Средство, его применение и способ повышения устойчивости организма млекопитающих к ишемически-реперфузионному поражению тонкого кишечника

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к средству для лечения ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника, характеризующемуся тем, что оно содержит фармацевтическую композицию препаратов, состоящую из рекомбинантного белка PSH, стабилизатора и фармацевтически приемлемого растворителя, где компоненты взяты в следующем соотношении, мас.%: рекомбинантный белок PSH - 0,1-0,4, стабилизатор трегалоза - 0,01-0,04, фармацевтически приемлемый растворитель - 99,89-99,56, также относится к способу повышения устойчивости организма млекопитающих к действию ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника. Группа изобретений обеспечивает получение средства, которое позволяет повышать резистентность эпителиальных клеток кишечника к ишемически-реперфузионному поражению, а способ позволяет расширить спектр использования средства для снижения поражения органов при реперфузии на моделях in vivo. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 пр., 1 табл.

 

Область техники

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии и может быть использовано для коррекции ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника. Предложенное терапевтическое средство и способ его применения может быть использован в терапии патологий тонкого кишечника, которые сопровождаются ишемически-реперфузионным синдромом, в том числе при окклюзии брызжеечных сосудов, странгуляционной тонкокишечной непроходимости и др.

Уровень техники

Ишемически-реперфузионное поражение тонкого кишечника играет фундаментальную роль при различных клинических состояниях. С этой патологией связано большинство кардиохирургических и сосудистых вмешательств, окклюзия брыжеечных сосудов, послеоперационные осложнения, разрешение странгуляционной непроходимости и операции по трансплантации кишечника [Тимербулатов Ш.В. и др., 2010; Yandza Т., et al., 2011].

Одной из причин поражения тонкого кишечника при ишемически-реперфузионном поражении является мощный окислительный стресс, а гиперпродукция АФК - основной фактор, запускающий механизм апоптоза, некроза и поражения клеток [Granger D.N. et al., 2015]. Среди внутренних органов тонкий кишечник наиболее чувствителен к ишемически-реперфузионному поражению. В условиях гиперпродукции активных форм кислорода (АФК) собственная антиоксидантная система кишечника не способна в полной мере справиться с нормализацией свободно-радикальных процессов [Меныцикова Е.Б. и др., 2008]. В этом случае одним из способов снижения избытка активных форм кислорода является повышение антиоксидантного статуса в поврежденной ткани, путем применения экзогенных ферментов-антиоксидантов и других антиоксидантных агентов.

Известны способы снижения ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника у животных в эксперименте путем предварительного внутривенного введения антиоксидантных агентов перед индуцированным поражением. В качестве таких агентов рассматриваются аллопуринол, ремифентанил, lazaroid (21 - amino steroid) U-74389G, селен, инфиксимаб и другие [Sapalidis К. et al., 2013; Cho S.S. et al., 2013; Flessas I. et al., 2015; Kim Y. et al., 2014; Pergel A. et al., 2012]. Антиоксидантные агенты уступают по эффективности ферментам-антиоксидантам, так как имеют косвенный механизм действия на баланс редок-с системы.

Известны способы использования прямых ингибиторов гиперпродукции АФК - пропофол и темпол для снижения уровня ишемических и реперфузионных поражений тонкого кишечника [Gan X., 2015, Zhang G. et al., 2016] Главный недостаток данных агентов - низкая субстратная специфичность в отношении АФК.

Известны способы комплексного применения антиоксидантных агентов. Для снижения ишемически-репефузионного поражения органов предлагают: антиоксидантную композицию, включающую аскорбат натрия, N-ацетилцистеин и дефероксамин. Композиция предназначена для инфузионной терапии [Патент США № US 20170333393, 2017]; композицию на основе аллопуринола, оксипуринола и дефероксамина для внутривенного введения в комплексе реанимационных мероприятий [Патент США №US 4978668,1990].

В клинической практике известны попытки использования низкомолекулярных антиоксидантов мексидола [Багов А.Н, 2009] и реамберина для проведения антиоксидантной терапии при ишемически-реперфузионном синдроме [Курбонов К.М., 2013]. Главный недостаток низкомолекулярных антиоксидантов, активно внедряющихся в клинику, - низкая антиоксидантная активность, они значительно уступают по эффективности ферментам-антиоксидантам.

