Способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени. Проводят реакцию амплификации в режиме реального времени с использованием обратной транскрипции и определение значений максимальных экстремумов (С_р) графиков второй производной для кривых накопления флуоресцентного сигнала. Расчет концентрации вирионов вируса ящура в пробах неинактивированного сырья проводят на основе квадратичной модели зависимости количества полных вирусных частиц и значений максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в реальном времени. Изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять количество вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины. 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 6 пр., 5 ил.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу определения концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода сравнения максимальных экстремумов (crossing point, С_р) кривых реакции амплификации в реальном времени с помощью второй производной, и разработанной квадратичной модели зависимости критической точки графика второй производной для кривой накопления флуоресценции С_р и концентрации вирионов вируса ящура.

Ящур является вирусным, наиболее контагиозным, остропротекающим, лихорадочным заболеванием, которому подвержены дикие и домашние парнокопытные и мозоленогие животные [3, 11]. Возбудитель принадлежит к реалму Riboviria, порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [7]. Вирион имеет диаметр 23-25 нм, средний молекулярный вес составляет около 0,0081675 МДа [2].

Известно 7 серотипов вируса ящура: А, О, С, Азия-1, САТ-1, САТ-2, САТ-3 с множеством топотипов и генетических линий [3]. Геном представляет собой одноцепочечную позитивную РНК, состоящую приблизительно из 8500 н.о. с одной большой открытой рамкой считывания длиной около 7000 и.о., за которой следует 3'-нетранслируемая область (приблизительно 100 н.о.) и поли(А)-фрагмент. 5'-нетранслируемая область, необходимая для инициации процесса трансляции вирусной РНК, имеет длину около 1300 н.о. РНК вируса ящура окружена икосаэдрическим капсидом, состоящим из 60 копий, каждая из которых представлена 4 структурными белками VP₁ (1D-ген), VP₂ (1B-ген), VP₃ (1C-ген), VP₄ (1A-ген) [2, 16].

В процессе трансляции РНК вируса ящура формируется полипептид, соответствующий всему транслируемому участку генома. Во время посттрансляционного процессинга происходит рестрикция первоначального полипептида на L-, Р1-, Р2- и Р3-белки. От сформированной полипептидной цепи отделяется L-белок, который, являясь протеазой, участвует в процессе индуцирования расщепления факторов трансляции вирусной РНК [2].

На этапе процессинга протеин Р1 расщепляется с помощью L- и 3С-протеаз с образованием структурных белков VP₀ (1АВ-ген), VP₁ (1D-ген), VP₃ (1C-ген), которые представляют собой пустые капсиды, необходимые для организации частиц вируса ящура. Во время формирования вириона белковый комплекс VP₀ (1AB-ген) диссоциирует на протеины VP₄ (1A-ген) и VP₂ (1B-ген). Полипептид Р2 за счет протеолитического действия 3С-белка расщепляется на неструктурные 2В- и 2С-пептиды. Белковый комплекс P3 под влиянием 3С-протеазы отделяется от полипептида Р2 и распадается на неструктурные белки 3А и 3В (VP_g). Происходит рестрикция Р3-белкового комплекса на ферменты 3С-протеазу и 3D-белок (РНК-зависимую-РНК-полимеразу). 3D-ген по нуклеотидному составу является наиболее консервативным в отличие от других генов вируса ящура [2, 16].

В процессе репродукции в биологических системах вирус ящура формирует 4 варианта компонентов: 146S компонент (вирион, полная частицы), состоящий из одной цельной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁ (1D-ген), VP₂ (1B-ген), VP₃ (1С-ген), VP₄ (1А-ген); 75S частица («пустой» капсид), включающий в себя 60 копий полипептидов VP₀ (1AB-ген), VP₁ (ID-ген), VP₃ (1С-ген); 12S частица (капсомер), представленный структурными белками VP₁ (ID-ген), VP₂ (1B-ген), VP₃ (1C-ген); 3,8S субъединица, представленная неструктурным белком VP_g. 75S, 12S и 3,8S компоненты не включают в себя РНК вируса ящура [2].

Ящур причиняет огромный экономический ущерб, который сопряжен с резким снижением продуктивности скота, значительными затратами на борьбу с болезнью и лишением возможности торговли. По оценкам, только с точки зрения реальных производственных потерь и затрат на вакцинацию в эндемичных регионах ущерб, который ящур причиняет экономике, составляет от 6,5 до 21,0 млрд долл. США в год [8]. На страны, свободные от ящура, также может быть оказано серьезное воздействие по причине чрезвычайно высоких затрат на ликвидацию болезни после вторжения. Иными словами, усиление контроля над ящуром и вакцинация восприимчивых животных во всем мире приносит пользу, как свободным, так и эндемичным странам и рассматривается как глобальное экономическое благо [3, 12].

В процессе промышленного производства противоящурных вакцин особое внимание уделяют количеству цельных вирионов, которые обладают важнейшими биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, определяющими иммуногенность вакцинных препаратов [2]. Исходя из этого, сырье для вакцин на различных этапах технологического процесса исследуют на количественное определение целевого маркера (вирионов вируса ящура) с применением обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ). Данная модификация имеет некоторые недостатки: при содержании до технологического процесса очистки антигена в исследуемой пробе аналита менее 0,100 мкг/см³ чувствительность реакции снижается; при наличии в образце высокого содержания клеточного белка и липопротеинов частицы сорбента сенсибилизируются избыточным количеством балластных компонентов, что уменьшает возможность сорбирования РНК вируса и снижает чувствительность и специфичность анализа; при возможном попадании следовых количеств сорбента в реакционную смесь может возрастать фоновое значение флуоресценции и отмечаться искажение результатов анализа при определении коэффициента пропорциональности, а между сигналом флуоресценции и количеством цельного вируса в пробе.

В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения количества вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе способа сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в реальном времени.

Данный метод позволяет в течение 4 часов с высокой степенью достоверности определять концентрацию вирионов вируса ящура в суспензиях с высоким содержанием клеточного белка и липопротеинов, а также в пробах, в которых количество вирионов ниже 0,100 мкг/см³, и не предполагает использование сорбента на этапе экстрагирования нуклеиновой кислоты. Исходя из этого, целесообразно предложить новый способ оценки концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе альтернативного метода.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного способа быстрого определения концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию нового способа оценки концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при сравнении максимальных экстремумов кривых реакции амплификации в реальном времени с помощью второй производной. Предложенный способ позволяет: 1) повысить специфичность анализа проб за счет иммунного связывания вирионов вируса ящура; 2) исключить возможность увеличения фоновых значений флуоресценции благодарю использованию методики разделения фракций проб с помощью смеси гуанидинизотиоцианата (ГТЦ), хладона-20, карболовой кислоты, этилового спирта и пропанола-2; 3) увеличить чувствительность и специфичность реакции за счет модификации компонентного состава смеси для проведения реакции амплификации; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями концентрации вирионов вируса ящура (С_{вирионов ВЯ}) и максимальными экстремумами графиков второй производной для кривых реакции амплификации (С_р), представленной в виде квадратичной функции С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446 с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 0,993). Предложенная модель позволяет количественно оценивать содержание вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Спектрограммы разведений элюатов РНК вируса ящура штамма Азия-1/Шамир Израиль/89 (снизу вверх отражены графики для разведений экстрактов, соответствующих следующим концентрациям вирионов: 0,01, 0,10, 0,50, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 мкг/см³).

