Генотерапевтический днк-вектор на основе генотерапевтического днк-вектора vtvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов bdnf, vegfa, bfgf, ngf, gdnf, nt3, cntf, igf1, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм escherichia coli scs110-af/vtvaf17-bdnf, или escherichia coli scs110-af/vtvaf17-vegfa, или escherichia coli scs110-af/vtvaf17-bfgf, или escherichia coli scs110-af/vtvaf17-ngf, или escherichia coli scs110-af/vtvaf17-gdnf, или escherichia coli scs110-af/vtvaf17-nt3, или escherichia coli scs110-af/vtvaf17-cntf, или escherichia coli scs110-af/vtvaf17-igf1, несущий генотерапевтический днк-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического днк-вектора

Авторы патента:

Савелиева Наталиа (AT)

C12R1/19 - Схема кодирования для подклассов C12C-C12Q или C12S, относящаяся к микроорганизмам

C12N15/70 - векторы или системы экспрессий, специально приспособленные для E.coli

C12N15/12 - гены, кодирующие животные белки

C12N1/21 - модифицированные введением чужеродного генетического материала

A61K48/00 - Лекарственные препараты, содержащие генетический материал, который включен в клетки живого организма для лечения генетических заболеваний; для генной терапии

Владельцы патента RU 2732479:

Селл энд Джин Терапи Лтд (GB)
Общество с ограниченной ответственностью "Прорывные Инновационные Технологии" (RU)

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии. Предложен генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных. При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1, или SEQ ID №2, или SEQ ID №3, или SEQ ID №4, или SEQ ID №5, или SEQ ID №6, или SEQ ID №7, или SEQ ID №8 соответственно. Предложены также способ получения указанного вектора, применение вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов, штамм Escherichia coli, несущий указанный вектор, а также способ производства в промышленных масштабах указанного вектора. Изобретение обеспечивает возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных. 20 н. и 2 з.п. ф-лы, 23 ил., 32 пр.

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.

Уровень техники

Генная терапия - это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Конечным продуктом экспрессии гена может являться молекула РНК или белка. Однако осуществление большей части физиологических процессов в организме связано с функциональной активностью белковых молекул, тогда как молекулы РНК являются либо промежуточным продуктом в синтезе белков, либо осуществляют регуляторные функции. Таким образом целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.

Гены BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, входящие в группу генов, играют ключевую роль в ряде процессов в организме человека и животных.

Нейротрофические факторы имеют доказанное стимулирующее воздействие на рост отдельных популяций нейронов (Aloe et al., 2012, Bothwell, 2014). Доставка терапевтических субстанций, содержащих нейротрофические факторы, в места с поврежденным нервными клетками и волокнами может осуществляться системно (Sahenk et al., 1994) или локально с использованием осмотических минипомп (Newman et al., 1996b, Utley et al., 1996), устройств с медленным высвобождением (Sterne et al., 1997, Fine и др., 2002, Wood et al., 2009, Wood et al., 2012, Wood et al., 2013) или инъекции (Chu et al., 2009). Большинство исследований показывают, что важные аспекты регенерации, включая рост аксонов, функцию клеток Шванна и миелинизацию, заметно улучшаются при использовании этих подходов (Klimaschewski et al., 2013). В тоже время реакция на экзогенные нейротрофические факторы зависит от типа нерва, стратегии восстановления и методологии, используемой для оценки их эффектов. Доза, время введения и способ доставки являются критическими параметрами, которые определяют эффективность, что свидетельствует, в том числе, о существующих ограничениях в фармакокинетических параметрах препаратов, содержащих белковые субстанции этих факторов. Для преодоления этих ограничений может использоваться генотерапевтический подход.

Вирусные векторы успешно были использованы для экспрессии нейротрофических факторов в клетках Шванна для восстановления поврежденных нервов в нескольких экспериментальных работах (Dijkhuizen et al., 1998, Hu et al., 2005, Hu et al., 2010, Eggers et al., 2008, Eggers et al., 2013, Tannemaat et al., 2008, Mason et al., 2011). Генотерапевтический подход также использовался для усиления потенциала клеточной терапии и аллогенных трансплантантов (Shakhbazau et al., 2012, Haastert et al., 2006, Li et al., 2006, Godinho et al., 2013, Santosa et al., 2013). Также было показано, что сочетанная генная терапия с экспрессией сразу нескольких генов (BDNF, CNTF, GDNF, NGF, NT3 и VEGF) значительно улучшала гистологические характеристики тканей, электрофизиологические и функциональные параметры у крыс (Hoyng et al., 2014).

Ген BDNF кодирует один из наиболее изученных нейротрофических факторов в центральной нервной системе, участвующий в развитии и поддержании нормальной функции ЦНС. Установлено, что BDNF опосредует выживание и дифференцировку нейронов путем связывания и активации рецепторов TrkB, локализованных как на пресинаптической, так и постсинаптической мембранах. В дополнение к нейротрофическим эффектам, BDNF-TrkB регулирует экспрессию белков на разных этапах развития синапса, а также участвует в нейропластичности мозга. Это особенно важно, поскольку все больше данных свидетельствует в пользу роли BDNF в патофизиологии заболеваний, связанных с головным мозгом, включая психические расстройства. Изменения в экспрессии BDNF широко известны при депрессии, шизофрении, биполярных и тревожных расстройствах (Polyakova et al., 2015, Mitchelmore et al., 2014, Autry et al., 2012, Briand et al., 2010, Monteleone et al., 2013). Более того, повышение экспрессии гена BDNF рассматривается как один из потенциальных подходов к лечению ряда заболеваний. Так, с использованием аденоассоциированного вектора, экспрессирующего данный ген, на лабораторной модели болезни Хантингтона у крыс было показано улучшение показателей клеточного состава и поведенческих тестов (Connor et al., 2016). Аналогичное исследование продемонстрировало нейропротективное действие на лабораторных мышах в условиях оксидативного стресса (Osborne et al., 2018). Также системное введение клеток, трансфицированных плазмидным вектором, экспрессирующим ген BDNF, предлагается как эффективный подход к терапии быстроразвивающихся состояний, вызывающих поражения ЦНС (например, ишемический инсульт) (Gomez-Vargas et al., 2012).

Ген VEGF кодирует белок с хорошо известным ангиогенным действием, на чем основано множество работ по его использованию для стимулирования роста сосудов при различных заболеваниях. Тем не менее, функции данного фактора роста не ограничены только этой областью. Показано, что VEGF также оказывает прямое воздействие на нервные клетки. У мышей с пониженными уровнями экспрессии VEGF развивается дегенерация моторных нейронов, напоминающая нейродегенеративные нарушения при боковом амиотрофическом склерозе (БАС) человека. Дополнительные генетические исследования подтвердили, что VEGF связан с дегенерацией моторных нейронов у людей и у мышей SOD1 (G93A) - модели БАС. Сниженные уровни экспрессии VEGF могут способствовать дегенерации мотонейронов путем ограничения перфузии нервной ткани и VEGF-зависимой нейропротекции. VEGF также влияет на гибель нейронов после острой ишемии и участвует в других неврологических расстройствах, таких как диабетическая и ишемическая невропатия, регенерация нервов, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и рассеянный склероз. Эти данные создали базу для оценки потенциала VEGF для терапии нейродегенеративных нарушений. Было показано, что внутримышечное введение экспрессирующего VEGF лентивирусного вектора, значительно замедляло начало, улучшало моторные характеристики и повышало выживаемость лабораторных животных с боковым амиотрофическим склерозом. Данные с использованием аденоассоциированных вирусных векторов, экспрессирующих VEGF, также показали многообещающий терапевтический эффект при БАС (Storkebaum E., Lambrechts D., Carmeliet P.б 2004).

Белок, кодируемый геном BFGF (другие названия - FGF2 или FGFb), является членом семейства фактора роста фибробластов (FGF). Члены семейства FGF белков обладают широкой митогенной и ангиогенной активностью. Этот белок участвует в различных биологических процессах, таких как развитие конечностей и нервной системы, заживление ран и рост опухолей.

В отношении процессов нейрогенеза введение BFGF оказалось высокоэффективно при регенерации нейронов в нескольких экспериментальных моделях на лабораторных животных, в том числе применительно к повреждениям зрительного нерва (Sapieha PS et al., 2003). Также несколько экспериментальных работ продемонстрировали потенциал BFGF в качестве терапевтического средства для таких нейродегенеративных состояний как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Аденоассоциированный вирусный вектор, экспрессирующий ген BFGF, обладал способностью восстанавливать у мышей пространственное обучение, долгосрочное потенцирование гиппокампа и нейрогенез при введении как до, так и после первичной симптоматики болезни Альцгеймера. Необходимо отметить, что в дополнение к своим нейрогенным свойствам FGF2 оказывал противовоспалительное и амилоидоз-снижающее действие (Kiyota T, et al., 2011).

Введение BFGF также изучалось как терапевтический метод для восстановления мозга после травматического повреждения. Крысы, получавшие FGF2 сразу после травмы, показали усиленный нейрогенез, увеличение числа выживших нейронов и улучшение когнитивной функции по сравнению с контролем (Sun D, et al., 2009).

В экспериментальной модели аутоиммунного энцефаломиелита на мышах была идентифицирована нейропротекторная роль BFGF. В одном из исследований интратекальная инъекция рекомбинантного вируса простого герпеса (HSV) 1-го типа, экспрессирующего ген FGF2 человека, значительно уменьшала патологические процессы у мышей, включая, например, уменьшение количества миелинотоксических клеток (Т-клеток и макрофагов) в паренхиме ЦНС (Ruffini F, et al., 2001).

Ген NGF кодирует белок NGF- фактор роста нервов. NGF является нейтрофином незаменимым для выживания и развития симпатических и сенсорных нейронов. В его отсутствии нейроны подвержены апоптозу. Фактор роста нервов вызывает рост аксонов: исследования показали, что он способствует их ветвлению и удлинению. NGF предотвращает или уменьшает дегенерацию нейронов у животных с нейродегенеративными заболеваниями. У человека экспрессия NGF увеличивается при воспалительных заболеваниях, при которых он подавляет воспаление. Кроме того, NGF необходим для процесса восстановления миелина. В исследовании пациентов с шизофренией, еще не получавших нейролептической терапии, было показано, что уровень NGF в спинномозговой жидкости и плазме крови понижен по сравнению с нормой (Kale et al., 2009).

В настоящее время проходит клиническое исследование метода терапии болезни Альцгеймера, заключающегося в введении пациентам аденоассоциированного вектора, экспрессирующего ген NGF (NCT00876863). Первые полученные результаты подтверждают эффективность и безопасность данного подхода.

Ген GDNF кодирует нейтрофин, который способствует выживанию и дифференциации допаминергических нейронов в культуре и способен предотвращать апоптоз моторных нейронов, вызванный аксотомией (Lin et al., 1993). В экспериментах на крысах было показано, что введение GDNF способствует восстановлению двигательного нерва бедра после его травматического повреждения (Zhou et al., 2018). Также с использованием лентивирусного вектора, экспрессирующего ген GDNF, был показан терапевтический эффект генотерапевтического подхода на мышиной модели болезни Альцгеймера (Revilla et al., 2014).