Для эффективного снижения ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника необходим агент с широкой субстратной специфичностью по отношению к АФК и с высокими показателями антиоксидантной активности.

Под эти характеристики подходит фермент-антиоксидант пероксиредоксин 6. Рекомбинантный человеческий пероксиредоксин 6 в отличие от других ферментов антиоксидантов обладает широкой субстратной специфичность, так как способен нейтрализовать весь спектр гидропероксидов (неорганические и органические гидропероксиды, перекисные соединения липидов, пероксинитриты). Он обладает выраженной антиоксидантной активностью (пероксидазная активность по H2O2 - 90 нмоль/мг/мин и по треть-бутилпероксиду - 60 нмоль/мг/мин). Ключевая особенность - пероксидазная активность Prx6 проявляется при малых концентрациях перекисей (1-100 мкМ), при которых другие ферменты антиоксиданты малоэффективны.

Показана эффективность использования фармакологических композиций с рекомбинантным пероксиредоксином 6 для лечения болезней, связанных с гиперпродукцией свободных радикалов, вызываемых экзогенными и эндогенными факторами [Патент РФ №2280448, 2006]. Однако данное техническое решение не связано с применением пероксиредоксина 6 при ишемически-реперфузионном поражении тонкого кишечника.

Известна работа М.Г. Шарапов и др., в которой рассматривается использование рекомбинантного пероксиредоксина 6 в терапии ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника. В работе показано, что внутривенное введение экзогенного пероксиредоксина 6 перед ишемией-реперфузией приводит к минимизации повреждений тканей и снижению апоптотической гибели клеток кишечника и мезентеральных сосудов [Шарапов М.Г. и др., 2017].

Тем не менее, рекомбинантный пероксиредоксин 6, обладая пероксидазной активностью, не способен нейтрализовать супероксидрадикал. Супероксидрадикал , наряду с перекисью водорода (Н₂О₂) относиться к потенциально опасным АФК. Для детоксикации потенциально опасных АФК: и Н₂О₂ в организме существуют супероксиддисмутазы и пероксидазы, которые объединяют в первую линию защиты от АФК [Ланкин В.З. и др., 2001]. С учетом этого факта, для максимальной защиты тонкого кишечника от поражающего действия АФК и торможения сигнальных каскадов, вызванных гиперпродукцией АФК необходим агент, объединяющий свойства супероксиддисмутазы и пероксидазы. В качестве такого агента возможно использование фермента-антиоксиданта PSH (Prx VI-SOD) с совмещенной пероксидазной и супероксиддисмутазной активностями. Раскрыт способ получения предложенного белка путем культивирования клеток штамма E.coli BL21(PSH), трансформированных сконструированным рекомбинантным вектором экспрессии на основе плазмиды pET22b(+). Изобретение позволяет получить высокой выход белка PSH, обладающего высокой антиоксидантной активностью [Патент РФ №2534348, 2014].

Наиболее близким аналогом-прототипом является использование фермента-антиоксиданта PSH (Prx VI-SOD) с совмещенной пероксидазной и супероксиддисмутазной активностями, в составе композиций кровозаменяющих растворов при реперфузии изолированного сердца (модель ex vivo). Реперфузия кровозамещающими растворами, содержащими белок PSH необходима для поддержания функционирования изолированного органа вне организма [Патент РФ №2534348, 2014]. Недостаток такого способа использования, в том, что применение PSH только для изолированных органов не раскрывает его терапевтической эффективности в целом организме.

Задачей изобретения является создание средства и более эффективного способа комбинированного лечения ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника млекопитающего.

Технический результат состоит в том, что заявленное средство позволяет повышать резистентность эпителиальных клеток кишечника к ишемически-реперфузионному поражению. Заявленный способ применения позволяет расширить спектр использования средства для снижения поражения органов при реперфузии на моделях in vivo.