Фиг. 2 - Средние значения критических точек С_р, рассчитанные с помощью второй производной для графиков реакции амплификации в реальном времени при анализе РНК калибратора-стандарта вируса ящура штамма Азия-1/Шамир Израиль/89 с концентрациями вирионов 0,01, 0,05, 0,10, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50, 2,00, 2,50, 3,00, 3,50, 4,00, 4,50, 5,00 мкг/см³ (n=3) (А - графики накопления флуоресцентного сигнала, первой и второй производных, Б - графики второй производной для кривых реакции амплификации).

Фиг. 3 - Зависимость критической точки С_р, детектируемой с помощью второй производной для кривой амплификации в режиме реального времени, от концентрации вирионов вируса ящура (с указанием стандартной погрешности) (n=3).

Фиг. 4 - Спектр поглощения экстрактов суммарной РНК вируса ящура исследуемых штаммов для оценки степени их чистоты при определении концентрации вирионов вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса ящура зарегистрированы при длине волны 262 нм).

Фиг. 5 - Критические точки С_р графиков реакции амплификации в реальном времени для исследуемых проб не инактивированного культурального вируса ящура, рассчитанные с помощью второй производной (вертикальная линия проецирует максимальный экстремум графика второй производной, выделенного красным цветом, на ось циклов амплификации).

Сущность изобретения заключается в новом подходе по определению концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых сигнала флуоресценции относительно количества циклов реакции амплификации. Заявляемый способ основан на проведении серологического штаммоспецифического связывания вирионов вируса ящура с использованием высокоочищенных поликлональных антител, получении очищенного элюата суммарной вирусной РНК без применения сорбента с использованием метода экстракции смесью карболовой кислоты, ГТЦ, хладона-20, этилового спирта и пропанола-2, постановке реакции амплификации в режиме реального времени с последующим детектированием максимальных экстремумов кривых реакции амплификации с помощью второй производной, определении количества вирионов вируса ящура с использованием разработанной модели зависимости критической точки графика второй производной для кривой накопления флуоресценции и концентрации полных вирусных частиц.

В настоящее время реакцию амплификации в режиме реального времени применяют для обнаружения вируса ящура в образцах афтозного патологического материала парнокопытных и мозоленогих животных, а также для определения концентрации 146S компонента вируса ящура с помощью регрессионной модели зависимости количества полных вирусных частиц и порогового цикла амплификации (threshold cycle, C_t) [1]. Разработанный способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в реальном времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью при анализе не инактивированных вирусных суспензий с высоким содержанием клеточного белка и липопротеинов, а также проб, в которых концентрация вирионов вируса ящура ниже 0,100 мкг/см³.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этап штаммоспецифического связывания вирионов вируса ящура с применением высокоочищенных поликлональных антител из штаммоспецифичных сывороток крови морских свинок против вируса ящура; модифицированный этап выделения РНК, исключающий использование сорбента; усовершенствованный этап проведения обратной транскрипции и реакции амплификации; новый подход к методике расчета концентрации вирионов вируса ящура с применением регрессионной модели зависимости критической точки графика второй производной для кривой флуоресценции и количества полных вирусных частиц. Применение предложенного способа повышает достоверность анализа содержания полных частиц вируса ящура в пробах, в том числе с концентрациями менее 0,100 мкг/см³. При этом также как и прототип разработанный способ позволяет одновременно исследовать несколько десятков проб не инактивированного сырья для вакцины за короткий промежуток времени (в течение 4 часов). Исходя их этого, актуально применять данный способ для определения количества вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.

Ключевым элементом заявляемого способа является детектирование максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени для исследуемых проб и определение концентрации вирионов вируса ящура с использованием разработанной модели зависимости критической точки графика второй производной для кривой накопления флуоресценции и количества полных вирусных частиц.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых амплификации в режиме реального времени с использованием разработанной квадратичной модели для определения концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.

Сведений о разработке предлагаемого способа оценки содержания вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины авторами не обнаружено.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости критической точки С_р, детектируемой с помощью второй производной для кривой амплификации в режиме реального времени, от концентрации вирионов вируса ящура (фиг. 3).

Сенсибилизируют иммунологический 6-луночный планшет, высокоочищенными штаммоспецифическими поликлональными антителами против вируса ящура в объеме 1,50 см³ суспензии с концентрацией иммуноглобулинов G 5 мкг/см³. После иммобилизации антител при температуре 4±2°С в течение 18-20 часов лунки планшета подвергают трехкратному промыванию 1/15 М фосфатным буферным раствором (ФБР), открытые сайты связывания блокируют 1,0%-ной суспензией желатина при температуре 37±1°С в течение 30 минут и вновь лунки промывают 1/15 М ФБР 5 раз. Процедуру подготовки планшета к работе с пробами осуществляют заранее, до проведения основного анализа.

На первом этапе исследования проводят серологическую реакцию связывания вирионов вируса ящура из исследуемых образцов (разведения калибратора-стандарта, отрицательный контроль, пробы). В качестве калибратора-стандарта используют не инактивированную суспензию вируса ящура, репродуцированного в суспензионной культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21) с известной концентрацией вирусных частиц. Отрицательным контролем служит не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,5-3,0 млн клеток/см³. Применяют контрольную панель готовых разведений калибратора-стандарта с количествами вирусной РНК, эквивалентными следующим концентрациям вирионов вируса ящура: 0,01, 0,05, 0,10, 0,20, 0,50, 1,00, 1,50, 2,00, 2,50, 3,00, 3,50, 4,00, 4,50, 5,00 мкг/см³. Данный диапазон разведений от 0,01 до 5,00 мкг/см³ используют, исходя из особенностей процесса производства противоящурных культуральных вакцин на этапе получения неинактивированного антигена, до этапа его инактивации, очистки и концентрирования. В лунки с сенсибилизированными штаммоспецифическими антителами против вируса ящура вносят по 2,4 см³ суспензий образцов и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 30 минут. В результате серологической реакции на поверхности лунок формируется комплексы «вирион вируса ящура - штаммоспецифичные антитела». Лунки отмывают от балластных компонентов с использованием 1/15 М ФБР 3 раза. Образовавшиеся иммунные комплексы ресуспендируют в 1,0 см³ среды Игла MEM.

