Комбинированная терапия для лечения злокачественной опухоли

Авторы патента:

БОНВИНИ Эцио (US)

ЛЕХЛЕЙДЕР Роберт Джозеф (US)

УИГГИНГТОН Джон Марк (US)

КОЕНИГ Скотт (US)

ПАНДЯ Наймиш Бхарат (US)

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K39/00 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

Владельцы патента RU 2733315:

МАКРОДЖЕНИКС, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается комбинированной терапии злокачественных опухолей. Для этого вводят вариантное химерное антитело 4D5 в комбинации с молекулой, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку. При этом антитело 4D5 содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и тяжелую цепь, которая содержит вариантный Fc-участок, проявляющий повышенную ADCC-активность, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13. Молекула, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности содержит вариантный Fc-участок, имеющий по меньшей мере одну модификацию относительно Fc-участка IgG1 дикого типа или Fc-участка IgG4, причем указанный вариантный Fc-участок указанной молекулы проявляет пониженную ADCC-активность относительно сопоставимой молекулы, которая содержит Fc-участок IgG1 дикого типа. Комбинированное введение указанных средств обеспечивает эффективное лечение опухолей, экспрессирующих HER2/neu, в том числе рефрактерных к терапии трастузумабом. 27 з.п. ф-лы, 7 табл., 8 пр., 15 ил.

Ссылки на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительными заявками на выдачу патента США с серийными номерами 62/175039 (поданной 12 июня 2015 года; на рассмотрении), 62/211109 (поданной 28 августа 2015 года; на рассмотрении) и 62/242640 (поданной 16 октября 2015 года; на рассмотрении), при этом упомянутые заявки включены в настоящий документ посредством ссылок в полном их объеме.

Ссылка на перечень последовательностей

Настоящая заявка включает один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. 1.821 и далее, которые раскрыты на машиночитаемом носителе (название файла: 1301-0120PCT_ST25.txt, создан 23 мая 2016 года и имеет размер 82289 байта), при этом упомянутый файл включен в настоящий документ посредством ссылки в полном его объеме.

Уровень техники

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит первую молекулу, которая специфически связывается с HER2/neu, и вторую молекулу, которая специфически связывается с рецептором клеточной поверхности, который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (или его лигандом). Настоящее изобретение, в частности, относится к варианту осуществления, в котором вторая молекула связывается с PD-1. Настоящее изобретение также относится к применению таких фармацевтических композиций для лечения злокачественной опухоли и других заболеваний.

Описание уровня техники

I. HER2/neu и рецепторы HER2/neu

В процессы клеточного роста и дифференцировки вовлекаются факторы роста, которые оказывают свои действия посредством специфических рецепторов, таких как тирозинкиназы. Связывание лиганда с тирозинкиназным рецептором запускает каскад событий, который в конечном итоге приводит к клеточной пролиферации и дифференцировке (Carpenter, G. et al. (1979) "Epidermal Growth Factor" Annu Rev Biochem. 48:193-216; Sachs et al. (1987) "Cell Differentiation And Bypassing Of Genetic Defects In The Suppression Of Malignancy" Cancer Res. 47:1981-1986). Тирозинкиназные рецепторы можно классифицировать на несколько групп по сходству последовательностей и различных признаков. Одним из таких семейств является семейство рецепторов эпидермального фактора роста или ErbB, которое включает в себя множество рецепторов, известных как HER-1 (также известных как erbB-1 или EGFR), HER2/neu (также известных как HER-2, erbB-2, c-neu или р185), HER-3 (также известных как erbB-3) и HER-4 (также известных как erbB-4) (см., например, Carpenter, G. et al. (1979) "Epidermal Growth Factor" Annu. Rev. Biochem. 48:193-216; Semba, K. et al. (1985) "A v-erbB-Related Protooncogene, c-erbB-2, Is Distinct From The c-erbB-1/Epidermal Growth Factor-Receptor Gene And Is Amplified In A Human Salivary Gland Adenocarcinoma," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501; Coussens, L. et al. (1985) "Tyrosine Kinase Receptor With Extensive Homology To EGF Receptor Shares Chromosomal Location With neu Oncogene" Science 230:1132-1139; Bargmann, C.I. et al. (1986) "Multiple Independent Activations Of The Neu Oncogene By A Point Mutation Altering The Transmembrane Domain Of p185" Cell 45:649-657; Kraus, M.H. et al. (1989) "Isolation And Characterization Of ERBB3, A Third Member Of The ERBB/Epidermal Growth Factor Receptor Family: Evidence For Overexpression In A Subset Of Human Mammary Tumors," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:9193-9197; Carraway, K.L. et al. (1994) "The erbB3 Gene Product Is A Receptor For Heregulin" J. Biol. Chem. 269:14303-14306; Plowman, G.D. et al. (1993) "Heregulin Induces Tyrosine Phosphorylation Of HER4/p180erbB4," Nature 366:473-475; и Tzahar, E. et al. (1994) "ErbB-3 and ErbB-4 Function As The Respective Low And High Affinity Receptors Of All neu Differentiation Factor/Heregulin Isoforms" Biol. Chem. 269: 25226-25233).

Рецепторы ErbB играют важную роль в распространении сигналов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку, подвижность и апоптоз клеток, как при нормальных процессах развития, так и при онкогенезе у человека (Slamon, D.J. et al. (1989) "Studies Of The HER-2/neu Proto-Oncogene In Human Breast And Ovarian Cancer" Science 244:707-712). Например, активация рецепторов erbB связана с последующими MAPK-Erk1/2 и фосфоинозитид-3-киназными (PI₃K)/AKT путями роста и выживания и стимулирует их. Дерегулирование этих путей при злокачественной опухоли связано с прогрессированием заболевания и рефрактерностью к терапии (Fukazawa, Т. et al. (1996) "Tyrosine Phosphorylation Of Cbl Upon Epidermal Growth Factor (EGF) Stimulation And Its Association With EGF Receptor And Downstream Signaling Proteins" J. Biol. Chem. 271:14554-14559; Tzahar, E. et al. (1996) "A Hierarchical Network Of Interreceptor Interactions Determines Signal Transduction By neu Differentiation Factor/Neuregulin And Epidermal Growth Factor" Mol. Cell. Biol. 16:5276-5287; Lange, C.A. et al. (1998) "Convergence Of Progesterone And Epidermal Growth Factor Signaling In Breast Cancer. Potentiation Of Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways" J. Biol. Chem. 273:31308-31316; Olayioye, M.A. et al. (1998) "ErbB-1 And ErbB-2 Acquire Distinct Signaling Properties Dependent Upon Their Dimerization Partner" Mol. Cell. Biol. 18:5042-5051; Hackel, P.O. et al. (1999) "Epidermal Growth Factor Receptors: Critical Mediators Of Multiple Receptor Pathways" Curr. Opin. Cell Biol. 11:184-189). Активация PI₃K/AKT способствует выживаемости клеток и повышенной агрессивности опухоли, и сообщалось, что AKT2 активируется и сверхэкспрессируется в HER2/neu-сверхэкспрессирующих злокачественных опухолях молочной железы (Shak, S. (1999) "Overview Of The Trastuzumab (Herceptin) anti-HER2 Monoclonal Antibody Clinical Program In HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer" Semin. Oncol. Suppl 12:71-77; Huang, S.M. et al. (2000) "Modulation Of Radiation Response After Epidermal Growth Factor Receptor Blockade In Squamous Cell Carcinomas: Inhibition Of Damage Repair, Cell Cycle Kinetics, And Tumor Angiogenesis" Clinical Cancer Res. 7:2166-2174; Bacus, S.S. et al. (2002) "AKT2 Is Frequently Upregulated In HER-2/neu-Positive Breast Cancers And May Contribute To Tumor Aggressiveness By Enhancing Cell Survival" Oncogene 21:3532-3540).

Передача сигналов семейством рецепторов ErbB инициируется связыванием лиганд а, что запускает димеризацию гомо- или гетерорецепторов, обратимое фосфорилирование тирозина цитоплаз магических хвостов и активацию путей внутриклеточной передачи сигналов (Cirti, A. et al. (2003) "The Deaf And The Dumb: The Biology Of ErbB-2 And ErbB-3," Exp. Cell Res. 284:54-65). Доступность лигандов, которые связываются с рецепторам ErbB и активируют их, опосредуется различными металлопротеиназами, такими как семейство цинк-зависимых металлопротеиназ ADAM (a disintegrin and metalloprotease - «дизинтегрин и металлопротеиназа»), которые катализируют отсоединение эктодоменом на клеточной поверхности определенных белков (см. Chang, С. and Werb, Z. (2001) "The Many Faces Of Metalloproteases: Cell Growth, Invasion, Angiogenesis And Metastasis," Trends in Cell Biology 11:S37-S43; Moss, M.L. et al. (2002) "Shedding Of Membrane Proteins By ADAM Family Proteases" Essays in Biochemistry 38:141-153; Seals, D.F. et al. (2003) "The ADAMs Family Of Metalloproteases: Multidomain Proteins With Multiple Functions," Genes and Development 17:7-30). В частности, было показано, что семейство ADAM отщепляет лиганды, ответственные за активацию рецепторов ErbB, таких как АРР и Notch (Blobel, С.Р. (2005) "ADAMs: Key Components In EGFR Signalling And Development" Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6:32-43).

HER2/neu является важным представителем семейства ErbB. Это рецепторный белок массой 185 кДа, который первоначально был идентифицирован как продукт трансформирующего гена ERBB2 из разных форм нейробластомы химически обработанных крыс. HER2/neu был широко исследован из-за его роли в нескольких формах карциномы человека и в развитии млекопитающих (Hynes, N.E. et al. (1994) "The Biology Of erbB-2/neu/HER-2 And Its Role In Cancer" Biochim. et Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall, W.C. et al. (1994) "The neu-Oncogene: Signal Transduction Pathways, Transformation Mechanisms And Evolving Therapies" Oncogene 9:2109-2123; Lee, K.F. et al. (1995) "Requirement For Neuregulin Receptor erbB2 In Neural And Cardiac Development" Nature 378:394-398). Человеческий ген HER2/neu и белок HER2/neu описаны в работе Semba, K. et al. (1985) "A v-erbB-Related Protooncogene, c-erbB-2, Is Distinct From The c-erbB-1/Epidermal Growth Factor-Receptor Gene And Is Amplified In A Human Salivary Gland Adenocarcinoma" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 6497-6501 и в работе Yamamoto, Т. et al. (1986) "Similarity Of Protein Encoded By The Human c-erb-B-2 Gene To Epidermal Growth Factor Receptor" Nature 319:230-234, а последовательность доступна в GenBank под номером доступа Х03363. HER2/neu содержит четыре домена: внеклеточный домен, с которым связывается лиганд, липофильный трансмембранный домен, консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен и С-концевой сигнальный домен, несущий несколько тирозиновых остатков, которые могут быть фосфорилированы (Plowman, G.D. et al. (1993) "Ligand-Specific Activation Of HER4/p180erbB4, A Fourth Member Of The Epidermal Growth Factor Receptor Family" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750). Последовательность внеклеточного домена HER2/neu (ECD) описана в работе Franklin, М.С. et al. (2004) "Insights Into ErbB Signaling From The Structure Of The ErbB2-Pertuzumab Complex" Cancer Cell. 5(4):317-328, и доступна под записью в Protein DataBank 1S78 (2004).

HER2/neu выполняет функцию рецептора фактора роста и зачастую экспрессируется клетками злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли яичников или злокачественной опухоли легких. HER2/neu сверхэкспрессируется в 25-30% случаев злокачественных опухолей молочной железы и яичников у человека, а его сверхэкспрессия ассоциирована с агрессивным клиническим течением и плохим прогнозом у пациентов, страдающих этим заболеванием (Slamon, D.J. et al. (1987) "Human Breast Cancer: Correlation Of Relapse And Survival With Amplification Of The HER-2/neu Oncogene," Science 235:177-182; Slamon, D.J. et al. (1989) "Studies Of The HER-2/neu Proto-Oncogene In Human Breast And Ovarian Cancer," Science 244:707-712). Сверхэкспрессию HER2/neu также наблюдали в клетках злокачественной опухоли других форм карциномы, включая различные карциномы желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, толстой кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря (см., например, работы King, C.R. et al. (1985) "Amplification Of A Novel v-erbB-Related Gene In A Human Mammary Carcinoma," Science 229:974; McCann, A. et al. (1990) "c-erbB-2 Oncoprotein Expression In Primary Human Tumors," Cancer 65:88-92; Yonemura, Y. et al. (1991) "Evaluation Of Immunoreactivity For erbB-2 Protein As A Marker Of Poor Short Term Prognosis In Gastric Cancer" Cancer Research 51:1034).

Активация HER2/neu коррелирует с уменьшением клинической восприимчивости к гормональной терапии у пациентов со злокачественной опухолью молочной железы (Wright, С. et. al. (1989) "Expression Of c-erbB-2 Oncoprotein: A Prognostic Indicator In Human Breast Cancer" Cancer Res. 49:2087-2090; Kurokawa, H. et al. (2001) "Inhibition Of erbB Receptor (HER) Tyrosine Kinases As A Strategy To Abrogate Antiestrogen Resistance In Human Breast Cancer" Clin. Cancer Res. 7:4436s-42s, 4411s-4412s). Действительно, экспрессии HER2/neu достаточно для обеспечения устойчивости к эстрогенам (Benz, C.C. et al. (1993) "Estrogen-Dependent, Tamoxifen-Resistant Tumorigenic Growth Of MCF-7 Cells Transfected With HER2/neu" Breast Cancer Res. Treat 24:85-95). HER2/neu, а также HER-3, по-видимому, участвует в возникновении устойчивости к гормонам у пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы. Примерно одна треть пациентов со злокачественной опухолью предстательной железы получают лечение гормональной терапией, направленное на блокировку действия тестикулярных и надпочечниковых андрогенов. Как и при злокачественной опухоли молочной железы, устойчивость неизбежна. Из недавно полученных данных видно, что сигналы, исходящие от HER2/neu и HER-3, индуцируют «гормонорефрактерное» состояние (Mellinghoff, I.K. et al. (2004) "HER2/neu Kinase-Dependent Modulation Of Androgen Receptor Function Through Effects On DNA Binding And Stability" Cancer Cell 6:517-527).

