирусные образцы, в виде суспензии заражённых клеток с титром 108 БОЕ/мл, хранили при температуре минус 70°С в среде для культивирования DMEM (Invitrogen, кат. №52100-047, США) с 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Hy Clone, кат. № SV30160.03, Великобритания). В таком виде штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis был депонирован.
Получение штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, было подтверждено результатами ПЦР со специфическими праймерами (представлен на фигуре 4).
Использовали пару праймеров на гексон аденовируса:
ADH01 ACTACAAYATTGGCTACCAGG;
ADH02 CAAAACATAAAGAAGKGTGGGC.
Пара праймеров на химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis:
CT666-For CAAGGACTGAGAGGCTTGCA;
CT666-Rev TCTCGGTGTTCACAGCTGTC.
Полученный штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis (Ad-MBL-CT666) зарегистрирован в Государственной коллекции микроорганизмов при ФГБУ «НИЦ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» (Музей генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов) под №22. Штамм продуцирует химерный белок MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в клетках организма субъекта.
Таким образом, был создан штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 3.
Изучение экспрессии химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis штаммом рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis
В данном примере методом in vitro показана способность экспрессировать химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis созданным по изобретению штаммом рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Анализ экспрессии целевого химерного белка Chlamydia trachomatis проводили методом электрофореза с иммуноблоттингом. С этой целью клетки линии НЕК 293 заражали штаммом рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis. На 1-е сутки клетки снимали пипетированием, суспензию ц\ф при 3000 об\мин 10 мин. К осадку добавляли лизирующий буфер в соотношении 2:1, встряхивали на льду в течении 50 минут. Затем ц\ф при 10000 об\мин 10 минут при +4°С, и супернатант использовали для анализа. Аналогично обрабатывали клетки, незараженные аденовирусом, далее использовали образец в качестве отрицательного контроля.
К каждой отобранной пробе, к отрицательному контролю, и положительному контролю перед проведением электрофореза добавляли 1:1 по объему буфер для образца (для приготовления буфера смешивают 2,5 мл 0,5М Tris-HCl, pH 6,8; 4 мл 10%-ного раствора SDS в воде; 310 мг дитиотреитола; 2 мл глицерина; 32 мкл 0,5 М Na-соли ЭДТА в воде (рН 6,8), 75 мкл 2,5%-ного раствора бромфенолового синего в воде, либо использовали коммерческий буфер) и инкубировали при температуре 95°С в течение 5 мин. После инкубации использовали полученные образцы для нанесения в кармашки концентрирующего ПААГ. Электрофорез проводили в течение 40 мин при постоянной силе тока 20 мА, с применением электродного буфера следующего состава: 25 мМ Tris; 0,25 М глицин; 0,1%-ный SDS, pH не доводить.
После проведения электрофореза переносили белки из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra посредством электроблоттинга в направлении, перпендикулярном направлению разделения белков. Когда бромфеноловый синий (краситель) достигал границы с буфером, гель вынимали из стекол, отделяли концентрирующий от разделяющего, разделяющий гель (помечали угол) переносили в дистиллированную воду на 5-10 мин.
Вырезанные заранее по размеру разделяющего геля фильтры (6 листов фильтровальной бумаги Whatman 3mm) и нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra вымачивали не менее 10 мин в буфере для переноса (5,81 г Трис(гидроксиметил)-аминометана, 2,93 г глицина, 0,375 г SDS, 20% этилового спирта на 1 л дистиллированной воды).
Нитроцеллюлозную мембрану (помечали угол, совмещали с меченым углом на ПААГ), листы Whatman 3 mm и разделяющий ПАГ собирали стопкой (3 листа фильтровальной бумаги, нитроцеллюлоза, гель, 3 листа фильтровальной бумаги) в электроблотнице Trans-Blot SD semi-dry Transfer Cell (Bio-Rad), прокатывали валиком для удаления пузырьков воздуха и проводили электроперенос белков в течение 15 мин при напряжении не более 15. Мембрану помещали в буфер для блокирования участков неспецифической сорбции белка (0,5 мг/мл яичный альбумин (ЯА) в - 1×TBS-TW буфере) и инкубировали в течение ночи на шейкере при температуре 4°С, или 1 час при 37 С. Состав 10×TBS-TW буфера: 1,5 М NaCl; 0,5%Tween-20; 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5.