На следующем этапе анализа осуществляют выделение связанной иммунным комплексом суммарной РНК вирионов вируса ящура в процессе лизиса белков и липопротеинов, очистки нуклеиновой кислоты от примесей и ее концентрирования. Данный метод выделения РНК вируса ящура позволяет достичь высокой стандартизации в процедуре экстракции и получить из неинактивированного сырья для противоящурной вакцины высокоочищенные препараты нуклеиновой кислоты. Представленная ниже модифицированная методика адаптирована к процессу получения высоокочищенного элюата РНК вируса ящура и имеет отличия по количеству используемых компонентов от прописи Chomczynski Р. [4]. Лизис проводят с применением 8,0 см³ раствора, содержащего 50% карболовой кислоты (рН<7,0) и 50% 4М ГТЦ, который смешивают с 1,0 см³ суспензии комплекса «вирион вируса ящура - штаммоспецифичные антитела». Смесь инкубируют при температуре 22-25°С в течение 15-20 минут для полного диссоциирования полипептидных и нуклеопротеидных комплексов. При этом суммарная вирусная РНК сохраняет свою целостность благодаря высокой ингибирующей активности карболовой кислоты и ГТЦ в отношении РНКаз. Полученный лизат очищают от конгломератов с помощью центрифугирования при 12000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносят в центрифужную пробирку с 2,0 см³ хладона-20 и инкубируют содержимое в течение 5 минут с перемешиванием на вортексе. Смесь после инкубирования фракционируют при 14000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4-8°С. В результате центрифугирования происходит разделение содержимого пробирки на три фракции: 1) нижняя фракция, содержащая комплекс карболовой кислоты и хладона-20 со связанными липопротеинами и денатурированными полипептидами; 2) средняя фракция, включающая в свой состав белки и клеточную ДНК; 3) верхняя фракция, представляющая собой водный элюат РНК [13]. Верхнюю фракцию полностью отбирают, не затрагивая остальные, и переносят элюат в новую центрифужную пробирку с 4,0 см³ 100%-ого пропанола-2 для преципитации одноатомным спиртом с целью концентрирования РНК вируса ящура. Смесь инкубируют в течение 10 минут при температуре 22-25°С, затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 7 минут при температуре 22-25°С. Супернатант удаляют, оставляя осадок РНК вируса ящура, к которому добавляют 2,0 см³ 80%-ого этанола. Содержимое перемешивают, инкубируют 3 минуты и осаждают при 14000 об/мин в течение 7 минут при температуре 22-25°С. Надосадок удаляют, осадок РНК высушивают в потоке воздуха комнатной температуры в течение 5 минут. К высушенному осадку добавляют 200 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg²⁺, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3-5 минут для получения элюата РНК вируса ящура. Таким образом, получают по 200 мкл 12-кратных (12х) экстрактов вирусной РНК относительно исходного объема суспензии вируса ящура (2,4 см³), вносимой в планшет до проведения серологической реакции связывания вирионов вируса ящура.

На следующем этапе осуществляют спектральное исследование элюата суммарной РНК вируса ящура, определяя поглощение аналитом монохроматического ультрафиолетового света, что позволяет оценить степень чистоты экстракта, который в последующем тестируют в реакции амплификации. Измерения спектральной поглощающей способности образцов проводят при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 22-25°С. В выделенных экстрактах оценивают содержание остатков фосфолипидов, полисахаридов и ГТЦ, карболовой кислоты, полипептидов и крупных взвешенных частиц, определяя значения оптической плотности (OD, optical density) при 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно [17]. Элюат РНК считают свободным от примесей белка и карболовой кислоты, если OD₂₆₂/OD₂₈₀ (коэффициент экстинкции R₁) находится в пределах 1,8-2,2 и оптимально составляет примерно 2,0. Более низкие значения R₁ указывают на наличие ДНК, белковых составляющих и остатков карболовой кислоты в элюате. Более высокие значения коэффициента R₁ свидетельствуют о деградации РНК и наличии свободных рибонуклеотидов. Экстракт нуклеиновой кислоты вируса ящура считают незагрязненным полисахаридами, если OD₂₆₂/OD₂₃₅ (коэффициент экстинкции R₂) приближен к значению 2,000 [5]. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие R₂ снижается на 0,002. Значения коэффициента R₂ большие 2,000 могут указывать на деградацию молекул РНК. Отсутствие взвеси крупных частиц в элюате подтверждается, если OD₃₂₀ приближено к нулевому значению [5, 17]. При несоответствии требованиям чистоты повторно проводят этапы серологического связывания и выделения РНК вируса ящура из исходного материала.

После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса ящура проводят ОТ-ПЦР-РВ для исследования контрольных образцов и исследуемых проб. Для постановки реакции готовят ОТ-ПЦР-РВ-смесь, рецептура приготовления которой представлена в таблице 1. В качестве гомологичных 3D-гену вируса ящура олигонуклеотидов используют Forward-3D-FMDV- (5'- ACT-GGT-TTT-ACA-AAC-CTG-TGA-GGT-3'), Reverse-3D-FMDV-праймеры (5'-GCG-AGT-CCT-GCC-ACG-GAG-TTG-GTT-3') и 3D-FMDV-ROX/BHQ2-зонд (5'-ROX-TCC-TTT-GCA-CGC-CGT-GGG-ACG-3') в концентрации 15 пМ на реакцию с внесением в ОТ-ПЦР-РВ-смесь по 0,1 мкл. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с концентрацией каждого в ОТ-ПЦР-РВ-смеси по 0,2 мМ. В качестве основы используют DreamTaq буфер (10х), содержание которого составляет 10% от общего объема реакционной смеси, а также добавляют 4 мМ хлорида магния и диметилсульфооксид в количестве 3% от объема ОТ-ПЦР-РВ-смеси. Содержание деионизированной воды составляет 56,25%. В качестве катализаторов обратной транскрипции и реакции амплификации применяют MMLV-обратная транскриптаза (10 ед.) и Thermus aquaticus DNA-полимеразу (1 ед.).

Объем ОТ-ПЦР-РВ-смеси компонентов для проведения одной реакции составляет 20 мкл. Элюаты суммарной РНК вируса ящура каждого образца добавляют к ОТ-ПЦР-РВ-смеси по 5 мкл. Объем реакционной смеси составляет 25 мкл.

Постановку реакции осуществляют при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 2. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 900 с за 1 цикл, предварительную денатурацию комплементарной ДНК - при температуре 95°С за 600 с в течение 1 цикла. Реакцию амплификации в режиме реального времени осуществляют в течение 40 циклов, каждый из которых складывается из 3 под этапов: «денатурации», проводимой при температуре 95°С в течение 18 с, а также объединенных под этапов «отжига праймеров и зонда» и «элонгации и аккумулирования флуоресцентного сигнала», осуществляемых при температуре 63°С за 50 с.

Процесс основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности Thermus aquticus ДНК-полимеразы [6]. В отсутствии мишени флуорофор ROX и гаситель флуоресценции BHQ2 в составе 3D-FMDV-зонда сближены за счет максимального использования водородных связей между атомами Н, О и N олигонуклеотидов. Благодаря механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии свечение подавлено. За счет 5'-экзонуклеазной активности Thermus aquticus ДНК-полимеразы после отжига Forward-3D-FMDV-, Reverse-3D-FMDV-праймеров и 3D-FMDV-ROX/BHQ2-зонда происходит разрушение гибридизованного зонда и ампликона, наблюдается их пространственное разделение, что приводит к росту детектируемого сигнала [10]. Увеличение уровня флуоресценции (Fl) пропорционально количеству образующихся продуктов реакции. Мониторинг сигнала в течение 40 циклов (С) ПНР в режиме реального времени позволяет построить кинетическую кривую флуоресценции, которая задана функцией Fl = f(С).

