Способ определения степени гидродинамической активации фактора фон виллебранда и устройство для его осуществления
Владельцы патента RU 2727753:
Габбасов Зуфар Ахнафович (RU)
Мельников Иван Сергеевич (RU)
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу определения степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда и устройству для осуществления данного способа. Способ заключается в том, что пропускают поток исследуемой биологической жидкости, содержащей тромбоциты и фактор фон Виллебранда, через проточную камеру с обеспечением разных скоростей пристеночного сдвига в пропускаемой жидкости, имеющих значения выше и ниже критического значения скорости пристеночного сдвига для степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда в норме, направляют лучи света снаружи на оптическую поверхность под углом падения, большим критического угла, при котором происходит полное внутреннее отражение, регистрируют потоки света, рассеянного и/или отраженного от оптической поверхности отдельно от каждого участка канала проточной камеры, сравнивают зарегистрированные значения для различных участков камеры с нормальными значениями для скорости пристеночного сдвига на соответствующем участке канала и по результатам сравнения делают вывод о степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда. Группа изобретений обеспечивает измерение степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 пр., 2 ил.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при диагностике заболеваний, связанных с патологией фактора фон Виллебранда.
Фактор фон Виллебранда - один из основных белков свертывающей системы крови, принимает непосредственное участие в обеспечении гемостаза. Известны заболевания, связанные с количественной или качественной патологией фактора фон Виллебранда. Ослабление способности молекул фактора фон Виллебранда связываться с тромбоцитами, дефицит синтеза или усиление протеолиза приводят к спонтанным кровотечениям, например при спектре заболеваний, известных как болезни Виллебранда, или к криптогенным желудочно-кишечным кровотечениям, как при синдроме Heyde. В то же время, патологическое повышение активности фактора фон Виллебранда, связанное с накоплением в крови его высокомолекулярных мультимеров или снижением порога гидродинамической активации фактора фон Виллебранда, приводят к развитию тромбозов, например, при тромботической тромбоцитопенической пурпуре или ишемической болезни сердца.
Исследование Schneider S.W. и соавт. (Schneider S.W. et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers. PNAS, May 2007, vol. 104, no. 19, p. 7899-7903, www.pnas.org cgi doi 10.1073 pnas.0608422104) показало, что молекулы фактора фон Виллебранда активируются в условиях потока, то есть способны к гидродинамической активации, и многократно увеличивают свои гемостатические свойства при высоких скоростях сдвига. При этом происходит изменение конформации молекул фактора фон Виллебранда с глобулярной на фибриллярную, в результате чего открываются места связывания фактора фон Виллебранда с тромбоцитами, коллагеном, металлопротеиназой ADAMTS13. В норме пороговая скорость сдвига, при которой происходит гидродинамическая активация фактора фон Виллебранда, составляет около 5000 с-1. В случае патологии значения скорости сдвига, необходимые для активации фактора фон Виллебранда, могут отличаться как в меньшую, так и в большую сторону. Скорости сдвига выше 5000 с-1 характерны для мест повреждения сосудистой стенки и стенозов, но не для интактных артерий и артериол, где скорости сдвига значительно ниже. Используя микрофлюидное устройство, авторы визуализировали конформационные изменения фактора фон Виллебранда в условиях высоких скоростей сдвига. Они обнаружили, что фактор фон Виллебранда обратимо изменяет конформацию с глобулярной на фибриллярную при скоростях сдвига выше пороговых, даже при отсутствии адгезивной поверхности. В связи с этим, в статических условиях или условиях с низкими скоростями сдвига ключевая роль в адгезии тромбоцитов принадлежит фибриногену. При повышении скорости сдвига выше критической на первый план выходит влияние на адгезию тромбоцитов фактора фон Виллебранда.
