Способ ранней диагностики отторжения трансплантата

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, трансплантологии, и может быть использовано для ранней диагностики отторжения трансплантата. Изобретение включает использование иммуногистохимического исследования, фотографирование гистологического среза фрагмента пересаженного органа, определение показателей с помощью ЭВМ. На фотографии выявляют клетки - Т и В лимфоциты, макрофаги и компоненты комплемента C3d и C4d. Затем на ЭВМ с помощью инструмента «ручное выделение» определяют общую площадь среза (S), суммарную площадь выявленных клеток и компонентов комплемента (m) и при значении средней плотности выявленных клеток и компонентов комплемента на 1 мм² в %: K = (m/S)⋅100%. до 0,9% определяют отсутствие отторжения, 1,0-2,9% - легкое отторжение, 3,0-5,0% - умеренное отторжение и при значении более 5,0% - тяжелое отторжение. Способ обеспечивает возможность ранней диагностики отторжения трансплантированных органов за счет иммуногистохимического исследования, снижение времени, необходимого для диагностики реакции отторжения, за счет применения программы ЭВМ, уменьшения количества субъективных ошибок и повышение диагностической точности за счет автоматизированной обработки фотографии. 6 пр.

 

Предполагаемое изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, трансплантологии, и может быть использовано для выявления и предупреждения реакции отторжения пересаженных органов.

Трансплантация органов широко применяется в мире как способ радикального лечения пациентов в терминальной стадии органной недостаточности (Kaye D.M. et al., 2019). Отторжение пересаженного органа - проблема, с которой сталкиваются все реципиенты на разных этапах после операции. Своевременная диагностика реакции отторжения позволяет скорректировать иммуносупрессивную терапию и предотвратить потерю трансплантата и ухудшение состояния здоровья реципиента.

Способом ранней диагностики процесса отторжения является иммуногистохимическое исследование биоптата пересаженного органа (Adam В. et al., 2015). От точности и информативности результатов иммуногистохимического исследования зависит качество и продолжительность жизни пациента (Abramoff M.D. et al., 2018). В связи с этим целесообразно введение морфометрического анализа в патогистологическую диагностику отторжения пересаженных органов, что позволит за короткий срок дать количественную характеристику процесса отторжения и с высокой точностью установить ее степень тяжести, а, значит, и необходимые меры по ее купированию.

В частности, известен способ диагностики реакции отторжения трансплантата, основанный на ручной морфометрической оценке гистологических препаратов трансплантированных органов после иммуногистохимической реакции, дающий возможность получить количественную характеристику реакции отторжения с последующим установлением ее степени тяжести (Н.Н. Бабенко, А.К. Зокоев, М.М. Морозова, М.М. Каабак. Микроморфометрический анализ почечных аллотрансплантатов в зависимости от способа восстановления мочевых путей. Альманах клинической медицины. 2005. №8-4. С. 10-18.). Сущностью способа является применение линейки-микрометра, накладываемой поверх фотографии гистологического среза биоптата трансплантированного органа в программе для ЭВМ Adobe Photoshop (версия 7.0, Adobe, 2005). Определение размеров клеток - Т и В лимфоцитов и макрофагов - проводится вручную с помощью делений линейки, после чего определяется среднее число клеток в поле зрения. На основании количества клеток врач-патологоанатом делает заключение о наличии/отсутствии реакции отторжения и ее тяжести. Основными недостатками данного способа является значительное время, затрачиваемое на характеристику одного гистологического среза, а также сравнительно низкая точность и информативность метода, связанная с субъективными причинами и неравномерным распределением клеток в срезе ткани.

За ближайший аналог принят способ диагностики реакции отторжения, предложенный Vatazin A.V. и соавт. (Vatazin A.V., Valov A.L., Vasilenko I.A., Shcherbakova E.O., Metelin V.B. Computer morphometry of lymphocytes in the diagnosis of chronic transplant nephropathy. Ter Arkh. 2010; 82(6):46-9.). Способ включает в себя определение показателей с помощью программы для ЭВМ CellProfiler (Carpenter АЕ [et al.] (2006) CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology 7: R100). Сущностью способа является фотографирование гистологического среза ткани трансплантата после проведения иммуногистохимической реакции и последующая обработка фотографии с помощью ЭВМ в программе CellProfiler: бинаризация изображения по яркости, количественный подсчет Т и В лимфоцитов и макрофагов в границах фотографии. После обработки изображения программа представляет результаты в виде таблицы, а врач патологоанатом, анализируя эти результаты, делает заключение о наличии/отсутствии реакции отторжения и ее тяжести. Основными недостатками данного способа служит значительная длительность и трудоемкость, а также сравнительно низкая точность результатов исследования.

Задачи: сокращение времени, необходимого для диагностики реакции отторжения трансплантата, повышение точности и информативности биопсийной диагностики, а также уменьшения числа ошибок, связанных с субъективным фактором.