Известно несколько укороченных и сплайсированных вариантов HER2/neu. Например, укороченный ECD, расположенный в околоядерной цитоплазме некоторых клеток карциномы желудка, продуцируется альтернативным транскриптом, который образуется с помощью сигнала полиаденилирования в интроне (Yamamoto, Т. et al. (1986) "Similarity Of Protein Encoded By The Human c-erb-B-2 Gene To Epidermal Growth Factor Receptor;” Nature 319:230-234; и Scott, G.K. et al. (1993) "A Truncated Intracellular HER2/neu Receptor Produced By Alternative RNA Processing Affects Growth Of Human Carcinoma Cells;” Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257). ECD HER2/neu также может протеолитически отщепляться с клеток злокачественной опухоли молочной железы в культуре, и встречается в сыворотке некоторых пациентов со злокачественной опухолью, и может быть сывороточным маркером метастатической злокачественной опухоли молочной железы и общего неблагоприятного прогноза (Petch, L.A. et al. (1990) "A Truncated, Secreted Form Of The Epidermal Growth Factor Receptor Is Encoded By An Alternatively Spliced Transcript In Normal Rat Tissue," Mol. Cell. Biol. 10:2973-2982; Leitzel, K. et al. (1992) "Elevated Soluble c-erbB-2 Antigen Levels In The Serum And Effusions Of A Proportion Of Breast Cancer Patients" J. Clin. Oncol. 10:1436-1443; Scott, G.K. et al. (1993) "A Truncated Intracellular HER2/neu Receptor Produced By Alternative RNA Processing Affects Growth Of Human Carcinoma Cells" Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257; и Lee, H. et al. (1998) "Isolation And Characterization Of Four Alternate c-erbBS Transcripts Expressed In Ovarian Carcinoma-Derived Cell Lines And Normal Human Tissues" Oncogene 16:3243-3252). В некоторых клетках злокачественной опухоли, сверхэкспрессирующих HER2/neu, хорошо известный активатор металлопротеиназы, ацетат 4-аминофенилртути (АРМА), активирует металлопротеиназы, такие как ADAM 10 и ADAM 15, с расщеплением рецептора HER2/neu на две части: укороченный мембранный рецептор, известный как р95, и растворимый ECD, известный как р105 или ECD105 (см., например, работу Molina, М.А. et al. (2001) "Trastuzumab (Herceptin), A Humanized anti-Her2 Receptor Monoclonal Antibody, Inhibits Basal And Activated Her2 Ectodomain Cleavage In Breast Cancer Cells" Cancer Res. 61:4744-4749; патентную публикацию США №2004/0247602). Утрата ECD делает рецептор р95 конститутивно активной тирозинкиназой, которая может доставлять сигналы роста и выживания клеткам злокачественной опухоли (см., например, патент США №6541214).

Исследования показали, что у сверхэкспрессирующих HER2/neu клеток злокачественной опухоли молочной железы лечение антителами, специфичными к HER2/neu, в комбинации с химиотерапевтическими средствами (например, цисплатином, доксорубицином, таксолом) вызывает более высокий цитотоксический ответ, чем лечение только химиотерапией (Hancock, М.С. et al. (1991) "A Monoclonal Antibody Against The c-erbB-2 Protein Enhances The Cytotoxicity Of Cis-Diamminedichloroplatinum Against Human Breast And Ovarian Tumor Cell Lines" Cancer Res. 51:4575-4580; Arteaga, C.L. et al. (1994) "p185c-erbB-2 Signal Enhances Cisplatin-Induced Cytotoxicity In Human Breast Carcinoma Cells: Association Between An Oncogenic Receptor Tyrosine Kinase And Drug-Induced DNA Repair" Cancer 54:3758-3765; Pietras, R.J. et al. (1994) "Antibody to HER-2/neu receptor Blocks DNA Repair After Cisplatin In Human Breast And Ovarian Cancer Cells," Oncogene 9:1829-1838). Возможными механизмами, с помощью которых антитела к HER2/neu могут усиливать ответ на химиотерапевтические средства, являются модуляция экспрессии белка HER2/neu или препятствие репарации ДНК (Stancovski, I. et al. (1991) "Mechanistic Aspects Of The Opposing Effects Of Monoclonal Antibodies To The ERBB2 Receptor On Tumor Growth" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus, S.S. et al. (1992) "A Ligand For The erbB-2 Oncogene Product (gp30) Induces Differentiation Of Human Breast Cancer Cells" Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus, S.S. et al. (1993) "Neu Differentiation Factor (Heregulin) Induces Expression Of Intercellular Adhesion Molecule 1: Implications For Mammary Tumors," Cancer Res. 53:5251-5261; Klapper, L.N. et al. (1997) "A Subclass Of Tumor-Inhibitory Monoclonal Antibodies To ErbB-2/HER2 Blocks Crosstalk With Growth Factor Receptors" Oncogene 14:2099-2109; Klapper, L.N. et al. (2000) "Tumor-Inhibitory Antibodies To HER-2/ErbB-2 May Act By Recruiting c-Cbl And Enhancing Ubiquitination Of HER-2" Cancer Res. 60:3384-3388; Arteaga, C.L. et al. (2001) "The Epidermal Growth Factor Receptor: From Mutant Oncogene In Nonhuman Cancers To Therapeutic Target In Human Neoplasia," J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s).

Был разработан ряд моноклональных антител и низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназы, нацеленных на HER-1 или HER2/neu. Например, мышиное моноклональное антитело, известное как мышиное антитело «4D5», распознает внеклеточный эпитоп (аминокислоты 529-627) в богатомцистеином II домене HER2/neu, который находится очень близко к трансмембранному участку. Обработка клеток злокачественной опухоли молочной железы мышиным 4D5 и гуманизированным 4D5 частично блокирует активацию NDF/херегулина в HER2/neu-HER-3 комплексах, по результатам измерения с помощью анализов фосфорилирования рецепторов (Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An anti-p185HER2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Nail. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; Sliwkowski, M.X. et al. (1999) "Nonclinical Studies Addressing The Mechanism Of Action OfTrastuzumab (Herceptin)," Sem. in Oncol. 26:60-70; Ye, D. et al. (1999) "Augmentation Of A Humanized anti-HER2 mAb 4D5 Induced Growth Inhibition By A Human-Mouse Chimeric anti-EGF Receptor mAb C225, " Oncogene 18:731-738; Vogel, C.L. et al. (2001) "First-Line Herceptin Monotherapy In Metastatic Breast Cancer" Oncology 61(suppl 2):37-42; Vogel, C.L et al. (2002) "Efficacy And Safety Of Trastuzumab As A Single Agent In First-Line Treatment Of HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer" J. Clin. Oncol. 20(3):719-726; Fujimoto-Ouchi, K. et al. (2002) "Antitumor Activity Of Combinations Of anti-HER-2 Antibody Trastuzumab And Oral Fluoropyrimidines Capecitabine/5'-Dfurd In Human Breast Cancer Models" Cancer Chemother. Pharmacol. 49:211-216). Тем не менее при введении мышиного 4D5 людям потерпели клиническую неудачу, потому что у пациентов быстро развивались ответы с выработкой человеческих антител к мышиным антителам (НАМА), поэтому были разработаны гуманизированные формы мышиного 4D5. Последовательность и кристаллическая структура гуманизированного антитела 4D5 были описаны в патенте США №6054297, Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An anti-p185HER2 Antibody For Human Cancer Therapy" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S. A) 89:4285-4289; и Eigenbrot, C. et al. (1993) "X-ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of Humanized anti-pI85HER2 Antibody 4D5 And Comparison With Molecular Modeling" J. Mol. Biol. 229:969-995.

Была разработана гуманизированная форма мышиного антитела 4D5, известная как «трастузумаб» (продаваемая как Herceptin® от компании Genentech, Inc.), и она была одобрена для лечения злокачественных опухолей, которые характеризуются сверхэкспрессией или генной амплификацией HER2/neu, в том числе злокачественной опухоли молочной железы (Cobleigh, М.А. et al. (1999) "Multinational Study Of The Efficacy And Safety Of Humanized anti-HER2 Monoclonal Antibody In Women Who Have HER2-Overexpressing Metastatic Breast Cancer That Has Progressed After Chemotherapy For Metastatic Disease" J. Clin. Oncol. 17:2639-2648). Трастузумаб ингибирует АРМА-опосредованное расщепление HER2/neu на части ECD и р95 in vitro и полагают, что он выполняет свою функцию in vitro с помощью различных механизмов, включая возможное ингибирование отщепления HER2/neu (Pegram, M.D. et al. (1998) "Phase II Study Of Receptor-Enhanced Chemosensitivity Using Recombinant Humanized anti-p185HER2/neu Monoclonal Antibody Plus Cisplatin In Patients With HER2/neu-Overexpressing Metastatic Breast Cancer Refractory To Chemotherapy Treatment" J. Clin. Oncology 16(8):2659-2671; Baselga, J. et al. (2001) "Mechanism Of Action Of Trastuzumab And Scientific Update" Seminars in Oncology 28(5)(suppl. 16):4-11; Baselga, J. et al. (2001) "Mechanism Of Action Of anti-HER2 Monoclonal Antibodies," Ann. Oncol. 12 (suppl. 1):S35-S41). Тем не менее терапия трастузумабом обладает рядом недостатков, таких как кардиотоксичность и развитие ответов с выработкой человеческих антител к гуманизированным антителам (НАНА) у некоторых пациентов.

В настоящем документе представлены новые и улучшенные формы антител к HER2/neu для применения в различных формах терапии против злокачественных опухолей, например, сконструированные химерные антитела 4D5, имеющие повышенную аффинность или специфичность, уменьшенный потенциал в отношении развития ответов НАМА или НАНА, улучшенные эффекторные функции и т.п., а также они были описаны в РСТ публикации WO 2009/123894. В доклинических исследованиях для эффекторных клеток было показано, что такие сконструированные антитела 4D5 характеризуются повышенной ADCC-активностью в отношении положительных по HER2/neu опухолей, в том числе клеток с низким уровнем экспрессии HER2/neu, независимо от варианта FcγR (Nordstrom, J.L. et al. (2011) "Anti-tumor Activity And Toxicokinetics Analysis Of MGAH22, An anti-HER2 Monoclonal Antibody With Enhanced Fey Receptor Binding Properties" Breast Cancer Research 13(6):R123). Кроме того, по результатам исследования I фазы видно, что такие антитела являются хорошо переносимыми с многообещающей активностью у пациентов со злокачественной опухолью молочной железы и злокачественной опухолью желудка и пищевода, у которых была безуспешной терапия HER-2/neu, и у пациентов с экспрессирующими HER2/neu опухолями, у которых трастузумаб считается неэффективным (Burris, Н.А. (2013) "Phase I Study Of margetuximab (MGAH22), An FC-Modified Chimeric Monoclonal Antibody (MAb), in Patients (pts) With Advanced Solid Tumors Expressing The HER2 Oncoprotein" J. Clin. Oncol. Suppl: abstr. 3004). Таким образом, такие улучшенные антитела к HER2/neu открывают новые возможности лечения для пациентов, у которых опухоли экспрессируют низкие уровни HER2/neu, или для которых другие виды терапии на основе HER2/neu были безуспешными.

II. Клеточные иммунные ответы

Иммунная система людей и других млекопитающих отвечает за обеспечение защиты от инфекции и заболевания. Такая защита обеспечивается как гуморальным иммунным ответом, так и клеточным иммунным ответом. Гуморальный ответ приводит в результате к выработке антител и других биомолекул, которые способны распознавать и нейтрализовать инородные мишени (антигены). Для сравнения, при клеточном иммунном ответе происходит активация макрофагов, натуральных киллеров (NK) и антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов Т-клетками и высвобождение различных цитокинов в ответ на распознание антигена (Dong, С. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules" Immunolog. Res. 28(1):39-48).

Способность Т-клеток оптимально опосредовать иммунный ответ на антиген нуждается в двух различных сигнальных взаимодействиях (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation" Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). Во-первых, антиген, который дислоцируется на поверхности антиген-презентирующих клеток (АРС), должен быть презентирован антиген-специфической наивной CD4⁺ Т-клетке. Такое презентирование доставляет сигнал с помощью Т-клеточного рецептора (TCR), который заставляет Т-клетку инициировать иммунный ответ, который будет специфическим к презентируемому антигену. Во-вторых, серия костимулирующих и коингибирующих сигналов, опосредуемых взаимодействиями между АРС и различными молекулами на поверхности Т-клеток, запускает сначала активацию и пролиферацию Т-клеток и в конечном итоге их ингибирование. Таким образом, первый сигнал придает специфичность иммунному ответу, в то время как второй сигнал служит для определения природы, величины и продолжительности ответа.