Известны способы исследования активности фактора фон Виллебранда и адгезии тромбоцитов в потоке. Согласно описанию Rand M.L. с соавт. (Rand M.L. et al. Use of the PFA-100 in the Assessment of Primary, Platelet-Related Hemostasis in a Pediatric Setting. Seminars in Thrombosos and Hemostasis - vol. 24, no. 6, 1998, p. 523-529), PFA-100, PFA-200 (Platelet function analyzer - 100, компания Siemens) - система, предназначенная для исследования функции тромбоцитов в цельной крови. PFA-200 не имеет отличий от PFA- 100 по принципу работы. В PFA-100 симулируется повреждение стенки сосуда малого диаметра. PFA-100 состоит из системы для регистрации результатов исследования и одноразовых картриджей, в которых выполняется исследование. Основной частью картриджа, в которой происходит активация тромбоцитов и образование микротромба, является полипропиленовая чаша. Внутри чаши расположена нитроцеллюлозная мембрана, делящая чашу примерно пополам. В мембране выполнено центральное отверстие диаметром 150 мкм. Нижняя поверхность мембраны покрыта либо 2 мкг лошадиного коллагена I типа с 10 мкг эпинефрина битартрата, или 50 мкг аденозина дифосфата, либо 5 нг простагландина Е1 с 20 мкг аденозина дифосфата. С одной стороны (нижней) в чашу входит стальной капилляр с внутренним диаметром 200 мкм. Капилляр опускается в полиэтиленовый резервуар, содержащий исследуемый образец крови. С другой стороны (верхней) к чаше присоединяется шприцевой насос для создания вакуума. Исследование выполняется следующим образом. Образец крови объемом 0.8 мл, содержащей цитрат натрия в качестве антикоагулянта, помещается в полиэтиленовый резервуар и затем помещается в систему PFA-100, где нагревается до температуры 37°С. В начале исследования вакуумный отсос помещается с верхней стороны полипропиленовой чаши. Постоянный вакуум с давлением 4 кПа ниже атмосферного давления обеспечивается оттягивающим движением поршня шприцевого насоса. Действие вакуума вызывает ток крови из резервуара с исследуемым образцом по стальному капилляру в чашу, где тромбоциты крови входят в контакт с нижней поверхностью мембраны, покрытой вышеуказанными активирующими веществами, и направляются вместе с током крови к отверстию в мембране. С учетом диаметра отверстия и объема проходящей через отверстие крови в единицу времени, расчетные скорости сдвига в отверстии мембраны составляют 5000-6000 с-1. Проходящие с током крови через отверстие мембраны тромбоциты адгезируют к коллагену, покрывающему нижнюю поверхность мембраны непосредственно у отверстия мембраны. Адгезировавшие тромбоциты обеспечивают необходимый субстрат для следующего этапа - аггрегации тромбоцитов с образованием тромба, который закупоривает отверстие. PFA-100 измеряет время от начала теста до закрытия отверсия (closure time). Чувствительность метода в значительной мере зависит от гематокрита, количества тромбоцитов, нарушений функции тромбоцитов. На конечный результат (время до закрытия отверстия) влияет совокупность факторов, и определить непосредственно величину вклада гидродинамической активации фактора фон Виллебранда при помощи PFA-100 невозможно.
Известны способы исследования способности фактора фон Виллебранда связывать гликопротеиновый рецептор GPIb тромбоцитов в статических условиях. К ним относится ристоцетин-кофакторный анализ, который используется для исследования способности плазмы крови агглютинировать тромбоциты в присутствии антибиотика ристоцетина. Используется плазма крови обследуемого пациента, в которую добавляют фиксированные формальдегидом или замороженные донорские тромбоциты. Затем в плазму крови добавляют ристоцетин, который связывает гликопротеиновый рецептор GPIb с фактором фон Виллебранда (участок Glu1239-Pro-Gly Gly1242). Диапазоном нормальных значений для ристоцетин-кофакторного метода считается 50-150 единиц/дл. Значения ниже референсных могут говорить о дефекте тромбоцитарных рецепторов GP lb или низкой концентрации фактора фон Виллебранда. Значения выше референсных могут говорить о высокой концентрации фактора фон Виллебранда.
Также используют вариации ристоцетин-кофакторного анализа, когда с целью исключения вариабельности, связанной с индивидуальными особенностями тромбоцитов и их GPIb рецепторов, в пробу плазмы крови добавляют латексные микрочастицы с конъюгированными рекомбинантыми рецепторами GPIb. При добавлении ристоцетина в пробу происходит связывание рекомбинантных GPIb с фактором фон Виллебранда, что приводит к агглютинации латексных микрочастиц. Кроме того, применяют микрочастицы с конъюгированными рекомбинантными GPIb рецепторами с усилением функции, реагирующими с фактором фон Виллебранда в плазме крови в отсутствие ристоцетина.
