Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации "886-84-подобных" штаммов вируса клещевого энцефалита

Авторы патента:

Сидорова Елена Александровна (RU)

Адельшин Ренат Викторович (RU)

Бондарюк Артем Николаевич (RU)

Андаев Евгений Иванович (RU)

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

Владельцы патента RU 2726420:

Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита, при этом праймеры имеют последовательности SEQ ID NO: 1-48. Изобретение может быть использовано для идентификации «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита путем амплификации и последующего секвенирования генома вируса клещевого энцефалита как в чистых культурах, так и в «микс» штаммах вируса КЭ. 11 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, вирусологии и может быть использовано для идентификации «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита (КЭ), изолированных из различных источников, путем амплификации и последующего секвенирования генома вируса.

Вирус клещевого энцефалита относится к роду Flavivirus семейства Flaviviridae. Геном вируса составляет около 11 тыс. нуклеотидов. Вирус КЭ подразделяется на три субтипа: дальневосточный, сибирский и европейский. В 1984 г. был обнаружен новый штамм - 886-84, который отличается по своим вирусологическим, серологическим и молекулярно-генетическим свойствам от штаммов трех известных субтипов (см Фиг. 1). На фиг.1. представлено филогенетическое древо вируса клещевого энцефалита на основе анализа 165 полногеномных нуклеотидных последовательностей из базы данных GenBank. Черными треугольниками объединены последовательности трех известных субтипов, штамм 886-84 показан отдельно. Древо построено в программе MEGA 5 (Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA version 5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011). Позднее из клещей Ixodes persulcatus, I. pavlovskyi, мелких млекопитающих, мозга умершего больного клещевым вирусным энцефалитом были выделены «886-84-подобные» штаммы вируса КЭ (Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Кулакова Н.В., Tungalag K., Арбатская Е.В., Миронова Л.В., Tserennorov D., Bolormaa G., Otgonbaatar D., Злобин В.И. Генетическая характеристика возбудителя клещевого энцефалита в Монголии. // Вопр. вирусол. - 2010. - Т. 55. - №3. - с. 27-32). В связи с тем, что «886-84-подобные» штаммы вируса КЭ выделены, в том числе, и из патологического материала больного, умершего от клещевого вирусного энцефалита, они являются медицински значимыми, идентификация и изучение данных штаммов, является актуальной задачей.

Наборов олигонуклеотидных праймеров для специфической идентификации группы «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ не существует.

Целью настоящего изобретения является создание набора олигонуклеотидных праймеров, позволяющих идентифицировать «886-84-подобные» штаммы путем амплификации и последующего секвенирования генома вируса.

Предлагаемый набор включает уникальные олигонуклеотидные праймеры, которые не дают перекрестных реакций с другими субтипами вируса КЭ, позволяют, ограничиваясь двухступенчатой процедурой проведения ПЦР, получить специфические продукты амплификации «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ.

Предлагаемый набор синтетических олигонуклеотидных праймеров может использоваться в учреждениях практического здравоохранения, Роспотребнадзора и в научно-исследовательских лабораториях для идентификации (выявления) «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита как в пробах клеточных культур вируса, так и в полевом и патологическом материале, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению вируса КЭ.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Предлагаемый набор содержит 48 олигонуклеотидов, комплементарных нуклеотидной последовательности полного генома «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ:

Предложенный набор для идентификации используется следующим образом:

Пример 1. Способ подбора специфичных синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поиск новых специфических праймеров осуществляли на основе полных геномов прототипных штаммов вируса КЭ, представленных в базе данных GenBank (http.//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html): дальневосточный субтип JX498940_Sofjin, сибирский субтип AF069066_Vasilchenko, европейский субтип U27495_Neudoerfl и группа «886-84» - EF469662_886-84. Все последовательности выравнивали относительно друг друга в программе BioEdit ver. 7.0.5.3 (Hall Т.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. - Nucleic Acids Symposium Series. - 1999. - №41. - pp. 95-98.) и выбирали участки генома, специфичные (97-100% гомологии) только для прототипного штамма «886-84» вируса КЭ (EF469662), но не для представителей трех известных субтипов. Для расчета GC-состава, температуры плавления праймеров и возможность образования петель в ПНР, использовали программу Oligo Analyzer (http://www.genelink.com).

Синтез олигонуклеотидных праймеров был произведен фирмой «Beagle» (г.Санкт-Петербург).

Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления генетического материала (идентификации) «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ.

Этап 1. Выделение суммарной нуклеиновой кислоты (НК) и реакция обратной транскрипции (ОТ).