Иммунная система жестко контролируется костимулирующими и коингибирующими лигандами и рецепторами. Такие молекулы обеспечивают второй сигнал для активации Т-клеток и обеспечивают сбалансированную сеть положительных и отрицательных сигналов для максимизации иммунных ответов к инфекции, при этом ограничивая иммунитет к «своим» клеткам (Wang, L. et al. (2011) "VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses" J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. et al. (2008) "The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections" Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). Ингибирующие пути, важные для сохранения аутотолерантности и модулирования продолжительности и величины иммунных ответов, совместно называют иммунными контрольными точками. Особое значение имеет связывание лигандов В7.1 (CD80) и В7.2 (CD86) антиген-презентирующей клетки с рецепторами CD28 и CTLA-4 у CD4⁺ Т-лимфоцита (Sharpe, А.Н. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation" Immunol. Rev. 229:307-321). Связывание B7.1 или B7.2 с CD28 стимулирует активацию Т-клеток; связывание В7.1 или В7.2 с CTLA-4 ингибирует такую активацию (Dong, С. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules" Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation" Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited" Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28 конститутивно экспрессируется на поверхности Т-клеток (Gross, J., et al. (1992) "Identification and Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse" J. Immunol. 149:380-388), в то время как экспрессия CTLA-4 быстро возрастает после активации Т-клеток (Linsley, P. et al. (1996) "Intracellular Trafficking Of CTLA4 and Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement" Immunity 4:535-543). Поскольку CTLA-4 является более высокоаффинным рецептором (Sharpe, А.Н. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2:116-126), связывание сначала инициирует пролиферацию Т-клеток (посредством CD28), а затем ингибирует ее (посредством начинающейся экспрессии CTLA-4), тем самым ослабляя эффект, если в пролиферации более нет необходимости.

Дополнительные исследования в лиганд ах рецептора CD28 привели к выявлению и описанию характеристик ряда родственных молекул В7 («суперсемейство В7») (Sharpe, А.Н. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily" Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited" Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands" Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy" Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity" J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance," Curr. Opin. Organ Transplant 13:366-372; Wang, S. et al. (2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses" Microbes Infect. 6:759-766). В настоящее время существует несколько известных членов семейства: В7.1 (CD80), В7.2 (CD86), индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), лиганд программируемой смерти 1 (PD-L1; В7-Н1), лиганд программируемой смерти 2 (PD-L2; B7-DC), В7-Н3, В7-Н4 и В7-Н6 (Collins, М. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands" Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC" Immunogeneucs 64(8):571-90).

III. PD-1

Белок программируемой смерти клетки 1 («PD-1») представляет собой мембранный белковый элемент I типа массой примерно 31 кДа обширного семейства регуляторов Т-клеток CD28/CTLA-4, который оказывает широкое отрицательное регулирующее действие на иммунные ответы (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-I, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death" EMBO J. 11:3887-3895; публикация заявки на выдачу патента США №№2007/0202100, 2008/0311117, 2009/00110667, патенты США №№6808710, 7101550, 7488802, 7635757, 7722868, РСТ публикация WO 01/14557).

PD-1 экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках и моноцитах (Agata, Y. et al. (1996) "Expression Of The PD-I Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes" Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al. (2002) "Expression Of Programmed Death I Ligands By Murine T-Cells And APC" J. Immunol. 169:5538-5545) и с низкими уровнями экспрессии у Т-клеток, относящихся к натуральным киллерам (NK) (Nishimura, Н. et al. (2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-I-Deficient Mice" J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity" Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).

Внеклеточный участок PD-1 состоит из одного иммуноглобулинового (Ig)V домена, который на 23% идентичен эквивалентному домену в CTLA-4 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity" Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). За внеклеточным IgV доменом следует трансмембранный участок и внутриклеточный хвост. Внутриклеточный хвост содержит два сайга фосфорилирования, расположенных в иммунорецепторном тирозиновом ингибирующей мотиве и иммунорецепторном тирозиновом активирующем мотиве, что свидетельствует о том, что PD-1 оказывает отрицательное регулирующее действие на сигналы TCR (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-I, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death" EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. et al. (2006) "Contribution Of The PD-LI/PD-I Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer," Immunol. Immunother. 56(5):739-745).

PD-1 опосредует ингибирование ним иммунной системы путем связывания с В7-Н1 и B7-DC (Flies, D.B. et al. (2007) "The New Bis: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260; патенты США №№6803192, 7794710; публикации заявок на выдачу патента США №№2005/0059051, 2009/0055944, 2009/0274666,2009/0313687; РСТ публикации WO 01/39722, WO 02/086083).

В7-Н1 и B7-DC широко экспрессируются на поверхностях человеческих и мышиных тканей, таких как сердце, плацента, мышца, эмбриональная печень, селезенка, лимфатические узлы и вилочковая железа, а также на клетках мышиной печени, легких, почек, островков поджелудочной железы и тонкой кишки (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity" Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). У людей экспрессия белка В7-Н1 была обнаружена в эндотелиальных клетках человека (Chen, Y. et al. (2005) "Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells" Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) "Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And В7-Н1" Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) "B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis" J. Immunol. 169:3581-3588), миокарде (Brown, J.A. et al. (2003) "Blockade Of Programmed Death-I Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production" J. Immunol. 170:1257-1266), синцитиальных трофобластах (Petroff, M.G. et al. (2002) "B7 Family Molecules: NovelImmunomodulators At The Maternal-Fetal Interface" Placenta 23:S95-S 101). Молекулы также экспрессируются резидентными макрофагами некоторых тканей, макрофагами, которые были активированы интерфероном (IFN)-γ или фактором некроза опухоли (TNF)-α (Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation" Nat. Immunol 2:261-268), и в опухолях (Dong, H. (2003) "B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity," J. Mol. Med. 81:281-287).

Было обнаружено, что взаимодействие между В7-Н1 и PD-1 является важным отрицательным костимулирующим сигналом для Т- и В-клеток (Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4): 288-298) и выполняет функцию индуктора гибели клеток (Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death" EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition" J. Molec. Med. 83:193-202). Более конкретно, было обнаружено, что в низких концентрациях взаимодействие между рецептором PD-1 и лигандом В7-Н1 приводит в результате к передаче ингибирующего сигнала, который сильно ингибирует пролиферацию антигенспецифических CD8⁺ Т-клеток; а в более высоких концентрациях взаимодействия с PD-1 не ингибируют пролиферацию Т-клеток, но заметно уменьшают выработку многих цитокинов (Sharpe, А.Н. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Было обнаружено, что пролиферация Т-клеток и выработка цитокинов как покоящимися, так и ранее активированными CD4 и CD8 Т-клетками и даже наивными Т-клетками из пуповинной крови ингибируются растворимыми слитыми белками B7-H1-Fc (Freeman, G.J. et al. (2000) "Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel В7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation" J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation" Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) "PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2" Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126).

Роль B7-H1 и PD-1 в ингибировании активации и пролиферации Т-клеток указывает на то, что эти биомолекулы могут служить терапевтическими мишенями для различных видов лечения воспаления и злокачественной опухоли. Поэтому было предложено применение антител к PD-1 для лечения инфекций и опухолей и положительной модуляции адаптивного иммунного ответа (см. публикации заявок на выдачу патентов США №№2010/0040614, 2010/0028330, 2004/0241745, 2008/0311117, 2009/0217401, патенты США №№7521051, 7563869, 7595048, РСТ публикации WO 2004/056875, WO 2008/083174). Антитела способны специфически связываться с PD-1, как сообщалось в работе Agata, Т. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes " Int Immunol. 8(5):765-772; и в работе Berger, R. et al. (2008) "Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies" Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051 (см. также патенты США №8008449 и №8552154, патентные публикации США №№2007/0166281, 2012/0114648, 2012/0114649, 2013/0017199, 2013/0230514 и 2014/0044738 и патентные РСТ публикации WO 2003/099196, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2006/121168, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2009/014708, WO 2009/073533, WO 2012/135408, WO 2012/145549 и WO 2013/014668).

IV. Злокачественные опухоли, экспрессирующие HER2/neu

Амплификация или сверхэкспрессия HER2/neu происходит примерно в 25-30% злокачественных опухолей молочной железы (Mitri, Z. et al. (2012). "The HER2 Receptor in Breast Cancer: Pathophysiology, Clinical Use, and New Advances in Therapy" Chemother Res Pract 2012:742193; Burstein, H.J. (2005) "The Distinctive Nature of HER2-Positive Breast Cancels," N. Engl. J. Med. 353(16):1652-4). Также известно, что сверхэкспрессия имеет место в злокачественной опухоли яичников, желудка и агрессивных формах злокачественной опухоли матки (см., например, работы Yonemura, Y. et al. (1991) "Evaluation Of Immunoreactivity For erbB-2 Protein As A Marker Of Poor Short Term Prognosis In Gastric Cancer" Cancer Research 51:1034; Lanitis, E. (2012) "Primary Human Ovarian Epithelial Cancer Cells Broadly Express HER2 At Immunologically-Detectable Levels" PloS One 7(11):e49829; и Tan, M. et al. (2007). "Molecular Mechanisms Of erbB2-Mediated Breast Cancer Chemoresistance," Adv. Exp. Med. Biol. 608:119-29). Как указано выше, сверхэкспрессия HER2/neu сильно связана с повышенной вероятностью рецидива заболевания и плохим прогнозом. Тем не менее, HER2/neu также является важной мишенью для средств против HER2/neu, в том числе моноклональных антител, которые нацелены на внеклеточный домен рецептора, таких как трастузумаб и маргетуксимаб, и низкомолекулярных конкурентов аденозинтрифосфата (АТФ), способных блокировать активность тирозинкиназы (TK) во внутриклеточном домене HER2, который является мишенью для специфических средств, таких как лапатиниб (Gandhi, M.D. et al. (2014) "Targeted Treatment Of Head And Neck Squamous-Cell Carcinoma: Potential Of Lapatinib" Onco. Targets Ther. 7:245-251; Opdam, F.L. et al. (2012) "Lapatinib For Advanced Or Metastatic Breast Cancer," Oncologist 17(4):536-542; Liao, J. et al. (2010) "Lapatinib: New Opportunities For Management Of Breast Cancer" Breast Cancer (Dove Med Press) 2:79-91).

Хотя эффективное целенаправленное воздействие на злокачественные опухоли, сверхэкспрессирующие HER2/neu, и улучшило выживаемость без прогрессирования (PFS) и общую выживаемость (OS), экспрессирующая HER2/neu метастатическая злокачественная опухоль молочной железы все еще остается неизлечимым заболеванием. Действительно, у многих пациентов со злокачественной опухолью молочной железы имеет место рецидив после лечения нацеленными на HER2/neu средствами, такими как трастузумаб и лапатиниб, что указывает на присутствие de novo или приобретенную устойчивость (Tan, М. et al. (2007). "Molecular Mechanisms Of erbB2-Mediated Breast Cancer Chemoresistance" Adv. Exp. Med. Biol. 608:119-29; Singh et al. (2014) "HER2-Positive Advanced Breast Cancer: Optimizing Patient Outcomes And Opportunities For Drug Development" British Journal of Cancer 111:1888-1898; Formisano, L. et al. (2014) "Epidermal Growth Factor-Receptor Activation Modulates Src-Dependent Resistance To Lapatinib In Breast Cancer Models" Breast Cancer Research 16:R45). Кроме того, низкий уровень экспрессии HER2/neu также может быть ассоциирован с плохим прогнозом (Gilcrease M.Z et al. (2009) "Even Low-Level HER2 Expression May Be Associated With Worse Outcome In Node-Positive Breast Cancer" Am J Surg Pathol. 2009 33(5):759-67). Тем не менее, к настоящему моменту не были одобрены средств терапии для нацеленного на HER2/neu лечения пациентов со злокачественными опухолями, имеющими низкие уровни экспрессии HER2/neu. Из этих данных особенно видна важность разработки усовершенствованных средств терапии злокачественных опухолей, экспрессирующих HER2/neu.

Таким образом, несмотря на предшествующие достижения, остается потребность в усовершенствованных композициях и способах лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих HER2/neu, и, в частности, метастатической злокачественной опухоли молочной железы и злокачественных опухолей, имеющих низкие уровни экспрессии HER2/neu. Настоящее изобретение относится к таким композициям и к способам их применения при лечении положительной по HER2/neu злокачественной опухоли молочной железы и других злокачественных опухолей, экспрессирующих HER2/neu.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

В частности, настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, предусматривающему введение нуждающемуся в том субъекту антитела, которое специфически связывает HER2/neu, и молекулы, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку.

Настоящее изобретение, в частности, относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело, которое специфически связывает HER2/neu, представляет собой «вариантное химерное антитело 4D5», содержащее вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13.

Настоящее изобретение, в частности, относится к варианту осуществления таких способов, при которых молекула, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку, является антителом к PD-1 или его антигенсвязывающим фрагментом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело к PD-1 или его антигенсвязывающему фрагмент:

(a) конкурирует за связывание с PD-1 с ниволумабом, пембролизумабом, пидилизумабом, антителом ЕН12.2Н7, антителом hPD-1 mAb 2, антителом hPD-1 mAb 7, антителом hPD-1 mAb 9, антителом hPD-1 mAb 15 или с другим антителом к PD-1, выбранным из таблицы 1; или

(b) имеет три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, антитела ЕН12.2Н7, антитела hPD-1 mAb 2, антитела hPD-1 mAb 7, антитела hPD-1 mAb 9, антитела hPD-1 mAb 15 или другого антитела к PD-1, выбранного из таблицы 1; или

(c) имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, антитела ЕН12.2Н7, антитела hPD-1 mAb 2, антитела hPD-1 mAb 7, антитела hPD-1 mAb 9, антитела hPD-1 mAb 15 или другого антитела к PD-1, выбранного из таблицы 1.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит Fc-участок. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых Fc-участок содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, которые уменьшают аффинность вариантного Fc-участка к FcγRIIIa (CD16A) и/или уменьшают ADCC-активность. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых модификации включают замену L234A, L235A или L234A и L235A.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело к PD-1 является ниволумабом, пембролизумабом, пидилизумабом, антителом ЕН12.2Н7, антителом hPD-1 mAb 2, антителом hPD-1 mAb 7, антителом hPD-1 mAb 9, антителом hPD-1 mAb 15 или другим антителом к PD-1, выбранным из таблицы 1. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антигенсвязывагощий фрагмент антитела к PD-1 является антигенсвязывающим фрагментом ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, антитела ЕН12.2Н7, антитела hPD-1 mAb 2, антитела hPD-1 mAb 7, антитела hPD-1 mAb 9, антитела hPD-1 mAb 15 или другого антитела к PD-1, выбранного из таблицы 1.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело, которое специфически связывает HER2/neu (в частности, вариантное химерное антитело 4D5), вводят в дозировке примерно 6-18 мг/кг массы тела каждые три недели, а молекулу, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку (в частности, антитело к PD-1), вводят в фиксированной дозировке примерно 200 мг каждые три недели. Настоящее изобретение также относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело, которое специфически связывает HER2/neu (в частности, вариантное химерное антитело 4D5), вводят в дозировке примерно 6-18 мг/кг массы тела каждые три недели, а молекулу, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку (в частности, антитело к PD-1), вводят в дозировке примерно 1-10 мг/кг массы тела каждые три недели. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело, которое специфически связывает HER2/neu (в частности, вариантное химерное антитело 4D5), вводят в дозировке примерно 6 мг/кг массы тела, примерно 10 мг/кг массы тела, примерно 15 мг/кг массы тела или примерно 18 мг/кг массы тела каждые три недели. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых молекула, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку (в частности, антитело к PD-1), вводят в дозировке примерно 1 мг/кг массы тела, примерно 2 мг/кг массы тела, примерно 3 мг/кг массы тела или примерно 10 мг/кг массы тела.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело, которое специфически связывает HER2/neu (в частности, вариантное химерное антитело 4D5), и молекулу, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку (в частности, антитело к PD-1), вводят субъекту одновременно в одной фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело, которое специфически связывает HER2/neu (в частности, вариантное химерное антитело 4D5), и молекулу, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку (в частности, антитело к PD-1), вводят одновременно в раздельных композициях так, чтобы обе композиции были введены в пределах 24-часового периода

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антитело, которое специфически связывает HER2/neu (в частности, вариантное химерное антитело 4D5), и молекулу, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку (в частности, антитело к PD-1), вводят субъекту последовательно в раздельных фармацевтических композициях, в частности, причем вторую вводимую композицию вводят по меньшей мере через 24 часа или более после введения первой вводимой композиции.