Сущность изобретения

Предметом настоящего изобретения является средство для лечения ишемически-реперфузионного поражения, которое содержит фармацевтическую композицию препаратов, состоящую из рекомбинантного белка PSH, стабилизатора и фармацевтически приемлемого растворителя, где компоненты взяты в следующем соотношении, мас. %:

рекомбинантный белок PSH	0,1-0,4
стабилизатор	0,01-0,04
фармацевтически приемлемый растворитель	99,89-99,56

В качестве стабилизатора средство содержит трегалозу.

Другим предметом настоящего изобретения является способ повышения устойчивости организма млекопитающих к действию ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника. Согласно способу терапевтически эффективное количество средства вводят млекопитающему внутривенно, однократно за 15-20 минут до индуцированной ишемии млекопитающего в дозе от 5 мг/кг до 20 мг/кг массы тела млекопитающего. Предпочтительно в дозе 10 мг/кг массы тела.

Следующим предметом настоящего изобретения является применение средства в качестве препарата для лечения ишемически-реперфузионного повреждений тонкого кишечника.

Перечень фигур

Фиг. 1. Распределение экзогенного PSH (Prx VI-SOD) в тканях тонкого кишечника крысы при внутривенном введении.

Фиг. 2. Гистоструктура тонкого кишечника в разных экспериментальных группах. Группа 1 (период ишемии 1 час, период реперфузии 2 часа, без лечения); группа 2 (период ишемии 1 час, период реперфузии 24 часа, без лечения); группа 3 (период ишемии 1 час, период реперфузии 2 часа, с использованием PSH (Prx VI-SOD); группа 4 (период ишемии 1 час, период реперфузии 24 часа, с использованием PSH (Prx VI-SOD). В группах 3 и 4 наблюдается сохранность архитектуры кишечной стенки. Микрофото ×100.

Фиг. 3. Уровень маркера апоптотической гибели клеток каспазы-3 в кишечной ткани в разных экспериментальных группах. Контроль (уровень каспазы-3 в интактном кишечнике) принят за 100%. Группа 1 (период ишемии 1 час, период реперфузии 2 часа, без лечения); группа 2 (период ишемии 1 час, период реперфузии 24 часа, без лечения); группа 3 (период ишемии 1 час, период реперфузии 2 часа, с использованием PSH (Prx VI-SOD); группа 4 (период ишемии 1 час, период реперфузии 24 часа, с использованием PSH (Prx VI-SOD).

Описание изобретения

При изучении эффективного состава композиции для внутривенного введения для снижения осложнений после ишемически-реперфузинонного поражения тонкого кишечника, было обнаружено, что применение рекомбинантного белка PSH привело к повышению устойчивости клеток к ишемически-реперфузионному поражению в условиях нормализации активности эндогенной антиоксидантной системы.

К новому составу композиции относится средство содержащее раствор содержащий, по меньшей мере, один антиоксидант, используемый в терапевтически эффективной дозе.

Терапевтически эффективную дозу PSH определяют в соответствии с данными об эффективной концентрации PSH при защите биомакромолекул от активных форм кислорода in vitro, а также в соответствии с концентрацией экзогенного пероксиредоксина Prx VI в кишечной ткани в норме. Диапазон терапевтически эффективных доз PSH в жидкой форме препарата может варьировать в зависимости от тяжести поражения и составлять от 5 мг до 20 мг белка на кг массы тела.

Сохранение структуры и активности PSH является принципиальным моментом данного изобретения. Для предотвращения снижения активности белка при его хранении используют способ стабилизации и лиофилизации раствора белка.

Лиофилизированный препарат для приготовления жидкой композиции с использованием PSH (Prx VI-SOD) и стабилизаторов имеет следующий состав (масс. %):

PSH (Prx VI-SOD) - около 90,0;

Стабилизатор - около 10,0

Непосредственно перед использованием сухой порошок лиофилизированного PSH растворяют в физрастворе в требуемой концентрации. Растворы используют сразу.

Основа фармацевтической композиции, входящей в состав средства, содержит следующее соотношение компонентов, мас. %

Антиоксидант, рекомбинантный белок PSH 0,1-0,4

Стабилизатор трегалоза - 0,01-0,04

Фармацевтически приемлемый растворитель 99,89-99,56

Введение внутривенное, однократное. В качестве растворителей PSH используют физ. раствор и/или другие приемлемые растворители.