Из образцов мозга сосунков беспородных белых, зараженных «886-84-подобными» штаммами вируса КЭ, готовили 10% суспензии в физиологическом растворе (0,9% хлорид натрия). Из полученных суспензий выделяли суммарную нуклеиновую кислоту сертифицированным коммерческим набором реагентов «АмплиПрайм® РИБО-преп» (ООО «НекстБио», Москва), в соответствии с инструкциями изготовителя. Таким же способом выделяется суммарная НК из патологического материала, культуры клеток и других источников.

Для обнаружения РНК ВКЭ применяли метод обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР), используя набор реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). Полученную комплементарную ДНК (кДНК) использовали для постановки ПЦР в амплификаторах с нагревающейся крышкой типа BioRad и Eppendorf.

Этап 2. Амплификация участков кДНК, перекрывающих полный геном «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ (получение продуктов ПЦР).

Амплификацию участков кДНК «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ проводили с разработанными праймерами и набором реактивов «ПЦР-РВ» («Синтол», Москва), в соответствии с инструкциями изготовителя. Каждую пару праймеров (1L/2R, 3L/4R, 5L/6R, 7L/8R, 9L/10R, 11L/12R, 13L/14R, 15L/16R, 17L/18R, 19L/20R, 21L/22R, 23L/24R, 25L/26R, 27L/28R, 29L/30R, 31L/32R, 33L/34R, 35L/36R, 37L/38R,39L/40R, 41L/42R, 43L/44R, 45L/46R, 47L/48) добавляли в отдельную пробирку с реакционной смесью (всего 24 пробирки). Таким образом, к реакционной смеси (25 мкл), включающей ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl₂, 25 mM КС1, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 1.25 е.а. Taq-ДНК-полимераза («Синтол», Москва), 5 мкл кДНК, добавляли по 0,1 мкг каждого праймера из соответствующей пары праймеров (L и R праймеры каждой пары). Отрицательный контроль ПЦР (вода вместо кДНК) проводили с каждой парой праймеров.

Температурный режим проведения ПЦР: 95°С - 30 сек.; 95°С - 10 сек., 63°С - 20 сек., 72°С - 30 сек., 5 циклов; 95°С - 10 сек., 61°С - 20 сек., 72°С - 30 сек., 30 циклов. В результате получали 24 продукта ПЦР.

Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.

Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в стандартном трис-боратном буфере (рН 8,0). 5 мкл ПЦР-продукта смешивали с 1 мкл буфера для нанесения образца (0,25% бромфеноловый синий, 40% сахароза) и вносили в лунку агарозного геля. Электрофорез проводили при напряжении 10 в/см до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 минут). Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм и документируя результат на приборе Gel Doc XR + System (США). Для оценки соответствующей длины ПЦР-продукта в последнюю лунку агарозного геля вносили генетический маркер (маркер длин фрагментов ДНК) (Thermo Scientific Ltd., Москва). На фиг. 2-10 представлены результаты визуализации (электрофореграммы) ПЦР-продуктов (фрагментов генома «886-84-подобного» штамма вируса КЭ), полученных с помощью разработанных праймеров, где 1L/2R … 47L/48R - пары праймеров; K- - отрицательный контроль, М - генетический маркер.

Длина продукта амплификации пары праймеров 1L/2R составляет 617 пар нуклеотидов (п.н.), пары праймеров 3L/4R - 586 п.н., пары праймеров 5L/6R - 499 п.н., пары праймеров 7L/8R - 578 п.н., пары праймеров 9L/10R - 591 п.н., пары праймеров 11L/12R - 470 п.н., пары праймеров 13L/14R - 591 п.н., 15L/16R - 535 п.н., пары праймеров 17L/18R - 661 п.н., пары праймеров 19L/20R - 727 п.н., пары праймеров 21L/22R - 644 п.н., пары праймеров 23L/24R - 645 п.н., пары праймеров 25L/26R - 634 п.н., пары праймеров 27L/28R - 644 п.н., пары праймеров 29L/30R - 664 п.н., пары праймеров 31L/32R - 939 п.н., пары праймеров 33L/34R - 460 п.н., 35L/36R - 665 п.н., 37L/38R - 603 п.н., 39L/40R - 475 п.н., 41L/42R - 535 п.н., 43L/44R - 621 п.н., 45L/46R - 776 п.н., 47L/48R - 679 п.н. Длины амплифицированных фрагментов соответствовали полосам генетического маркера в пределах от 400 до 950 п.н.

Этап 4. Очистка ПЦР-продуктов.