Настоящее изобретение, в частности, относится к вариантам осуществления таких способов, при которых злокачественной опухолью является экспрессирующая HER2/neu злокачественная опухоль. Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых злокачественной опухолью является злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль предстательной железы, злокачественная опухоль матки, злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль толстой кишки, эндотелиальная злокачественная опухоль, карцинома надпочечника, немелкоклеточная злокачественная опухоль легкого, злокачественная опухоль головы и шеи, злокачественная опухоль гортани, злокачественная опухоль печени, почечная злокачественная опухоль, глиобластома или злокачественная опухоль поджелудочной железы.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, которые дополнительно предусматривают стадию введения третьего терапевтического средства, в частности, причем третье терапевтическое средство представляет собой антиангиогенное средство, противоопухолевое средство, химиотерапевтическое средство или цитотоксическое средство.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых третье терапевтическое средство вводят одновременно с антителом, которое специфически связывает HER2/neu (в частности, вариантным химерным антителом 4D5), и/или молекулой, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку (в частности, антителом к PD-1), или отдельно от них.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антителом, которое специфически связывает HER2/neu, является маргетуксимаб, а молекулой, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку, является антитело к PD-1 под названием пембролизумаб.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам осуществления таких способов, при которых антителом, которое специфически связывает HER2/neu является маргетуксимаб, а молекулой, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку, является антитело к PD-1 под названием пидилизумаб.

Дополнительные преимущества и признаки настоящего изобретения будут очевидны из приведенного далее подробного описания, чертежей и примеров, которые иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны результаты выравнивания последовательностей, сравнивающего последовательности вариабельного домена легкой цепи «химерного антитела 4D5» (SEQ ID NO: 4) с вариабельным доменом легкой цепи «мышиного антитела 4D5» (SEQ ID NO: 3) и вариабельным доменом легкой цепи «гуманизированного антитела 4D5» (SEQ ID NO: 5).

На фиг. 2 показаны результаты сравнения последовательностей тяжелой цепи «химерного антитела 4D5», имеющего Fc-участок дикого типа («WT») (SEQ ID NO: 7), тяжелой цепи «вариантного химерного антитела 4D5 МТ1», которое имеет первый вариантный Fc-участок («МТ1») (SEQ ID NO: 9), тяжелой цепи «вариантного химерного антитела 4D5 МТ2», которое имеет второй вариантный Fc-участок («МТ2») (SEQ ID NO: 11), и тяжелой цепи «вариантного химерного антитела 4D5 МТ3», которое имеет третий вариантный Fc-участок («МТ3») (SEQ ID NO: 13). Остатки CDR обозначены черными полосками, показанными под такими остатками.

На фиг. 3 (секции А-С) показаны результаты анализа BIACore® связывания химерного антитела 4D5, имеющего Fc дикого типа («ch4D5 с Fc дикого типа») (секция A), 4D5 (секция В) и трастузумаба (секция С).

На фиг. 4 (секции A-D) показано влияние ch4D5-Ag (секции А и В) и Ch4D-FcMT1 (секции В и D) на пролиферацию CD16-158F+ (секции А и С) или CD16-158V+ (секции В и D) клеток SKBR3 in vitro.

На фиг. 5 показана повышенная противоопухолевая активность различных антител по настоящему изобретению у нетрансгенных мышей.

На фиг. 6 показана повышенная противоопухолевая активность различных антител по настоящему изобретению у hCD16A трансгенных мышей.

На фиг. 7 (секции А-В) показана роль mFcR.IV и hCD16A в ингибировании роста опухоли различными антителами по настоящему изобретению у нетрансгенных и трансгенных мышей.

На фиг. 8 показана повышенная противоопухолевая активность различных антител по настоящему изобретению у hCD16A трансгенных мышей.

На фиг. 9 (секции А-М) проиллюстрировано репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание клеток из различных линий клеток злокачественных опухолей по HER2/neu. В секциях A-L представлены различные линии клеток, т.е. секция A: MDA-MB-435; секция В: MDA-MB-231; секция С: А549; секция D: OVCAR-8; секция Е: MCF-7; секция F: ВТ-20; секция G: НТ-29; секция Н: ZR75-1; секция I: JIMT-1; секция J: MDA-MB-453; секция K: ВТ-474; секция L: SKBR-3; и секция М: mSKOV-3.

На фиг. 10 (секции А-В) показаны результаты анализа ADCC, осуществляемого для проверки способности вариантов химерного антитела 4D5 по настоящему изобретению опосредовать ADCC в линиях клеток злокачественных опухолей (MDA-MB-435 в секции A; MDA-MB-231 в секции В), имеющих очень низкие или отсутствующие уровни экспрессии HER2/neu (оценка DAKO равна 0).

На фиг. 11 (секции А-Е) показаны результаты анализа ADCC, осуществляемого для проверки способности вариантных химерных антител 4D5 по настоящему изобретению опосредовать ADCC в линиях клеток злокачественных опухолей (А549 в секции A; OVCAR-8 в секции В; MCF-7 в секции С; ВТ-20 в секции D; НТ-29 в секции Е), имеющих низкие уровни экспрессии HER2/neu (оценка DAKO равна 1+).

На фиг. 12 (секции А-В) показаны результаты анализа ADCC, осуществляемого для проверки способности вариантных химерных антител 4D5 по настоящему изобретению опосредовать ADCC в линиях клеток злокачественных опухолей (ZR75-1 в секции A; JIMT-1 в секции В), имеющих умеренные уровни экспрессии HER2/neu (оценка DAKO равна 2+).

На фиг. 13 (секции А-С) показаны результаты анализа ADCC, осуществляемого для проверки способности вариантных химерных антител 4D5 по настоящему изобретению опосредовать ADCC в линиях клеток злокачественных опухолей (MDA-МВ-453 в секции А; ВТ-474 в секции В; SKBR-3 в секции С; mSKOV-3 в секции D), имеющих высокие уровни экспрессии HER2/neu (оценка DAKO равна 3+).

На фиг. 14 показана диаграмма протокола оценки способности антител к PD-1 усиливать пролиферацию Т-клеток.

На фиг. 15 показано, что добавление PD-1 mAb 1 (5С4; BMS-936558; Bristol-Myeis Squibb, ниволумаба), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, пембролизумаба (ранее ламбролизумаб)) и PD-1 mAb 3 (ЕН12.2Н7; Dana Farber) в начале анализа алло-MLR индуцировало сильный пролиферативный ответ Т-клеток по сравнению с изотипическим контрольным антителом IgG1. Также показаны пролиферативные ответы, полученные с помощью PD-1 mAb 4 (СТ-011; CureTech, пидилизумаба), mAb к CTLA и mAb к LAG-3. Клетки-респондеры (R) являются панТ-клетками; клетки-стимуляторы (S) являются зрелыми дендритными клетками (mDC).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит:

(I) первое антитело, которое специфически связывается с HER2/neu, таким образом являясь полезным в качестве селективного цитотоксического средства для сверхэкспрессирующих HER2/neu клеток (например, вариантное химерное антитело 4D5 к HER2/neu, имеющее уменьшенное гликозилирование и измененные эффекторные функции по сравнению с известными антителами 4D5); и (II) второе антитело, которое специфически связывается с PD-1, таким образом являясь полезным в противодействии или блокировке связывания PD-1/PD-L1 и тем самым сохранении Т-клеточных ответов, предупреждая доставку отрицательного сигнала к Т-клеткам. Настоящее изобретение также относится к способам применения таких композиций при диагностике, прогнозировании и терапии таких заболеваний, как злокачественная опухоль.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, с помощью способов и композиций по настоящему изобретению, в которых объединены в комбинацию высокоактивное нацеленное антитело к HER2/neu с антителом к PD-1, можно оказывать непосредственное целенаправленное воздействие на опухоль путем связывания с HER2/neu на клетках злокачественной опухоли, тем самым уменьшая/блокируя активацию NDF/херегулина в HER2/neu-HER-3 комплексах и/или усиливая ADCC-активность в отношении положительных по HER2/neu опухолей, и непосредственного усиления эндогенных противоопухолевых иммунных ответов, например, связываясь с молекулами PD-1 клеточной поверхности, которые присутствуют на поверхностях истощенных и толерантных противоопухолевых эффекторных лимфоцитов, и тем самым ослабляя способность таких молекул клеточной поверхности связываться с их рецепторными лигандами, и тем самым способствуя активации иммунной системы. Эти особенности позволяют использовать такие способы лечения и композиции при лечении злокачественной опухоли.

Теперь подробнее рассмотрим предпочтительные в настоящее время варианты осуществления настоящего изобретения, которые совместно с чертежами и приведенными далее примерами предназначены для пояснения идей настоящего изобретения. Эти варианты осуществления описаны достаточно подробно, чтобы дать возможность специалистам в настоящей области техники осуществлять на практике настоящее изобретение, и следует понимать, что могут быть использованы другие варианты осуществления, а также что могут быть внесены структурные, биологические и химические изменения без отступления от идеи и объема настоящего изобретения. Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимается рядовым специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Для осуществления на практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, общепринятые методики молекулярной биологии (в том числе рекомбинантные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в компетенции специалистов в настоящей области техники. Такие методики в полной мере описаны в литературе, такой как: molecular CLONING: A LABORATORY MANUAL, Fourth Edition (Sambrook et al. Eds., 2012) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, С.A. et al. 2007) Garland Science, London, UK; MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al. Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al. Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; и DEVITA, HELLMAN, AND CANCER PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, РА. Конструирование антител рассмотрено в предварительных заявках на выдачу патентов США №№60/781564, 60/945523,61/015106 и 61/019051 ив US 20040185045, US 20040197347, US 20040197866, US 20050037000, US 20050064514, US 20050215767, US 20060134709, US 20060177439, US 20070004909, US 20070036799, US 20070037216, US 20070077246, US 20070244303, US 20080044429, US 20080050371, 11/869410, 11/952568, патенте США №7112439, WO 04/063351, WO 06/088494, WO 07/024249, WO 06/113665, WO 07/021841, WO 07/106707 и WO/2008/140603.

V. Определения

Настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, которая содержит первую молекулу, которая специфически связывается с HER2/neu, и вторую молекулу, которая специфически связывается с рецептором клеточной поверхности, который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (или его лигандом), для лечения таких заболеваний, как злокачественная опухоль. Настоящее изобретение, в частности, относится к варианту осуществления, в котором вторая молекула связывается с PD-1.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «ADCC» относится к антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, in vitro клеточноопосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR (например, моноциты, такие как натуральные киллеры (NK) и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «антитело» обозначает молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с полипептидом или белком или небелковой молекулой в связи с наличием на такой молекуле конкретного домена, или фрагмента, или конформации («эпитопа»). Эпитоп-содержащая молекула может обладать иммуногенной активностью, такой, что вызывает ответ с выработкой антител у животного; такие молекулы называют «антигенами». Эпитоп-содержащие молекулы не обязательно должны быть иммуногенными.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «антитело» охватывает моноклональные антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, поликлональные антитела, камелизированные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, иммунологически активные фрагменты антитела (например, фрагменты антитела, способные связываться с эпитопом, например, Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, Fv-фрагменты, фрагменты, содержащие домен VL и/или VH, или которые содержат 1, 2 или 3 определяющих комплементарность участка (CDR) такого домена VL (т.е. CDRL1, CDRL2 и/или CDRL3) или домена VH (т.е. CDRH1, CDRh2 и/или CDRh3)), которые специфически связывают антиген и т.д., бифункциональные или мультифункциональные антитела, связанные дисульфидным мостиком биспецифические Fv (sdFv), интраантитела и диатела и эпитоп-связывающие фрагменты любых из перечисленных выше. Так, в частности, термин «антитело» подразумевают как охватывающий молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулина, т.е. молекул, которые содержат антигенсвязывающий сайт.Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂) или подкласса (см., например, патентные публикации США №№20040185045, 20050037000, 20050064514, 20050215767, 20070004909, 20070036799, 20070077246 и 20070244303). Последние несколько десятилетий наблюдается оживление интереса в терапевтическом потенциале антител, а антитела становятся одним из лидирующих классов получаемых биотехнологическими методами лекарственных средств (Chan, С.Е. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases" Singapore Med. J. 50(7):663-666). Более 200 лекарственных средств на основе антител были одобрены для применения или находятся на стадии разработки.