Ген NT3 кодирует белок нейтрофин, который обеспечивает дифференцировку и выживание существующих нейронов, а также поддерживает рост и дифференцировку новых нейронов и синапсов. У пациентов с депрессией наблюдается пониженная концентрация NT3 в сыворотке крови ( et al., 2016). Также было показано, что экспрессия генов NT3 и BDNF необходима для восстановления сенсорных нейронов после акустической травмы (Wan et al., 2014).

Белок NT3 изучался в качестве средства для лечения запоров. В рандомизированном, двойном слепом, плацебо-контролируемом исследовании II фазы подкожное введение нейротрофина-3 три раза в неделю значительно увеличивало частоту спонтанных полных опорожнений кишечника и усиливало действие других средств для лечения запоров (Parkman et al., 2003). В различных экспериментальных работах на лабораторных животных было показано, что генотерапетвический подход с использованием аденоассоциированных векторов позволяет достигнуть увеличения диаметра мышечных волокон (Yalvac et al., 2018), снижает воспаление при аутоиммунной нейропатии (Yalvac et al., 2016), уменьшает симптомы болезни Шарко - Мари - Тута (Sahenk et al., 2014).

Ген CNTF кодирует полипептидный гормон, действие которого ограничено нервной системой, где он способствует синтезу нейротрансмиттеров и регуляции некоторых популяциях нейронов. Белок является мощным фактором выживания для нейронов и олигодендроцитов и может иметь значение для уменьшения разрушения тканей во время воспалительных процессов, например, при сепсисе (Guillard et al., 2013). Доказано, что CNTF играет важную протективную роль при ретинопатиях (Rhee et al., 2013). При этом трансплантация клеток, гиперэкспрессирующих ген CNTF, также оказывает протективное действие у мышей с дистрофическими изменениями сетчатки (Jung et al., 2013).

Мутация в гене CNTF, которая приводит к аберрантному сплайсингу, приводит к дефициту цилиарного нейротрофического фактора, но фенотип при этом пока не имеет доказанной причинно-следственной связи ни с какими неврологическими заболеваниями.

Ген IGF1 кодирует белок сходный по своей структуре и функции с инсулином. При этом уже накопилось достаточно данных, свидетельствующих в пользу того, что инсулиновый сигнальный путь играет важную роль в различных неврологических и нейродегенеративных процессах (Mishra et al., 2018). Также показано, что IGF1 играет протективную роль в процессе снижения когнитивной функции, обусловленной старением (Wennberg et al., 2018). На мышиной модели БАС было показано, что введение аденоассоциированного вирусного вектора, экспрессирующего ген IGF1, увеличивало продолжительность жизни лабораторных животных (Hu et al., 2018). Интраназальное введение белка IGF1 снижало электрофизиологические явления, являющиеся проявлением ауры мигрени у крыс (Grinberg et al., 2017).

Таким образом предшествующий уровень техники свидетельствует о том, что мутации в генах BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 или недостаточная экспрессия белков, кодируемых этими генами, связаны с развитием спектра заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся, психическими и нейродегенеративными аутоиммунными заболеваниями, раком, наследственными и приобретенными патологическими состояниями, такими как травматические повреждения, и другими процессами. Этим обусловлено объединение генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами из группы BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов для предотвращения и терапии различных заболеваний и патологических состояний.

Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенностью к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия данных белков может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, которые неблагоприятны для человека и животных и связанны с ухудшением качества жизни.

Анализ подходов для повышения экспрессии целевых генов подразумевает возможность использования различных генотерапевтических векторов.

Генотерапевтические векторы разделяют на вирусные, клеточные и ДНК-векторы (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014). В последнее время в генной терапии все большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Плазмидные векторы лишены недостатков, присущих клеточным и вирусным векторам. В клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, не интегрируют в геном, производство их достаточно дешево, отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики (ДНК-вакцины) (Li L, Petrovsky N. // Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29).

Тем не менее, ограничениями для использования плазмидных векторов для генной терапии являются: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в бактериальных штаммах, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.

Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies). Данная рекомендация связана, в первую очередь, с потенциальной опасностью проникновения ДНК-вектора или горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности в клетки бактерий, представленных в организме в составе нормальной или оппортунистической микрофлоры. Помимо этого, наличие генов антибиотикорезистентности значительно увеличивает размер ДНК-вектора, что приводит к снижению эффективности его проникновения в эукариотические клетки.

Необходимо отметить, что гены антибиотикорезистентности также вносят принципиальный вклад в способ получения ДНК-векторов. В случае наличия генов антибиотикорезистентности штаммы для наработки ДНК-векторов обычно культивируются в среде, содержащей селективный антибиотик, что создает риск наличия следовых количеств антибиотика в недостаточно очищенных препаратах ДНК-векторов. Таким образом, получение ДНК-векторов для генной терапии, в которых отсутствуют гены антибиотикорезистентности, связано с получением штаммов, обладающих такой отличительной особенностью как способность к стабильной амплификации целевых ДНК-векторов в среде без содержания антибиотиков.

Кроме того, Европейское Медицинское Агентство рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), являющихся нуклеотидными последовательностями геномов различных вирусов (Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products,http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf). Данные последовательности, хотя и могут увеличивать уровень экспрессии целевого трансгена, однако создают риск рекомбинации с генетическим материалом вирусов дикого типа и интеграции в геном эукариотической клетки. Более того, целесообразность гиперэкспрессии того или иного гена в целях терапии остается нерешенным вопросом.

Также, существенным моментом является размер терапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. // Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104). Например, ген устойчивости к ампициллину в векторах серии pBR322, как правило, состоит из не менее чем 1000 п.н., что составляет более 20% от размера самого вектора. При этом наблюдается обратная зависимость между размером вектора и его способностью проникать в эукариотические клетки - ДНК-векторы с небольшим размером эффективней проникаю в клетки человека и животных. Так, например, в серии экспериментов по трансфекции клеток HELA ДНК-векторами с размером от 383 до 4548 п.н. было показано, что разница в эффективности проникновения может достигать двух порядков (отличаться в 100 раз) (Hornstein BD et al. // PLoS ONE. 2016;11(12): e0167537.).

Таким образом при выборе ДНК-вектора в целях безопасности и наибольшей эффективности следует отдавать предпочтение тем конструкциям, в которых не содержатся гены устойчивости к антибиотикам, последовательности вирусного происхождения и размер которых позволяет эффективно проникать в эукариотические клетки. Штамм для получения такого ДНК-вектора в количествах, достаточных для целей генной терапии, должен обеспечивать возможность стабильной амплификации ДНК-вектора с использованием питательных сред, не содержащих антибиотики.

Примером использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии является способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации по патенту US 9550998 В2. Плазмидный вектор представляет собой суперскученный плазмидный ДНК-вектор и предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из ориджина репликации, регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека.

Накопление вектора проводят в специальном штамме E. coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Недостатком данного изобретения является наличие в составе ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.

Прототипами настоящего изобретения в части использования генотерапевтических подходов для повышения уровня экспрессии генов из группы BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 являются следующие патенты и заявки.

В заявке EP0969875A1 описано изобретение на основе аденовирусного вектора, экспрессирующего ген NT3 или ген CNTF, и способ его использования для протекции или восстановления нейронов при заболеваниях или травмах. Недостатком данного изобретения является ограниченность используемых генов и выбор вирусного вектора.

В заявке WO1998056404A1 описано изобретение одним из способов реализации которого является применение ДНК векторов, экспрессирующих ген NGF, или ген BFGF, или ген NT-3, или ген BNDF для стимулирования роста нейронов. Недостатком данного изобретения является ограниченность используемых генов и неопределенные требования к эффективности и безопасности векторов.

В патенте US 6800281B2 описано изобретение для терапии или профилактики нейродегенеративных заболеваний, которое заключается в использовании лентивирусного вектора, экспрессирующего ген GDNF. Недостатком данного изобретения является ограниченность используемых генов и выбор вирусного вектора.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 в организме человека и животных, сочетающих в себе следующие свойства:

I) Эффективность генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессии целевых генов в эукариотических клетках.

II) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов.

III) Возможность безопасного применения для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности.

(IV) Технологичность получения и возможность наработки генотерапевтического ДНК-вектора в промышленных масштабах.

Пункты II и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам касательно отказа от введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development/ 14, December, 2011, EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies) и касательно отказа от введения в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии элементов вирусных геномов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).

Задачей изобретения также является конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора, для наработки и производства в промышленных масштабах генотерапевтических ДНК-векторов.

Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1, или SEQ ID №2, или SEQ ID №3, или SEQ ID №4, или SEQ ID №5, или SEQ ID №6, или SEQ ID №7, или SEQ ID №8 соответственно. Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17- BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF или, VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающей 3200 п.н., обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 соответственно. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген BDNF, ген VEGFA, ген BFGF, ген NGF, ген GDNF, ген NT3, ген CNTF, ген IGF1, который заключается в том, что каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17- BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена из группы BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 клонируют в ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, SEQ ID №1, или VTvaf17-VEGFA, SEQ ID №2, или VTvaf17-BFGF, SEQ ID №3, или VTvaf17-NGF, SEQ ID №4, или VTvaf17-GDNF, SEQ ID №5, или VTvaf17-NT3, SEQ ID №6, или VTvaf17-CNTF, SEQ ID №7, или VTvaf17-IGF1, SEQ ID №8, соответственно.

Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген BDNF, ген VEGFA, ген BFGF, ген NGF, ген GDNF, ген NT3, ген CNTF, ген IGF1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, заключается во введении выбранного генотерапевтического ДНК-вектора или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток человека или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, или в сочетании обозначенных способов.

Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 заключается в электропорации компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF созданным генотерапевтическим ДНК-вектором и последующей селекцией стабильных клонов штамма с использованием селективной среды.

Заявлен штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор для его наработки с возможностью культивирования штамма без использования антибиотиков.

Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора заключается в масштабировании бактериальной культуры штамма до количеств, необходимых для наращивания бактериальной биомассы в промышленном ферментере, после чего биомассу используют для выделения фракции, содержащей целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.

Изобретение поясняется чертежами, где:

На фиг.1

приведена схема генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Escherichia coli.

На фиг.1 приведены схемы, соответствующие:

A - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- BDNF,

B - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- VEGFA,

C - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- BFGF,

D - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- NGF,

E - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- GDNF,

F - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- NT3,

G - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- CNTF,

H - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- IGF1.

На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:

EF1a - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека;

Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена BDNF (фиг. 1A), гена VEGFA (фиг. 1B), гена BFGF (фиг. 1C), гена NGF (фиг. 1D), гена GDNF (фиг. 1E), гена NT3 (фиг. 1F), гена CNTF (фиг. 1G), гена IGF1 (фиг. 1H) соответственно;

hGH-TA - терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена фактора роста человека;

ori - ориджин репликации, служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Escherichia coli;

RNA-out - регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Escherichia coli SCS 110.

Отмечены уникальные сайты рестрикции.