Полученные ПЦР-продукты очищали энзиматическим методом с помощью набора ExoSAP от непрореагировавших нуклеотидов и праймеров. Набор включает ферменты экзонуклеазу (Ехо - Exonuclease I) и щелочную фосфатазу (SAP - Shrimp Alkaline Phosphatase).

Состав реакционной смеси для очистки ПЦР-продукта:

ПЦР-продукт - 5 мкл.

Ехо - 0,5 мкл. (10 е.а.)

SAP - 1 мкл. (1 е.а.)

Условия проведения реакции: 37°С - 15 мин, 85°С - 15 мин.

Этап 5. Секвенирование ПЦР-продуктов фрагментов генома «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ.

Состав реакционной смеси для проведения секвенирующей реакции (10 мкл.):

BigDye™ Terminator 3.1 Ready Reaction Mix - 2 мкл.

BigDye™ Terminator v1.l & v3.1 5X Sequencing Buffer - 2 мкл.

Primer (3.2 μM) - 1 мкл.

Deionized water (RNase/DNase-free) - варьирутся.

ГЩР-продукт (5-20 ng) - варьирутся.

Условия проведения реакции:

1) денатурация: 96°С - 10 сек,

2) отжиг праймеров: 50°С - 5 сек,

3) элонгация: 60°С - 4 мин, 25 циклов.

Анализ продуктов секвенирующей реакции проводили на приборе Genetic Analyzer 3500 xL (Applied Biosystems, Япония) с помощью программы Sequencing Analysis ver. 5.4. Сборку расшифрованных фрагментов каждого штамма проводили в программе BioEdit ver. 7.0.5.3 (Hall Т.А. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. - Nucleic Acids Symposium Series. - 1999. - №41. - pp. 95-98.). Затем осуществляли сравнение анализируемой последовательности ДНК как с референсной последовательностью штамма «886-84» (номер GenBank EF469662), так и со всеми полногеномными последовательностями вируса КЭ, депонированными в базе данных GenBank, с помощью программы BLASTn в режиме «online» на сервере (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В результате была определена наибольшая степень гомологии расшифрованных нуклеотидных последовательностей со штаммом «886-84» (номер GenBank EF469662), но не с последовательностями известных субтипов вируса КЭ.

Таким образом, специфическая идентификация полных геномов «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ возможна только при получении всех 24 продуктов ПЦР и последующего секвенирования с разработанным набором олигонуклеотидных праймеров.

На фиг. 11 представлено филогенетическое древо, построенное на основе сравнения секвенированных последовательностей полных геномов исследуемых «886-84-подобных» штаммов и 171 полногеномной нуклеотидной последовательности вируса КЭ. Черными треугольниками объединены последовательности трех известных субтипов вируса КЭ из базы данных GenBank. Группа «886-84-подобных» штаммов выделена прямоугольником. Древо построено в программе MEGA 5 (Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA version 5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011).

С использованием предлагаемого набора олигонуклеотидных праймеров была проведена амплификация и секвенирование шести штаммов вируса КЭ из коллекции ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, изолированных с 1999 по 2010 гг.от иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Среди изученных штаммов два оказались «микс» штаммами, в которых ранее было определено наличие фрагментов нуклеиновой кислоты двух групп вируса КЭ: дальневосточного субтипа и группы «886-84»; сибирского субтипа и группы «886-84». С помощью предлагаемого набора праймеров удалось получить ПЦР-продукты и провести специфическую идентификацию только «886-84-подобных» штаммов в «микс» (гетерологичных) образцах.

Также для контроля специфичности предлагаемого набора олигонуклеотидных праймеров были взяты по одному штамму дальневосточного и сибирского субтипов вируса КЭ. Получить продукты амплификации для дальнейшего полногеномного секвенирования штаммов дальневосточного и сибирского субтипов вируса КЭ с помощью предлагаемого набора олигонуклеотидных праймеров не удалось.

Таким образом, разработанный набор праймеров показал высокую специфичность и универсальность при проведении ПЦР и расшифровки полногеномной нуклеотидной последовательности «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ, изолированных из различных источников (иксодовые клещи, мелкие млекопитающие). Высокий уровень специфичности установлен при наработке ПЦР-продуктов и секвенировании «микс» штаммов, в которых было определено наличие нуклеиновой кислоты двух групп вируса КЭ: дальневосточного субтипа и «886-84-подобных» штаммов; сибирского субтипа и «886-84-подобных» штаммов. Универсальность разработанных праймеров заключается в том, что получение ПЦР-продуктов, перекрывающих полный геном «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ, происходит в одном режиме амплификации.