Сущностью изобретения является фотографирование гистологического среза, определение показателей с помощью ЭВМ, выявление на фотографии Т и В лимфоцитов, макрофагов и компонентов комплемента C3d и C4d, затем на ЭВМ с помощью инструмента «ручное выделение» - определение общей площади среза (s), суммарной площади выявленных клеток и компонентов комплемента (m) и средней плотности выявленных клеток и компонентов комплемента на 1 мм² в % . При условии значения К до 0,9% определяют отсутствие отторжения, 1,0-2,9% - легкое отторжение, 3,0-5,0% - умеренное отторжение и при значении более 5,0% - тяжелое отторжение.

Техническим результатом является способ ранней диагностики отторжения трансплантированных органов, с помощью которого за счет применения программы ЭВМ снижается время, необходимое для диагностики реакции отторжения, а за счет автоматизированной обработки фотографии уменьшается количество субъективных ошибок и повышается диагностическая точность. Способ диагностики отторжения трансплантата апробирован на 227 пациентах в течение 4 лет. Достигнуто снижение времени, необходимого для диагностики каждого случая отторжения, на 35%, а также снижение числа субъективных ошибок диагностики на 32%.

Способ ранней диагностики отторжения трансплантата осуществляют следующим образом: после получения фрагмента ткани пересаженного органа его фиксируют 10% раствором формалина, проводят в парафин, изготавливают срезы с помощью микротома, проводят иммуногистохимическую реакцию для определения Т и В лимфоцитов, макрофагов, компонентов комплемента C3d и C4d, используя стрептавидин-пероксидазную систему детекции. Затем осуществляют фотографирование получившегося гистологического среза, определение показателей с помощью программы для ЭВМ ImageJ (Schneider С.А.; Rasband W.S. & Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. - 2012. - Vol. 9(7). - P. 671-675): на фотографии выявляют T и В лимфоциты, макрофаги и компоненты комплемента C3d и C4d после проведения бинаризации изображения по цвету и выставления порога чувствительности во вкладке «Цвет», затем на ЭВМ в программе ImageJ с помощью инструмента «ручное выделение» из главного меню интерфейса определяют общую площадь среза (S) и площадь выявленных клеток и компонентов комплемента (m). Используя инструмент «анализатор частиц», находят среднюю плотность выявленных клеток и компонентов комплемента на 1 мм² в % (К) по формуле . При условии значения К до 0,9% определяют отсутствие отторжения, 1,0-2,9% - легкое отторжение, 3,0-5,0% - умеренное отторжение и при значении более 5,0% - тяжелое отторжение.

Примеры:

1) Пациентка М, 45 лет. Выполнена трансплантация почки по поводу диабетического нефросклероза. Иммуносупрессивная терапия проводится в соответствии со стандартным протоколом. В срок 2 месяца после операции проведена плановая биопсия трансплантированной почки. Фрагмент ткани подвергнут иммуногистохимическому исследованию, выполнено фотографирование и обработка изображения с помощью программы ImageJ. Площадь среза составила 2,4 мм² суммарная площадь Т и В лимфоцитов составила 0,0216 мм², макрофаги и компоненты комплемента C3d и C4d не выявлены. Средняя плотность в % на 1 мм² К=0,0216/2,4*100%=0,9%. Исходя из этого, определено отсутствие отторжения трансплантата. Пациентка продолжает иммуносупрессивную терапию по стандартному протоколу.

2) Пациент Ж, 35 лет. Выполнена трансплантация сердца по поводу дилатационной кардиомиопатии. Пациент проходит иммуносупрессивную терапию по стандартному протоколу. Спустя два месяца после трансплантации отмечается картина нарастающей сердечной недостаточности. Пациенту в срочном порядке выполнена эндомиокардиальная биопсия. Фрагмент ткани подвергнут иммуногистохимическому исследованию, выполнено фотографирование и обработка изображения с помощью программы ImageJ. Площадь среза составила 3,3 мм², суммарная площадь Т и В лимфоцитов составила 0,08 мм², макрофагов 0,1 мм², компоненты комплемента C3d и C4d не выявлены. Средняя плотность в % на 1 мм² К=(0,1+0,08)/3,3*100%=5,5%. Исходя из этого, определено отторжение трансплантата тяжелой степени. Пациент экстренно госпитализирован в кардиологическое отделение, начата инфузионная терапия антилимфоцитарным иммуноглобулином и глюкокортикостероидами. Состояние больного улучшилось, повторная биопсия спустя две недели не выявила никаких морфологических признаков отторжения.