Мембрану инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение часа с раствором антисыворотки (первичных антител) в разведении 1:2500 в TBS-TW с 0,5 мг/мл БСА. После инкубации мембрану промывали 3 раза по 10 мин в 1×TBS-TW буфере, перекладывали в чистую квадратную чашку Петри и инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение часа с антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена (Sigma) в разведении 1:5000. Затем мембрану отмывали в 1×TBS-TW буфере 3 раза по 10 мин. Далее мембрану окрашивали хемилюминисцентным красителем ECL Prime Western Blotting Detection Reagent согласно протоколу и сканировали на приборе Amersham Imager 600, GE.
При анализе иммуноблоттингом первичные антитела сыворотки должны выявлять рекомбинантный белок положительного контроля, окрашивать специфическим химерный белок MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, и не окрашивать отрицательный контроль.
На фигуре 5 представлены результаты оценки экспрессии химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis методом электрофореза с иммуноблоттингом.
По результатам анализа очевидно, что специфический сигнал связывания с белком Chlamydia trachomatis около 24 кДа (расчетная молекулярная масса равна 23742.76 Да) присутствует в треке 2, содержащим образец зараженных клеток в денатурирующих условиях. В отрицательном контроле сигнала не наблюдается. Данный факт свидетельствует о наличии экспрессии химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis in vitro. Положительный контроль на треке 1 указывает на специфичность проведенной реакции по наличию связывания антител с рекомбинантным белком CdSf Chlamydia trachomatis.
Таким образом, было показано, что созданный по изобретению штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, способен продуцировать соответствующий химерный белок MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Задача по получению штамма рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующего химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis выполнена.
Пример 4.
Получение иммуногенной композиции, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Для проведения экспериментов по изучению иммуногенности и протективных свойств требовалось дальнейшее наращивание штамма рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц и получение иммуногенной композиции на его основе.
Для этого штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, для введения субъекту с целью формирования иммунитета против урогенитального хламидиоза, рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы наращивали, многостадийно очищали и формулировали приемлемым буферным раствором до получения эффективных концентраций. Детально данный процесс описан в известных источниках.
В сущности своей процесс культивирования включал наращивание клеточной суспензии НЕК293 до концентрации 2×106кл/мл (24-48 часов) и засев штаммом (с титром не менее 108 БОЕ/мл, 5-10 БОЕ/клетку) с последующим выращиванием 36-60 часов до конечной концентрации не менее 2×108-БОЕ/мл, в количестве, не менее 3×1010ф.ч./мл.
Для стерилизации полученный препарат фильтровали через систему фильтров с размером пор 0,22 мкМ и разбавляли стерильным фармацевтическим приемлемым буферным раствором, например: 10 mM TrisHCl, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% этанол, 100 мкм ЭДТА, pH 8.0, до получения активного компонента с учетом требуемой конечной активности не менее 2×108-БОЕ/мл рекомбинантных аденовирусных частиц. Полученный объем препарата разливали по флаконам по 0,5 мл.
Таким образом, поставленная задача по получению иммуногенной композиции, содержащей штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis по изобретению была выполнена.
Возможно получение иммуногенной композиции, содержащей на дозу 0,5 мл:
- штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis не менее 1×108 БОЕ;
- фармацевтически приемлемый буферный раствор - до 0,5 мл.
Полученную по изобретению иммуногенную композицию, содержащую в качестве действующего вещества штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, использовали для дальнейших экспериментов по изучению характеристик штамма.
Пример 5.
Изучение иммуногенных свойств штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis
В данном примере оценка иммуногенных созданного штамма рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis проводилась путем определения его способности к индукции специфических антител в составе иммуногенной композиции.
Специфические антитела класса IgG к антигену CdsF определяли методом ИФА (как было описано ранее). Мыши были иммунизированы интраназально 50 мкл иммуногенной композицией, содержащей штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в дозе 2×108 БОЕ на мл. Сыворотки крови получали на 14 и 28 день после иммунизации. В качестве контролей использовали сыворотки крови от мышей иммунизированных и/н аденовирусным вектором, не несущим вставки (Ad-null) и сыворотки от мышей, которым вводили физиологический раствор (отрицательный контроль). Результаты представлены на фигуре 6.