Перечисленные способы отличаются высокой вариабельностью результатов и не измеряют физиологическую функцию фактора фон Виллебранда, так как реакция происходит в статических условиях, при которых фактор фон Виллебранда физиологически неактивен, а связывание рецептора GPIb тромбоцитов происходит не с их естественным лигандом на факторе фон Виллебранда, а с лигандом ристоцетина, либо с рекомбинантным GPIb с усилением функции.
Техническая проблема, решаемая изобретением, заключается в создании методики количественной оценки степени активации и функции фактора фон Виллебранда в крови.
Технический результат, полученный в изобретении, заключается в обеспечении измерения степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда.
Технический результат достигается способом определения степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда, заключающимся в том, что пропускают поток исследуемой биологической жидкости, содержащей тромбоциты и фактор фон Виллебранда, через проточную камеру, имеющую канал с изменяющейся по длине площадью поперечного сечения с обеспечением разных скоростей пристеночного сдвига в пропускаемой жидкости, имеющих значения выше и ниже критического значения скорости пристеночного сдвига для степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда в норме, при этом проточная камера имеет стенку, выполненную из оптического материала с адгезивным покрытием на внутренней поверхности стенки, обеспечивающим адгезию тромбоцитов, направляют лучи света снаружи на оптическую поверхность - границу между оптическим материалом и потоком жидкости - на участках камеры с разными площадями поперечного сечения канала под углом падения большим критического угла, при котором происходит полное внутреннее отражение, регистрируют потоки света, рассеянного и/или отраженного от оптической поверхности отдельно от каждого участка канала проточной камеры, сравнивают зарегистрированные значения для различных участков камеры с нормальными значениями для скорости пристеночного сдвига на соответствующем участке канала и по результатам сравнения делают вывод о степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда.
При этом в случае, когда зарегистрированное значение потока света на участке со скоростью пристеночного сдвига ниже критического значения превышает нормальные значения потока света, делают вывод о повышенной степени гидравлической активации фактора фон Виллебранда.
В случае же, когда нормальные значения потока света превышают зарегистрированное значение потока света на участке со скоростью пристеночного сдвига выше критического значения, делают вывод о снижении степени и/или отсутствии гидравлической активации фактора фон Виллебранда.
В одном варианте осуществления способа можно использовать проточную камеру, канал которой имеет два или более участка с разным поперечным сечением.
В другом варианте можно использовать проточную камеру, канал которой имеет непрерывно уменьшающееся поперечное сечение в направлении от входа к выходу.
Кроме того, в качестве адгезивного покрытия, обеспечивающего адгезию тромбоцитов, предпочтительно использовать покрытие из адгезивного белка.
Технический результат также достигается устройством для определения степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда, содержащим средство подачи биологической жидкости, проточную камеру, имеющую канал с изменяющейся по длине площадью поперечного сечения и стенку, выполненную из оптического материала с адгезивным покрытием на внутренней поверхности стенки, обеспечивающим адгезию тромбоцитов, источник света, выполненный с возможностью направления лучей света снаружи на внутреннюю поверхность стенки из оптического материала с адгезивным покрытием на участках камеры с разными площадями поперечного сечения канала,
и фоточувствительные элементы для регистрации потоков света, рассеянных и/или отраженных от указанной поверхности стенки отдельно от каждого участка канала проточной камеры.
В одном варианте выполнения устройства проточная камера может иметь канал с двумя или более участками с разным поперечным сечением.
В другом варианте проточная камера может иметь канал с непрерывно уменьшающимся поперечным сечением в направлении от входа к выходу.
Кроме того, адгезивное покрытие, обеспечивающее адгезию тромбоцитов, предпочтительно выполнять из адгезивного белка.
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 показана схема предложенного устройства, вариант с каналом проточной камеры, имеющей участки с разной площадью поперечного сечения.
На фиг. 2 - проточная камера с непрерывно уменьшающейся площадью поперечного сечения канала проточной камеры.
Устройство для определения степени активации фактора фон Виллебранда содержит средство подачи биологической жидкости, включающее емкость 1 с биологической жидкостью и насос 2 (фиг. 1). Проточная камера 3 имеет канал 4 для прокачки исследуемой биологической жидкости с переменной площадью поперечного сечения. На фиг. 1 показана проточная камера 3, канал 4 которой имеет два участка с разным поперечным сечением. На фиг. 2 показана проточная камера 4, поперечное сечение канала 4 которой непрерывно, плавно уменьшается в направлении от входа к выходу из канала 4 проточной камеры 3. Канал 4 имеет предпочтительно прямоугольное сечение. Ширина канала 4 является постоянной по всей его длине, а высота канала 4 изменяется ступенчато или непрерывно. Возможно выполнение канала 4 с постоянной высотой по длине и изменяющейся шириной, либо изменяющимися могут быть и высота, и ширина канала 4.