Результаты реакции амплификации в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям максимальных критических точек С_р, определенных с помощью построения графика второй производной функции Fl = f(С_р). Величина С_р является важной характеристикой реакции, прямо пропорциональна количеству копий исходной матрицы РНК и соответственно концентрации цельных вирионов вируса ящура. Учитывая, что вторая производная функции f(С_р) (f''(С_р)) непрерывна в некоторой окрестности точки С_р = С_р1 и задана на отрезке циклов амплификации [0; 40], существует определенный участок около точки С_р, для которого во всех координатах на оси O-С_р вторая производная функции f(С_р) будет отрицательна. Поскольку f''(С_р) является первой производной от функции f'(С_р), то из условия (f'(С_р))'<0, следует, что f'(С_р) на некотором малом отрезке, содержащем точку С_р = С_р1, будет убывающей. Учитывая, что f'(С_р)=0, на участке при С_р < С_р1 первая производная функции f(С_р) >0, а при С_р > С_р1 получаем, что f'(Ср)<0. Иными словами, первая производная функции f(С_р) при переходе через точку С_р = С_р1 изменяет знак с «+» на «-», следовательно, в точке С_р1 функция, отражающая процесс накопления флуоресцентного сигнала, имеет максимальный экстремум. Таким образом, если график реакции амплификации в режиме реального времени представлен функцией Fl = f(С_р), f'(С_р) = 0 и f''(С_р)<0, то при условии, что С_р = С_р1 полученная функция имеет максимум в точке с аргументом С_р1, значение которой учитывают для установления зависимости между концентрацией вирионов вируса ящура и величиной С_р.

Преимущество использования второй производной в данном случае заключается в том, что при умножении функции кривой амплификации Fl = f(С_р) на любые множители, в том числе коэффициент пропорциональности α [9, 14], положение максимумов производных не меняется. Максимальный экстремум второй производной находится внутри экспоненциального участка графика накопления флуоресценции, то есть в зоне экспоненты, при анализе которой эффективность реакции амплификации не изменяется [15].

Математически определив значения С_р графиков второй производной для кривых, отражающих накопление флуоресцентного сигнала образцов с разной концентрацией 146S частиц, устанавливают зависимость между количеством вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины и максимальным экстремумом С_р, а также оценивают степень достоверности аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины.

Пример 1. Выявление существования зависимости между концентрацией вирионов вируса ящура штамма Азия-1/Шамир Израиль/89 в неинактивированном сырье для вакцины и значением максимального экстремума кривых реакции амплификации в режиме реального времени

На первом этапе исследования применяют контрольную панель готовых разведений калибратора-стандарта, в качестве которого используют не инактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма Азия-1/Шамир Израиль/89 с количествами вирусной РНК, эквивалентными следующим концентрациям вирионов вируса ящура: 0,01, 0,05, 0,10, 0,20, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50, 3,00, 3,50, 4,00, 4,50, 5,00 мкг/см³. Отрицательным контролем служит не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,5-3,0 млн клеток/см³. В лунки с сенсибилизированными антителами против вируса ящура штамма Азия-1/Шамир Израиль/89 вносят по 2,4 см³ суспензий положительных образцов данного штамма и инкубируют при температуре 37±1°С в течение 30 минут. На поверхности лунок формируются комплексы «вирион вируса ящура - штаммоспецифические антитела». Лунки отмывают от балластных компонентов с использованием 1/15 М ФБР 3 раза. Образовавшиеся иммунные комплексы ресуспендируют в 1,0 см³ среды Игла MEM.

После этапа серологического связывания вирионов вируса ящура штамма Азия-1/Шамир Израиль/89 из полученных комплексов выделяют суммарную РНК вирионов за счет лизиса белков и липопротеинов, очистки нуклеиновой кислоты от примесей и ее концентрирования. Лизис проводят с использованием 8,0 см³ раствора, содержащего 50% карболовой кислоты (рН<7,0) и 50%) 4М ГТЦ, который смешивают с 1,0 см³ суспензии комплекса «вирион вируса ящура - штаммоспецифические антитела». Смесь инкубируют при температуре 22-25°С в течение 15-20 минут для полного диссоциирования полипептидных и нуклеопротеидных комплексов. Полученный лизат очищают от конгломератов с помощью центрифугирования при 12000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносят в центрифужную пробирку с 2,0 см³ хладона-20 и инкубируют содержимое в течение 5 минут с перемешиванием на вортексе. После инкубирования смесь фракционируют при 14000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4-8°С. В результате происходит разделение содержимого пробирки на три фракции: 1) нижняя фракция, содержащая комплекс карболовой кислоты и хладона-20 со связанными липопротеинами и денатурированными полипептидами; 2) средняя фракция, включающая в свой состав белки и клеточные ДНК; 3) верхняя фракция, представляющая собой водный элюат РНК. Верхнюю фракцию полностью отбирают, не затрагивая остальные, и элюат переносят в новую центрифужную пробирку с 4,0 см³ 100%-ого изопропанола. Смесь инкубируют в течение 10 минут при температуре 22-25°С, далее центрифугируют при 14000 об/мин в течение 7 минут при температуре 22-25°С. Супернатант удаляют, оставляя осадок РНК вируса ящура, к которому добавляют 2,0 см³ 80%-ого этанола. Содержимое перемешивают, инкубируют 3 минуты и осаждают при 14000 об/мин в течение 7 минут при температуре 22-25°С. Супернатант удаляют, осадок РНК высушивают в потоке воздуха комнатной температуры в течение 5 минут. К высушенному осадку добавляют 200 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиаминтетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg²⁺. Содержимое пробирки нагревают при температуре 60±2°С в течение 3-5 минут для получения элюата РНК вируса ящура. Таким образом, получают по 200 мкл 12-кратных (12х) экстрактов вирусной РНК каждого разведения калибратора-стандарта.

На следующем этапе исследования с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводят оценку степени чистоты полученных элюатов РНК вируса ящура штамма Азия-1/Шамир Израиль/89 из разведений калибратора-стандарта, соответствующих следующим концентрациям вирионов: 0,01, 0,10, 0,50, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 мкг/см³. Образцы РНК сканируют в кварцевой кюветы (l=10 мм) при температуре 23-25°С и регистрируют значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Specrtrum v. 5.0 (Фиг. 1).