Было показано, что на 28 день после иммунизации созданной по изобретению композицией, и через 14, и через 28 дней определялись специфические антитела класса IgG, что указывает на наличие иммуногенных свойств у штамма рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis к специфическому возбудителю урогенитального хламидиоза Chlamydia trachomatis.
Таким образом, задача по получению штамма рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, выполнена.
Пример 6.
Иммуногенные свойства вакцины против урогенитального хламидиоза, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в качестве прайм-компонента
В данном примере оценивалась возможность применения полученного по изобретению штамма рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в качестве компонента противохламидийной вакцины. Указанная вакцина должна состоять из двух компонентов в разных флаконах - прайм-компонента и буст-компонента, которые вводятся однократно через определенный промежуток времени, по очереди, для осуществления так называемой прайм-буст иммунизации для получения протективного иммунитета. Композиция на основе штамма по изобретению применялась в качестве компонента для праймирующей иммунизации, затем проводилось бустирование компонентом на основе рекомбинантного белка CdsF. Изучался индуцируемый вакциной гуморальный (специфические антитела класса IgG1 и IgG2a) и Т-клеточный иммунный ответ.
Интраназальную иммунизацию праймирующим компонентом, содержащим штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в дозе 2×108 БОЕ/мл проводили на линии мышей DBA/2 самках, весом 14-16 г. (10 мышей/группу) однократно. Через две недели после иммунизации проводили подкожное бустирование белком rMBL-CT666 в дозе 10 мкг/мышь в сочетании с MPLA. В качестве контрольных использовались группы мышей, получавшие (интраназально) рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа, не несущий трансгена - Ad-null и физиологический раствор NaCl.
1) Специфические антитела класса IgG1 и IgG2a.
Определяли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Для этих целей использовали сыворотки, полученные на 14 день после «прайм-буст» иммунизации мышей.
ИФА проводили общепринятым методом. В качестве антигена применяли рекомбинантный белок rMBL-CT666 C. trachomatis. Полученные сыворотки от иммунизированных мышей титровали в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800. Для определения специфических антител класса IgG (IgG1, IgG2a) в качестве конъюгата использовали кроличьи моноклональные антимышиные антитела класса IgG1 и IgG2a («Sigma-Aldrich», США) в разведении 1:10000, меченные пероксидазой хрена, в качестве субстрата - тетраметилбензидин (ТМБ) («Biolegend», США). Учет реакции проводили при длине волны 450 нм. Результаты представлены на фигуре 7.
В результате исследования была показана продукция специфических антител изотипов IgG: IgG2a и IgG1 в ответ на однократную иммунизацию композицией, содержащей штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis с однократным бустированием rMBL-CT666. При разведении 1:800 была показана достоверная разница между группой животных иммунированных по схеме «прайм - буст» компонентами вакцины (Ad-MBL-CT666+rMBL-CT666) (OD~0,5155, p<0,05) и контролями Ad-null и ОК (OD~0,188, OD~0,0985). При этом наиболее выраженно наблюдалась продукция антител изотипа IgG2a, который опосредует эффекторные функции, включая антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), что способствует ранней элиминации хламидийной инфекции из организма. Кроме того, ADCC связан с улучшенной презентацией химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, способной усиливать ответы CD4 + T-клеток. Антитела изотипа IgG1 также были индуцированы в ответ на иммунизацию (OD~0,4515, при разведении 1:100), однако их уровень не отличался достоверно от уровня антител контрольных групп Ad-null и ОК (OD~0,23675, OD~0,2685). Кроме этого, соотношение IgG2a к IgG1 было > 1, что указывает на дифференцировку иммунного ответа в сторону Тх1 - типа и соответственно, преимущественно развитие клеточного иммунитета. Эти данные говорят об иммуногенности противохламидийной вакцины, в качестве прайм-компонента включающей иммуногенную композицию, содержащую штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, а также указывает на наличие протективной активности в отношении хламидийной инфекции.
2). Определение количества Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФγ, методом ELISPOT in vitro.
Количество ИФγ-продуцирующих клеток в селезенке и лимфатических узлах вакцинированных и контрольных мышей определяли с помощью метода ELISPOT.