Термин «химерное антитело» обозначает антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична антителу от одного вида (например, мыши) или класса или подкласса антитела, в то время как оставшаяся часть идентична или гомологична антителу другого вида (например, человека) или класса или подкласса антитела, при условии, что они характеризуются необходимой биологической активностью. К представляющим интерес химерным антителам по настоящему описанию относятся «примитизированные» антитела, содержащие антигенсвязываюшие последовательности вариабельного домена, полученные от отличного от человека примата (например, мартышковых, человекообразных обезьян и т.д.), и последовательности константного участка человека.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «моноклональное антитело» обозначает антитело популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в состав популяции, являются идентичными, за исключением возможных антител, обладающих встречающимися в природе мутациями, которые могут присутствовать в незначительном количестве, а применяемый в контексте настоящего документа термин «поликлональное антитело» обозначает антитело, полученное из популяции гетерогенных антител. Термин «моноклональное» указывает на характерных признак антитела как являющегося популяцией практически однородных антител, и его не следует истолковывать как обозначающий получение антитела каким-либо конкретным способом (например, с помощью гибридомы, фагового отбора, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает целые иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше под определением «антитела». Способы получения моноклональных антител известны из уровня техники. Одним способом, который можно использовать, является способ Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity" Nature 256:495-497, или его модификация. Как правило, моноклональные антитела разрабатывают на мышах, крысах или кроликах. Антитела получают путем иммунизации животного иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые содержат необходимый эпитоп. Иммуноген может представлять собой без ограничения первичные клетки, культивируемые линии клеток, злокачественные опухолевые клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или ткань. Применяемые для иммунизации клетки можно культивировать в течение некоторого периода времени (например, по меньшей мере 24 часа) перед их применением в качестве иммуногена. Клетки можно применять в качестве иммуногенов сами по себе или в комбинации с неденатурирующим адъювантом, таким как Ribi (см., например, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production" ILAR J. 37(3):119-125). Обычно клетки следует поддерживать интактными и предпочтительно жизнеспособными при применении в качестве иммуногенов. Интактные клетки могут обеспечивать для иммунизированных животных лучшую детекцию антигенов, чем разрушенные клетки. Применение денатурирующих или агрессивных адъювантов, например, адъюванта Фрейнда, может разрушить клетки и, следовательно, не рекомендуется. Иммуноген можно вводить многократно с периодическими интервалами, такими как два раза в неделю или раз в неделю, или можно вводить таким образом, чтобы сохранялась его жизнеспособность у животного (например, в рекомбинантной ткани). Альтернативно, существующие моноклональные антитела и любые другие эквивалентные антитела, которые являются специфическими для необходимого патогенного эпитопа, можно секвенировать и получить рекомбинантно любыми способами, известными из уровня техники. В соответствии с одним вариантом осуществления, такое антитело секвенируют, а полинуклеотидную последовательность затем клонируют в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующую представляющее интерес антитело, можно сохранять в векторе в клетке-хозяине, а затем клетку-хозяина можно размножить и заморозить для последующего применения. Полинуклеотидную последовательность таких антител можно применять для генетической манипуляции с целью создания моноспецифических или мультиспецифических (например, биспецифических, триспецифических и тетраспецифических) молекул по настоящему изобретению, а также антитела с оптимизированной аффинностью, химерного антитела, гуманизированного антитела и/или канинизированного антитела, для улучшения аффинности или других характеристик антитела.

Термин «гуманизированное» антитело обозначает химерную молекулу, обычно полученную с помощью рекомбинантных методик, имеющую антигенсвязывающий сайт иммуноглобулина от не относящегося к человеку вида и остальную иммуноглобулиновую структуру молекулы, которая основана на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Антигенсвязывающий сайт может содержать либо полные вариабельные домены, слитые на константных доменах, либо только CDR, привитые на соответствующие каркасные участки в вариабельных доменах. Антигенсвязывающие сайты могут быть дикого типа или модифицированы одной или несколькими аминокислотными заменами. Это устраняет константный участок в качестве иммуногена у людей, но возможность иммунного ответа на чужеродный вариабельный участок сохраняется (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). В другом подходе основное внимание уделяется не только обеспечению наличия константных участков человеческого происхождения, но и модификации вариабельных участков, а также изменению их формы на как можно более близкую к человеческой форме. Известно, что вариабельные участки как тяжелых, так и легких цепей содержат три CDR, которые варьируют в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют связывающую способность, фланкированные четырьмя каркасными участками (FR), которые относительно консервативны у заданного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении отличных от человеческих антител к конкретному антигену вариабельные участки можно «переформировать» или «гуманизировать» путем прививки CDR, полученных из отличного от человеческого антитела, на FR, присутствующие в подлежащем модификации человеческом антителе. Применение такого подхода к различным антителам рассмотрено в работе Sato, K. et al. (1993) "Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth" Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy" Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity" Science 239:1534-1536; Kettleborough, C.A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation" Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity" Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S.D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo" Bio/Technology 9:266-271; Co, M.S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.SA.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen" J. Immunol. 148:1149-1154. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). В соответствии с другими вариантами осуществления, гуманизированные антитела имеют один или несколько CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), которые изменены по их аминокислотной последовательности(-ям) относительно исходного антитела, которые также называют одним или несколькими CDR, «которые являются производными от» одного или нескольких CDR из исходного антитела (т.е. являются производными от таких CDR, которые получены благодаря сведениям об аминокислотных последовательностях таких CDR, и т.д.). Полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельный домен антитела, можно применять для создания таких производных и улучшения аффинности или других характеристик таких антител. Общий принцип гуманизации антитела предусматривает сохранение основной последовательности антигенсвязывающего сайта антитела при замене оставшейся нечеловеческой части антитела на последовательности человеческого антитела. Существует четыре общих стадии гуманизации моноклонального антитела. Эти стадии следующие: (1) определение нуклеотидной и прогнозируемой аминокислотной последовательности вариабельных доменов легких и тяжелых цепей исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела или канинизированного антитела, т.е. принятие решения о том, какой каркасный участок антитела применять в процессе гуманизации или канинизации, (3) фактические методологии/методики гуманизации или канинизации и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела См., например, патенты США №№4816567, 5807715, 5866692 и 6331415.

Естественные антитела (такие как антитела IgG) состоят из двух легких цепей в комплексе с двумя тяжелыми цепями. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен (VH), три константных домена (CH1, СН2 и СН3) и «шарнирный» домен («Н»), расположенный между доменами С H1 и СН2. Таким образом, основной структурной единицей естественных иммуноглобулинов (например, IgG) является тетрамер, имеющий две легкие цепи и две тяжелые цепи, обычно экспрессируемые в виде гликопротеина с массой приблизительно 150000 Да. Аминоконцевая («N-концевая») часть каждой цепи включает в себя вариабельный домен, содержащий приблизительно 100-110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена.

Карбоксиконцевая («С-концевая») часть каждой цепи определяет константный участок, причем легкие цепи имеют один константный домен, а тяжелые цепи обычно имеют три константных домена и шарнирный домен. Таким образом, структура легких цепей молекулы IgG представляет собой n-VL-CL-c, а структура тяжелых цепей IgG представляет собой n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (где n и с представляют собой соответственно N-конец и С-конец полипептида). Способность антитела связывать эпитоп антигена зависит от наличия и аминокислотной последовательности доменов VL и VH антитела. В результате взаимодействия легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела и, в частности, взаимодействия его доменов VL и VH образуется один из двух антигенсвязывающих сайтов естественного антитела Естественные антитела способны связываться только с одним видом эпитопа (т.е. они являются моноспецифическими), при этом они могут связывать несколько копий такого вида (т.е. характеризуются бивалентностью или мулыивалентностью). Вариабельные домены молекулы IgG состоят из определяющих комплементарность участков (CDR), которые содержат остатки, вступающие в контакт с эпитопом, и не относящихся к CDR сегментов, называемых каркасными сегментами (FR), которые обычно поддерживают структуру и определяют позиционирование петель CDR с тем, чтобы сделать такой контакт возможным (хотя некоторые каркасные остатки также могут вступать в контакт с антигеном). Таким образом, домены VL и VH имеют структуру n-FR1 -CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c. Полипептиды, которые представляют собой (или могут выступать в их роли) первый, второй и третий CDR легкой цепи антитела, в настоящем документе соответственно обозначены доменом CDR_L1, доменом CDR_L2 и доменом CDR_L3. Аналогичным образом, полипептиды, которые представляют собой (или могут выступать в их роли) первый, второй и третий CDR тяжелой цепи антитела, в настоящем документе соответственно обозначены доменом CDR_H1, доменом CDR_H2 и доменом CDR_H3. Таким образом, термины домен CDR_L1, домен CDR_L2, домен CDR_L3, домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 относятся к полипептидам, которые при включении в белок приводят к тому, что белок становится способным связываться со специфическим эпитопом независимо от того, является ли белок антителом, имеющим легкую и тяжелую цепи, или диателом, или одноцепочечной связывающей молекулой (например, scFv, BiTe и т.д.) или другим типом белка. Следовательно, применяемый в контексте настоящего документа термин «антигенсвязывающий домен» обозначает такую часть антигенсвязывающей молекулы, которая отвечает за способность такой молекулы специфически связывать эпитоп антигена Антигенсвязывающий фрагмент может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 доменов CDR такого антитела, и хотя он и способен специфически связываться с таким эпитопом, может характеризоваться специфичностью, аффинностью или селективностью в отношении такого эпитопа, которые отличаются от таковых у такого антитела. Предпочтительно, тем не менее, антигенсвязывающий фрагмент будет содержать все 6 доменов CDR такого антитела. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой отдельную полипептидную цепь (например, scFv) или может содержать две или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет аминоконец и карбоксиконец (например, диатело, Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент и т.д.).

Применяемый в контексте настоящего документа термин «диатело» относится к комплексу из двух или более полипептидных цепей или белков, каждая из которых содержит по меньшей мере один V_L и один V_H домен или его фрагмент, причем оба домена находятся в одной полипептидной цепи, но отделены промежуточным линкером, который является слишком коротким для возможности их соединения для образования эпитоп-связываюший сайт; таким образом для образования диатела необходимы по меньшей мере две полипептидные цепи или два белка. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, «молекула диатела» включает молекулы, содержащие «Fc» или «шарнирный-Fc-участок» антитела. Полипептидные цепи в комплексе могут быть одинаковыми или отличаться, например, молекула диатела может представлять собой гомомультимер или гетеромультимер. В соответствии с конкретными аспектами, «молекула диатела» включает димеры или тетрамеры или указанные полипептидные цепи, содержащие как V_L, так и VH домен (например, молекула гомодимерного антитела, молекула гетеродимерного антитела и т.д.). Отдельные полипептидные цепи, содержащие мультимерные белки могут быть ковалентно соединены по меньшей мере в один другой пептид мулыимера с помощью межцепочечных дисульфидных связей.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «злокачественная опухоль» обозначает заболевание, характеризующееся наличием новообразования или опухоли, которые образуются в результате аномального неконтролируемого роста клеток (при этом такие клетки являются «клетками злокачественной опухоли»). Применяемый в контексте настоящего документа термин злокачественная опухоль определенно включает различные формы лейкоза и лимфомы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, термин «злокачественная опухоль» обозначает заболевание, которое характеризуется наличием доброкачественной опухоли, которая сохраняет свою локализацию. Тем не менее, в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, термин «злокачественная опухоль» обозначает заболевание, характеризующееся наличием злокачественной опухоли, которая прорастает в близлежащие структуры организма. Такие опухоли могут дополнительно обладать способностью распространяться к отдаленным участкам. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, злокачественная опухоль ассоциирована с клетками злокачественной опухоли, которые экспрессируют специфический антиген злокачественной опухоли. В соответствии с некоторыми аспектами, применяемый в контексте настоящего документа термин злокачественная опухоль, в частности, обозначает экспрессирующую HER2/neu злокачественную опухоль. Таким образом, применяемый в контексте настоящего документа термин «экспрессирующая HER2/neu злокачественная опухоль» обозначает злокачественные опухоли, которые характеризуются наличием клеток злокачественной опухоли, которые экспрессируют поддающиеся обнаружению уровни HER2/neu. Клетки злокачественной опухоли таких экспрессирующих HER2/neu злокачественных опухолей могут иметь высокий уровень экспрессии HER2/neu или низкий уровень экспрессии HER2/neu. Применяемый в контексте настоящего документа термин «высокий уровень HER2/neu» обозначает злокачественную опухоль, которая характеризуется наличием клеток злокачественной опухоли, которые имеют оценку, равную 2+ или более, при использовании классификации HercepTest® (Dako Cytomation California Inc., Карпентерия, Калифорния), или субъекта или пациента, имеющего клетки злокачественной опухоли, которые были выявлены как сверхэкспрессирующие Her2/neu, например, с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Применяемый контексте настоящего описания «низкий уровень HER2» обозначает злокачественную опухоль, которая характеризуется клетками злокачественной опухоли, которые имеют оценку менее 2+ (например, 1+) в классификации herceptest® (Dako Cytomation California Inc., Карпентерия, Калифорния). Доступны различные диагностические/прогностические анализы для определения уровня экспрессии HER2 клетками злокачественной опухоли. В соответствии с одним аспектом, сверхэкспрессию HER2 можно проанализировать иммуногистохимическим методом (IHC), например, с помощью HercepTest® (Dako). Соответственно, на залитых парафинов срезах ткани, полученных в результате биопсии опухоли, можно провести анализ IHC и согласовать с критерием интенсивности окрашивания белка HER2. Альтернативно или дополнительно, анализы FISH, такие как INFORM™ (наборы для которых продаются компанией Ventana, Аризона) или PATHVISION™ (Vysis, Иллинойс) можно осуществлять на фиксированной формалином и залитой парафином ткани опухоли для определения величины (если она существует) сверхэкспрессии HER2 в опухоли.