По результатам анализа контрольных образцов в указанных выше разведениях выявили, что значения OD_205-259 и OD_263-325 не превышают OD_260-262, что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (n=3). Из данных спектрального исследования стандартов отмечают отсутствие выраженных пиков на графиках (фиг. 1) при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствует о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, карболовой кислоты, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициентов экстинкции (R₁) для стандартов приближены к норме 2,000 (R₁ = 1,995-1,999), что подтверждает отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка и остатков карболовой кислоты. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах не наблюдается, так как R₁ не превышает 2,000. Экстракты вирусной РНК разведений калибратора-стандарта не загрязнены полисахаридами и ГТЦ, поскольку значения коэффициента экстинкции (R₂) приближены к норме 2,000 и соответствуют 2,000-2,001. Учитывая, что при замещении 1% РНК на углеводы значение R₂ уменьшается на 0,002, в полученных экстрактах наличие полисахаридных примесей не выявлено. Степень разрушения РНК в экстрактах составляет 0,5% ((2,001-2,000)/0,002), что является допустимым. Таким образом, экстракты РНК вируса ящура, выделенные из разведений калибратора-стандарта, характеризуются высокой степенью чистоты [5, 17] и могут быть использованы для дальнейшего исследования.

После оценки степени чистоты экстрактов выделенных РНК вируса ящура, полученных из разведений калибратора-стандарта проводят ОТ-ПЦР-РВ. В качестве гомологичных 3D-гену вируса ящура олигонуклеотидов используют Forward-3D-FMDV-праймер (5'- ACT-GGT-ТТТ-ACA-AAC-CTG-TGA-GGT-3'), Reverse-3D-FMDV-преймер (5'-GCG-AGT-CCT-GCC-ACG-GAG-TTG-GTT-3') и 3D-FMDV-ROX/BHQ2-зонд (5'-ROX-TCC-TTT-GCA-CGC-CGT-GGG-ACG-3') в концентрациях по 15 пМ на реакцию с внесением в ОТ-ПЦР-РВ-смесь данных олигонуклеотидов по 0,1 мкл. Смесь состоит также из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (концентрация каждого - по 0,2 мМ), DreamTaq буфера (10х) (10% от общего объема смеси), хлорида магния (4 мМ) и диметилсульфооксида (3% от объема ОТ-ПЦР-РВ-смеси). Содержание деионизированной воды составляет 56,25%. В качестве ферментов реакции применяют MMLV-обратная транскриптаза (10 ед.) и Thermus aquaticus DNA-полимеразу (1 ед.).

Объем ОТ-ПЦР-РВ-смеси компонентов для проведения одной реакции составляет 20 мкл. Элюаты суммарной РНК вируса ящура каждого образца добавляют к ОТ-ПЦР-РВ-смеси по 5 мкл. Объем реакционной смеси в сумме составляет 25 мкл.

Постановку реакции осуществляют при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 2. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 900 с за 1 цикл, предварительную денатурацию комплементарной ДНК - при температуре 95°С за 600 с в течение 1 цикла. Реакцию амплификации в режиме реального времени осуществляют в течение 40 циклов, каждый из которых складывается из 3 подэтапов: «денатурации», проводимой при температуре 95°С в течение 18 с, а также объединенных подэтапов «отжига праймеров и зонда» и «элонгации и аккумулирования флуоресцентного сигнала», осуществляемых при температуре 63°С за 50 с.

Полученные данные анализируют с помощью программного обеспечения «Rotor-Gene FRT-manager», которое позволяет строить графики накопления флуоресцентного сигнала в режиме реального времени на протяжении заданного количества циклов амплификации. Применяя технологии компьютерной программы «Maxima» (или аналога), проводят построение графиков первой и второй производной для полученных элюатов РНК вируса ящура каждого разведения калибратора-стандарта с определенными концентрациями вирионов вируса ящура и рассчитывают средние значения максимальных экстремумов графиков второй производной с проекцией на ось абсцисс О-С (n=3) (Фиг. 2). Результаты эксперимента по представлению системы параллельной оценки величины максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени (С_р) и концентрации вирионов вируса ящура (С_{вирионов ВЯ}) в контрольных образцах представлены в таблице 3. Значения С_р для всех разведений калибратора-стандарта неинактивированного культурального вируса ящура с концентрациями от 0,01 до 5,00 мкг/см³ находятся в диапазоне от 30,81±0,07 до 19,08±0,04, соответственно. При исследовании отрицательного контроля накопления флуоресцентного сигнала не наблюдалось, что подтверждает отсутствие вируса ящура в данном образце. В представленных исследованиях р-уровень значимости меньше 0,01 для контрольных образцов калибратора-стандарта с концентрациями вирионов вируса ящура от 0,01 до 0,10 мкг/см³ и р<0,005 для образцов с концентрациями полных вирусных частиц от 0,20 до 5,00 мкг/см³. Зависимость концентрации вирионов вируса ящура и значений максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в реальном времени представлена на фиг. 3 и отражена в виде квадратичной функции С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446 с высокой достоверностью аппроксимации (R² = 99,3%). Данная модель разработана для анализа 12х-ных элюатов РНК неинактивированного вируса ящура. Таким образом, выявлено существование зависимости концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины и максимального экстремума графика второй производной для кривой реакции амплификации в режиме реального времени.

Контрольные образцы параллельно исследовали классическим методом ОТ-ПЦР-РВ с определением значения порогового цикла амплификации (C_t) и расчетом концентрации 146S частиц (n=3) [1]. Следует отметить, что подготовка элюатов и проведение ОТ-ПЦР-РВ для разработанного способа и прототипа [1] различаются, в связи с этим значения пороговых циклов амплификации для получаемых графиков накопления флуоресцентного сигнала одной и той же пробы будут иметь отличия. Полученные данные отражены в таблице 3, из которой следует, что степень различий результатов анализа контролей разработанным методом и истинными значениями положительных стандартов составляет 0,00-2,91%. Различия в определении содержания вирионов вируса ящура положительных контролей прототипным способом по сравнению с истинными значениями для образцов с концентрациями полных вирусных частиц от 0,01 до 0,20 мкг/см³ составили 10,31-28,21%, с содержанием полных вирусных частиц от 0,50 до 5,00 мкг/см³ - 0,18-2,47%). Степень различия в определении количеств вирионов вируса ящура разработанным способом и в ОТ-ПЦР-РВ по C_t для образцов с концентрациями вирионов от 0,01 до 0,20 мкг/см³ составили 8,52-28,21%, с содержанием от 0,50 до 5,00 мкг/см³ - 0,29-1,88%. В отрицательном контроле вирус ящура не был выявлен ни одним из представленных методов. Таким образом, разработанный способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени позволяет с высокой степенью достоверности исследовать неинактивированные суспензии вируса ящура с концентрациями от 0,01 до 5,00 мкг/см³.

Пример 2. Определение концентрации вирионов вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени

Для анализа использовали референтную неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013, изготовленную с заведомо низким содержанием вирионов (0,08 мкг/см³) и высоким содержанием клеточного белка (более 7,00 мг/см³). В качестве положительного контроля (К+) применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура с количеством вирионов 1,00 мкг/см³. Отрицательным контролем (К-) служила не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,50-3,00 млн клеток/см³. Испытуемую пробу и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этап штаммоспецифического связывания вирионов вируса ящура, выделения из них РНК, оценки степени чистоты полученных 12х элюатов и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили так, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены на фиг. 4, 5А и в таблице 4.