Стенка 5 проточной камеры 4 выполнена из оптического материала, предпочтительно из стекла, но может быть также выполнена из прозрачного пластика. Внутренняя оптическая поверхность стенки 5 является адгезивной поверхностью 6, обладающей свойством адгезии тромбоцитов. Со стороны стенки 5 установлены источник 7 света и фоточувствительные элементы 8.
Способ определения степени активации фактора фон Виллебранда осуществляется следующим образом. Для исследования используется биологическая жидкость, под которой подразумевают цельную кровь, плазму крови, суспензии клеток и белков крови. В случае исследования крови у человека отбирают пробу крови в пробирку с антикоагулянтом, например цитратом натрия или гирудином. При необходимости получения плазмы крови выполняют центрифугирование пробы согласно стандартным протоколам. Пробу крови помещают в емкости 1 - резервуаре из инертного материала, например, полипропилена. Объем пробы крови необходим такой, чтобы обеспечить непрерывную циркуляцию крови в течение всего исследования и определяется емкостью системы трубок устройства, через которые прокачивается кровь, однако объема 1 стандартной пробирки (3,4-4,2 мл) достаточно для исследования. Движение крови по системе трубок обеспечивается насосом 2, например, перистальтическим или мембранным насосом. Насос 2 обеспечивает непрерывную прокачку крови из емкости 1 в проточную камеру 3 и снова в емкость 1, обеспечивая циркуляцию пробы. Управляя работой насоса 2, можно изменять скорость расхода жидкости. По системе трубок кровь поступает из емкости 1 в проточную камеру 3. В проточной камере 3 выполнен канал для гидродинамической активации фактора фон Виллебранда. Скорость пристеночного сдвига (у) в жидкости, прокачиваемой через канал 4 проточной камеры 3, рассчитывается по формуле (1):
где Q - расход жидкости в единицу времени, W - ширина канала 4 проточной камеры 3, Н - высота канала 4 проточной камеры 3. Например, при расходе жидкости (Q) 0,025 см /с, ширине канала 4 (W) 0,3 см, высоте канала 4 (Н) 0,01 см рассчитанная по формуле 1 скорость пристеночного сдвига (γ) составит 5000 с-1.
Следовательно, в зависимости от нужд исследователя, скорость сдвига в канале 4 проточной камеры 3 можно изменять. Во-первых, скорость сдвига в канале 4 проточной камеры 3 можно изменять, управляя расходом жидкости с помощью насоса 2. Во-вторых, с целью создания нарастающей скорости сдвига канал 4 проточной 3 камеры имеет два или более последовательно расположенных по направлению потока участка с разной площадью поперечного сечения (фиг. 1), или имеет форму с непрерывно уменьшающейся площадью поперечного сечения (фиг. 2). Например, площадь поперечного сечения рассчитана так, что в первой части канала 4 скорость пристеночного сдвига, рассчитанная по формуле 1, составляет 3000 с-1, а в каждой последующей части канала 4 возрастает на 2000 с-1, при одной и той же скорости расхода жидкости. Таким образом, в канале 4 одной проточной камеры 3 можно исследовать гидродинамическую активацию фактора фон Виллебранда при разных последовательно нарастающих скоростях сдвига.
Адгезия тромбоцитов происходит на адгезивной поверхности 6 стенки 5 из оптического материала с одной стороны канала 4 проточной камеры 3. В качестве оптического материала может быть использовано, например, минеральное стекло марки Ml. Адгезивная поверхность 6 должна обеспечивать адгезию тромбоцитов и не препятствовать взаимодействию луча света, проходящего через оптический материал, с тромбоцитами. Такая адгезивная поверхность может быть образована покрытием из адгезивного белка, такого как, например, фибриноген, или коллаген, или фибронектин, или иным покрытием или обработкой поверхности, способной обеспечивать адгезию тромбоцитов. Адгезия тромбоцитов на адгезивную поверхность 6 в условиях потока зависит от гидродинамической активации фактора фон Виллебранда. На том участке или участках канала 4, где развивается скорость пристеночного сдвига, при которой в исследуемой пробе происходит гидродинамическая активация фактора фон Виллебранда, будет происходить интенсивная адгезия тромбоцитов на адгезивную поверхность 6 стенки 5 из оптического материала. На том участке или участках канала 4, где скорость пристеночного сдвига не достигает величины, необходимой для гидродинамической активации фактора фон Виллебранда, будет происходить слабо выраженная адгезия тромбоцитов на адгезивную поверхность 6 стенки 5 из оптического материала.