Применяемые в контексте настоящего документа термины «нарушение» и «заболевание» применяют взаимозаменяемо для обозначения состояния субъекта. В частности, термин «аутоиммунное заболевание» применяют взаимозаменяемо с термином «аутоиммунное нарушение» для обозначения состояния у субъекта, которое характеризуется клеточным, тканевым и/или органным повреждением, вызванным иммунологической реакцией субъекта на собственные клетки, ткани и/или органы. Термин «воспалительное заболевание» применяют взаимозаменяемо с термином «воспалительное нарушение» для обозначения состояния у субъекта, которое характеризуется воспалением, предпочтительно хроническим воспалением. Аутоиммунные нарушения могут быть ассоциированы или не ассоциированы с воспалением. Кроме того, воспаление может быть вызвано или не вызвано аутоиммунным нарушением. Таким образом, определенные нарушения можно характеризовать как аутоиммунное нарушение, так и как воспалительное нарушение, в то время как другие нарушения можно характеризовать либо только как аутоиммунное нарушение, либо только как воспалительное нарушение. Злокачественная опухоль является примером «пролиферативного нарушения» (т.е. нарушения, которое ассоциировано с некоторой степенью аномальной пролиферацией клеток).

В контексте настоящего документа «эффективное количество» фармацевтической композиции, в соответствии с одним вариантом осуществления, представляет собой количество, достаточное для достижения полезных или необходимых результатов, включая без ограничения клинические результаты, такие как сокращение размера опухоли (в контексте злокачественной опухоли, например, опухоли молочной железы, злокачественной опухоли желудка или предстательной железы), задержка клеточного роста злокачественной опухоли, задержка развития метастаз, уменьшение симптома, являющегося следствием заболевания, повышение качества жизни страдающих заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных препаратов, необходимых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного препарата, например, путем нацеливания и/или интернализации, задержка прогрессирование заболевания и/или продление дожития индивидуума. Эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений. В контексте настоящего изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для уменьшения пролиферации (или разрушения) клеток злокачественной опухоли или для уменьшения и/или задержки развития или роста метастаз клеток злокачественной опухоли, либо непосредственно, либо опосредованно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть или не быть достигнуто в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективное количество» можно рассматривать в контексте введения одного или нескольких химиотерапевтических средств, и одно средство можно рассматривать как такое, которое дают в эффективном количестве, если в сочетании с одним или несколькими другими средствами может быть достигнут или достигается необходимый результат. Несмотря на то, что индивидуальные потребности различаются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого компонента входит в компетенцию специалистов в настоящей области техники. Типичные дозировки рассмотрены ниже.

Термин «эффекторная активность» обозначает биологические активности, связанные со взаимодействием Fc-участка антитела с рецептором или лигандом Fc. Антитело может иметь одну или несколько эффекторных функций. Неограничивающие примеры эффекторных функций антитела включают ADCC, связывание C1q, комплементзависимую цитотоксичность (CDC), даунрегуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR), опсонизацию, опсонно-фагоцитоз, клеточное связывание и розеткообразование. Эффекторные функции включают как функции, которые действуют после связывания антигена, так и функции, которые действуют вне зависимости от связывания антигена.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «эффекторная клетка» обозначает клетку иммунной системы, которая экспрессирует один или несколько рецепторов Fc и опосредует одну или несколько эффекторных функций. К эффекторным клеткам относятся без ограничения моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В-клетки, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, натуральные киллеры (NK), и они могут образовываться любым организмом, включая без ограничения людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян.

Термины «рецептор Fc» или «FcR» применяют в контексте настоящего документа для описания рецептора, который связывается с Fc-участком антитела. Иллюстративным FcR является человеческий FcR с нативной последовательностью. FcR может быть участком, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор, «FcγR»), и к нему относятся рецепторы подклассов FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIV, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы таких рецепторов, например, существует по меньшей мере два известных рецептора FcγRII: FcγRIIA и FcγRIIB. Термин «FcR» также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за передачу материнских IgG зародышу.

Термин «сайт гликозилирования» обозначает аминокислотный остаток или остатки, распознаваемые клеткой млекопитающего как место для присоединения олигосахарида (т.е. углеводов, содержащих два или более соединенных вместе простых Сахаров). Аминокислотные остатки, к которым присоединяются углеводы, такие как олигосахариды, обычно представляют собой аспарагиновый (N-связь), сериновые (О-связь) и треониновые (О-связь) остатки. N-связанное гликозилирование относится к присоединению олигосах аридного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. О-связанное гликозилирование обозначает присоединение олигосахаридного фрагмента к гидроксиаминокислоте, например, серину или треонину. Молекулы по настоящему изобретению могут содержать один или несколько сайтов гликозилирования, включая сайты N-связанного и О-связанного гликозилирования. В соответствии с настоящим изобретением, можно применять любой известный из уровня техники сайт гликозилирования для N-связанного или О-связанного гликозилирования. Специфические сайты присоединения обычно имеют характерную последовательность аминокислот, называемую «последовательностью сайта гликозилирования». Последовательность сайта гликозилирования для N-связанного гликозилирование представляет собой: N-X-S или N-X-T, где N обозначает аспарагин, X может представлять собой любую из традиционных аминокислот, кроме пролина, S обозначает серин, а Т обозначает треонин. Fc-участок нативного IgG человека имеет два сайта N-связанного гликозилирования, один в каждом из доменов СН2, по аспарагину в положении 297 (Asn 297). Сайты гликозилирования можно внести в молекулу по настоящему изобретению с помощью способов, хорошо известных в области техники, к которой относится настоящее изобретение (см., например, In vitro mutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J.D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме. Иллюстративный способ внесения сайта гликозилирования в молекулу по настоящему изобретению может предусматривать модификацию или мутацию аминокислотой последовательности молекулы так, чтобы получить необходимую последовательность N-X-S или N-X-T. Аналогичным образом, сайты гликозилирования можно удалить путем модификации или мутации аминокислотной последовательности существующего сайта гликозилирования, например, для изменения существующей последовательности N-X-S или N-X-T.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «ответ с выработкой человеческих антител к мышиным антителам («НАМА»)» относится к пагубному иммуногенному ответу, который имеет место, когда иммунная система человека распознает мышиное антитело в качестве чужеродной молекулы и вырабатывает воспалительный ответ в его отношении. Ответ НАМА может вызывать токсический шок или смерть. Химерные и гуманизированные антитела уменьшают вероятность ответа НАМА путем уменьшения отличных от человеческих частей вводимых антител, но при этом все еще сохраняется возможность иммунного ответа с выработкой человеческих антител к человеческим антителам («ответ НАНА») против таких антител.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «гетерогенная» нуклеиновая кислота обозначает ДНК, РНК и т.д., которую вводят в клетку-хозяина. Нуклеиновая кислота может быть получена из любого из ряда источников, в том числе геномной ДНК, мРНК, кДНК, синтетической ДНК или продуктов их слияния или комбинации. Нуклеиновая кислота может включать полинуклеотид из той же клетки или типа клетки, что и клетка-хозяин или клетка-реципиент, или полинуклеотид из другого типа клетки, например, из млекопитающего или растения, и может необязательно включать маркерные гены или гены отбора, например, гены устойчивости к антибиотику, гены устойчивости к температуре и т.д.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «иммуномодулирующее средство» и его варианты обозначают средство, которое модулирует иммунную систему хозяина. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, иммуномодулирующее средство представляет собой иммунодепрессивное средство. В соответствии с другими вариантами осуществления, иммуномодулирующее средство представляет собой иммуностимулирующее средство. К иммуномодулирующим средствам относятся без ограничения малые молекулы, пептиды, полипептиды, слитые белки, антитела, неорганические молекулы, миметики и органические молекулы.

В контексте настоящего документа считают, что молекула (например, антитело) «специфически» связывает участок другой молекулы (т.е. «эпитоп»), если она вступает в реакцию или связывается чаще, быстрее, дольше и/или с большей аффинностью с таким участком относительно других участков молекулы или альтернативных молекул. Например, антитело, которое специфически связывается с эпитопом HER2/neu, является антителом, которое связывает такой эпитоп HER2/neu с большей аффинностью, авидностью, легче и/или дольше, чем оно связывается с другими эпитопами HER2/neu или с отличным от HER2/neu эпитопом. Аналогичным образом, антитело, которое специфически связывается с эпитопом PD-1, связывает такой эпитоп с большей аффинностью, авидностью, легче и/или дольше, чем оно связывается с другими эпитопами PD-1 или с отличным от PD-1 эпитопом. Также при прочтении этого определения будет понятно, что, например, антитело (или фрагмент, или эпитоп), которое специфически связывается с первой мишенью, может специфически или предпочтительно связываться, или не связываться, со второй мишенью. Таким образом, «специфическое связывание» не обязательно указывает (хотя и может включать) на исключительное связывание. Как правило, если контекст очевидно не свидетельствует об обратном, указание «связывания» означает «специфическое связывание». Способность антитела специфически связываться с эпитопом антигена может быть определена, например, с помощью иммуноанализа.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «молекула нуклеиновой кислоты» включает молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), комбинации молекул ДНК и РНК или гибридные молекулы ДНК/РНК и аналоги молекул ДНК или РНК. Такие аналоги можно получить с помощью, например, нуклеотидных аналогов, которые включают без ограничения инозиновые или тритилированные основания. К таким аналогам также могут относиться молекулы ДНК или РНК, содержащие модифицированные скелеты, которые придают благоприятные свойства молекулам, такие как, например, устойчивость к нуклеазам или увеличенная способность проходить через клеточные мембраны. Нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, могут содержать как одноцепочечные, так и двухцепочечные части и могут содержать трехцепочечные части, но предпочтительно являются двухцепочечными ДНК.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «существенная идентичность последовательностей» относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям (например, доменам), которые по меньшей мере приблизительно на 80% идентичны по аминокислотным остаткам, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% или по меньшей мере приблизительно на 95% идентичны при сравнении и выравнивании по максимальному соответствию. Идентичность последовательностей между двумя схожими последовательностями (например, вариабельными доменами антитела) можно рассчитать с помощью алгоритмов, таких как описанные в работах Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Comparison Of Biosequences" Adv. Appl. Math. 2:482 [алгоритм локальной гомологии]; Needleman, S.B. & Wunsch, CD. (1970) "A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins," J. Mol. Biol. 48:443 [алгоритм гомологичного выравнивания], Pearson, W.R. & Lipman, D.J. (1988) "Improved Tools For Biological Sequence Comparison" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 [способ поиска схожести]; или в работе Altschul, S.F. et al., (1990) "Basic Local Alignment Search Tool," J. Mol. Biol. 215:403-10 [алгоритм BLAST]. При применении указанных выше алгоритмов применяют параметры по умолчанию (для длины окна, штраф за введения гэпа и т.д.). Указанная первая аминокислотная последовательность является «существенно схожей» со второй аминокислотной последовательностью, если степень идентичности последовательностей составляет по меньшей мере приблизительно 70% идентичной, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90% или даже по меньшей мере приблизительно 95%. Считают, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты является «существенно схожей» со второй последовательностью, когда либо: (1) степень идентичности последовательностей составляет по меньшей мере приблизительно 70%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%, или по меньшей мере приблизительно 90%», или даже по меньшей мере приблизительно 95%», либо (2) молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирует полипептид, который по меньшей мере приблизительно на 70%» идентичен, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 90%», или даже по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полипептиду, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей вторую последовательность. Последовательности, которые являются существенно идентичными, также являются существенно схожими.

При упоминании антител отнесение аминокислот к каждому домену производят в соответствии с работой Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. (National Institutes of Health, Bethesda, MD., (1991) ("Kabat et al."), которая явно включена в настоящий документ посредством ссылки. По всему настоящему описанию нумерация константных остатков в тяжелой цепи IgG «в соответствии с Kabat» обозначает нумерацию EU антитела IgG1 человека, как описано у Kabat et al.

Термин «мышиное антитело 4D5» обозначает мышиное антитело IgGl, описанное в патенте США №5677171 под номером АТСС CRL 10463. Мышиное антитело 4D5 связывает HER2/neu и имеет вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47. Термин «гуманизированное антитело 4D5» обозначает антитело IgG, описанное в работе Carter, P. et al. (1992) ("Humanization Of An Anti-P185her2 Antibody For Human Cancer Therapy" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289). Сообщалось, что гуманизированное антитело 4D5 способно связывать HER2/neu, и оно имеет вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

Аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела 4D5 является (SEQ ID NO: 3) (остатки CDR1 подчеркнуты):

Аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела 4D5 является (SEQ ID NO: 47) (остатки CDR1 подчеркнуты):

Аминокислотной последовательностью вариабельного домена легкой цепи гуманизированного антитела 4D5 является (SEQ ID NO: 5) (остатки CDR1 подчеркнуты):

Аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой цепи гуманизированного антитела 4D5 является (SEQ ID NO: 48) (остатки CDR1 подчеркнуты):

Термин «химерное антитело 4D5» обозначает антитело IgG, которое связывает Her2/neu человека и имеет легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую Fc-участок дикого типа; аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного антитела 4D5 показана под SEQ ID NO: 7. «Вариантное химерное антитело 4D5» является антителом IgG, которое связывает HER2/neu и имеет легкую цепь и/или тяжелую цепь, аминокислотная последовательность(последовательности) которого(которых) отличается(отличаются) от последовательностей химерного антитела 4D5 (например, антитела IgG, содержащего легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13).