На фиг.2

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена BDNF, в клетках первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM (Gibco cat # A12555) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BDNF с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.2 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена BDNF в клетках первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BDNF;

2 - кДНК гена BDNF в клетках первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BDNF;

3 - кДНК гена B2M в клетках первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BDNF;

4 - кДНК гена B2M в клетках первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BDNF.

В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг.3

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена VEGFA, в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC (ATCC PCS-420-012) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.3 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена VEGFA в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA;

2 - кДНК гена VEGFA в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA.

На фиг.4

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена BFGF в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC (ATCC CRL-1999™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BFGF с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.4 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена BFGF в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BFGF;

2 - кДНК гена BFGF в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BFGF;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BFGF;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-BFGF.

На фиг.5

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно гена NGF, в клетках эндотелия пупочной вены человека HUVEC (ATCC® PCS-100-013™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NGF с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.5 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена NGF в клетках эндотелия пупочной вены человека HUVEC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NGF;

2 - кДНК гена NGF в клетках эндотелия пупочной вены человека HUVEC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NGF;

3 - кДНК гена B2M в клетках эндотелия пупочной вены человека HUVEC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NGF;

4 - кДНК гена B2M в клетках эндотелия пупочной вены человека HUVEC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NGF.

На фиг.6

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена GDNF, в культуре клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 (ATCC CRL-3243) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-GDNF с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.6 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена GDNF в культуре клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-GDNF;

2 - кДНК гена GDNF в культуре клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-GDNF;

3 - кДНК гена B2M в культуре клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-GDNF;

4 - кДНК гена B2M в культуре клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-GDNF.

На фиг.7

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена NT3, в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC® CRL-2266™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NT3 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.7 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена NT3 в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NT3;

2 - кДНК гена NT3 в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NT3;

3 - кДНК гена B2M в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NT3;

4 - кДНК гена B2M в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-NT3;

На фиг.8

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена CNTF, в первичной культуре эпителиальных клеток роговицы (ATCC® PCS-700-010™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CNTF с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.8 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена CNTF в первичной культуре эпителиальных клеток роговицы до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CNTF;

2 - кДНК гена CNTF в первичной культуре эпителиальных клеток роговицы после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CNTF;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре эпителиальных клеток роговицы до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CNTF;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре эпителиальных клеток роговицы после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-CNTF.

На фиг.9

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена, а именно, гена IGF1, в первичной культуре эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC (ATCC® PCS-600-010™) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IGF1 с целью оценки способности проникать в эукариотические клетки и функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне мРНК.

На фиг.9 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена IGF1 в первичной культуре эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IGF1;

2 - кДНК гена IGF1 в первичной культуре эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IGF1;

3 - кДНК гена B2M в первичной культуре эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC до трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IGF1;

4 - кДНК гена B2M в первичной культуре эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC после трансфекции ДНК-вектором VTvaf17-IGF1.

На фиг.10

показана диаграмма концентрации белка BDNF в клеточном лизате первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM (Gibco cat # A12555) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BDNF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка BDNF в лизате клеток.

На фиг.10 отмечены следующие элементы:

культура А - первичная культура скелетных миобластов человека HSkM, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - первичная культура скелетных миобластов человека HSkM, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - первичная культура скелетных миобластов человека HSkM, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-BDNF.

На фиг.11

показана диаграмма концентрации белка VEGFA в лизате первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC (ATCC PCS-420-012) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген VEGFA.

На фиг.11 отмечены следующие элементы:

культура А - первичная культура гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - первичная культура гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC, трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - первичная культура гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC, трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA.

На фиг.12

показана диаграмма концентрации белка BFGF в лизате первичной культуре гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC (ATCC CRL-1999™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BFGF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BFGF.

На фиг.12 отмечены следующие элементы:

культура А - первичная культура гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - первичная культура гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - первичная культура гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-BFGF.

На фиг. 13

показана диаграмма концентрации белка NGF в лизате клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC (ATCC® PCS-100-013™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NGF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген NGF.

На фиг.13 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC , трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-NGF.

На фиг.14

показана диаграмма концентрации белка GDNF в лизате культуры клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 (ATCC CRL-3243) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-GDNF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка GDNF в лизате клеток.

На фиг.14 отмечены следующие элементы:

культура А - культура клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - культура клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - культура клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-GDNF.

На фиг.15

показана диаграмма концентрации белка NT3 в лизате клеточной культуры нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC® CRL-2266™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NT3 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка NT3 в лизате клеток.

На фиг.15 отмечены следующие элементы:

культура А - клеточная культура нейробластомы человека SH-SY5Y, трансфицированная водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - клеточная культура нейробластомы человека SH-SY5Y, трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - клеточная культура нейробластомы человека SH-SY5Y, трансфицированная ДНК-вектором VTvaf17-NT3.

На фиг.16

показана диаграмма концентрации белка CNTF в лизате первичной культуры эпителиальных клеток роговицы (ATCC® PCS-700-010™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-CNTF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка CNTF в лизате клеток.

На фиг.16 отмечены следующие элементы:

культура А - первичная культура эпителиальных клеток роговицы, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - первичная культура эпителиальных клеток роговицы, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - первичная культура эпителиальных клеток роговицы, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-CNTF.

На фиг.17

показана диаграмма концентрации белка IGF1 в лизате первичной культуры эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC (ATCC® PCS-600-010™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-IGF1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии на уровне белка, по изменению количества белка IGF1 в лизате клеток.

На фиг.17 отмечены следующие элементы:

культура А - первичная культура эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC, трансфицированных водным раствором дендримеров без плазмидной ДНК (контроль);

культура B - первичная культура эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура C - первичная культура эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-IGF1.

На фиг. 18

показана диаграмма концентрации белка GDNF в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген GDNF.

На фиг.18 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-GDNF;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка,

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-GDNF;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-GDNF;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг. 19

показана диаграмма концентрации белка BDNF в биоптатах икроножной мышцы трех пациентов после введения в икроножную мышцу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- BDNF, с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BDNF.

На фиг.19 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- BDNF;

П1II - биоптат икроножной мышцы пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П1;

П2I - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- BDNF;

П2II - биоптат икроножной мышцы пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П2;

П3I - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- BDNF;

П3II - биоптат икроножной мышцы пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат интактного участка икроножной мышцы пациента П3.

На фиг.20

показана диаграмма концентрации белка GDNF, NT3, CNTF и IGF1 в биоптатах кожи трех пациентов после сочетанного введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1 с целью оценки их функциональной активности, то есть экспрессии целевых генов на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущих целевой ген GDNF и/или NT3 и/или CNTF и/или IGF1.

На фиг.20 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг. 21

показана диаграмма концентрации белка VEGFA в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA.

На фиг.21 отмечены следующие элементы:

П1С - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA;

П1B - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17;

П1А - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка.

На фиг. 22

показана диаграмма концентрации белка BDNF, VEGFA, BFGF и NGF в биоптатах больше-берцовой мышцы трех крыс после сочетанного введения в больше-берцовую мышцу этих животных генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-BDNF, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-BFGF и VTvaf17-NGF с целью оценки их функциональной активности, то есть экспрессии целевых генов на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтических ДНК-векторов на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущих целевой ген BDNF и/или VEGFA и/или BFGF и/или NGF.

На фиг.22 отмечены следующие элементы:

К1I - биоптат больше-берцовой мышцы крысы К1 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-BDNF, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-BFGF и VTvaf17-NGF;

К1II - биоптат больше-берцовой мышцы крысы К1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К1III - биоптат контрольного интактного участка больше-берцовой мышцы крысы К1;

К2I - биоптат больше-берцовой мышцы крысы К2 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-BDNF, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-BFGF и VTvaf17-NGF;

К2II - биоптат больше-берцовой мышцы крысы К2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо)

К2III - биоптат контрольного интактного участка больше-берцовой мышцы крысы К2;

К3I - биоптат больше-берцовой мышцы крысы К3 в зоне введения смеси генотерапевтических ДНК векторов: VTvaf17-BDNF, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-BFGF и VTvaf17-NGF;

К3II - биоптат больше-берцовой мышцы крысы К3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

К3III - биоптат контрольного интактного участка больше-берцовой мышцы крысы К3.

На фиг. 23

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена BFGF в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC (Genlantis) до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- BFGF с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора животным.

На фиг.23 отмечены следующие кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена BFGF в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- BFGF;

2 - кДНК гена BFGF в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF;

3 - кДНК гена ACT в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- BFGF;

4 - кДНК гена ACT в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF.

В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (АСТ), приведенного в базе данных GenBank под номером AH001130.2.

Реализация изобретения

На основе ДНК-вектора VTvaf17 размером 3165 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека, предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ген BDNF (кодирует белок BDNF) , ген VEGFA (кодирует белок VEGFA), ген BFGF (кодирует белок BFGF), ген NGF (кодирует белок NGF), ген GDNF (кодирует белок GDNF), ген NT3 (кодирует белок NT3), ген CNTF (кодирует белок CNTF), ген IGF1 (кодирует белок IGF1) человека. Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, предпочтительным является отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК-вектора. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена его небольшими размерами.

Каждый из генотерапевтических ДНК-векторов: ДНК-вектор VTvaf17- BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 получали следующим образом: кодирующую часть целевого гена BDNF, или VEGFA, или BFGF, или NGF, или GDNF, или NT3, или CNTF, или IGF1 клонировали в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 и получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, SEQ ID №1, или VTvaf17-VEGFA, SEQ ID №2, или VTvaf17-BFGF, SEQ ID №3, или VTvaf17-NGF, SEQ ID №4, или VTvaf17-GDNF, SEQ ID №5, или VTvaf17-NT3, SEQ ID №6, или VTvaf17-CNTF, SEQ ID №7, или VTvaf17-IGF1, SEQ ID №8, соответственно. Кодирующую часть гена BDNF размером 750 п.н., или гена VEGFA размером 1242 п.н., или гена BFGF размером 872 п.н., или гена NGF размером 726 п.н., или гена GDNF размером 693 п.н., или гена NT3 размером 816 п.н., или гена CNTF размером 607 п.н., или гена IGF1 размером 481 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека. Для получения первой цепи кДНК генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 человека использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов. Расщепление продукта амплификации специфическими эндонуклеазами рестрикции проводили с учетом оптимальной процедуры дальнейшего клонирования, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводили по сайтам рестрикции BamHI, EcoRI, HindIII расположенными в полилинкере вектора VTvaf17. Выбор сайтов рестрикции проводили таким образом, чтобы клонированный фрагмент попадал в рамку считывания экспрессионной кассеты вектора VTvaf17, при этом белок-кодирующая последовательность не содержала сайты рестрикции для выбранных эндонуклеаз. При этом специалистам в данной области техники понятно, что методическая реализация получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 может варьировать в рамках выбора известных методов молекулярного клонирования генов, при этом эти способы подпадают под объем настоящего изобретения. Так, например, могут быть использованы различные последовательности олигонуклеотидов для амплификации гена BDNF, или VEGFA, или BFGF, или NGF, или GDNF, или NT3, или CNTF, или IGF1 различные эндонуклеазы рестрикции или такие лабораторные техники как безлигазное клонирование генов.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 обладает нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1, или ,SEQ ID №2, или SEQ ID №3, или SEQ ID №4, или SEQ ID №5, или SEQ ID №6, или SEQ ID №7, или SEQ ID №8 соответственно. При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора VTvaf17. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.