Для измерения адгезии тромбоцитов регистрируется свет, отраженный и/или рассеянный от адгезировавших тромбоцитов. На каждом участке канала 4 луч света поступает отдельно из источника света 7, проходит через оптический материал стенки 5 и падает на оптическую поверхность - границу оптических сред, представленных оптическим материалом стенки 5 и прокачиваемой через канал 4 проточной камеры 3 жидкостью, под углом падения выше критического. Критической угол падения, при котором выполняется закон полного внутреннего отражения, вычисляется по формуле (2):
где θс - критический угол падения, n2 - коэффициент преломления светоотражающей среды, n1 - коэффициент преломления светопропускающей среды.
Критический угол падения будет зависеть от коэффициента преломления оптического материала (светопропускающая среда) и коэффициента преломления биологической жидкости - цельной крови/плазмы крови (светопреломляющая среда). Например, коэффициент преломления стекла марки M1 составляет 1,514, а плазмы крови 1,348. Согласно формуле 2, критический угол падения (θс) составит 62,92°.
В случае, если угол падения луча света оказывается больше θс, проходящий через светопропускающую среду свет полностью отражается от границы оптических сред. Тем не менее, свет проникает через границу оптических сред приблизительно на 
длины волны. Плотно адгезировавшие к оптической поверхности тромбоциты оказываются в пределах проникновения света и взаимодействуют с ним, в результате чего свет частично рассеивается от границы оптических сред, а частично отражается. Чем больше тромбоцитов адгезирует на оптическую поверхность, тем больше света из луча рассеивается, и тем меньше отражается. Отраженный и/или рассеянный свет от каждого участка канала 4 регистрируется фоточувствительными элементами 8, которые преобразуют интенсивность светового потока в силу электрического тока. Изменением в силе электрического тока, преобразованного из отраженного и/или рассеянного от адгезировавших тромбоцитов света, измеряется интенсивность адгезии тромбоцитов. Чем меньше сила тока от фоточувствительного элемента 8, регистрирующего отраженный от границы оптических сред свет, и/или чем больше сила тока от фоточувствительного элемента 8, регистрирующего рассеянный от границы оптических сред свет, тем интенсивнее адгезия тромбоцитов.
Так как канал 4 проточной камеры 3 имеет два или более последовательно расположенных участка с разной площадью поперечного сечения, или имеет форму с постоянно уменьшающейся площадью поперечного сечения, для каждого отдельного участка предусмотрены отдельные фоточувствительные элементы 8, одновременно регистрирующие интенсивность отраженного и/или рассеянного света.
Величина гидродинамической активации фактора фон Виллебранда измеряется в регистрируемой силе тока (Ампер), преобразуемого фоточувствительными элементами из отраженного и/или рассеянного света. За норму принимается диапазон значений, полученных от группы здоровых добровольцев. Например, диапазоном нормальных значений для скорости пристеночного сдвига 1000 с-1 является 1,5-4 мА. Диапазоном нормальных значений для скорости пристеночного сдвига 5000 с-1 является 14-22,5 мА. Получение в результате исследования значения выше нормального диапазона указывают на усиление гидродинамической активации фактора фон Виллебранда при данной скорости пристеночного сдвига, ниже диапазона нормальных значений - на ослабление гидродинамической активации фактора фон Виллебранда или отсутствие фактора фон Виллебранда в пробе.
Осуществление предложенного способа с использованием предложенного устройства иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Пример 1. Обследовался здоровый доброволец без патологии фактора фон Виллебранда. В пробирку с 3,2% цитратом натрия отобрано 3,2 мл крови. В течение 1 часа кровь помещена в приемный резервуар - емкость 1. Проточная камера 3 подключена к системе трубок, оптическая поверхность сориентирована по направлению к лучу источника 7 света. Активирован насос 2. Скорость расхода жидкости (Q) установлена такой, чтобы согласно формуле (1) на одном из двух или более участков канала 4 с разной площадью поперечного сечения скорость пристеночного сдвига (γ) при прокачивании жидкости была 3000 с-1, а в другой - 6000 с-1 (ниже и выше критического значения 5000 с-1 для гидродинамической активации фактора фон Виллебранда в норме, соответственно).