Для оценки клеточного иммунного ответа методом ELISPOT получали суспензию клеток селезенок и лимфатических узлов от мышей иммунизированных праймирующим компонентом вакцины, содержащим штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis и бустирующим компонентам (rMBL-CT666) на 14 день после бустирования. Клетки стимулировали антигеном CdsF и C. trachomatis серовар D. В качестве контроля использовали клетки селезенки и лимфатических узлов от мышей иммунизированных интраназально пустым аденовирусом Ad-null, интактных мышей, и не стимулированные клетки (Фигура 8).
Иммобилизованные моноклональные антитела к ИФγ (Anti-Mouse IFN-γ 250x Capture Antibody, Ready-Set-Go!,eBioscience, San Diego, CA), разведенные в стерильном буфере (ELISA/ELISPOT Coating Buffer), вносили в лунки 96-луночного плейта (Millipore, MAIPS4510, США) в объеме 100 мкл/лунку и инкубировали в течение 18-20 часов при 4°С. По окончании периода инкубации содержимое лунок удаляли и промывали 2 раза стерильным буфером (ELISA/ELISPOT Coating Buffer). Далее вносили по 200 мкл/лунку культуральной среды RPMI, содержащей 5% FCS, инкубировали при 37°С. Через 1 час удаляли из лунок среду, вносили в них исследуемые клетки в дуплетах в концентрации 2×105/лунку с антигеном (10 мкг/мл) или без него и инкубировали в термостате 24 часа при 37°С в 5% СО2. Плейты отмывали 5 раз фосфатным буфером (ELISA/ELISPOT Coating Buffer) по 200 мкл/лунку, один раз дистиллированной водой, вносили по 100 мкл биотинилированных проявляющих антител (Biotin anti-mouse IFN-γ (250х), Biolegend) в Assay Diluent буфере и инкубировали 2 часа при температуре 2-8°С. По окончании периода инкубации плейты отмывали 6 раз фосфатным буфером и добавляли конъюгат стрептавидин AP (Streptavidin-Alkaline Phosphatase Conjugate, Affymetrix), разведенный в фосфатном буфере до концентрации 1:1000, по 100 мкл/лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки отмывали 3 раза по 100 мкл фосфатным буфером и еще 3 раза дистиллированной водой. Далее добавляли субстрат BCIP®/NBT Liquid Substrate System (Sigma) Через 5-60 минут реакцию останавливали водой и высушивали плейты. Количество пятен в лунках подсчитывали с помощью ELISPOT AID ELISpot Reader (Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany).
Методом ELISPOT была продемонстрирована индукция Т-клеточного иммунного ответа, продуцирующего ИФγ - ключевого компонента протективного иммунного ответа при хламидийной инфекции.
3). Изучение клеточной пролиферации методом проточной цитометрии.
Полученные суспензии спленоцитов и клеток лимфатических узлов от вакцинированных и контрольных мышей на 30 день после иммунизации, метили CFSE и инкубировали в присутствие антигена rMBL-CT666 или C. trachomatis в течение 48 часов. Пролиферацию клеток анализировали с помощью проточной цитометрии на приборе FACSCALIBUR (BD, США), используя программу BD CellQuest™ Pro (Bioline) (Фигура 9).
Как показано на фигуре 9 CD4+ Т-клетки, полученные от группы мышей иммунизированных по схеме «прайм-буст» имели статистически значимое увеличение субпопуляций, прошедшей 4 и 5 деление в ответ на антиген CdsF и прошедшей 4 деление в ответ на стимуляцию C. trachomatis (p<0,5). При этом CD4+ Т-клетки, полученные от мышей, которым вводили Ad-null и интактных мышей, не имели увеличения субпопуляций, пролиферующих в ответ на антиген CdsF в течение всех 5 стадий деления.
CD8+ Т-клетки, полученные от мышей иммунизированных Ad-MBL-CT666 с бустированием rMBL-CT666 так же имели статистически значимое увеличение субпопуляций, прошедшей 3 деление в ответ на антиген CdsF (Рис. Хв) (p<0,5), и 3 и 4 деление в ответ на стимуляцию C. trachomatis (Рис.Хв). CD8+ Т-клетки, полученные от контрольных мышей, как и CD4+ Т-клетки, не имели увеличения субпопуляций, пролиферующих в ответ на антиген или C. trachomatis.
Таким образом, в данном исследовании была продемонстрирована способность изучаемого вакцинного препарата индуцировать специфический ответ CD4+ и CD8+ Т-клеток в реакции пролиферации и подтверждена иммуногенность данного препарата.