Возможно применение композиции, включающей рекомбинантный белок PSH и стабилизатор трегалозу, совместно с, по крайней мере, одним терапевтическим агентов широкого спектра действия. Используемый терапевтический агент не должен ингибировать ферментивную активность Prx VI-SOD, как пероксидазную, так и супероксиддисмутазную.

Приведенные ниже примеры включают, но не ограничивают варианты использования аналогов действующих веществ, входящих в состав средства.

Предлагаемый способ лечения ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника, может быть, применим к разным направлениям профилактики и терапии тонкого кишечника при ишемически-реперфузионном синдроме и включать:

A) профилактическую защиту тонкого кишечника и других органов от гиперпродукции свободных радикалов при кардио-сосудистых вмешательствах, например при моделировании операций по реваскуляризации миокарда и при оперативных вмешательствах на аорте, с ее пережатием выше чревного ствола.

Б) терапевтическую защиту тонкого кишечника от патологических изменений при острых формах абдоминальных патологий, например при разрешении странгуляционной тонкокишечной непроходимости, при остром нарушении мезентерального кровообращения.

B) профилактическую защиту тонкого кишечника для снижения послеоперационных осложнений в случае несостоятельности желудочно-кишечных анастомозов, синдроме инраабодминальной гипертензии, гиповолемическом шоке и др.

Г) сохранение жизнеспособности органов, в том числе тонкого кишечника и его сегментов, в условиях экстракорпоральной перфузии в теле асистолического донора до начала операции эксплантации.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1

Опыты проводят на белых крысах самцах линии Wistar массой 200-220 г. Моделирование ишемически-реперфузионного поражения проводят под общей анестезией. В качестве анестезии используют смесь золетила® 100 (Zoletil® 100, «Virbac Same Animale», Франция) и рометара (Rometar, «Bioveta», Чехия). Смесь. вводят внутривенно. У наркотизированной крысы срединным лапаротомным разрезом вскрывают брюшную полость на 1/3 ниже диафрагмы и осуществляют доступ к верхней мезентеральной артерии и вене. Модель окклюзии верхней мезентеральной артерии выполняют путем наложением сосудистого зажима на верхнюю мезентеральную артерию на срок 60 минут. Рекомбинантный PSH (Prx VI-SOD) вводят внутривенно в жидкой форме за 15-20 минут до индуцированной ишемии в дозе 10 мг белка на кг массы тела. Через 2 и 24 часа реперфузии производят забор тканей кишечника для исследования. Исследования включают гистологическую оценку тканей, иммуноферментный анализ и определение состояния эндогенной антиоксидантной системы по уровню экспрессии генов ферментов-антиоксидантов методом ОТ-ПЦР.

Пример 2 Получение и подготовка средства на основе PSH (Prx VI-SOD)

В рамках настоящего изобретения бифункциональный пептид PSH получают из клеток штамма E.coli BL21(PSH), трансформированных сконструированным рекомбинантным вектором экспрессии на основе плазмиды pET22b(+) (РФ патент №2534348, 2014)

Присутствие His-tag в структуре белка PSH упрощает процедуру очистки рекомбинантного белка благодаря тому, что этот домен специфически связывается с Ni-NTA-агарозой.

Бактерии E.coli BL21(PSH), экспрессирующие PSH (Prx VI-SOD), ресуспендируюти разрушают ультразвуком на генераторе УЗДН-2 при 4°С. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин, надосадок фильтруют через 0,45 мкм фильтр (Corning, США) и наносят на колонку (BioRad, США) объемом 10 мл с Ni-NTA-агарозой (Invitrogen, США), которая предварительно была уравновешена буфером для нанесения. Инкубацию бактериального лизата с Ni-NTA-агарозой проводят в течение 40 мин при +4°С. Затем, колонку промывают 100 мл раствора: 12 мМ Трис-HCl рН 7.8, 20 мМ имидазола. Элюцию белка проводят 5 мл буфера: 12 мМ Трис-HCl, рН 7.8, 250 мМ имидазола. Белок концентрируют с помощью мембранного концентратора VIVASCIENCE 30.000 MWCO (Sartorius, Германия) и в нем же диализуют против 1×PBS (1.7 мМ КН₂РО₄, 5.2 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl, рН 7.4). Чистота белка, оцениваемая по электрофорезу в полиакриламидном геле, составляла около 95%. Обычно получают около 20-40 мг очищенного белка с одной ферментации. Полученный белок используют для дальнейших экспериментов.