Способность проникать в эукариотические клетки и функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. Наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами, с использованием иммунологических методов. Наличие белка BDNF, или VEGFA, или BFGF, или NGF, или GDNF, или NT3, или CNTF, или IGF1 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1.

Таким образом для подтверждения эффективности экспрессии созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген, а именно, ген BDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего целевой ген, а именно, ген BFGF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- NGF, несущего целевой ген, а именно, ген NGF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего целевой ген, а именно, ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего целевой ген, а именно, ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего целевой ген, а именно, ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего целевой ген, а именно, ген IGF1 использовали следующие методы:

А) ПЦР в реальном времени - изменение накопления ампликонов кДНК целевых генов в лизате клеток человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий человека и животного генотерапевтическим ДНК-векторами;

B) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в лизате клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий человека генотерапевтическими ДНК-векторами;

C) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов;

D) Иммуноферментный анализ - изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген, а именно, ген BDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего целевой ген, а именно, ген BFGF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- NGF, несущего целевой ген, а именно, ген NGF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего целевой ген, а именно, ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего целевой ген, а именно, ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего целевой ген, а именно, ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего целевой ген, а именно, ген IGF1 выполняли:

А) трансфекцию генотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;

B) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;

С) введение в ткани человека и животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;

D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов, и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- BDNF, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1 (SEQ ID №1, или SEQ ID №2, или SEQ ID №3, или SEQ ID №4, или SEQ ID №5, или SEQ ID №6, или SEQ ID №7, или SEQ ID №8 соответственно).

Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген BDNF, или VEGFA, или BFGF, или NGF, или GDNF, или NT3, или CNTF, или IGF1, использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli SCS110-AF. Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, или ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, или ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, или ДНК-вектора VTvaf17-NGF, или ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, или ДНК-вектора VTvaf17-NT3, или ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, или ДНК-вектора VTvaf17-IGF1 соответственно с помощью методов трансформации (электропорации), общеизвестных специалистам в данной области техники. Полученный штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 используется для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 соответственно с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.

Для подтверждения получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.

Для подтверждения технологичности получения и возможности масштабирования до промышленного производства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген, а именно, ген BDNF или VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA или VTvaf17-BFGF, несущего целевой ген, а именно, ген BFGF или VTvaf17-NGF, несущего целевой ген, а именно, ген NGF или VTvaf17-GDNF, несущего целевой ген, а именно, ген GDNF или VTvaf17-NT3, несущего целевой ген, а именно, ген NT3 или VTvaf17-CNTF, несущего целевой ген, а именно, ген CNTF или VTvaf17-IGF1, несущего целевой ген, а именно, ген IGF1 выполняли ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно BDNF, или VEGFA, или BFGF, или NGF, или GDNF, или NT3, или CNTF, или IGF1.

Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика, обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BFGF, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NGF, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-GDNF, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NT3, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-CNTF, или генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IGF1, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 подпадают под объем настоящего изобретения.

Заявленное изобретение подтверждается примерами реализации настоящего изобретения.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген, а именно, гена BDNF.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF конструировали клонированием кодирующей части гена BDNF размером 750 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Кодирующую часть гена BDNF размером 750 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

BDNF_F GGATCCGCCACCATGACCATCCTTTTCCTTACTATG

BDNF_R AGGGAATTCCTATCTTCCCCTTTTAATGGTC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США).

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:

(а) ориджин репликации получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pBR322 с внесением точечной мутации;

(б) промоторный регион EF1а получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(в) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(г) регуляторный участок транспозона Tn10 РНК-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов;

(д) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pET-28 человека;

(е) полилинкер получали отжигом двух синтетических олигонуклеотидов.

ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты имеют перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а) и (б) с использованием олигонуклеотидов Ori-F и EF1-R, а также фрагменты (в), (г) и (д) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R. Далее, полученные участки объединяли путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и NcoI. В результате получали плазмиду, пока еще не содержащую полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды по сайтам BamHI и EcoRI, и лигирование с фрагментом (е). Таким образом, получали вектор, несущий ген устойчивости к канамицину, который фланкирован сайтами рестрикции SpeI. Далее этот участок выщепляли по сайтам рестрикции SpeI, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена BDNF и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-BDNF размером 3891 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1 и общей структурой изображенной на фиг.1A.

Пример 2.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, гена VEGFA.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA конструировали клонированием кодирующей части гена VEGFA размером 1242 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и HindIII. Кодирующую часть гена VEGFA размером 1242 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

VEGFA_F GGGGGATCCACCATGACGGACAGACAGACAGACACCGC

VEGFA_R TTTGGATCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC

и коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США), расщепление продукта амплификации и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII (New England Biolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA размером 4395 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №2 и общей структурой изображенной на фиг.1B.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 3

Получение ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего целевой ген, а именно, гена BFGF человека.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BFGF конструировали клонированием кодирующей части гена BFGF размером 872 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции HindIII, EcoRI. Кодирующую часть гена BFGF размером 872 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

BFGF_F GAGGAAGCTTCCACCATGGTGGGTGTGGGGGGTGGAGATG

BFGF_R GAGGGAATTCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGA

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-BFGF размером 4031 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №3 и общей структурой изображенной на фиг.1C.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 4.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF, несущего целевой ген, а именно, гена NGF.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NGF конструировали клонированием кодирующей части гена NGF размером 726 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции SalI и KpnI. Кодирующую часть гена NGF размером 726 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

NGF_F TTTGTCGACCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATC

NGF_R AATGGTACCTCAGGCTCTTCTCACAGCCTTCC

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-NGF размером 3889 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 и общей структурой изображенной на фиг.1D.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 5.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего целевой ген, а именно, гена GDNF.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-GDNF конструировали клонированием кодирующей части гена GDNF размером 693 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и HindIII. Кодирующую часть гена GDNF размером 693 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

GDNF_F GGGGGATCCACCATGCAGTCTTTGCCTAACAGCAATGG

GDNF_R TTTAAGCTTTCAGATACATCCACACCTTTTAGCG

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-GDNF размером 3846 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №5 и общей структурой изображенной на фиг.1E.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 6.

Получение ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего целевой ген, а именно, гена NT3 человека.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-NT3 конструировали клонированием кодирующей части гена NT3 размером 816 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHI и HindIII. Кодирующую часть гена NT3 размером 816 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

NT3_F AGGATCCACCATGGTTACTTTTGCCACGATC

NT3_R TATAAGCTTTCATGTTCTTCCGATTTTTCTC

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-NT3 размером 3969 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №6 и общей структурой изображенной на фиг.1F.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 7.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего целевой ген, а именно, гена CNTF.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-CNTF конструировали клонированием кодирующей части гена CNTF размером 607 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции BamHII и HindIII. Кодирующую часть гена CNTF размером 607 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

CNTF_F TTTGTCGACCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACC

CNTF_R AATGGTACCTACATTTTCTTGTTGTTAGCAATATAATGG

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-CNTF размером 3765 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №7 и общей структурой изображенной на фиг.1G.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 8.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего целевой ген, а именно, гена IGF1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-IGF1 конструировали клонированием кодирующей части гена IGF1 размером 481 п.н. в ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н. по сайтам рестрикции SalI и KpnI. Кодирующую часть гена IGF1 размером 481 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген) и ПЦР-амплификации с использованием олигонуклеотидов:

IGF1_F TTTGTCGACCACCATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCC

IGF1_R AATGGTACCTACTTGCGTTCTTCAAATGTACTTCC

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17-IGF1 размером 3639 п.н. с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №8 и общей структурой изображенной на фиг.1H.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 9.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген, а именно, ген BDNF, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена BDNF, в клетках первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM (Gibco cat # A12555) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BDNF, несущим ген BDNF человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Для оценки изменения накопления мРНК целевого гена BDNF, использовалась клетки первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM. Клеточную культуру HSkM выращивали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2) с использованием питательной среды DMEM. В процессе культивирования каждые 48 ч происходила смена ростовой среды.

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴клеток/лунку. Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BDNF, экспрессирующим ген BDNF человека, проводили с использованием Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора VTvaf17-BDNF (концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco, США) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamin 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.

В качестве контроля использовали клетки HSkM, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена BDNF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано выше.

Суммарную РНК из клеток HSkM выделяли с использованием Trizol Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. В лунку с клетками добавляли 1 мл Trizol Reagent и гомогенизировали с последующим прогреванием в течении 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14000g в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65°С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14000g в течении 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия, рН 5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°С в течении 10 мин с последующим центрифугированием при 14000g в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Определение уровня экспрессии мРНК гена BDNF после трансфекции проводили путем оценки динамики накопления ампликонов кДНК методом ПЦР в режиме реального времени. Для получения и амплификации кДНК, специфичной для гена BDNF человека, использовали олигонуклеотиды BDNF_SF и BDNF_SR:

BDNF_SF TTTGGTTGCATGAAGGCTGC

BDNF_SR GCCGAACTTTCTGGTCCTCA

Длина продукта амплификации - 199 п.н.

Реакцию обратной транскрипции и ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBR GreenQuantitect RT-PCR Kit (Qiagen, США) для ПЦР в режиме реального времени. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащих: 25 мкл QuantiTect SYBR Green RT-PCR MasterMix, 2,5 мM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42^оС - 30 минут, денатурация 98^оС - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94^оС - 15 сек, отжиг праймеров 60^оC - 30 сек и элонгацию 72^оС - 30 сек. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов BDNF и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество динамику накопления ампликонов кДНК генов BDNF и B2M оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 2.

Из фигуры 2 следует, что в результате трансфекции клеткок первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BDNF, уровень специфической мРНК гена BDNF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BDNF на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF для повышения уровня экспрессии гена BDNF в эукариотических клетках.

Пример 10.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена VEGFA, в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC (ATCC PCS-420-012) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим ген VEGFA человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру клеток гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC выращивали в среде с ростовыми добавками, приготовленной с использованием набора Vascular Smooth Muscle Cell GroCGRPh Kit (ATCC® PCS-100-042™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, экспрессирующим ген VEGFA человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток HBdSMC, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена VEGFA до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена VEGFA человека, использовали олигонуклеотиды VEGFA_SF и VEGFA_SR:

VEGFA_SF TCTGCTGTCTTGGGTGCATT

VEGFA_SR CCAGGGTCTCGATTGGATGG

Длина продукта амплификации - 167 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов VEGFA и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов VEGFA и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 3.

Из фигуры 3 следует, что в результате трансфекции первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, уровень специфической мРНК гена VEGFA человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген VEGFA на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA для повышения уровня экспрессии гена VEGFA в эукариотических клетках.