Из данных спектрограммы 12х элюата РНК пробы вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 (фиг. 4, табл. 4) видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD_260-262 (0,001-0,120<0,121-0,124 и 0,118-0,002<0,121-0,124), иными словами, элюат РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Экстракт не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, карболовой кислоты, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограмме (фиг. 4) отсутствуют выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R₁) составляет 1,967 (OD₂₆₂/OD₂₈₀ = 0,122/0,062), что приближено к значению нормы 2,000 и означает высокую степень чистоты элюата РНК вируса ящура, практически полное отсутствие белка и остатков карболовой кислоты после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R₂) соответствует значению нормы 2,000 (OD₂₆₂/OD₂₃₅ = 0,122/0,061) и обуславливает высокую чистоту препарата. Таким образом, полученный препарат удовлетворяет требованиям чистоты [5, 17] и его можно использовать для дальнейших исследований.

Полученные элюаты неинактивированного вируса ящура тестировали в ОТ-ПЦР-РВ. С помощью разработанного метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени определили средние значения С_р для испытуемого образца и положительного контроля. Результаты исследования представлены на фиг. 5А и в таблице 4, из которых следует, что С_{р среднее пробы} составляет 29,68±0,06, С_{р среднее К+} - 27,25±0,01. Пользуясь разработанной моделью С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446, определили значение концентрации вирионов вируса ящура, которое для положительного контроля составило 1,004±0,005 мкг/см³, что сочетается с эталонным значением (1,000 мкг/см³). В отрицательном контроле вирус ящура не обнаружен. Испытуемую пробу тестировали в ОТ-ПЦР-РВ с помощью разработанного способа и прототипа. Поскольку подготовка элюатов и проведение ОТ-ПЦР-РВ для этих способов различаются, то значения пороговых циклов амплификации (C_t) для получаемых графиков накопления флуоресцентного сигнала для одной и той же пробы имеют отличия. В испытуемой пробе количество вирионов, определенное с помощью предложенного способа, составило 0,078±0,004 мкг/см³, что коррелирует с количеством, заложенным в данный образец (0,080 мкг/см³). Содержание 146S частиц в анализируемой пробе по данным метода ОТ-ПЦР-РВ с расчетом концентрации по значению C_t (прототип) составило 0,037±0,011 мкг/см³, что отличается от заранее известного количества вирионов вируса ящура, содержащегося в образеце, на -46,25% (табл. 4). Таким образом, именно разработанный способ сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени позволяет оценивать концентрацию вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с низким содержанием аналита и высоким количеством балластного компонента.

Пример 3. Определение концентрации вирионов вируса ящура штамма O/PanAsia2 в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени

Для анализа использовали референтную неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма O/PanAsia2 с известным содержанием вирионов (1,60 мкг/см³) и высоким количеством клеточного белка (более 7,00 мг/см³). В качестве положительного контроля применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура с количеством вирионов 1,00 мкг/см³. Отрицательным контролем служила не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,50-3,00 млн клеток/см³. Испытуемую пробу и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этап штаммоспецифического связывания вирионов вируса ящура, выделения из них РНК, оценки степени чистоты полученных 12х элюатов и постановку ОТ-ПЦР-РВ проводили так, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены на фиг. 4, 5Б и в таблице 4.

Из данных спектрограммы 12х элюата РНК пробы вируса ящура штамма O/PanAsia2 (фиг. 4, табл. 4) видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD_260-262 (0,001-0,429<0,431-0,432 и 0,430-0,002<0,431-0,432), иными словами, элюат РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Экстракт не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, карболовой кислоты, полипептидов и крупных конгломератов, так как на спектрограмме (фиг. 4) отсутствуют выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R₁) соответствует значению нормы 2,000 (OD₂₆₂/OD₂₈₀ = 0,432/0,216), что означает высокую степень чистоты элюата РНК вируса ящура и отсутствие в нем белка и остатков карболовой кислоты после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R₂) соответствует значению 1,991 (OD₂₆₂/OD₂₃₅ = 0,432/0,217), что близко к норме 2,000 и обуславливает высокую чистоту препарата. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие значение R₂ уменьшается на 0,002, следовательно, в полученном элюате наличие полисахаридных примесей составляет не более 4,5% (доля примесей полисахаридов = ((2,000-1,991)/0,002), что допустимо. Таким образом, полученный препарат удовлетворяет требования чистоты [5, 17] и его можно использовать для дальнейших исследований.

Элюаты РНК неинактивированного вируса ящура штамма O/PanAsia2 исследовали в ОТ-ПЦР-РВ. С помощью разработанного метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени определили средние значения С_р для испытуемого образца и положительного контроля. Результаты исследования представлены на фиг. 5Б и в таблице 4, из которых следует, что С_{р среднее пробы} составляет 25,84±0,03, С_{р среднее К+} - 27,25±0,01. Пользуясь моделью С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446, определили значение концентрации вирионов вируса ящура, которое для положительного контроля составило 1,004±0,005 мкг/см³, что сочетается с эталонным значением (1,000 мкг/см³). В отрицательном контроле вирус ящура не обнаружен. Испытуемую пробу тестировали в ОТ-ПЦР-РВ с помощью разработанного способа и прототипа. В испытуемой пробе количество вирионов, определенное с помощью предложенного способа, составило 1,612±0,018 мкг/см³, что коррелирует с количеством, заложенным в данный образец (1,600 мкг/см³), и с результатами метода расчета количества 146S частиц в ОТ-ПЦР-РВ по значению C_t (прототип) (1,621±0,034 мкг/см³) (табл. 4). Таким образом, представленная квадратичная модель с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени позволяет оценивать концентрацию вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с высоким содержанием клеточных белков.

Пример 4. Определение концентрации вирионов вируса ящура штамма О/Приморский/2012 в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени

Для анализа использовали референтную неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма О/Приморский/2012 с заведомо низким содержанием вирионов (0,05 мкг/см³) и высоким содержанием клеточного белка (более 7,00 мг/см³). В качестве положительного контроля применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура с концентрацией вирионов 1,00 мкг/см³. Отрицательным контролем служила не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,50-3,00 млн клеток/см³. Испытуемую пробу и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этап штаммоспецифического связывания вирионов вируса ящура, выделения из них РНК, оценки степени чистоты полученных 12х элюатов и проведение ОТ-ПЦР-РВ проводили так, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены на фиг. 4, 5В и в таблице 4.

Из данных спектрограммы 12х элюата пробы РНК вируса ящура штамма О/Приморский/2012 (фиг. 4, табл. 4) видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD_260-262 (0,001-0,091<0,092 и 0,090-0,001<0,092), иными словами, элюат РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Экстракт не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и ГТЦ, карболовой кислоты, полипептидов, крупных конгломератов, так как на спектрограмме (фиг. 4) отсутствуют выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R₁) составляет 2,000 (OD₂₆₂/OD₂₈₀ = 0,092/0,046), что соответствует значению нормы, означает высокую степень чистоты элюата РНК вируса ящура и практически полное отсутствие белка и остатков карболовой кислоты после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R₂) соответствует значению нормы 2,000 (OD₂₆₂/OD₂₃₅ = 0,092/0,046) и обуславливает высокую чистоту препарата. Таким образом, полученный препарат удовлетворяет требованиям чистоты [5, 17] и его можно использовать для дальнейших исследований.