Полученный PSH (Prx VI-SOD) возможно использовать в жидкой форме, однако белок нестабилен при длительном хранении в растворах, а при неоднократном замораживании/размораживании он теряет свою активность. Поэтому проводят лиофилизацию и стабилизацию рекомбинантного белка для того, чтобы сохранить активность белка при его хранении. Лиофилизированные формы могут быть использованы в дальнейшем для приготовления жидких форм для введения в кровь.

Лиофилизированный препарат PSH (Prx VI-SOD) получают по технологии, включающей как минимум 4 стадии: 1) очистка белка с помощью аффинной хромотографии на Ni-NTA-агарозе; 2) концентрирование фракций до концентрации 5-7 мг/мл, содержащих PSH (Prx VI-SOD) и диализ против деоинизированной воды 3) введение, по крайней мере, одного стабилизатора; 4) процесс лиофилизации при -20°С до образования сухого порошка.

Стабилизаторы необходимы для сохранения активности PSH (Prx VI-SOD) на более длительный срок, не менее одного года, и в более доступных условиях, при температуре от +4 до -20°С в зависимости от срока хранения. Лиофилизированный препарат расфасовывают в стерилизованные в автоклаве при +120°С флаконы (в зависимости от применения по дозам от 1 до 5 мг и хранят при -20°С).

Известно, что трегалоза выполняет функцию сохранения вторичной структуры пептидов и белков [Singer М.А. et. al, 1998]. Применение трегалозы, в качестве стабилизатора включает, но не ограничивает использование других стабилизаторов. Стабилизаторы могут быть выбраны из группы, состоящей из: а) одного или более моно- или полисахаридов или сахарных спиртов (мальтоза, глюкоза, лактоза, трегалоза, сахароза, маннит, инозит, галактоза, рибоза, ксилоза, манноза, сахароза, целлобиоза, рафиноза и мальтотриоза, б) аминокислот (аланин, глицин др), в) полипептидов или белков (альбумин).

В связи с тем, что PSH (Prx VI-SOD), является хорошо растворимым белком, для непосредственного приготовления жидкой формы препарата из лиофилизата белка с целью внутривенного введения можно использовать в качестве растворителей физ. раствор, раствор Рингера и другие сбалансированные солевые растворы (Dawson R.M., 1986).

Непосредственно перед использованием сухой порошок лиофилизированного PSH растворяют в физрастворе в требуемой концентрации. Растворы используют сразу. Для снижения ишемически-реперфузионного поражения в зависимости от тяжести поражения рекомендовано использовать (мас. %) от 0,1 до 0,4% (от 1 до 4 мг/мл) основного действующего вещества PSH (Prx VI-SOD).

Состав фармацевтической композиции, входящей в состав средства, содержит следующее соотношение компонентов, мас. %

Антиоксидант, рекомбинантный белок PSH	0,1-0,4
Стабилизатор трегалоза	0,01-0,04
Фармацевтически приемлемый растворитель	99,89-99,6

Пример 3 Распределение PSH (Prx VI-SOD) в организме животного после его инъекции

Для выявления распределения экзогенного PSH (Prx VI-SOD) в тканях тонкого кишечника при внутривенном введении крысе в вену вводят PSH (Prx VI-SOD) в количестве 20 мг на животное. Доза 20 мг не является терапевтической, а используется для идентификации экзогенного PSH (Prx VI-SOD) в тканях тонкого кишечника. PSH (Prx VI-SOD) вводили внутривенно с использованием 24-G катетера и через 20 мин образцы тонкой кишки отбирали для приготовления гистологического препарата. Для иммуногистохимического исследования распределения эндогенного PSH (Prx VI-SOD) используют образцы кишечной ткани здоровой крысы, в качестве детекционной метки выступал His-tag домен, сшитый с конструкцией Prx VI-SOD

Для иммуномечения экзогенного Prx VI-SOD-His-tag срезы инкубируют с первичными моноклональными антителами мыши к His-tag домену Prx6 («USBiological», США) (1:100) Полученные данные показывают, что через 20 минут после инъекции PSH (Prx VI-SOD), наблюдается в кровеносных сосудах подслизистой основы и в собственной пластинке слизистой оболочки. Кроме того, отмечается его диффузное распространение по слизистой оболочке кишечника (фиг. 1).