Пример 11.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего целевой ген, а именно, ген BFGF, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена BFGF в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC (ATCC CRL-1999™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF, несущим ген BFGF человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC выращивали в среде F-12K Medium (АТСС) с добавлением 0.05 мг/мл аскорбиновой кислоты, 0.01 мг/мл инсулина, 0.01 мг/мл трансферрина, 10 нг/мл селенита натрия, 0.03 мг/мл Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS), 10% сыворотки эмбрионов коров в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF, экспрессирующим ген BFGF человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток линии T/G HA-VSMC, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена BFGF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена BFGF человека, использовали олигонуклеотиды BFGF_SF и BFGF_SR:

BFGF_SF TGTGCTAACCGTTACCTGGC

BFGF_SR ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT

Длина продукта амплификации - 166 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов BFGF и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов BFGF и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 4.

Из фигуры 4 следует, что в результате трансфекции первичной культуры гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF уровень специфической мРНК гена BFGF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BFGF на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF для повышения уровня экспрессии гена BFGF в эукариотических клетках.

Пример 12.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF, несущего целевой ген, а именно, ген NGF, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена NGF, в клетках эндотелия пупочной вены человека HUVEC (ATCC® PCS-100-013™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NGF, несущим ген NGF человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC выращивали в среде Endothelial Cell Growth Kit-BBE (ATCC® PCS-100-040) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NGF, экспрессирующим ген NGF человека, проводили как описано в примере 9. В качестве контроля использовали культуру клеток HUVEC, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена NGF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена NGF человека, использовали олигонуклеотиды NGF_SF и NGF_SR:

NGF_SF TGAAGCTGCAGACACTCAGG

NGF_SR CTCCCAACACCATCACCTCC

Длина продукта амплификации - 200 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов NGF и B2M. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов NGF и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 5.

Из фигуры 5 следует, что в результате трансфекции клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NGF, уровень специфической мРНК гена NGF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген NGF на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NGF для повышения уровня экспрессии гена NGF в эукариотических клетках.

Пример 13.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего целевой ген, а именно, ген GDNF, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена GDNF, в культуре клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 (ATCC CRL-3243) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-GDNF, несущим ген GDNF человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Культуру клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 выращивали в среде MCDB131 (Gibco™, Кат. 10372019) без содержания глутамина и с добавлением 10 нг/мл рекомбинантного EGF (Sigma, E9644, США),10 мМ глутамина (Панэко, Россия), 1 мкг/мл гидрокортизона (Sigma H0888, США), 10 % HyClone™ Fetal Bovine Serum (Hyclone Laboratories Inc SH30068.03HI, США) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-GDNF, экспрессирующим ген GDNF человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток HMEC-1, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена GDNF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена GDNF человека, использовали олигонуклеотиды GDNF _SF и GDNF _SR:

GDNF_SF GTCACTGACTTGGGTCTGGG

GDNF_SR GCCTGCCCTACTTTGTCACT

Длина продукта амплификации - 152 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов GDNF и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов GDNF и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 6.

Из фигуры 6 следует, что в результате трансфекции культуры клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-GDNF, уровень специфической мРНК гена GDNF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген GDNF на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF для повышения уровня экспрессии гена GDNF в эукариотических клетках.

Пример 14.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего целевой ген, а именно, ген NT3, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена NT3 в клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC® CRL-2266™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NT3, несущим ген NT3 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Клеточную культуру нейробластомы человека SH-SY5Y выращивали в среде с использованием смеси питательных сред (1:1) ATCC-formulated Eagle’s Minimum Essential Medium (ATCC, 30-2003) и F12 Medium (ATCC® 30-2006™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5Ч10⁴клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NT3, экспрессирующим ген NT3 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве контроля использовали культуру клеток линии SH-SY5Y, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена NT3 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена NT3 человека, использовали олигонуклеотиды NT3_SF и NT3_SR:

NT3_SF AACTGCTGCGACAACAGAGA

NT3_SR GTACTCCCCTCGGTGACTCT

Длина продукта амплификации - 176 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов NT3 и B2M. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов NT3 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 7.

Из фигуры 7 следует, что в результате трансфекции клеточной культуры нейробластомы человека SH-SY5Y генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NT3 уровень специфической мРНК гена NT3 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген NT3 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3 для повышения уровня экспрессии гена NT3 в эукариотических клетках.

Пример 15.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего целевой ген, а именно, ген CNTF, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена CNTF, в первичной культуре эпителиальных клеток роговицы (ATCC® PCS-700-010™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CNTF, несущим ген CNTF человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру эпителиальных клеток роговицы выращивали в среде Corneal Epithelial Cell Basal Medium (ATCC® PCS-700-030™) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5Ч10⁴клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CNTF, экспрессирующим ген CNTF человека, проводили как описано в примере 9. В качестве контроля использовали первичную культуру эпителиальных клеток роговицы, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена CNTF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена CNTF человека, использовали олигонуклеотиды CNTF _SF и CNTF _SR:

CNTF_SF ACATCAACCTGGACTCTGCG

CNTF_SR TGGAAGTCACCTTCGGTTGG

Длина продукта амплификации - 178 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов CNTF и B2M. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов CNTF и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 8.

Из фигуры 8 следует, что в результате трансфекции первичной культуры эпителиальных клеток роговицы генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CNTF, уровень специфической мРНК гена CNTF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген CNTF на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CNTF для повышения уровня экспрессии гена CNTF в эукариотических клетках.

Пример 16.

Подтверждение способности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего целевой ген, а именно, ген IGF1, проникать в эукариотические клетки и подтверждение его функциональной активности на уровне экспрессии мРНК целевого гена. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген.

Оценивали изменения накопления мРНК целевого гена IGF1, в первичной культуре эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC (ATCC® PCS-600-010™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IGF1, несущим ген IGF1 человека. Количество мРНК определяли по динамике накопления ампликонов кДНК в реакции ПРЦ в реальном времени.

Первичную культуру эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC выращивали в среде Mammary Epithelial Cell Basal Medium (PCS-600-030) c добавлением Mammary Epithelial Cell Growth Kit (PCS-600-040) в стандартных условиях (37°С, 5% СО2). Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IGF1, экспрессирующим ген IGF1 человека, проводили как описано в примере 9. В качестве контроля использовали культуру клеток HMEC, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген (кДНК гена IGF1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Выделение РНК, реакцию обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени проводили как описано в примере 9, за исключением олигонуклеотидов с отличающимися от примера 9 последовательностями. Для амплификации кДНК, специфичной для гена IGF1 человека, использовали олигонуклеотиды IGF1_SF и IGF1_SR:

IGF1_SF CCATGTCCTCCTCGCATCTC

IGF1_SR ACCCTGTGGGCTTGTTGAAA.

Длина продукта амплификации - 159 п.н.

В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов IGF1 и B2M. В качестве референтного гена использовали ген B2M (Бета-2-микроглобулин) приведенный в базе данных GenBank под номером NM 004048.2. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов IGF1 и B2M, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1 (Bio-Rad, США). Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 9.

Из фигуры 9 следует, что в результате трансфекции первичной культуры эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IGF1, уровень специфической мРНК гена IGF1 человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IGF1 на уровне мРНК. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IGF1 для повышения уровня экспрессии гена IGF1 в эукариотических клетках.

Пример 17.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего ген BDNF, для повышения экспрессии белка BDNF в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка BDNF в лизате клеток первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM (Gibco cat # A12555) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BDNF, несущим ген BDNF человека.

Клеточную культуру скелетных миобластов человека HSkM человека выращивали как это описано в примере 9.

Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴клеток/лунку. Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена BDNF (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, несущий ген BDNF человека (С). Приготовление комплекса ДНК/дендример проводили по методике производителя (QIAGEN, SuperFect Transfection Reagent Handbook, 2002) с некоторыми изменениями. Для трансфекции клеток в одной лунке 24-луночного планшета к 1 мкг ДНК-вектора, растворенного в буфере ТЕ, добавляли культуральную среду до конечного объема 60 мкл, затем добавляли 5 мкл SuperFect Transfection Reagent и осторожно перемешивали пятикратным пипетированием. Комплекс инкубировали при комнатной температуре в течении 10-15 мин. Далее отбирали из лунок культуральную среду, лунки промывали 1 мл буфера PBS. К образовавшемуся комплексу добавляли 350 мкл среды, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, осторожно перемешивали и добавляли к клеткам. Клетки инкубировали с комплексом 2-3 часа при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.

Затем осторожно удаляли среду, промывали клеточный монослой 1 мл буфера PBS. Затем добавляли среду, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и инкубировали 24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2.

После трансфекции клетки промывали три раза PBS, далее к клеткам добавляли 1 мл PBS и подвергали трехкратному замораживанию/оттаиванию. Далее суспензию центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка BDNF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human BDNF ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F35-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка BDNF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 80 пг/мл, диапазон измерения - от 66 пг/мл до 16000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 10.

Из фигуры 10 следует, что трансфекция клеток первичной культуры скелетных миобластов человека HSkM генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BDNF приводит к увеличению количества белка BDNF по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BDNF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF для повышения уровня экспрессии BDNF в эукариотических клетках.

Пример 18.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего ген VEGFA, для повышения экспрессии белка VEGFA в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка VEGFA в лизате первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC (ATCC PCS-420-012) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим ген VEGFA человека. Клетки выращивали как описано в примере 10.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена VEGFA (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA, несущий ген VEGFA человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток HBdSMC проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка VEGFA проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human VEGFA ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F968-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка VEGFA, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 16 пг/мл, диапазон измерения - от 16 пг/мл до 1000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 11.

Из фигуры 11 следует, что трансфекция первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря человека HBdSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA приводит к увеличению количества белка VEGFA по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген VEGFA на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA для повышения уровня экспрессии VEGFA в эукариотических клетках.

Пример 19.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего ген BFGF, для повышения экспрессии белка BFGF в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка BFGF в лизате первичной культуры гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC (ATCC CRL-1999™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-BFGF, несущим ген BFGF человека. Клетки культивировали как описано в примере 11.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена BFGF (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-BFGF, несущий ген BFGF человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток T/G HA-VSMC проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка BFGF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human FGF2 / Basic FGF ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F955) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка BFGF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 63 пг/мл, диапазон измерения - от 63 пг/мл до 400 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 12.

Из фигуры 12 следует, что трансфекция первичной культуры гладкомышечных клеток аорты человека T/G HA-VSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF приводит к увеличению количества белка BFGF по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BFGF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF для повышения уровня экспрессии BFGF в эукариотических клетках.

Пример 20.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF, несущего ген NGF, для повышения экспрессии белка NGF в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка NGF в лизате клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC (ATCC® PCS-100-013™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NGF, несущим ген NGF человека. Клетки культивировали как описано в примере 12.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена NGF (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-NGF, несущий ген NGF человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток HUVEC проводили как описано в примере 17.

Количественное определение белка NGF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human NGF ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F9557-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка NGF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 3.12 пг/мл, диапазон измерения - от 3.12 пг/мл до 200 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 13.