Элюаты неинактивированного вируса ящура штамма О/Приморский/2012 исследовали в ОТ-ПЦР-РВ. С помощью разработанного метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени определили средние значения С_р для испытуемого образца и положительного контроля. Результаты исследования представлены на фиг. 5В и в таблице 4, из которых следует, что С_{р среднее пробы} составляет 29,75±0,04, С_{р среднее К+} - 27,25±0,01. Пользуясь разработанной моделью С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446, определили значение концентрации вирионов вируса ящура, которое для положительного контроля составило 1,004±0,005 мкг/см³, что сочетается с эталонным значением (1,000 мкг/см³). В отрицательном контроле вирус ящура не обнаружен. Испытуемую пробу тестировали в ОТ-ПЦР-РВ с помощью разработанного способа и прототипа. В пробе количество вирионов, определенное с помощью предложенного способа, составило 0,053±0,009 мкг/см³, что коррелирует с количеством, заложенным в данный образец (0,050 мкг/см³). Содержание 146S частиц в анализируемой пробе по данным метода ОТ-ПЦР-РВ с расчетом концентрации по значению C_t (прототип) составило 0,121±0,032 мкг/см³, что отличается от известной концентрации вирионов в образце, на +228,3% (табл. 4). Иными словами, именно разработанный способ сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени позволяет оценивать концентрацию вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с низким содержанием аналита и высоким количеством клеточных белков.

Пример 5. Определение концентрации вирионов вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени

Для анализа использовали референтную неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 с известным содержанием вирионов (2,500 мкг/см³) и высоким содержанием клеточного белка (более 7,00 мг/см³). В качестве положительного контроля применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура с содержанием вирионов 1,00 мкг/см³. Отрицательным контролем служила не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,50-3,00 млн клеток/см³. Испытуемую пробу и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этап штаммоспецифического связывания вирионов вируса ящура, выделения из них РНК, оценки степени чистоты полученных 12х элюатов и проведение ОТ-ПЦР-РВ проводили так, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены на фиг. 4, 5Г и в таблице 4.

Из данных спектрограммы 12х элюата пробы РНК вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 (фиг. 4, табл. 4) видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD_260-262 (0,001-0,532<0,533-0,536 и 0,531-0,002<0,533-0,536), иными словами, элюат РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Экстракт не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, карболовой кислоты, полипептидов и крупных конгломератов, так как на спектрограмме (фиг. 4) отсутствуют выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R₁) соответствует значению нормы 2,000 (OD₂₆₂/OD₂₈₀ = 0,536/0,238) и означает высокую степень чистоты элюата РНК вируса ящура и отсутствие белка и остатков карболовой кислоты после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R₂) соответствует значению 1,993 (OD₂₆₂/OD₂₃₅ = 0,536/0,269), что близко к норме 2,000 и обуславливает высокую чистоту препарата. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие значение R₂ уменьшается на 0,002, следовательно, в полученном элюате наличие полисахаридных примесей составляет не более 3,5% (доля примесей полисахаридов = ((2,000-1,993)/0,002), что допустимо. Таким образом, полученный препарат удовлетворяет требованиям чистоты [5, 17] и его можно использовать для дальнейшей работы.

Полученные элюаты пробы и контролей исследовали в ОТ-ПЦР-РВ и с помощью разработанного способа сравнения максимальных экстремумов кривых графиков второй производной для реакции амплификации в режиме реального времени определили средние значения С_р для испытуемого образца и положительного контроля. Результаты исследования представлены на фиг. 5Г и в таблице 4, из которых следует, что С_{р среднее пробы} составляет 23,91±0,03, С_{р среднее К+} - 27,25±0,01. Пользуясь моделью С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446, определили значение концентрации вирионов вируса ящура, которое для положительного контроля составило 1,004±0,005 мкг/см³, что сочетается с эталонным значением (1,000 мкг/см³). В отрицательном контроле вирус ящура не обнаружен. Испытуемую пробу тестировали в ОТ-ПЦР-РВ с помощью разработанного способа и прототипа. Для испытуемой пробы количество вирионов, определенное с помощью предложенного способа, составило 2,506±0,011 мкг/см³, что коррелирует с референтным значением концентрации вирионов в данном образце (2,500 мкг/см³), и с результатами метода расчета количества 146S частиц в ОТ-ПЦР-РВ по значению C_t (прототип) (2,531±0,029 мкг/см³) (табл. 4). Таким образом, представленная квадратичная модель с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени позволяет оценивать концентрацию вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с высоким содержанием клеточных белков.

Пример 6. Определение концентрации вирионов вируса ящура штамма САТ-2/Египет/2012 в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени

Для анализа использовали референтную неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма САТ-2/Египет/2012 с известным содержанием вирионов (0,500 мкг/см³) и высоким содержанием клеточного белка (более 7,00 мг/см³). В качестве положительного контроля применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура с количеством вирионов 1,00 мкг/см³. Отрицательным контролем служила не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,50-3,00 млн клеток/см³. Испытуемую пробу и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этап штаммоспецифического связывания вирионов вируса ящура, выделения из них РНК, оценки степени чистоты полученных 12х элюатов проб и контролей и проведение ОТ-ПЦР-РВ проводили так, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены на фиг. 4, 5Д и в таблице 4.

Из данных спектрограммы 12х элюата пробы РНК вируса ящура штамма САТ-2/Египет/2012 (фиг. 4, табл. 4) видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышают OD_260-262 (0,001-0,249<0,250-0,252 и 0,248-0,001<0,250-0,252), иными словами, элюат РНК характеризуется высокой степенью чистоты. Экстракт не контаминирован примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков ГТЦ, карболовой кислоты, полипептидов и крупных конгломератов, так как на спектрограмме (фиг. 4) отсутствуют выраженные пики при λ 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции (R₁) соответствует значению нормы 2,000 (OD₂₆₂/OD₂₈₀ = 0,252/0,126) и означает высокую степень чистоты элюата РНК вируса ящура и отсутствие белка и остатков карболовой кислоты после этапа выделения РНК. Коэффициент экстинкции (R₂) соответствует значению 2,000 (OD₂₆₂/OD₂₃₅ = 0,252/0,126), что соответствует норме и обуславливает высокую чистоту препарата. Таким образом, полученный препарат удовлетворяет требованиям чистоты [5, 17] и его можно использовать для дальнейших исследований.