Получены результаты: на участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 3000 с-1 фоточувствительными элементами 8 зарегистрирована сила электрического тока 2,5 мА. Это свидетельствует о том, что при данной скорости сдвига в пробе не происходит гидродинамической активации фактора фон Виллебранда. На участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 6000 с-1 фоточувствительными элементами зарегистрирована сила электрического тока 16 мА. Это соответствует известным данным о том, что гидродинамическая активация фактора фон Виллебранда в норме происходит при скоростях пристеночного сдвига выше 5000 с-1.
Пример 2. Обследовался пациент с тромботической тромбоцитопенической пурпурой. При этом заболевании образуются молекулы фактора фон Виллебранда, активные даже при низких скоростях пристеночного сдвига, что приводит к образованию тромбов в сосудах. В пробирку с 3,2% цитратом натрия отобрано 3,2 мл крови. В течение
1 часа кровь помещена в приемный резервуар - емкость 1. Проточная камера 3 подключена к системе трубок, оптическая поверхность сориентирована по направлению к лучу источника 7 света. Активирован насос 2. Скорость расхода жидкости (Q) установлена такой, чтобы согласно формуле (1) на одном из двух или более участков канала 4 с разной площадью поперечного сечения скорость пристеночного сдвига (у) при прокачивании жидкости была 3000 с-1, а в другой - 6000 с-1.
Получены результаты: в части канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 3000 с-1 фоточувствительными элементами 8 зарегистрирована сила электрического тока 32 мА. На участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 6000 с-1 фоточувствительными элементами 8 зарегистрирована сила электрического тока 46 мА. Это соответствует известным данным о том, что при тромботической тромбоцитопенической пурпуре гидродинамическая активация фактора фон Виллебранда происходит при скоростях пристеночного сдвига ниже 5000 с-1.
Пример 3. Обследовался пациент с синдромом Heyde. У пациентов с этим заболеванием присутствует выраженный стеноз (сужение) аортального клапана, где возникают очень высокие скорости сдвига. Это приводит к гидродинамической активации фактора фон Виллебранда и его расходу. В результате у таких пациентов фактор фон Виллебранда становится неактивен даже при высоких скоростях сдвига, так как уже был израсходован в месте стеноза аортального клапана. Клинически это проявляется склонностью пациента к кровотечениям, например, из желудочно-кишечного тракта. В пробирку с 3,2% цитратом натрия отобрано 3,2 мл крови. В течение 1 часа кровь помещена в приемный резервуар - емкость 1. Проточная камера 3 подключена к системе трубок, оптическая поверхность сориентирована по направлению к лучу источника 7 света. Активирован насос 2. Скорость расхода жидкости (Q) установлена такой, чтобы согласно формуле (1) на одном из двух или более участков канала 4 с разной площадью поперечного сечения скорость пристеночного сдвига (у) при прокачивании жидкости была 3000 с-1, а в другой - 6000 с-1.
Получены результаты: на участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 3000 с-1 фоточувствительными элементами 8 зарегистрирована сила электрического тока 2 мА. На участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 6000 с-1 фоточувствительными элементами 4 зарегистрирована сила электрического тока 5 мА. Это свидетельствует о том, что в исследуемой пробе степень гидравлической активации фактора фон Виллебранда резко снижена.
При хирургическом лечении стеноза аортального клапана, когда восстанавливаются нормальные размеры просвета аортального клапана, устраняются высокие скорости сдвига в этом месте. В результате фактор фон Виллебранда перестает активироваться и расходоваться, его концентрация и функция в крови возвращаются к норме.
Исследовалась кровь того же пациента с синдромом Heyde после хирургического лечения стеноза аортального клапана.
Получены результаты: на участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 3000 с-1 фоточувствительными элементами 8 зарегистрирована сила электрического тока 4 мА. На участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 6000 с-1 фоточувствительными элементами зарегистрирована сила электрического тока 15 мА. Это свидетельствует о степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда в пределах нормы и о восстановлении нормальной функции фактора фон Виллебранда (фиг. 5).