Из фигуры 13 следует, что трансфекция культуры клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NGF приводит к увеличению количества белка NGF по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген NGF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF для повышения уровня экспрессии NGF в эукариотических клетках.

Пример 21.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, для повышения экспрессии белка GDNF в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка GDNF в кондиционированной среде лизате культуры клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 (ATCC CRL-3243) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-GDNF, несущим ген GDNF человека. Клетки выращивали как описано в примере 13.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена GDNF (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-GDNF, несущий ген GDNF человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток HMEC-1 проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка GDNF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human GDNF ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F2435) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка GDNF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 4 пг/мл, диапазон измерения - от 31.2 пг/мл до 2000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 14.

Из фигуры 14 следует, что трансфекция культуры клеток эндотелия капилляров кожи человека линии HMEC-1 человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-GDNF приводит к увеличению количества белка GDNF по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген GDNF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF для повышения уровня экспрессии GDNF в эукариотических клетках.

Пример 22.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, для повышения экспрессии белка NT3 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка NT3 в лизате клеточной культуре нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC® CRL-2266™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-NT3, несущим ген NT3 человека. Клетки культивировали как описано в примере 14.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена NT3 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-NT3, несущий ген NT3 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендример и трансфекцию клеток SH-SY5Y проводили как описано в примере 17.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости добавляли 0,1 мл 1N HCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2М NaOH/0.5M HEPES (pH 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка. Количественное определение белка NT3 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human NT-3 ELISA (RayBiotech ELH-NT3-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка NT3, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 4 пг/мл, диапазон измерения - от 4 пг/мл до 3000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 15.

Из фигуры 15 следует, что трансфекция клеточной культуры нейробластомы человека SH-SY5Y генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NT3 приводит к увеличению количества белка NT3 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген NT3 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3 для повышения уровня экспрессии NT3 в эукариотических клетках.

Пример 23.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, для повышения экспрессии белка CNTF в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка CNTF в лизате первичной культуры эпителиальных клеток роговицы (ATCC® PCS-700-010™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-CNTF, несущим ген CNTF человека. Клетки культивировали как описано в примере 15.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена CNTF (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17-CNTF, несущий ген CNTF человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию эпителиальных клеток роговицы проводили как описано в примере 17.

Количественное определение белка CNTF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human CNTF ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F3977-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка CNTF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 3.2 пг/мл, диапазон измерения - от 7.81 пг/мл до 500 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 16.

Из фигуры 16 следует, что трансфекция первичной культуры эпителиальных клеток роговицы генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CNTF приводит к увеличению количества белка CNTF по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген CNTF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF для повышения уровня экспрессии CNTF в эукариотических клетках.

Пример 24.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1, для повышения экспрессии белка IGF1 в клетках млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка IGF1 в лизате первичной культуре эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC (ATCC® PCS-600-010™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-IGF1, несущим ген IGF1 человека. Клетки культивировали как описано в примере 16.

Для трансфекции использовали реагент SuperFect Transfection Reagent 6-го поколения (Qiagen, Германия). В качестве контроля использовали водный раствор дендримеров без ДНК-вектора (А), ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена IGF1 (В), в качестве трансфицируемых агентов - ДНК-вектор VTvaf17- IGF1, несущий ген IGF1 человека (С). Приготовление комплекса ДНК-дендримеры и трансфекцию клеток HMEC проводили как описано в примере 17.

Количественное определение белка IGF1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human IGF1 ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F11726) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка IGF1, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее 78 пг/мл, диапазон измерения - от 78 пг/мл до 5000 нг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графики, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 17.

Из фигуры 17 следует, что трансфекция культуры первичной культуры эпителиальных клеток молочной железы человека HMEC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- IGF1 приводит к увеличению количества белка IGF1 по сравнению с контрольными образцами, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген IGF1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1 для повышения уровня экспрессии IGF1 в эукариотических клетках.

Пример 25.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, для повышения экспрессии белка GDNF в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего целевой ген, а именно, ген GDNF и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка GDNF в коже человека при введении в кожу человека генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген человека GDNF.

С целью анализа изменения количества белка GDNF трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-GDNF, несущий ген GDNF и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена GDNF.

Пациент 1, женщина 43 года, (П1); пациент 2, женщина 62 года, (П2); пациент 3, мужчина, 49 лет, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-GDNF, который содержит кДНК гена GDNF и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК гена GDNF, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-GDNF, несущий ген GDNF вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human GDNF ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F2435) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Из фигуры 18 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-GDNF, несущего целевой ген GDNF человека, произошло существенное увеличение количества белка GDNF в сравнении с количеством белка GDNF в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген GDNF человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутрикожном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 26.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего ген BDNF, для повышения экспрессии белка BDNF в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген BDNF и реализуемости способа его применения оценивали изменение количества белка BDNF в мышечной ткани человека при введении генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген, а именно, ген BDNF человека.

С целью анализа изменения количества белка BDNF трем пациентам вводили в ткань икроножной мышцы генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, несущий ген BDNF с транспортной молекулой, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена BDNF с транспортной молекулой.

Пациент 1, мужчина 60 лет, (П1); пациент 2, женщина 52 года (П2); пациент 3, мужчина, 57 лет, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция), пробоподготовку проводили в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-BDNF, несущий ген BDNF вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину около 10 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BDNF, несущего ген BDNF - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагали медиально на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BDNF, несущего ген BDNF (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактного участка икроножной мышцы (III), используя устройство для взятия биопсии MAGNUM (BARD, США). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 20 куб. мм, масса - около 22 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение белка BDNF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор используя набор Human BDNF ELISA Kit (Sandwich ELISA) (LifeSpan BioSciences LS-F35-1) согласно методике производителя с детекцией оптической плотности при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка BDNF, входящим в состав набора. Чувствительность метода составляла не менее не менее 80 пг/мл, диапазон измерения - от 66 пг/мл до 16000 пг/мл. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 19.

Из фигуры 19 следует, что в икроножной мышце всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген, а именно, ген BDNF человека, произошло существенное увеличение количества белка BDNF в сравнении с количеством белка BDNF в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген BDNF человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при внутримышечном введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 27.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1, для повышения уровня экспрессии белков GDNF, NT3, CNTF и IGF1 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1, и реализуемости способа их применения оценивали изменения количества белка GDNF, NT3, CNTF и IGF1 в коже человека при сочетанном введении в кожу человека смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1.

С целью анализа изменения количества белка GDNF, NT3, CNTF и IGF1 трем пациентам вводили в кожу предплечья смесь генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий кДНК гена GDNF, NT3, CNTF и IGF1.

Пациент 1, мужчина 38 лет (П1); пациент 2, женщина 43 года (П2); пациент 3, мужчина, 48 лет (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Смесь (в соотношении 1:1:1:1) генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, который не содержит кДНК генов GDNF, NT3, CNTF и IGF1, каждый из которых растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и смесь генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1 вводили в количестве 4 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1 - 1,2 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке кожи предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1 (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков как это описано в примере 21 (количественное определение белка GDNF), примере 22 (количественное определение белка NT3), примере 23 (количественное определение белка CNTF), примере 24 (количественное определение белка IGF1).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка GDNF, NT3, CNTF и IGF1, входящим в состав каждого набора. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/). Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 20.

Из фигуры 20 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения смеси генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, несущего ген GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, несущего ген NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, несущего ген CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1, несущего ген IGF1 человека, произошло увеличение количества белка GDNF, NT3, CNTF и IGF1 в сравнении с количеством белка GDNF, NT3, CNTF и IGF1 в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген GDNF, NT3, CNTF и IGF1 человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-GDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NT3, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-CNTF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-IGF1 и подтверждает реализуемость способа их применения, в частности при внутрикожном сочетанном введении генотерапевтических ДНК-векторов в ткани человека.

Пример 28.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего ген VEGFA и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка VEGFA в тканях человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего ген VEGFA и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка VEGFA в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA.

Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим ген VEGFA, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген VEGFA.

Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5 % СО2 в среде DMEM с 10 % фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×10⁴ клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим ген VEGFA и плацебо - вектором VTvaf17, не несущим целевой ген VEGFA.

Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus Transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, и плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим целевой ген, а именно, ген VEGFA и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим целевой ген, а именно, ген VEGFA (C), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген VEGFA (плацебо) (B), а также из участков интактной кожи (A), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу в зоне отбора биоптата пациентов предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка VEGFA как это описано в примере 18.

Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 21.

Из фигуры 21 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим ген VEGFA, произошло увеличение количества белка VEGFA в сравнении с количеством белка VEGFA в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген VEGFA (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии VEGFA в тканях человека, в частности при введении аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA.

Пример 29.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего ген BDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего ген BFGF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF, несущего ген NGF, для повышения уровня экспрессии белков BDNF, VEGFA, BFGF и NGF в тканях млекопитающих.

Оценивали изменение количества белка BDNF, VEGFA, BFGF и NGF в больше-берцовой мышце крысы при введении в эту мышцу трем крысам смеси генотерапевтических векторов.

В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Эквимолярную смесь генотерапевтических ДНК-векторов растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Для получения генетической конструкции готовили комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI в соответствии с рекомендациями производителя. Объем вводимого раствора составлял 0,05 мл с суммарным количеством ДНК 100 мкг. Введение раствора осуществляли тоннельным методом иглой 33G на глубину 2 - 3 мм в зону больше-берцовой мышцы крысы.

Биопсийные образцы отбирали на 2 сутки после введения генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков мышцы в зоне введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов, несущих гены BDNF, VEGFA, BFGF, NGF (зона I), зоны введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (зона II), а также из интактных участков второй больше-берцовой мышцы животного ( зона III), используя устройство для взятия биопсии MAGNUM (BARD, США). Зону отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер каждого биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Каждый образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевых белков как это описано в примере 17 (количественное определение белка BDNF), примере 18 (количественное определение белка VEGFA), примере 19 (количественное определение белка BFGF), примере 20 (количественное определение белка NGF). Графические материалы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 22.

Из фигуры 22 следует, что в зоне больше-берцовой мышцы всех крыс (зона I), в которую вводилась смесь генотерапевтических векторов: генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, несущего целевой ген BDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего целевой ген BFGF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF, несущего целевой ген NGF, произошло увеличение количества белков BDNF, VEGFA, BFGF, NGF по сравнению с зоной II (зона плацебо) и зоной III (интактная зона). Полученные результаты свидетельствуют об эффективности сочетанного применения генотерапевтического ДНК-векторов VTvaf17-BDNF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-NGF, и подтверждает реализуемость способа их применения для повышения уровня экспрессии целевых белков в тканях млекопитающих.

Пример 30.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего ген BFGF и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка BFGF в клетках млекопитающих.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF, несущего ген BFGF оценивали изменение накопления мРНК целевого гена BFGF в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC (Genlantis) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF, несущим ген BFGF человека.