Из вышеприведенных примеров видно, что создан набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации генетического материала «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ, изолированных из различных источников.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Federal Government Health Institution “Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East” of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers’ Rights Protection and Human Welfare)

<120> НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ «886-84-ПОДОБНЫХ» ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

<160> 48

<210> 1

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 1L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 1

agattttctt gcacgtgcgt gc 22

<210> 2

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 2R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 2

agtgagtcat cacaccatga tcc 23

<210> 3

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 3L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 3

gatgcggcaa cccaggtg 18

<210> 4

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 4R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 4

tggtagatgg agtcaagcca ca 22

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 5

actggcactc agggaaccac 20

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 6R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 6

agtctcccat ggtcaagatg gt 22

<210> 7

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 7L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 7

aagattgtgt acacagtcaa agttg 25

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 8R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 8

catgaccact gtgtcatgtc c 21

<210> 9

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 9L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 9

tgatggaacc aagtaccacc tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 10R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 10

attcctcatg ttcaggccca ac 22

<210> 11

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 11L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 11

aggcgctgca cacagtcct 19

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 12R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 12

tgggatcgag tttgtccacc a 21

<210> 13

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 13L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 13

gacttgaaat ggccatgtgg ag 22

<210> 14

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 14R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 14

ggtatcctgt tgtaccagga tc 22

<210> 15

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 15L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 15

atgaagtccg tgagaaatga cac 23

<210> 16

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 16R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 16

ctcctccgga tgacgtattc 20

<210> 17

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 17L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 17

acagactgtt ggtatgccat gg 22

<210> 18

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 18R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 18

ttctgttctc tgtgtcctcg g 21

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 19L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 19

ttggtgctgg aactgggact 20

<210> 20

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 20R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 20

agcatttctg acagcgtcca ca 22

<210> 21

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 21L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 21

cacctgacag agcttgagaa ag 22

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 22R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 22

gatgctgctg acgtaggtct 20

<210> 23

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 23L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 23

gataggggca gtgccaattg at 22

<210> 24

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 24R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 24

actggtgatt gctccattgg att 23

<210> 25

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 25L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 25

cgtatgtcaa cagacggctg 20

<210> 26

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 20R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 26

tcatcacatt gtccagagta tatgt 25

<210> 27

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 27L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 27

gctcacaggg accagacgt 19

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 28R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 28

ccaggttcct catgcatcag 20

<210> 29

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 29L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 29

gacgtgacat cagagaattc gt 22

<210> 30

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 30R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 30

ctggtggatt atgtatggtg tgaa 24

<210> 31

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 31L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 31

cagagaagca gtgatgacaa ca 22

<210> 32

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 32R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 32

gttccgtctc caggatgcc 19

<210> 33

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 33L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 33

tggacgatgc cagtggcct 19

<210> 34

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 34R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 34

cttgtcacca tctttggagt ctc 23

<210> 35

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 35L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 35

tcgcctggct tgaggaacg 19

<210> 36

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 36R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 36

cactgatcct ctcctgcaca t 21

<210> 37

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 37L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 37

atgtattact caaccgctgt cact 24

<210> 38

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 38R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 38

accacctgtt ctgctcatca ga 22

<210> 39

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 39L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 39

atgtgcagca gagaggaatt ca 22

<210> 40

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 40R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 40

tcttcatcct ctaggtctgc g 21

<210> 41

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 41L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 41

gtggagggaa taagcctgaa ct 22

<210> 42

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 42R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 42

gccatgtcat tcagaaagta gag 23

<210> 43

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 43L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 43

gtctcggaag aatgctcgtg 20

<210> 44

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 44R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 44

ttggcccact ctgccctct 19

<210> 45

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 45L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 45

cgtctggaac agggtgtgga 20

<210> 46

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 46R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 46

gtcgccactc tcactgacgt 20

<210> 47

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 47L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 47

tggaatgatg cggcagcgc 19

<210> 48

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 48R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.

<400> 48

cgggtgtttt tccgagtcac 20

<---

Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита, при этом праймеры имеют последовательности SEQ ID NO: 1-48.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ идентификации ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающем выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащей фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер; T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер; Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК из ткани домашнего осла (Equus asinus) и для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани домашнего осла (Equus asinus) со следующей нуклеотидной последовательностью: Donk F: 5'- CATATCTTAATCCCAATAATAGAC-3' - прямой праймер; Donk R: 5'- AGTATTCGTTCTGATATAGGC-3' - обратный праймер; Donk Р: РАМ-5'- ATCTTATACTGGACTATTCTATCGAC-3 -BHQ1 - зонд, при этом для обнаружения ДНК ткани домашнего осла (Equus asinus) используют флуоресцентный краситель FAM/Green.