Таким образом, была показана возможность использования в составе противохламидийной вакцины в качестве прайм-компонента иммуногенной композиции, содержащей штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Пример 7.
Протективные свойства вакцины против урогенитального хламидиоза, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в качестве прайм-компонента.
Было проведено изучение эффективности (протективности) вакцины против урогенитальной хламидийной инфекции, представляющую в качестве прайм-компонента иммуногенную композицию со штаммом рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis.
Вакцину вводили по схеме, описанной в примере 6.
1) Оценка в реакции нейтрализации.
К важнейшим изучаемым иммунным реакциям in vitro относят реакцию нейтрализации. Оценку нейтрализующей активности антител в сыворотках крови, полученных от мышей, иммунизированных Ad-MBL-CT666 с бустированием rMBL-CT666 оценивали с помощью реакции нейтрализации.
Сыворотки крови мышей, полученные через 14 дней после бустирования, инкубировали с C. trachomatis и оценивали их нейтрализующий эффект в культуре клеток in vitro. В качестве контроля инфекции использовали C. trachomatis серовар D в дозе 105 ВОЕ/мл (с инкубацией при 37°С и без t). Для постановки реакции нейтрализации использовали клетки линии McCoy. Полученные сыворотки от иммунизированных животных инкубировали с C. trachomatis в различных разведениях (1:32; 1:64; 1:128; 1:256) в течение 20 минут при t=37°С в термостате. Затем клетки заражали прединкубированными образцами хламидий и центрифугировали при 2000 об/мин, t=25°С в течение 60 мин. Инкубацию проводили в атмосфере CO2 при температуре 37°С в течении 48 часов. Количественную оценку эффекта нейтрализации хламидийных включений в культуре клеток McCoy проводили методом иммунофлуоресценции после окрашивания хламидийных включений видоспецифическими моноклональными антителами, меченными ФИТЦ.
Для подсчета хламидийных включения образующих единиц (ВОЕ) под микроскопом использовали стандартную формулу (Scidmore M.A., 2005). Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Оценка нейтрализующей активности антител, полученных от мышей, иммунизированных Ad-MBL-CT666 c последующим бустированием rMBL-CT666 в культуре клеток, зараженных C. trachomatis.
| Процент подавления хламидий, % | ||||
| Группы\Разведения сывороток | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 |
| Ad-MBL-CT666+ rMBL-CT666 | 65 | 63 | 60 | 53 |
| Ad-null | 35 | 30 | 25 | 25 |
Было показано, что иммунизация Ad-MBL-CT666 c последующим бустированием rMBL-CT666, приводила к продукции специфических антител, обладающих нейтрализующей активностью в отношении C. trachomatis инфекции in vitro (Таблица 1). Титр антител, вызывающих 50% нейтрализацию инфекции, составил 1:256.
2) Оценка патологии репродуктивных органов методом прямой визуализации
Оценку патологии репродуктивных органов проводили после заражения C. trachomatis, у иммунизированных животных. Для визуальной оценки патологии органов репродуктивного тракта мышей были сделаны фотографии. Патологию оценивали методом прямой визуализации, оценивая наличие гидросальпинкса и гиперемии органов верхних отделов урогенитального тракта.
На 30 сутки после заражения C. trachomatis патологические изменения оценивали визуально. Для этого мышей забивали, проводили вскрытие и изъятие репродуктивных органов (матки, яичников). Были сделаны макроснимки органов и сравнительный анализ патологических изменений между экспериментальной и контрольными группами животных (фиг. 10А, Б, В).
При аутопсии яичников и матки в группе животных, иммунизированных комбинированной вакциной, содержащей Ad-MBL-CT666 и rMBL-CT666, не было выявлено патологических изменений, таких как гидросальпинкс, не наблюдалось гиперемии маточных труб и спаечных процессов (фиг. 10А).
У неиммунизированных мышей и получавшим пустой аденовирус (Ad-null), зараженных C. trachomatis, патология репродуктивных органов была ярко выражена, в особенности в виде гидросальпинкса, характерного при поражении хламидийной инфекцией, также регистрировали наличие серозно-геморрагического экссудата в небольшом количестве и сильную гиперемия маточных рогов, яичников (фиг. 10Б, В).
3) Оценка подавления инфекции, вызванной C. trachomatis в нижних отделах урогенитального тракта.