Пример 4. Обследовался пациент с болезнью Виллебранда 3 типа. У пациентов с этим заболеванием в крови отсутствует фактор фон Виллебранда. В пробирку с 3,2% цитратом натрия отобрано 3,2 мл крови. В течение 1 часа кровь помещена в приемный резервуар - емкость 1. Проточная камера 3 подключена к системе трубок, оптическая поверхность сориентирована по направлению к лучу источника 7 света. Активирован насос 2. Скорость расхода жидкости (Q) установлена такой, чтобы согласно формуле (1) на одном из двух или более участков канала 4 с разной площадью поперечного сечения скорость пристеночного сдвига (γ) при прокачивании жидкости была 3000 с-1, а в другой -6000 с'1.
Получены результаты: на участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 3000 с-1 фоточувствительными элементами 8 зарегистрирована сила электрического тока 2 мА. На участке канала 4 со скоростью пристеночного сдвига 6000 с-1 фоточувствительными элементами 4 зарегистрирована сила электрического тока 2 мА. Нахождение зарегистрированных значений силы тока ниже нормальных значений и отсутствие изменений в регистрируемой силе тока на участках канала со скоростью пристеночного сдвига выше и ниже критической для гидродинамической активации фактора фон Виллебранда свидетельствует об отсутствии гидродинамической активации фактора фон Виллебранда.
1. Способ определения степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда, заключающийся в том, что
пропускают поток исследуемой биологической жидкости, содержащей тромбоциты и фактор фон Виллебранда, через проточную камеру, имеющую канал с изменяющейся по длине площадью поперечного сечения с обеспечением разных скоростей пристеночного сдвига в пропускаемой жидкости, имеющих значения выше и ниже критического значения скорости пристеночного сдвига для степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда в норме,
при этом проточная камера имеет стенку, выполненную из оптического материала с адгезивной поверхностью, обеспечивающей адгезию тромбоцитов,
направляют лучи света снаружи на оптическую поверхность - границу между оптическим материалом и потоком жидкости - на участках камеры с разными площадями поперечного сечения канала под углом падения, большим критического угла, при котором происходит полное внутреннее отражение,
регистрируют потоки света, рассеянного и/или отраженного от оптической поверхности отдельно от каждого участка канала проточной камеры, сравнивают зарегистрированные значения для различных участков камеры с нормальными значениями для скорости пристеночного сдвига на соответствующем участке канала и по результатам сравнения делают вывод о степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда.
2. Способ по п. 1, по которому в случае, когда зарегистрированное значение потока света на участке со скоростью пристеночного сдвига ниже критического значения превышает нормальные значения потока света, делают вывод о повышенной степени гидравлической активации фактора фон Виллебранда.
3. Способ по п. 1, по которому в случае, когда нормальные значения потока света превышают зарегистрированное значение потока света на участке со скоростью пристеночного сдвига выше критического значения, делают вывод о пониженной степени или об отсутствии гидравлической активации фактора фон Виллебранда.
4. Способ по п. 1, по которому используют проточную камеру, канал которой имеет два или более участка с разным поперечным сечением.
5. Способ по п. 1, по которому используют проточную камеру, канал которой имеет непрерывно уменьшающееся поперечное сечение в направлении от входа к выходу.
6. Способ по п. 1, по которому в качестве адгезивной поверхности, обеспечивающей адгезию тромбоцитов, предпочтительно используют покрытие из адгезивного белка.
7. Устройство для определения степени гидродинамической активации фактора фон Виллебранда, содержащее
средство подачи биологической жидкости,
проточную камеру, имеющую канал с изменяющейся по длине площадью поперечного сечения и стенку, выполненную из оптического материала с адгезивной поверхностью, обеспечивающей адгезию тромбоцитов,
источник света, выполненный с возможностью направления лучей света снаружи на внутреннюю поверхность стенки из оптического материала с адгезивным покрытием на участках камеры с разными площадями поперечного сечения канала,
и фоточувствительные элементы для регистрации потоков света, рассеянных и/или отраженных от указанной поверхности стенки отдельно от каждого участка канала проточной камеры.
8. Устройство по п. 7, в котором проточная камера имеет канал с двумя или более участками с разным поперечным сечением.
9. Устройство по п. 7, в котором проточная камера имеет канал с непрерывно уменьшающимся поперечным сечением в направлении от входа к выходу.
10. Устройство по п. 7, в котором адгезивная поверхность, обеспечивающая адгезию тромбоцитов, предпочтительно образована покрытием из адгезивного белка.