Клетки гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC выращивали в среде Bovine Smooth Muscle Cell Growth Mediumm (Sigma B311F-500) с добавлением сыворотки рогатого скота до 10% (Панэко, Россия). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF, несущим ген BFGF человека и ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген BFGF человека (контроль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификации и анализ данных проводили как описано в примере 11. В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (АСТ), приведенного в базе данных GenBank под номером AH001130.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов BFGF и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов BFGF и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).

Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 23.

Из фигуры 23 следует, что в результате трансфекции клеток гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF, уровень специфической мРНК гена BFGF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген BFGF на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BFGF для повышения уровня экспрессии гена BFGF в клетках млекопитающих.

Пример 31.

Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, и способ его получения.

Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, а именно штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1 соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BDNF, или ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BFGF, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NGF, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-GDNF, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-NT3, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-CNTF, или генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-IGF1, после чего клетки высеваются на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coli SCS110-AF для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., ген устойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола.

Полученные штаммы для наработки были внесены в коллекции Национального биоресурсного центра - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK с присвоением регистрационных номеров:

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF - регистрационный № ВКПМ В-13259, дата депонирования 24.09.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43213, дата депонирования 20.09.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA - регистрационный № ВКПМ В-13344, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43289, дата депонирования 22.11.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF - регистрационный № ВКПМ В-13278, дата депонирования 16.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43303, дата депонирования 13.12.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF - регистрационный № ВКПМ В-13273, дата депонирования 16.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43307, дата депонирования 13.12.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF - регистрационный № ВКПМ В-13258, дата депонирования 24.09.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43212, дата депонирования 20.09.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3 - регистрационный № ВКПМ В-13339, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43285, дата депонирования 22.11.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF - регистрационный № ВКПМ В-13276, дата депонирования 16.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43298, дата депонирования 13.12.2018;

штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 - регистрационный № ВКПМ В-13274, дата депонирования 16.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43304, дата депонирования 13.12.2018.

Пример 32.

Способ масштабирования получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 до промышленного объема.

Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF, (SEQ ID №1), или VTvaf17-VEGFA, (SEQ ID №2), или VTvaf17-BFGF, (SEQ ID №3), или VTvaf17-NGF, (SEQ ID №4), или VTvaf17-GDNF, (SEQ ID №5), или VTvaf17-NT3, (SEQ ID №6), или VTvaf17-CNTF, (SEQ ID №7), или VTvaf17-IGF1, (SEQ ID №8) проводили масштабную ферментацию штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно BDNF, или VEGFA, или BFGF, или NGF, или GDNF, или NT3, или CNTF, или IGF1. Каждый штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 получали на базе штамма Escherichia coli SCS110-AF (Cell and Gene Therapy LLC, Великобритания) по примеру 31 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1, несущим целевой ген, а именно, BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.

Ферментацию полученного штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- BDNF проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF.

Для ферментации штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BDNF готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121°С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер Techfors S (Infors HT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, рН 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3M ацетат натрия, 2М уксусная кислота, рН 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу А (Sigma, США) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore, США). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100кДа (Millipore, США) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, pH 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAE sepharose HP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-BDNF линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-BDNF объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штаммов Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1 проводили аналогичным образом.

Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- BDNF, или VTvaf17-VEGFA, или VTvaf17-BFGF, или VTvaf17-NGF, или VTvaf17-GDNF, или VTvaf17-NT3, или VTvaf17-CNTF, или VTvaf17-IGF1.

Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией белка, кодируемого данным геном, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.

Задача, поставленная в данном изобретении, а именно: конструирование генотерапевтических ДНК-векторов для повышения уровня экспрессии генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1, сочетающих в себе следующие свойства:

I) Эффективность повышения экспрессии целевых генов в эукариотических клетках за счет полученных генотерапевтических векторов с ограниченным размером векторной части;

III) Технологичность получения и возможность наработки в штаммах в промышленных масштабах;

IV) также задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производства этих генотерапевтических ДНК-векторов решена, что подтверждается примерами:

для I - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30

для II - пример 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30

для III - 1, 2, 3, 4, 5; 6; 7; 8, 31, 32

для IV - пример 31, 32.

Промышленная применимость:

Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ген BDNF, ген VEGFA, ген BFGF, ген NGF, ген GDNF, ген NT3, ген CNTF, ген IGF1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-BFGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-GDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-NT3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-CNTF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-IGF1, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа получения генотерапевтического ДНК-вектора, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

Перечень сокращений

VTvaf17 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vector therapeutic virus-antibiotic-free)

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

мл - миллилитр, мкл - микролитр

куб. мм - кубический миллиметр

л - литр

мкг - микрограмм

мг - миллиграмм

г - грамм

мкМ - микромоль

мМ - миллимоль

мин - минута

сек - секунда

об/мин - обороты в минуту

нм - нанометр

см - сантиметр

мВт - милливатт

о.е. ф-относительная единица флуоресценции

РВС - фосфатно-солевой буфер

Список литературы

1. Aloe, L.,Rocco, M.L.,Bianchi, P.,Manni, L., 2012. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use. J. Transl. Med. 10, 239.

2. Autry AE, Monteggia LM. Brain-derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders. Pharmacol Rev 2012; 64: 238-258.

3. Bothwell, M., 2014. NGF, BDNF, NT3, and NT4. Handb. Exp. Pharmacol. 220, 3-15.

4. Briand LA, Blendy JA. Molecular and genetic substrates linking stress and addiction. Brain Res 2010; 1314: 219-234.

5. Chu, T.-H., Li, S.-Y.,Guo, A.,Wong, W.-M., Yuan, Q.,Wu, W., 2009. Implantation of neurotrophic factor-treated sensory nerve graft enhances survival and axonal regeneration of motoneurons after spinal root avulsion. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 68, 94-101.

6. Connor B, Sun Y, von Hieber D, Tang SK, Jones KS, Maucksch C. AAV1/2-mediated BDNF gene therapy in a transgenic rat model of Huntington’s disease. Gene Ther. 2016 Mar;23(3):283-95.

7. Dijkhuizen, P.A., Pasterkamp, R.J., Hermens, W.T., de Winter, F., Giger, R.J., Verhaagen, J., 1998. Adenoviral vector-mediated gene delivery to injured rat peripheral nerve. J. Neurotrauma 15, 387-397.

8. Draft Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf.

9. Eggers, R., de Winter, F., Hoyng, S.a., Roet, K.C.D., Ehlert, E.M. Malessy, M.J.a,Verhaagen, J., Tannemaat, M.R., 2013. Lentiviral vector-mediated gradients of GDNF in the injured peripheral nerve: effects on nerve coil formation, Schwann cell maturation and myelination Deli MA, ed. PLoS One 8, e71076.

10. Eggers, R.,Hendriks, W.T.J.,Tannemaat, M.R.,van Heerikhuize, J.J.,Pool, C.W.,Carlstedt, T.P., Zaldumbide, A.,Hoeben, R.C.,Boer, G.J.,Verhaagen, J., 2008. Neuroregenerative effects of lentiviral vector-mediated GDNF expression in reimplanted ventral roots. Mol. Cell. Neurosci. 39, 105-117.

11. Fine, E.G.,Decosterd, I., M., Zurn, A.D.,Aebischer, P., Papalozos, M., 2002. GDNF and NGF released by synthetic guidance channels support sciatic nerve regeneration across a long gap. Eur. J. Neurosci. 15, 589-601.

12. Godinho, M.J., Teh, L., Pollett, M.A.,Goodman, D., Hodgetts, S.I., Sweetman, I.,Walters, M., Verhaagen, J., Plant, G.W., Harvey, A.R., 2013. Immunohistochemical, ultrastructural and functional analysis of axonal regeneration through peripheral nerve grafts containing Schwann cells expressing BDNF, CNTF or NT3. PLoS One 8, e69987.

13. Gomez-Vargas Andrew, Gonzalo Hortelano, Michel Rathbone Ex-Vivo Gene Therapy Approach for Continuous Delivery of BDNF and Its Potential Use for Neurological Disorders Neurology Apr 2012, 78 (1 Supplement) IN6-1.008.

14. Grinberg YY, Zitzow LA, Kraig RP. Intranasally administered IGF-1 inhibits spreading depression in vivo. Brain Res. 2017 Dec 15;1677:47-57.

15. Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal Products EMA/CAT/80183/2014.

16. Guillard E, Gueret G, Guillouet M, Vermeersch V, Rannou F, Giroux-Metges MA, Pennec JP. Alteration of muscle membrane excitability in sepsis: possible involvement of ciliary nervous trophic factor (CNTF). Cytokine. 2013 Jul;63(1):52-57.

17. Haastert, K.,Lipokatic, E.,Fischer, M.,Timmer, M.,Grothe, C., 2006. Differentially promoted peripheral nerve regeneration by grafted Schwann cells over-expressing different FGF-2 isoforms. Neurobiol. Dis. 21, 138-153.

Schwann cells over-expressing different FGF-2 isoforms. Neurobiol. Dis. 21, 138-153.

18. Hornstein BD, Roman D, LM, Engevik MA, Zechiedrich L. Effects of Circular DNA Length on Transfection Efficiency by Electroporation into HeLa Cells. Ceña V, ed. PLoS ONE. 2016;11(12):e0167537.

19. Hu H, Lin H, Duan W, Cui C, Li Z, Liu Y, Wang W, Wen D, Wang Y, Li C. Intrathecal Injection of scAAV9-hIGF1 Prolongs the Survival of ALS Model Mice by Inhibiting the NF-kB Pathway. Neuroscience. 2018 Jun 15;381:1-10.

20. Hu, X.,Cai, J.,Yang, J., Smith, G.M., 2010. Sensory axon targeting is increased by NGF gene therapy within the lesioned adult femoral nerve. Exp. Neurol. 223, 153-165.

21. Hu, Y.,Leaver, S.G.,Plant, G.W.,Hendriks, W.T.J.,Niclou, S.P.,Verhaagen, J.,Harvey, A.R.,Cui, Q., 2005. Lentiviral-mediated transfer of CNTF to schwann cells within reconstructed peripheral nerve grafts enhances adult retinal ganglion cell survival and axonal regeneration. Mol. Ther. 11, 906-915.

22. Jung G, Sun J, Petrowitz B, Riecken K, Kruszewski K, Jankowiak W, Kunst F, Skevas C, Richard G, Fehse B, Bartsch U. Genetically modified neural stem cells for a local and sustained delivery of neuroprotective factors to the dystrophic mouse retina. Stem Cells Transl Med. 2013 Dec;2(12):1001-10.

23. Kale A, Joshi S, Pillai A, Naphade N, Raju M, Nasrallah H, Mahadik SP. Reduced cerebrospinal fluid and plasma nerve growth factor in psychotic patients. Schizophr Res . 2009 Aug 25.

24. Kiyota T, et al. FGF2 gene transfer restores hippocampal functions in mouse models of Alzheimer’s disease and has therapeutic implications for neurocognitive disorders. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(49):E1339-E1348.

25. Klimaschewski, L., Hausott, B., Angelov, D.N., 2013. The pros and cons of growth factors and cytokines in peripheral axon regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 108, 137-171.

26. Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29.