3) Пациентка Т., 44 года. Выполнена трансплантация почки по поводу нефросклероза в исходе подострого гломерулонефрита. В связи с ОРВИ нарушила режим иммуносупрессивной терапии. Спустя две недели стала отмечать незначительные отеки по утрам и потемнение мочи. Проведена биопсия почки. Фрагмент ткани подвергнут иммуногистохимическому исследованию, выполнено фотографирование и обработка изображения с помощью программы ImageJ. Площадь среза составила 1,7 мм², суммарная площадь Т и В лимфоцитов составила 0,016 мм², макрофагов 0,01 мм², компоненты комплемента C3d и C4d не выявлены. Средняя плотность в % на 1 мм² К=(0,016+0,01)/1,7*100%=1%. Исходя из этого, определена легкая степень отторжения трансплантированной почки. Пациентке назначена противовоспалительная терапия, режим приема иммунодепрессантов восстановлен. Спустя четыре дня клинические симптомы купированы. Пациентка выписана из стационара.

4) Пациентка С., 26 лет. Выполнена трансплантация печени по поводу острого токсического гепатоза. Иммуносупрессивная терапия проводится по стандартному протоколу. При плановом биохимическом исследовании функций печени спустя три месяца после операции выявлены маркеры цитолиза гепатоцитов, в пять раз превышающие норму. Проведена биопсия печени. Фрагмент ткани подвергнут иммуногистохимическому исследованию, выполнено фотографирование и обработка изображения с помощью программы ImageJ. Площадь среза составила 3,6 мм², суммарная площадь Т и В лимфоцитов составила 0,08 мм², макрофагов 0,02 мм², компонентов комплемента C3d и C4d 0,004%. Средняя плотность в % на 1 мм² К=(0,02+0,08+0,004)/3,6*100%=2,9%. Исходя из этого, определена легкая степень отторжения трансплантированной печени. Проведена коррекция дозировки иммуносупрессивных препаратов. Повторное биохимическое исследование крови не выявило признаков повреждения гепатоцитов, пациентка выписана из стационара.

5) Пациент Ф., 17 лет. Проведена трансплантация сердца по поводу аритмогенной дисплазии правого желудочка. Иммуносупрессивную терапию проходил согласно стандартному протоколу. Спустя полгода после трансплантации перенес грипп. После перенесенного заболевания возникла клиническая картина нарастающей сердечной недостаточности. Проведена срочная эндомиокардиальная биопсия. Фрагмент ткани подвергнут иммуногистохимическому исследованию, выполнено фотографирование и обработка изображения с помощью программы ImageJ. Площадь среза составила 4,2 мм², суммарная площадь Т и В лимфоцитов составила 0,05 мм², макрофагов 0,06 мм², компонентов комплемента C4d 0,03 мм². Средняя плотность в % на 1 мм² К=(0,05+0,06+0,03)/4,2*100%=3%. Исходя из этого, определено умеренное отторжение трансплантата. Пациент госпитализирован в кардиологическое отделение, начата инфузионная терапия антилимфоцитарным иммуноглобулином. Состояние больного улучшилось, повторная биопсия спустя две недели не выявила никаких морфологических признаков отторжения. 6) Пациент А., 50 лет. Выполнена трансплантация печени по поводу цирроза печени в исходе склерозирующего холангита. Иммуносупрессивная терапия проводилась по стандартному протоколу. При плановом биохимическом исследовании функций печени спустя месяц после операции выявлены маркеры цитолиза гепатоцитов, в восемь раз превышающие норму. Проведена биопсия печени. Фрагмент ткани подвергнут иммуногистохимическому исследованию, выполнено фотографирование и обработка изображения с помощью программы ImageJ. Площадь среза составила 8 мм², суммарная площадь Т и В лимфоцитов составила 0,2 мм², макрофагов 0,1 мм², компонентов комплемента C3d 0,1 мм², компоненты комплемента C4d не выявлены. Средняя плотность в % на 1 мм² К=(0,2+0,1+0,1)/8*100%=5%. Исходя из этого, определено умеренное отторжение трансплантированной печени. Проведена инфузия глюкокортикостероидами, режим иммуносупрессии скорректирован. Биохимическое исследование крови спустя неделю от начала лечения не выявило маркеров цитолиза, пациент был выписан с рекомендациями относительно диеты.

Способ ранней диагностики отторжения трансплантата, включающий использование иммуногистохимического исследования, фотографирование гистологического среза фрагмента пересаженного органа, определение показателей с помощью ЭВМ, отличающийся тем, что на фотографии выявляют клетки - Т и В лимфоциты, макрофаги и компоненты комплемента C3d и C4d, затем на ЭВМ с помощью инструмента «ручное выделение» определяют общую площадь среза (S), суммарную площадь выявленных клеток и компонентов комплемента (m) и при значении средней плотности выявленных клеток и компонентов комплемента на 1 мм² в %: K = (m/S)⋅100% до 0,9% определяют отсутствие отторжения, 1,0-2,9% - легкое отторжение, 3,0-5,0% - умеренное отторжение и при значении более 5,0% - тяжелое отторжение.