Для оценки накопления инфекции в нижних отделах урогенитального тракта, у мышей после заражения C. trachomatis отбирали вагинальные смывы с 3 по 21 день. Хламидийную инфекцию в смывах определяли с помощью культурального метода исследования (Таблица 2, Фигура 11А, Б, В, Г, Д).
Таблица 2. Определение количества зараженных мышей в исследуемых группах.
| Количество зараженных мышей в каждой группе в течение 21 дня | |||||
| 3 сутки | 6 сутки | 9 сутки | 15 сутки | 21 сутки | |
| Ad-MBL-CT666+ rMBL-CT666 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 9/10 | 1/10 |
| Ad-null | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
| C. trachomatis | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
Изучение динамики развития инфекции в нижних отделах урогенитального тракта показало, что иммунизация Ad-MBL-CT666 с бустированием rMBL-CT666 приводила к значительному подавлению хламидийной инфекции к 15 дню, а на 20 сутки после заражения (Фигура 11) инфекция была обнаружена только у одной иммунизированной мыши, в то время как в контрольной группе инфекция выявлялась в 104 ВОЕ/мл у 10 из 10 мышей.
Таким образом, была показана возможность использования иммуногенной композиции, содержащей штамм рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, несущих химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в качестве прайм-компонента противохламидийной вакцины с целью индукции протективного иммунного ответа против урогенитального хламидиоза.
Все приведенные примеры подтверждают, что задача, поставленная в данном изобретении, а именно, получение действующего вещества иммуногенной композиции против урогенитального хламидиоза человека - штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, который может быть использован для создания иммуногенной композиции без использования адьювантов, эффективной для однократного введения в качестве праймирующего компонента противохламидийной вакцины человеку, за счет того, что антиген нарабатывается непосредственно в клетках организма человека и обладающей широким спектром действия в отношении различных серотипов C. Trachomatis, выполнена.
Промышленная применимость
Предложенный штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующей химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, может применяться в качестве иммуногенного компонента для изготовления вакцин с целью профилактики урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis.
1. Штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, полученный на основе ДНК аденовируса человека 5 серотипа с делецией в области Е1 и Е3 генома аденовируса, имеющий в области делеции E1 генома аденовируса экспрессирующую конструкцию с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, который после введения субъекту экспрессирует химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis SEQ ID NO: 1 в клетках организма и продуцирует химерный белок MBL-CT666 Chlamydia trachomatis в виде аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, индуцирующий защиту от урогенитального хламидиоза человека.
2. Способ получения штамма рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующего химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis по п.1, заключающийся в том, что штамм получают путем гомологичной рекомбинации в клетках E.coli штамма BJ5183 между плазмидой pShuttle-CMV (#240007, pShuttle-CMV vector, Agilent, US), несущей кассету с химерным геном MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, переклонированным из плазмиды pAL2-T, и ДНК аденовируса человека 5 серотипа с делецией в области E1 и Е3 генома аденовируса, причем сборку рекомбинантных псевдоаденовирусных наночастиц проводят в клетках линии HEK293, Human embryonic kidney 293, после трансфекции рекомбинантной ДНК pAd-MBL-CT666, при этом в результате конструирования экспрессирующая кассета содержит CMV–промотор цитомегаловируса человека, целевой ген - химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis, пА–сигнал полиаденилирования и находится в области делеции E1 генома аденовируса, при этом для детекции химерного гена MBL-CT666 Chlamydia trachomatis используют полимеразную цепную реакцию со специфическими праймерами:
на гексон аденовируса:
ADH01 ACTACAAYATTGGCTACCAGG;
ADH02 CAAAACATAAAGAAGKGTGGGC,
на химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis:
CT666-For CAAGGACTGAGAGGCTTGCA;
CT666-Rev TCTCGGTGTTCACAGCTGTC.
3. Иммуногенная композиция, содержащая штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis по п.1, в количестве не менее 2×108 БОЕ/мл, а также фармацевтически приемлемый буферный раствор до 0,5-1,0 мл, при этом объем дозы составляет 0,5-1,0 мл во флаконе.
4. Применение иммуногенной композиции, содержащей штамм рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, экспрессирующий химерный ген MBL-CT666 Chlamydia trachomatis по п.3, в качестве прайм-компонента вакцины против хламидиоза для защиты от урогенитального хламидиоза человека.