27. Lin LF, Doherty DH, Lile JD, Bektesh S, Collins F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 1993;260:1130-1132.

28. Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104.

29. Mason, M.R.J., Tannemaat, M.R.,Malessy, M.J.a, Verhaagen, J., 2011. Gene therapy for the peripheral nervous system: a strategy to repair the injured nerve? Curr. Gene Ther. 11, 75-89.

30. Mishra N, Lata S, Deshmukh P, Kamat K, Surolia A, Banerjee T. Insulin signaling pathway protects neuronal cell lines by Sirt3 mediated IRS2 activation. Biofactors. 2018 May;44(3):224-236.

31. Mitchelmore C, Gede L. Brain derived neurotrophic factor: epigenetic regulation in psychiatric disorders. Brain Res 2014; 1586: 162-172.

32. Monteleone P, Maj M. Dysfunctions of leptin, ghrelin, BDNF and endocannabinoids in eating disorders: beyond the homeostatic control of food intake. Psychoneuroendocrinology 2013; 38: 312-330.

33. Newman, J.P.,Verity, A.N.,Hawatmeh, S.,Fee, W.E.J.,Terris, D.J., 1996b. Ciliary neurotrophic factors enhances peripheral nerve regeneration. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 122, 399-403.

34. EA, Just MJ, Szromek AR, Araszkiewicz A. Melatonin and neurotrophins NT-3, BDNF, NGF in patients with varying levels of depression severity. Pharmacol Rep. 2016 Oct;68(5):945-51.

35. Osborne A, Wang AXZ, Tassoni A, Widdowson PS, Martin KR. Design of a Novel Gene Therapy Construct to Achieve Sustained Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling in Neurons. Hum Gene Ther. 2018 Jul;29(7):828-841.

36. Parkman H, Rao S, Reynolds J, et al. Neurotrophin-3 improves functional constipation. Am J Gastroenterol 2003;98:1338-1347.

37. Polyakova M, Stuke K, Schuemberg K, Mueller K, Schoenknecht P, Schroeter ML. BDNF as a biomarker for successful treatment of mood disorders: a systematic & quantitative meta-analysis. J Affect Disord 2015; 174: 432-440.

38. Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies.

39. Revilla S, Ursulet S, MJ, Castro-Freire M, U, Y, Bortolozzi A, L, Kaliman P, R, Sarkis C, Sanfeliu C. Lenti-GDNF gene therapy protects against Alzheimer's disease-like neuropathology in 3xTg-AD mice and MC65 cells. CNS Neurosci Ther. 2014 Nov;20(11):961-72.

40. Ruffini F, et al. Fibroblast growth factor-II gene therapy reverts the clinical course and the pathological signs of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Gene Ther. 2001;8(16):1207-1213.

41. S.A. Hoyng Fred De Winterab Sara Gnaviac Ralphde Boerb Lennard I. BoonaLaura M.Korversa Martijn R.Tannemaatad Martijn J.A. Malessyab Joost Verhaagen A comparative morphological, electrophysiological and functional analysis of axon regeneration through peripheral nerve autografts genetically modified to overexpress BDNF, CNTF, GDNF, NGF, NT3 or VEGFA. Experimental Neurology 261 (2014) 578-593.

42. Sahenk Z, Galloway G, Clark KR, Malik V, Rodino-Klapac LR, Kaspar BK, Chen L, Braganza C, Montgomery C, Mendell JR. AAV1.NT-3 gene therapy for charcot-marie-tooth neuropathy. Mol Ther. 2014 Mar;22(3):511-521.

43. Sahenk, Z, Seharaseyon, J.,Mendell, J.R., 1994. CNTF potentiates peripheral nerve regeneration. Brain Res. 655, 246-250.

44. Santosa, K.B. Jesuraj, N.J.,Viader, A.,MacEwan, M.,Newton, P.,Hunter, D.A.,Mackinnon, S.E., Johnson, P.J., 2013. Nerve allografts supplemented with schwann cells overexpressing glial-cell-line-derived neurotrophic factor. Muscle Nerve 47, 213-223.

45. Sapieha PS, et al. Fibroblast growth factor-2 gene delivery stimulates axon growth by adult retinal ganglion cells after acute optic nerve injury. Mol Cell Neurosci. 2003;24(3):656-672.

46. Shakhbazau, A.,Mohanty, C., Shcharbin, D.,Bryszewska, M.,Caminade, A.-M.,Majoral, J.-P., Alant, J.,Midha, R., 2013. Doxycycline-regulated GDNF expression promotes axonal regeneration and functional recovery in transected peripheral nerve. J. Control. Release 172, 841-851.

47. Sterne, G.D. Coulton, G.R.,Brown, R.A.,Green, C.J.,Terenghi, G., 1997. Neurotrophin-3- enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b. J. Cell Biol. 139, 709-715.

48. Storkebaum E., Lambrechts D., Carmeliet P. VEGFA: once regarded as a specific angiogenic factor, now implicated in neuroprotection // Bioessays. 2004. Т. 26. №9. - С. 943-954.

49. Sun D, et al. Basic fibroblast growth factor-enhanced neurogenesis contributes to cognitive recovery in rats following traumatic brain injury. Exp Neurol. 2009;216(1):56-65.

50. Tannemaat, M.R.,Eggers, R.,Hendriks, W.T.,De Ruiter, G.C.W.,Van Heerikhuize, J.J.,Pool, C. W., Malessy, M.J.a, Boer, G.J., Verhaagen, J., 2008. Differential effects of lentiviral vector-mediated overexpression of nerve growth factor and glial cell line-derived neurotrophic factor on regenerating sensory and motor axons in the transected peripheral nerve. Eur. J. Neurosci. 28, 1467-1479.

51. Utley, D.S., Lewin, S.L., Cheng, E.T., Verity, A.N., Sierra, D., Terris, D.J., 1996. Brain-derived neurotrophic factor and collagen tubulization enhance functional recovery after peripheral nerve transection and repair. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 122, 407-413.

52. Wan G, ME, Gigliello AR, Liberman MC, Corfas G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 2014 Oct 20;3.

53. Wennberg AMV, Hagen CE, Machulda MM, Hollman JH, Roberts RO, Knopman DS, Petersen RC, Mielke MM. The association between peripheral total IGF-1, IGFBP-3, and IGF-1/IGFBP-3 and functional and cognitive outcomes in the Mayo Clinic Study of Aging. Neurobiol Aging. 2018 Jun;66:68-74.

54. Wood, M.D., Kim, H., Bilbily, A., Kemp, S.W.P., Lafontaine, C., Gordon, T., Shoichet, M.S., Borschel, G.H., 2012. GDNF released from microspheres enhances nerve regeneration after delayed repair. Muscle Nerve 46, 122-124.

55. Wood, M.D., Moore, A.M., Hunter, D.A., Tuffaha, S., Borschel, G.H., Mackinnon, S.E., Sakiyama-Elbert, S.E., 2009. Affinity-based release of glial-derived neurotrophic factor 592 S.A. Hoyng et al. / Experimental Neurology 261 (2014) 578-593.

56. Wood, M.D.,Gordon, T.,Kim, H.,Szynkaruk, M.,Phua, P.,Lafontaine, C.,Kemp, S.W.,Shoichet, M.S.,Borschel, G.H., 2013. Fibrin gels containing GDNF microspheres increase axonal regeneration after delayed peripheral nerve repair. Regen. Med. 8, 27-37.

57. Yalvac ME, Amornvit J, Chen L, Shontz KM, Lewis S, Sahenk Z. AAV1.NT-3 gene therapy increases muscle fiber diameter through activation of mTOR pathway and metabolic remodeling in a CMT mouse model. Gene Ther. 2018 Apr;25(2):129-138.

58. Yalvac ME, Arnold WD, Braganza C, Chen L, Mendell JR, Sahenk Z. AAV1.NT-3 gene therapy attenuates spontaneous autoimmune peripheral polyneuropathy. Gene Ther. 2016 Jan;23(1):95-102.

59. Zhou Z, Shi P, Cai J. The effects of exogenous human glial cell line-derived neurotrophic factor on functional regeneration of severed femoral nerve and its underlying mechanisms. J Cell Biochem. 2018;1-7.

60. Молекулярная биология, 2011, том 45, № 1, с. 44-55.

Перечень сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

мл - миллилитр, мкл - микролитр

куб. мм - кубический миллиметр

л - литр

мкг - микрограмм

мг - миллиграмм

г - грамм

мкМ - микромоль

мМ - миллимоль

мин - минута

сек - секунда

об/мин - обороты в минуту

нм - нанометр

см - сантиметр

мВт - милливатт

о.е. ф-относительная единица флуоресценции

РВС - фосфатно-солевой буфер.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Селл энд Джин Терапи Лтд (CELL and GENE THERAPY Ltd), Общество с ограниченной ответственностью «Прорывные Инновационные Технологии»,

<120> Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF, IGF1 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- BFGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- NGF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- GDNF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- NT3, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- CNTF, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- IGF1, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 3891

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 1

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccgccacca tgaccatcct tttccttact atggttattt catactttgg 1260

ttgcatgaag gctgccccca tgaaagaagc aaacatccga ggacaaggtg gcttggccta 1320

cccaggtgtg cggacccatg ggactctgga gagcgtgaat gggcccaagg caggttcaag 1380

aggcttgaca tcattggctg acactttcga acacgtgata gaagagctgt tggatgagga 1440

ccagaaagtt cggcccaatg aagaaaacaa taaggacgca gacttgtaca cgtccagggt 1500

gatgctcagt agtcaagtgc ctttggagcc tcctcttctc tttctgctgg aggaatacaa 1560

aaattaccta gatgctgcaa acatgtccat gagggtccgg cgccactctg accctgcccg 1620

ccgaggggag ctgagcgtgt gtgacagtat tagtgagtgg gtaacggcgg cagacaaaaa 1680

gactgcagtg gacatgtcgg gcgggacggt cacagtcctt gaaaaggtcc ctgtatcaaa 1740

aggccaactg aagcaatact tctacgagac caagtgcaat cccatgggtt acacaaaaga 1800

aggctgcagg ggcatagaca aaaggcattg gaactcccag tgccgaacta cccagtcgta 1860

cgtgcgggcc cttaccatgg atagcaaaaa gagaattggc tggcgattca taaggataga 1920

cacttcttgt gtatgtacat tgaccattaa aaggggaaga taggaattcc ctgtgacccc 1980

tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta 2040

ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg 2100

aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc 2160

tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc 2220

tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg 2280

accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg 2340

ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga 2400

ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttacgc gtagaattgg taaagagagt 2460

cgtgtaaaat atcgagttcg cacatcttgt tgtctgatta ttgatttttg gcgaaaccat 2520

ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct taacttaatg attttgataa aaatcattaa 2580

ctagtccatg gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag 2640

ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag 2700

ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat 2760

agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 2820

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 2880

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 2940

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 3000

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 3060

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 3120

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 3180

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 3240

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 3300

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 3360

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 3420

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 3480

actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 3540

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 3600

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 3660

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 3720

tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 3780

caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 3840

cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc c 3891

<210> 2

<211> 4395

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 2