Полученные элюаты неинактивированного вируса ящура штамма САТ-2/Египет/2012 исследовали в ОТ-ПЦР-РВ и с помощью разработанного способа сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени определили средние значения С_р для испытуемого образца и положительного контроля. Результаты исследования представлены на фиг. 5Д и в таблице 4, из которых следует, что С_{р среднее пробы} составляет 28,55±0,03, С_{р среднее К+} - 27,25±0,01. Пользуясь моделью С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446, определили значение концентрации вирионов вируса ящура, которое для положительного контроля составило 1,004±0,005 мкг/см³, что сочетается с эталонным значением (1,000 мкг/см³). В отрицательном контроле вирус ящура не обнаружен. Испытуемую пробу тестировали в ОТ-ПЦР-РВ с помощью разработанного способа и прототипа. Для испытуемой пробы количество вирионов, определенное с помощью предложенного способа, составило 0,495±0,009 мкг/см³, что коррелирует с количеством, заложенным в данный образец (0,500 мкг/см³), и с результатами метода расчета количества 146S частиц в ОТ-ПЦР-РВ по значению C_t (прототип) (0,489±0,038 мкг/см³) (табл. 4). Таким образом, представленная квадратичная модель с применением метода сравнения максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени позволяет оценивать концентрацию вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с высоким содержанием клеточных белков.

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность определения концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированной суспензии, содержащей высокое количество клеточного белка и количеством полных вирусных частиц от 0,01 до 5,00 мкг/см³. Предлагаемое изобретение сочетает осуществление штаммоспецифического анализа с последующим проведением молекулярно-биологического исследования неинактивированной суспензии культурального вируса ящура в течение 4 часов, что повышает чувствительность способа. В предлагаемом изобретении между концентрацией вирионов вируса ящура и значением максимального экстремума графика второй производной кривой накопления флуоресцентного сигнала реакции амплификации в режиме реального времени установлена зависимость, которая представлена в виде квадратичной функции С_{вирионов ВЯ} = 0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,4460 с высокой достоверностью аппроксимации R² = 0,993. Разработанная модель дает возможность оценивать значение концентрации вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье для производства вакцины.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять количество полных частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе значения максимальных экстремумов кривых реакции амплификации в режиме реального времени, рассчитанных с помощью второй производной, с последующим применением предложенной квадратичной модели.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени»

1. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Патент России №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. и др.

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант. - 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson [et al.] // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.

4. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2). - 2006. - P. 581-585.

5. Glasel J. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios // BioTechniques. - 1995. - Vol. 18 (1). - P. 62-63.

6. Holland P.M. Detection of specific PCR product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / P.M. Holland, R.D. Abramson, R. Watson, D.H. Gelfand // Proc. Natl Acad Sci USA, 1991. - V. 88. - P. 7276-7280.

7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=FMDV (дата обращения 14.07.2019).

8. Knight-Jones TJ.D. The economic impacts of FMD - What are they, how big are they and where do they occur? / TJ.D. Knight-Jones, J. Rushton // Prev. Vet. Med. - 2013. - V. 112 (3-4). - P. 161-173.

9. Liu W., Saint D.A. Validation of a quantitative method for real-time PCR kinetics // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. - V. 294. - P. 347-353.

10. Livak K.J. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction // Methods Mol. Biol., 2003. - V. 212. - P. 129-147.

11. Lubroth, J., Rodriguez, L. and Dekker, A. Vesicular diseases. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., D'Allaire, S. and Taylor, D.J., editors. Diseases of Swine. 9^th ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. - 2006. - P. 517-536.

12. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris. - 2017. - Ch. 2.1.8.

13. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.

14. Peirson S.N., Butler J.M., Foster R.G. Experimantal validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis // Nucleic Acids Res. - 2003. - V. 31:e.73.

15. Rutledge R.G. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves / R.G. Rutledge, C. Cote // Nucleic Acide Res. - 2004. - V. 31, N. 16. - e. 93. P. 1-6.

16. Saiz, M., Gomes, S., Martinez-Salas, E. and Sorbino, F. (2001). Deletion or substitution of the Aphthovirus 30 NCR abrogates infectivity and virus replication. J. Gen. Virol. - V. 82. - P. 93-101.

17. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com (дата обращения 02.06.2019). http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm.

1. Способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени, включающий следующие стадии:

- внесение в лунки с сенсибилизированными штаммоспецифическими антителами против вируса ящура по 2,4 см³ суспензий образцов и их инкубирование при температуре 37±1°С в течение 30 минут;

- штаммоспецифическое связывание вирионов вируса ящура с применением высокоочищенных поликлональных антител из штаммоспецифичных сывороток крови морских свинок против вируса ящура с формированием иммунных комплексов «вирион вируса ящура - штаммоспецифичные антитела»;

- выделение вирусной РНК из иммунных комплексов «вирион вируса ящура - штаммоспецифические антитела» с использованием метода экстракции смесью карболовой кислоты, гуанидинизотиоцианата (ГТЦ), хладона-20, этилового спирта и пропанола-2;

- оценка степени чистоты экстрактов РНК методом спектрального анализа;

- проведение реакции амплификации в режиме реального времени с использованием обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ);

- определение значений максимальных экстремумов (С_р) графиков второй производной для кривых накопления флуоресцентного сигнала в режиме реального времени;

- расчет концентрации вирионов вируса ящура в пробах неинактивированного сырья для вакцины на основе разработанной квадратичной модели зависимости количества полных вирусных частиц и значений максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в реальном времени.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сочетают проведение серологического штаммоспецифического анализа и молекулярно-биологического исследования неинактивированных суспензий культурального вируса ящура с последующим расчетом значений максимальных экстремумов кривых накопления флуоресцентного сигнала в реальном времени и определением концентрации вирионов вируса ящура.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают высокоочищенные экстракты РНК вируса ящура и осуществляют спектральный анализ степени чистоты получаемых элюатов при длинах волны от 205 до 325 нм.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смесь компонентов для проведения ОТ-ПЦР-РВ включает в свой состав следующие реагенты: Forward-3D-FMDV-, Reverse-3D-FMDV-праймеры и 3D-FMDV-ROX/BHQ2-зонд (каждый) - 15 пМ, дезоксирибоаденозинтрифосфаты (dATP) - 0,2 мМ, дезоксирибогуанозинтрифосфаты (dGTP) - 0,2 мМ, дезоксирибоцитидин-трифосфаты (dCTP) - 0,2 мМ, дезоксириботимидинтрифосфаты (dTTP) - 0,2 мМ, хлорид магния - 4 мМ, DreamTaq буфер (х10) - 10% от объема реакционной смеси, диметилсульфооксид - 3% от объема реакционной смеси, Thermus aquaticus ДНК-полимераза - 1 ед., MMLV-обратная транскриптаза - 10 ед, деионизированная вода, свободная от нуклеаз, - 56,25% от объема реакционной смеси.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ОТ-ПЦР-РВ проводят в течение 40 циклов с соблюдением следующих температурных и временных режимов:

- обратная транскрипция: 42°С в течение 900 с,

- предварительная денатурация: 95°С в течение 600 с,

- реакция амплификации:

- денатурация: 95°С в течение 18 с,

- отжиг праймеров и зонда, элонгация и аккумулирование флуоресцентного сигнала: 63°С в течение 50 с.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на основании данных графика второй производной кривой накопления флуоресцентного сигнала в процессе реакции обратной транскрипции и амплификации в режиме реального времени определяют значение максимального экстремума (С_р) и рассчитывают количество вирионов вируса ящура (С_{вирионов ВЯ}) с применением модели: С_{вирионов ВЯ}=0,0111(С_р)²-1,0157С_р+20,446.