Исследование выполнено на 40 крысах-самцах линии Wistar. Животные были разделены на четыре экспериментальные группы. Десяти животным производили введение рекомбинантного PSH (Prx VI-SOD) по предложенной нами схеме с последующим индуцированием ишемического и реперфузионного поражения тонкого кишечника. Индуцирование И-Р поражения было выполнено путем окклюзии верхней мезентеральной артерии.

Экспериментальные группы:

1. Клипирование верхней мезентеральной артерии на 1 час (период ишемии), с последующим ее деклампированием для воспроизведения реперфузии тонкого кишечника в течение 2 часов - 10 особей.

2. Клипирование верхней мезентеральной артерии на 1 час (период ишемии), с последующим ее деклампированием для воспроизведения реперфузии тонкого кишечника в течение 24 часов - 10 особей

3. Внутривенное введение PSH (Prx VI-SOD) в дозе 10 мг/кг с последующим клипированием верхней мезентеральной артерии на 1 час (период ишемии), с последующим ее деклампированием для воспроизведения реперфузии тонкого кишечника в течение 2 часов - 10 особей

4. Внутривенное введение PSH (Prx VI-SOD) в дозе 10 мг/кг с последующим клипированием верхней мезентеральной артерии на 1 час (период ишемии), с последующим ее деклампированием для воспроизведения реперфузии тонкого кишечника в течение 24 часов - 10 особей

По истечению реперфузионного периода сроком 2 и 24 часа, животных декапитировали и производили забор тканей тонкого кишечника для морфологического исследования и оценки состояния эндогенной антиоксидантной системы. Морфологическое исследование ткани производилось по стандартной гистологической технике с окраской эозином/гематоксилином. Микроскопический анализ срезов кишечной и сосудистой тканей проводили на микроскопе Leica DM 6000. Итоговую гистологическую картину оценивали в соответствии с критериями, описанными Chiu C.J. et al [Chiu C.J. et al., 1970]. Исследование общего состояния клеток было выполнено с использованием иммуноферментного анализа по оценке уровня маркера апоптотической гибели клеток каспазы-3 в кишечной ткани. ИФА была выполнена по стандартной методике с использованием поликлональных кроличьих антител против маркера апоптоза каспазы-3 (1:1000) (Imgenex, США).

Пример 4

Гистологические исследования показали, что применение предложенного способа восстановления последствий ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника положительно влияет на сохранность архитектуры кишечной стенки (Фиг. 2, таб. 1).

Степень поражения кишечника при ишемических и реперфузионных повреждениях выражена в соответствии с критериями Chiu C.J. et al [Chiu C.J. et al., 1970] ишемических и реперфузионных повреждений. Где: Степень 0 - нормальная слизистая; степень 1 - развитие субэпителиальных пространств на вершине ворсинок и закупорка сосудов; степень 2 - расширение субэпителиальных пространств с умеренным отслоением эпителия от собственной пластинки; степень 3 - значительное отслоение эпителия по всей длине ворсинок и оголенные участки ворсинок: степень 4 - обнажение ворсинок с появлением собственной пластинки и расширение капилляров; и степень 5 - дезинтеграция подслизистой основы, кровоизлияния и изъязвления.

Из таблицы 1 хорошо видно, что использование экзогенного PSH эффективно снижает степень ишемически-реперфузионого поражения через 2 и 24 часа реперфузии.

Пример 5 Данные иммуноферментного анализа содержания маркера апоптотической гибели клеток.