Тест-система для выявления днк вируса нодулярного дерматита (lsdv) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // 2726242

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома возбудителя инфекционного заболевания животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец и положительный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя инфекционного заболевания животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3' - прямой праймер; T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3' - обратный праймер; Т4Р: FAM-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1 - зонд, взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и фрагмент генома вируса нодулярного дерматита (LSDV) со следующей нуклеотидной последовательностью: LSDV-F 5-ТТТAGGAGATAAGATTGTCАС-3' прямой праймер; LSDV-R 5'-GGAGATTTTATTATGAGTGGC-3' обратный праймер; LSDV-P ROX-5'-GGTTAATTTTTTACCACAAATAGG -3' -BHQ2 зонд.

Дезоксиуридинтрифосфаты, маркированные цвитерионными индоцианиновыми красителями // 2725884

Данное изобретение относится к применимым в качестве флуоресцентных меток для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР нуклеозидтрифосфатам и промежуточным соединениям для их получения.

Способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени // 2725862

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени.

Тест-система для идентификации днк тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах // 2725539

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для идентификации ДНК ткани крыс (Rattus) и мышей (Mus musculus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер, T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер, Т4Р FAM ACATTGGCACTGACCGAGTTC BHQ1 - зонд, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и крыс (Rattus) и мышей (Mus musculus) взятых в объемном соотношении 1:1:1 со следующей нуклеотидной последовательностью: Rat-F: 5'-GCCTTCCTACCATTCCTGCAT-3' - прямой праймер, Rat-R: 5'-AGGAGGTTGGCTACTAGGAT-3' - обратный праймер, Rat-P: 5'-FAM-ACGCAGCTTAACATTCCGCCCA-3'-BHQ1 - зонд, Mus-F: 5'-GTTGCTTTGTCTACTGAG-3' - прямой праймер, Mus-R: 5'-ACCTGAAACATTGGAGTA-3' - обратный праймер, Mus-P: РАМ-5'-TCGCAGTCATAGCCACAGCA-3-BHQ1 - зонд.

Способ проведения пренатальной и постнатальной генетической диагностики числовых хромосомных аномалий у эмбрионов человека и днк-микрочип на основе полнохромных днк-зондов // 2725488

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам проведения пренатальной и постанатальной генетической диагностики числовых хромосомных аномалий у эмбрионов человека и ДНК-микрочипам для их осуществления.

Способ выявления наличия мутаций, приводящих к резистентности у mycoplasma genitalium к макролидным и фторхинолоновым антибиотикам // 2725477

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретеение представляет собой способ включает в себя выделение ДНК исследуемого образца, включающего ДНК M.

Тест-система для определения днк ткани дятла (picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах // 2725216

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест систему для идентификации ДНК ткани ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью, взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и дятла (Picidae) со следующей нуклеотидной последовательностью.

Тест-система для идентификации днк ткани ежа обыкновенного (erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах // 2725215

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-систему для идентификации ДНК ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающую буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащую фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F: 5`-TACATATAAATCACGCAAAGC-3` - прямой праймер; T4R: 5`- TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3` - обратный праймер; Т4Р: НЕХ-5`-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3`-BHQ1 - зонд, взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца используют фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани ежа обыкновенного (Erinaceus europaeus) со следующей нуклеотидной последовательностью: Hed-F: 5`-AGTCTATTGATTCGAATAGAGC-3` - прямой праймер; Hed-R: 5`-CATGAGAGGTACTAACCAGT-3` - обратный праймер; Hed-P: FAM-5`-CAGGAGCTTTATTAGGTGATGATCAG-3-BHQ1 – зонд.

Способ идентификации днк ткани медведя (ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах // 2726427

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции. Для повышения точности идентификации видовой принадлежности, упрощения процесса подготовки и уменьшения его стоимости, в способе идентификации ДНК ткани медведей (Ursus) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающем выделение ДНК из ткани животного сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для животного - JOE/Yellow и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×103 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащей фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: - прямой праймер - обратный праймер - зонд, взятых в соотношении 1:1, и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК из ткани медведя (Ursus) и для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ткани медведя (Ursus) со следующей нуклеотидной последовательностью: - прямой праймер, - обратный праймер, - зонд. 5 табл.