Иммуноферментный анализ содержания маркера апоптотической гибели клеток каспазы-3 показал, что после 2-х часов реперфузии происходит увеличение уровня этого маркера в 3,5 раза относительно интактного контроля (р<0.05), через 24 часа реперфузии этот показатель снижается в 1,75 раза, относительно значений первой группы, однако не соответствует контрольным значениям. Во второй группе содержания маркера апоптотической гибели клеток в 2 раза выше контрольных значений (фиг. 3)

Использование экзогенного PSH, в третьей экспериментальной группе, уменьшает уровень каспазы - 3 (в 1,4 раза) относительно уровня этого маркера в первой экспериментальной группе (р<0.05), где, при равных временных сроках ишемии и реперфузии, не использовался экзогенный PSH. Через 24 часа реперфузии, после использования PSH (четвертая экспериментальная группа) уровень каспазы - 3 снижается в 1,5 раза относительно значений второй экспериментальной группы, где при равных временных сроках ишемии и реперфузии не использовался экзогенный PSH (р<0.05). Кроме того, в четвертой группе показатель апоптотической гибели снижается почти в 2 раза, относительно значений третьей группы (р<0.05), и соответствует значениям содержания этого маркера в контроле. Таким образом, снижение степени поражения кишечника при использовании PSH по предложенной схеме лечения происходит на фоне уменьшения уровня апоптотической гибели клеток в третье и четвертой экспериментальных группах относительно экспериментальных групп, где, при равных временных сроках ишемии и реперфузии, лечение PSH.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что терапевтическое средство, содержащее эффективную концентрацию рекомбинантного антиоксиданта PSH (Prx VI-SOD) и его способ его применения для коррекции последствий и осложнений ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника путем внутривенного введение по схеме, способствовало снижению степени поражения тканей кишечника в остром и хроническом эксперименте. Кроме того, препятствовало росту уровня апоптотической гибели клеток тонкого кишечника, тем самым предотвращая прогрессирование патологических изменений в органе при его ишемически-реперфузионном поражении.

Таким образом, использование предложенного нами терапевтического средства и способа его применения для коррекции последствий и осложнений ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника позволяет предупредить прогрессирование патологических изменений в органе при хирургическом вмешательстве, что оправдывает его использование с лечебной и профилактической целью для противоишемической и противореперфузионной защиты тонкого кишечника.

Промышленная применимость

Способ лечения путем внутривенно введения белка-антиоксиданта рекомбинантного PSH в дозе от 5 мг/кг до 20 мг/кг массы тела может найти профилактическое и/или лечебное применение для коррекции последствий и осложнений ишемически-репефузионного синдрома тонкого кишечника при различных клинических состояниях. Использование способа лечения путем применения средства на основе PSH позволяет повысить эффективность и сократить сроки лечения, что объясняется высокой эффективностью PSH по сравнению с известными антиоксидантами. PSH хорошо растворим в водных растворах, не токсичен и биосовместим с организмом млекопитающих, в том числе и человека, так как в нем в качестве соединения-лидера используется рекомбинантный человеческий пероксиредоксин VI.

Применение рекомбинантного белка PSH повышает защитные функции организма при ишемическом и реперфузионном поражении, что на сегодняшний день является актуальной задачей для терапии подобных клинических состояний. Комбинирование двух ферментов-антиоксидантов с разными мишенями для действия может обеспечить максимальную защиту от гиперпродукции АФК посредством аддитивных эффектов.

Источники информации

1. Тимербулатов Ш.В. и др. Реперфузионный синдром в абдоминальной хирургии. Медицинский вестник Башкортостана. - 2010. - Т 5.

2. Yandza Т. et al. The pig as a preclinical model for intestinal ischemia-reperfusion and transplantation studies. Hebuterne Surg Res. - 2012. - Vol. 178. - P. 807-19.

3. Granger D. N. et al. Reperfusion injury and reactive oxygen species: The evolution of a concept. Redox Biology. - 2015. - Vol. 6. - P. 524-551.

4. Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания - Новосибирск: APTA, 2008. 284 с.

5. Sapalidis К. et al. The role of allopurinoFs timing in the ischemia reperfusion injury of small intestine. J Emerg Trauma Shock. - 2013. - Vol. 6. - P. 203-8.

6. Cho S.S. et al. Remifentanil ameliorates intestinal ischemia-reperfusion injury. BMC Gastroenterol. - 2013. - Vol, 13. - P. 69.

7. Flessas I. et al. Effect of lazaroid U -74389G on intestinal ischemia and reperfusion injury in porcine experimental model. Int J Surg. - 2015. - Vol. - 13. - P 42-8.

8. Kim Y. et al. Antioxidant and anti-inflammatory effect of selenium in oral buccal mucosa and small intestinal mucosa during intestinal ischemia-reperfusion injury. J Inflamm (bond). - 2014. - Vol. 11. - P. 36.

9. Pergel A. et al. Anti-inflammatory and antioxidant effects of infliximab in a rat model of intestinal ischemia/reperfusion injury. Toxicol Ind Health. - 2012. - Vol. 28. - P. 923-32.

10. Gan X. et al. Propofol attenuates small intestinal ischemia reperfusion injury through inhibiting NADPH oxidase mediated mast cell activation. Oxid Med Cell Longev. - 2015.-167014. doi: 10.1155/2015/167014

11. Zhang G. et al. Protective effect of tempol on acute kidney injury through PI3K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Kidney Blood Press Res. - 2016. - Vol. - 41. - P. 129-38.

12. Rodrigo S. et al. Injectable antioxidant formulation for intravenous use of sodium ascorbate in high dosage, N-acetyl cysteine, and deferoxamine; method of administration and use for preventing injury due to reperfusion; and kit. Заявка США № US 20170333393 (23.11.2017).

13. Babbs C.F., Badylak S.F. Treatment to reduce ischemic tissue injury Патент CIHA № US 4978668 (18.12.1990).

14. Багов А.Н. Исследование органопротекторного действия мексидола в условиях реперфузионного синдрома экспериментально-клиническое исследование: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.25 - Майкоп, 2005.

15. Курбонов К.М. Фармакологическая коррекция свободнорадикальных нарушений и эндоксикоза у больных с острой странгуляционной кишечной непроходимостью в послеоперационном периоде. Хирургия. - 2013. №5. - С. 49-52.

16. Шарапов, М.Г. и др. Пероксиредоксин 6 - природный радиопротектор. Доклады Академии наук. - 2016. - Т. 467(3). - С. 355-357.

17. Патент РФ №2280448, 27.07.2006. Новоселов В.И., Янин В.А., Фесенко Е.Е. Композиция с антиоксидантными свойствами и способ лечения болезней млекопитающих. Патент России № RU 2280448 (27.07.2006).

18. Панкин В.З. и др. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях Пособие для врачей. - М.: РКНПК МЗ РФ, 2001. - 78 с.

19. Равин В.К. и др. Рекомбинантный бифункциональный белок psh, обладающий антиоксидантной активностью супероксиддисмутазы и пероксидазы, кодирующая его химерная нуклеиновая кислота, рекомбинантный плазмидный вектор ее содержащий и применение белка psh при реперфузии сердца. Патент России № RU 2534348 (27.11.2014).

20. Dawson R.M. et al. Data of biochemical research. Clarendon Press, Oxford, 1986.

21. Singer M.A. et. al. Multiple effects of trehalose on protein folding in vitro and in vivo. Mol. Cell. - 1998. - Vol. 1:5. P. 639-648.

1. Средство для лечения ишемически-реперфузионного поражения тонкого кишечника, характеризующееся тем, что оно содержит фармацевтическую композицию препаратов, состоящую из рекомбинантного белка PSH, стабилизатора и фармацевтически приемлемого растворителя, где компоненты взяты в следующем соотношении, мас.%:

рекомбинантный белок PSH	0,1-0,4
стабилизатор трегалоза	0,01-0,04
фармацевтически приемлемый растворитель	99,89-99,56

2. Средство по п. 1, характеризующееся тем, что в качестве стабилизатора содержит трегалозу.

3. Способ повышения устойчивости организма млекопитающих к действию ишемических и реперфузионных повреждений тонкого кишечника, характеризующийся тем, что терапевтически эффективное количество средства по пп. 1-2 вводят млекопитающему однократно.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что терапевтически эффективное количество средства вводят внутривенно за 15-20 минут до индуцированной ишемии млекопитающего.

5. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что средство вводят в дозе от 5 мг/кг до 20 мг/кг массы тела млекопитающего.

6. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что средство вводят в наиболее эффективной терапевтической дозе 10 мг/кг массы тела.

7. Применение средства, охарактеризованного в пп. 1-2, в качестве препарата для лечения ишемически-реперфузионного повреждения тонкого кишечника.