VI. Связывающие молекулы

А. Молекулы, которые специфически связывают HER2/neu

К молекулам, которые специфически связывают HER2/neu и охватываются настоящим изобретением, относятся антитела к HER2/neu, способные специфически связываться с непрерывным или дискретным (например, конформационным) эпитопом Her2/neu человека. Антитела к HER2/neu, применяемые в способах по настоящему изобретению, будут предпочтительно также характеризоваться способностью связываться с молекулами HER2/neu одного или нескольких не относящихся к человеку видов, особенно мышей, крыс, собак и приматов (особенно яванского макака).

Ниже представлены антитела к HER2/neu. Дополнительные искомые антитела можно получить путем мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептидную цепь таких антител, а затем скрининга в отношении экспрессированных антител, которые характеризуются способностью специфически связываться с Her2/neu, путем выделения новых секретирующих антитела гибридом, продуцирование у которых индуцируется при контакте с HER2/neu или его пептидным фрагментом или с помощью других способов. Последовательность HER/2 человека была описана в работе Yamamoto, Т. et al. (1986) "Similarity Of Protein Encoded By The Human c-erb-B-2 Gene To Epidermal Growth Factor Receptor" Nature 319:230-234, а последовательность доступна в GenBank под номером доступа Х03363.

Настоящее изобретение, в частности, относится к вариантам химерного антитела 4D5 и, более конкретно, к вариантам такого химерного антитела 4D5, которые специфически связываются с HER2/neu, предпочтительно Her2/neu человека, и которые характеризуются уменьшенным гликозилированием относительно мышиного антитела 4D5 по причине удаления сайта гликозилирования в вариабельном домене легкой цепи. В частности, предпочтительные химерные антитела по настоящему изобретению лишены сайга гликозилирования в вариабельном домене легкой цепи мышиного антитела 4D5, который в легкой цепи мышиного антитела 4D5 содержит последовательность N-R-S в положениях 65, 66 и 67. Предпочтительно антитела имеют повышенную аффинность связывания с HER2/neu, и более предпочтительно вариантные химерные антитела 4D5 по настоящему изобретению имеют повышенную эффекторную функцию или как повышенную аффинность связывания с HER2/neu, так и повышенную эффекторную функцию по сравнению с мышиным антителом 4D5.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, предпочтительные варианты химерного антитела 4D5 содержат легкую цепь (легкую цепь химерного 4D5), имеющую или содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного антитела 4D5 (SEQ ID NO: 2) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Иллюстративной молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует легкую цепь предпочтительных вариантных химерных антител 4D5, является SEQ ID NO: 1:

Антитела, имеющие такую аминокислотная последовательность легкой цепи, имеют модификацию по положениям 65 участка V_L и соответственно лишены сайта N-связанного гликозилирования, обнаруживаемого в мышином антителе 4D5 (см. фиг. 1, на которой изображено иллюстративное сравнение между аминокислотными последовательностями участка V_L химерного антитела 4D5, имеющего модификацию N65S (SEQ ID NO: 4), и мышиного (SEQ ID NO: 3) и гуманизированного (SEQ ID NO: 5) антител 4D5). В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, вариантные химерные антитела 4D5 по настоящему изобретению имеют аминокислотную последовательность участка V_L SEQ ID NO: 4.

Аминокислотная последовательность участка V_L химерного 4D5 (SEQ ID NO: 4) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Химерное антитело 4D5 содержит тяжелую цепь («тяжелую цепь химерного 4D5»), которая имеет Fc-участок дикого типа (SEQ ID NO: 7), который может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6. Ниже показаны эти последовательности:

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного 4D5, имеющего Fc-участок дикого типа (SEQ ID NO: 7) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь химерного 4D5, имеющего Fc-участок дикого типа (SEQ ID NO: 6):

В соответствии с другими вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к использованию вариантного химерного антитела 4D5, тяжелая цепь которого содержит вариантный Fc-участок и, более предпочтительно, вариантный Fc-участок «FcMT1», «FcMT2» или «FcMT3». Ниже показаны эти последовательности:

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи вариантного химерного антитела 4D5, имеющего вариантный Fc-участок FcMT1 (SEQ ID NO: 9) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь вариантного химерного антитела 4D5, имеющего вариантный Fc-участок FcMT1 (SEQ ID NO: 8):

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи вариантного химерного антитела 4D5, имеющего вариантный Fc-участок FcMT2(SEQ ID NO: 11) (CDR_H остатки подчеркнуты):

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь вариантного химерного антитела 4D5, имеющего вариантный Fc-участок FcMT2 (SEQ ID NO: 10):

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи вариантного химерного антитела 4D5, имеющего вариантный Fc-участок FcMT3 (SEQ ID NO:13) (CDR_H остатки подчеркнуты):

Иллюстративная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь вариантного химерного антитела 4D5, имеющего вариантный Fc-участок FcMT3 (SEQ ID NO: 12):

В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к применению вариантного химерного антитела 4D5, имеющего тяжелую цепь, которая имеет модификацию в Fc-участке и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8, или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 10 или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, или кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 12 или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

В соответствии с одним вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к применению антитела к HER2/neu, которое содержит легкую цепь иммуноглобулина, имеющую модификацию N65S в домене VL, и тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую модифицированный Fc-участок. Предпочтительно, такое антитело к HER2/neu будет представлять собой химерное антитело 4D5 или вариантное химерное антитело 4D5, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, антитело к HER2/neu по настоящему изобретению дополнительно содержит константный домен легкой цепи, слитый с вариабельным доменом легкой цепи, который, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, содержит по меньшей мере SEQ ID NO: 4. В соответствии с другими вариантами осуществления, антитело является модифицированным, фрагментом или модифицированным фрагментом.

Химерные антитела 4D5 были сконструированы, в соответствии с различными вариантами осуществления по настоящему изобретению, для повышения связывания с активирующими низкоаффинными рецепторами Fc, но не для изменения или лишь минимального повышения связывания с ингибирующим низкоаффинным рецептором CD32B (FcγRIIb). К таким антителам относятся следующие антитела дикого типа и Fc-оптимизированные антитела:

• ch4D5 с Fc дикого типа, которое имеет легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. ch4D5 с Fc дикого типа имеет замену N65S на легкой цепи, что приводит в результате к образованию дегликозилированной легкой цепи.

• ch4D5-FcMT1, которое имеет легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. ch4D5-FcMT1 имеет замену N65S на легкой цепи, что приводит в результате к образованию дегликозилированной легкой цепи, и замены F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L на тяжелой цепи (все пронумерованы по Kabat). ch4D5-FcMT1 характеризуется 10-кратным увеличением связывания с CD16A (FcγRIII-A) человека, и связывание с CD16-158^phe пропорционально повышено в сравнении со связыванием с CD16-158^Val.

• ch4D5-FcMT2, («маргетуксимаб», рег. № CAS 1350624-75-7), которое имеет легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. Маргетуксимаб имеет замену N65 S на легкой цепи, что приводит в результате к образованию дегликозилированной легкой цепи, и замены L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L на тяжелой цепи (все пронумерованы по Kabat). Это антитело является результатом дополнительно усовершенствования антитела ch4D5-FcMT1 и имеет схожие свойства связывания CD16A, но также имеет более благоприятное уменьшение связывания с CD32B (FcγRIIB).

• ch4D5-FcMT3, которое имеет легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. ch4D5-FcMT3 имеет замену N65S на легкой цепи, что приводит в результате к образованию дегликозилированной легкой цепи, и замены F243L, R292P и Y300L на тяжелой цепи (все пронумерованы по Kabat). Это антитело является результатом дополнительно усовершенствования антитела ch4D5-FcMT1 и имеет схожие свойства связывания CD16A, но также имеет более благоприятное уменьшение связывания с CD32B (FcγRIIB).

• ch4D5-N297Q (также называемое в настоящем документе «ch4D5-Ag»), которое имеет легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, имеющую замену N297Q (пронумерованную по Kabat). Сравнение последовательностей тяжелой цепи ch4D5 с Fc дикого типа и Fc-оптимизированных вариантов ch4D5-FcMT1, ch4D5-FcMT2 и ch4D5-FcMT3 показано на фиг. 2. CDR обозначены черными полосами, показанными под соответствующими остатками.

В. Молекулы, которые специфически связывают PD-1

К молекулам, которые специфически связывают PD-1 и охватываются настоящим изобретением, относятся антитела к PD-1, способные специфически связываться с непрерывной или дискретной (например, конформационной) частью (эпитопом) PD-1 человека. Антитела к PD-1, применяемые в способах по настоящему изобретению, предпочтительно будут также характеризоваться способностью связываться с молекулами PD-1 одного или нескольких не относящихся к человеку видов, особенно мышей, крыс, собак и приматов.

Известны антитела, которые являются специфическими в отношении к PD-1 (см., например, патентную заявку США №62/198867, патенты США №№5952136, 7488802, 7521051, 8008449, 8088905, 8354509, 8552154, 8779105, 8900587, 9084776, патентные РСТ публикации WO 2004/056875, WO 2006/121168, WO 2008/156712, WO 2012/135408, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/179664, WO 2014/194302 и WO 2015/112800). Дополнительные искомые антитела можно получить выделением секретирующих антитело гибридом, продуцирование у которых индуцируется при контакте с PD-1 или его пептидным фрагментом. PD-1 человека (включая сигнальную последовательность из 20 аминокислотных остатков (показанную подчеркнутой) и зрелый белок из 268 аминокислотных остатков) имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 14):

Предпочтительные антитела к PD-1 имеют домены V_L и/или V_H моноклональных антител к PD-1 человека «PD-1 mAb 1» (ниволумаба, рег. № CAS 946414-94-4, также известного как 5С4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106 и продаваемого под названием OPDIVO® компанией Bristol-Myers Squibb); «PD-1 mAb 2» (пембролизумаба (ранее известного как ламбролизумаб), рег. № CAS 1374853-91-4, также известного как МК-3475, SCH-900475 и продаваемого под названием KEYTRUDA® компанией Merck); «PD-1 mAb 3» (ЕН12.2Н7; Dana Farber), «PD-1 mAb 4» (пидилизумаба, рег. № CAS 1036730-42-3 также известного как СТ-011, CureTech,) или любого из антител к PD-1, представленных в таблице 1, и более предпочтительно имеет 1, 2 или все 3 CDR участка V_L и/или 1, 2 или всеми 3 CDR домена V_H таких моноклональных антител к PD-1. Недавно были выявлены дополнительные антитела к PD-1, имеющие уникальные связывающие характеристики, пригодные для способов и композиций по настоящему изобретению (см. заявку на выдачу патента США №62/198867). В частности, предпочтительными являются связывающие PD-1 молекулы, которые имеют гуманизированный домен V_H и/или V_L антитела к PD-1 «PD-1 mAb 5» (hPD-1 mAb 2, MacroGenics); «PD-1 mAb 6» (hPD-1 mAb 7, MacroGenics); «PD-1 mAb 7» (hPD-1 mAb 9, MacroGenics); «PD-1 mAb 8» (b.PD-1 mAb 15, MacroGenics) и более предпочтительно имеют 1, 2 или все 3 CDR участка V_L и/или 1, 2 или все 3 CDR домена V_H таких моноклональных антител к PD-1. К таким предпочтительным антителам к PD-1 относятся антитела, имеющие вариантные Fc-участки, биспецифические (или мультиспецифические) антитела, химерные или гуманизированные антитела, молекулы BiTe, диатела и т.д.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 1 (SEQ ID NO: 15) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 1 (SEQ ID NO: 19) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 2 (SEQ ID NO: 23) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 2 (SEQ ID NO:27) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 3 (SEQ ID NO:31) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 3 (SEQ ID NO: 35) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 4 (SEQ ID NO: 39) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 4 (SEQ ID NO: 43) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 5 (SEQ ID NO: 53) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 5 (SEQ ID NO: 57) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (PD-1 mAb 6 (SEQ ID NO: 61) (CDR_H остатки подчеркнуты):

где X представляет собой I или А

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 6 (SEQ ID NO: 65) (остатки CDR_L подчеркнуты):

где X₁ представляет собой N или S, а Х₂ представляет собой Q или R; или X₁ представляет собой N, а Х₂ представляет собой Q; или X₁ представляет собой S, а Х₂ представляет собой Q; или X₁ представляет собой S, а Х₂ представляет собой R.

где X₁ является таким, как описано выше.

где Х₂ является таким, как описано выше.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления, PD-1 mAb 6 содержит:

(a) SEQ ID NO: 61, где X представляет собой I; и SEQ ID NO: 65, где X₁ представляет собой N, и Х₂ представляет собой Q; или

(b) SEQ ID NO: 61, где X представляет собой I; и SEQ ID NO: 65, где X₁ представляет собой S, а Х₂ представляет собой Q.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 7 (SEQ ID NO: 69) (остатки CDRH подчеркнуты):

где X₁ представляет собой V или А; Х₂ представляет собой S или G; Х₃ представляет собой V или Т; Х₄ представляет собой L или A; X₁ представляет собой V, Х₂ представляет собой S, Х₃ представляет собой V, а Х₄ представляет собой L; или X₁ представляет собой А, Х₂ представляет собой G, Х₃ представляет собой Т, а Х₄ представляет собой А.

где Х₂ является таким, как описано выше.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 7 (SEQ ID NO: 73) (остатки CDR_L подчеркнуты):

где X₁ представляет собой N или S, а Х₂ представляет собой N или D; X₁ представляет собой S, а Х₂ представляет собой N; или X₁ представляет собой N, а Х₂ представляет собой D.

где X₁ является таким, как описано выше.

где Х₂ является таким, как описано выше.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления, PD-1 mAb 7 содержит:

(a) SEQ ID NO: 69, где X₁ представляет собой V, Х₂ представляет собой S, Х₃ представляет собой V, а Х₄ представляет собой L; и SEQ ID NO: 73, где X₁ представляет собой S, а Х₂ представляет собой N; или

(b) SEQ ID NO: 69, где X₁ представляет собой А, Х₂ представляет собой G, Х₃ представляет собой Т, а Х₄ представляет собой А; и SEQ ID NO: 73, где X₁ представляет собой N, а Х₂ представляет собой D.

Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи PD-1 mAb 8 (SEQ ID NO: 77) (остатки CDR_H подчеркнуты):

Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи PD-1 mAb 8 (SEQ ID NO: 81) (остатки CDR_L подчеркнуты):

В соответствии с конкретными вариантами осуществления, антитела PD-1, пригодные для способов и композиций по настоящему изобретению, содержат домены VL и VH любого из представленных выше антител (например, PD-1 mAb 1, PD-1 mAb 2, PD-1 mAb 3, PD-1 mAb 4, PD-1 mAb 5, PD-1 mAb 6, PD-1 mAb 7, PD-1 mAb 8 или любого из антител к PD-1 в таблице 1), домен каппа CL и домен Fc IgG4, необязательно без С-концевого лизинового остатка. Такие антитела предпочтительно будут содержать домен CH1 IgG4 и шарнир и более предпочтительно будут содержать стабилизированный шарнир IgG4, содержащий замену S228P (причем нумерация приведена согласно EU системе нумерации по Kabat).

Аминокислотной последовательностью домена каппа CL является (SEQ ID NO: 85):

Аминокислотная последовательность домена CH1 IgG4 и стабилизированный шарнир (SEQ ID NO: 86) представляет собой:

Ниже представлена аминокислотная последовательность доменов СН2-СН3 IgG4 (SEQ ID NO: 52).

Иллюстративное антитело к PD-1, обозначаемое «PD-1 mAb 6-ISQ», содержит легкую цепь, имеющую домен VL из PD-1 mAb 6 (SEQ ID NO: 65), где X₁ представляет собой S, а Х₂ представляет собой Q и каппа CL (SEQ ID NO: 85); и тяжелую цепь, имеющую домен VH из PD-1 mAb 6 (SEQ ID NO: 61), где X₁ представляет собой I, домен CH1 IgG4, стабилизированный шарнир IgG 4 (SEQ ID NO: 86) и домен CH2-CH3 IgG4 (SEQ ID NO: 52).

Ниже показана аминокислотная последовательность полной легкой цепи из PD-1 mAb 6-ISQ (SEQ ID NO: 87) (остатки CDR_L подчеркнуты):

Ниже показана аминокислотная последовательность полной тяжелой цепи из PD-1 mAb 6-ISQ (SEQ ID NO: 88) (остатки CDR_H подчеркнутыми):

Другое иллюстративное антитело к PD-1 представляет собой PD-1 mAb 1 (ниволумаб), которое представляет собой антитело человека, содержащее легкую цепь, имеющую домен VL (SEQ ID NO: 19) и домен каппа CL (см., например, SEQ ID NO: 85); и тяжелую цепь, имеющую домен VH (SEQ ID NO: 15), домен CH1 IgG4 и стабилизированный шарнир (см., например, SEQ ID NO: 86) и домены СН2-СН3 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 54).

Другое иллюстративное антитело к PD-1 представляет собой PD-1 mAb 2 (пембролизумаб), которое представляет собой гуманизированное антитело, содержащее легкую цепь, имеющую домен VL (SEQ ID NO: 27) и домен каппа CL (см., например, SEQ ID NO: 85); и тяжелую цепь, имеющую домен VH (SEQ ID NO: 23), CH1 IgG4 и стабилизированный шарнир IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 86) и домены СН2-СН3 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 52).

С. Варианты антитела

Также предусмотрено, что можно получить варианты антител. Варианты могут иметь модификации последовательности (например, замены, делении и/или добавления) в требуемых положениях в пределах их аминокислотных последовательностей относительно нативной аминокислотной последовательности. Специалисты в настоящей области техники поймут, что изменения аминокислот могут изменять посттрансляционные процессы с антителом, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования или изменение характеристик заякоривания в мембране. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, антитело и варианты представляют собой варианты Fc-участка.

Варианты могут иметь одинаковую или измененную активность по сравнению с нативным антителом. Например, может быть необходимо, чтобы вариант имел такую же активность, но был модифицирован таким образом, чтобы он был более стабильным или имел более длительный период полужизни in vivo, например, в результате конъюгирования антитела с альбумином, или эпитоп связывания рецептора реутилизации, как описано, например, в патенте США №5739277. Или, например, может быть необходимо, чтобы антитело имело повышенную аффинность связывания с антигеном, но такую же эффекторную функцию, что и нативное антитело, или может быть необходимо, чтобы антитело имело такую же аффинность связывания с антигеном, но уменьшенную эффекторную функцию. Активность можно протестировать, например, с помощью анализов in vitro, таких как анализы ИФА, анализы с применением поверхностного плаз ионного резонанса, анализы связывания белка с радиоактивной меткой (RIA) или иммунопреципитационные анализы.

Существенные изменения в функции или иммунологической идентичности могут быть осуществлены путем выбора модификаций, которые существенно различаются по их влиянию на поддержание: (а) структуры полипептидного скелета в области модификации, например, в виде листа или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (с) объема боковой цепи. Также можно использовать сканирующий аминокислотный анализ для выявления одной или нескольких аминокислот вдоль непрерывной последовательности, например, как описано в работе Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085. К числу предпочтительных сканирующих аминокислот относятся относительно небольшие нейтральные аминокислоты, такие как аланин, глицин, серии и цистеин. Как правило, в этой группе предпочтительной сканирующей аминокислотой является аланин, поскольку он является наиболее распространенной аминокислотой, часто встречается как в скрытых, так и в открытых положениях, а также потому, что он устраняет боковую цепь за пределами бета-углерода и с меньшей вероятностью изменяет конформацию основной цепи у варианта. Если аланиновая замена не дает надлежащих количеств варианта, можно использовать изомерную аминокислоту. Кроме того, любой цистеиновый остаток, не вовлеченный в поддержание надлежащей конформации антитела или полипептида, может быть замещен, обычно серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предупреждения ошибочного сшивания. Тем не менее, при определенных обстоятельствах, в частности, когда антитело является фрагментом антитела, таким как фрагмент Fv, в антитело или полипептид можно внести цистеиновую связь(связи) для повышения его стабильности.

Тот факт, что изменение одной аминокислоты в остатке CDR может привести в результате к потере функционального связывания (Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6): 1979-1983), обеспечивает возможность системного определения альтернативных функциональных последовательностей CDR. В соответствии с одним предпочтительным способом получения таких вариантных CDR, полинуклеотид, кодирующий CDR подвергают мутации (например, посредством случайного мутагенеза или сайт-направленного способа (например, с помощью полимеразной цепной амплификации с праймерами, которые кодируют мутантный локус)) для получения CDR, имеющего замененный аминокислотный остаток. При сравнении идентичности соответствующего остатка в исходной (функциональной) последовательности CDR с идентичностью замененной (нефункциональной) вариантной последовательности CDR можно найти оценку замены по BLOSUM62.iij для такой замены. Система BLOSUM обеспечивает матрицу аминокислотных замен, созданную путем анализа базы данных последовательностей для надежных выравниваний (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8): 1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes" Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective" J. Mol. Biol. 219, 555-565. В настоящее время самой современной базой данных BLOSUM является база данных BLOSUM62 (BLOSUM62.iij). В приведенной ниже таблице 2 представлены оценки замен BLOSUM 62.iij (чем выше оценка, тем более консервативной является замена и, следовательно, более вероятно, что замена не повлияет на функцию). Если антигенсвязываюший фрагмент, содержащий полученный в результате CDR, не может, например, связываться с ROR1, тогда оценку замены BLOSUM62.iij считают недостаточно консервативной и выбирают и производят новая кандидатную замену, имеющую более высокую оценку замены. Таким образом, например, если исходным остатком был глутамат (Е), а нефункциональным остатком-заменителем был гистидин (Н), то оценка замены BLOSUM62.iij будет 0, и предпочтительны более консервативные изменения (такие как, аспартат, аспарагин, глутамин или лизин).

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению направленного или случайного мутагенеза для выявления улучшенных CDR.

D. Варианты Fc-участка

В традиционной иммунной функции взаимодействие комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы приводит в результате к широкому спектру ответов, начиная от эффекторных функций, таких как ADCC, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, и до иммуномодулирующих сигналов, таких как регуляция пролиферации лимфоцитов и секреции антител. Все эти взаимодействия инициируются при связывании Fc-участка антител или иммунных комплексов со специализированными рецепторами клеточной поверхности на гематопоэтических клетках. Разнообразие клеточных ответов, запускаемых антителами и иммунными комплексами, обусловлено структурной гетерогенностью трех рецепторов Fc: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) и FcγRIII (CD16) являются активирующими (т.е. усиливающими иммунную систему) рецепторами; FcγRIIB (CD32B) является ингибирующим (т.е. ослабляющим иммунную систему) рецептором.

Ниже показана аминокислотная последовательность Fc-участка IgG1 (под SEQ ID NO: 49, нумерация по Kabat):

которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG2 человека представляет собой (SEQ ID NO: 50):

которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG3 человека представляет собой (SEQ ID NO: 51):

которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.

Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 иллюстративного IgG4 человека представляет собой (SEQ ID NO: 52):

которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat, где X является лизином (K) или отсутствует.

По ряду различных положений в пределах константных участках антитела наблюдались полиморфизмы (например, по положениям Fc, в том числе без ограничения положениям 270, 272, 312, 315, 356 и 358, пронумерованным согласно EU системе нумерации по Kabat), и, следовательно, могут иметь место небольшие различия между представленной последовательностью и последовательностями, известными из уровня техники. Были хорошо охарактеризованы полиморфные формы иммуноглобулинов человека В настоящее время известны 18 Gm аллотипов: G1m (1,2, 3,17) или G1m (а, х, f, z), G2m (23) или G2m (и), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (b1, с3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, с5, u, v, g5) (Lefranc, G.et al., в "The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation, (Shakib, F. (ed.) 1990, pp. 43-78, Pergamon, Oxford,; Lefranc, G. et al., (1979) "Gm, Am And Km Immunoglobulin Allotypes Of Two Populations In Tunisia" Hum. Genet. 50:199-211). В частности, предполагается, что антитела по настоящему изобретению могут включать любой аллотип, изоаллотип или гаплотип любого гена иммуноглобулина и не ограничены аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом последовательностей, представленных в настоящем документе. Кроме того, в некоторых системах экспрессии С-концевой аминокислотный остаток (выделен жирным и подчеркнут в SEQ ID NO: 49-52 выше) домена СН3 может быть удален посттрансляционно. Соответственно, С-концевой остаток домена СН3 (выделен жирным и подчеркнут выше) является необязательным аминокислотным остатком в антителах, применяемых в способах по настоящему изобретению.

Молекулы по настоящему изобретению могут иметь вариантные Fc-участки. Модификация Fc-участка обычно приводит к изменению фенотипа, например, изменению периода полужизни в сыворотке, изменению стабильности, изменению восприимчивости к клеточным ферментам или изменению эффекторной функции. Может быть необходима модификация антитела по настоящему изобретению в отношении эффекторной функции, с тем чтобы повысить эффективность антитела при лечении, например, злокачественной опухоли. В некоторых случаях необходимо уменьшение или исключение эффекторной функции, например, в случае антител, механизм действия которых предусматривает блокировку или антагонизм, но не уничтожение клеток, несущих целевой антиген. Повышенная эффекторная функция, как правило, необходима в отношении нежелательных клеток, таких как опухолевые и чужеродные клетки, где FcγR экспрессируются на низких уровнях, например, опухолеспецифические В-клетки с низкими уровнями FcγRIIB (например, при неходжкинской лимфоме, CLL и лимфоме Беркитта). В соответствии с указанными вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению, которым придали или у которых повысили эффекторную функциональную активность, полезны для лечения и/или предупреждения развития заболевания, нарушения или инфекции, при которых необходима повышенная эффективность эффекторной функциональной активности.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат одну или несколько модификаций относительно аминокислот Fc-участка, которые уменьшают аффинность и авидность Fc-участка, и, следовательно, молекулы по настоящему изобретению, к одному или нескольким рецепторам FcγR. В соответствии с другими вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат одну или несколько модификаций относительно аминокислот Fc-участка, которые увеличивают аффинность и авидность Fc-участка, и, следовательно, молекулы по настоящему изобретению, к одному или нескольким рецепторам FcγR. В соответствии с другими вариантами осуществления, молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или опосредует повышенную ADCC-активность и/или повышенное связывание с FcγRIIA относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа В соответствии с альтернативными вариантами осуществления, молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или опосредует пониженную ADCC-активность (или другую эффекторную функцию) и/или повышенное связывание с FcγRIIB относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к молекулам, содержащим вариантный Fc-участок, причем у такого вариантного Fc-участка не наблюдают поддающегося детекции связывания с любым FcγR относительно сравниваемой молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к молекулам, содержащим вариантный Fc-участок, причем такой вариантный Fc-участок связывает лишь один FcγR, предпочтительно один из FcγRIIA, FcγRIIB или FcγRIIIA.

Молекулы по настоящему изобретению могут характеризоваться измененными показателями аффинности в отношении активирующего и/или ингибирующего рецептора Fcγ. В соответствии с одним вариантом осуществления, антитело или молекула содержит вариантный Fc-участок, который обладает повышенной аффинностью в отношении FcγRIIB и пониженной аффинностью в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа. В соответствии с другим вариантом осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который обладает пониженной аффинностью в отношении FcγRIIB и повышенной аффинностью в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа В соответствии с еще одним вариантом осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который обладает пониженной аффинностью в отношении FcγRIIB и пониженной аффинностью в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа В соответствии с еще одним вариантом осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который обладает неизмененной аффинностью в отношении FcγRIIB и пониженной (или повышенной) аффинностью в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA относительно сравниваемой молекулы с Fc-участком дикого типа.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к иммуноглобулинам, содержащим вариантный Fc-участок с измененной аффинностью в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA с тем, чтобы иммуноглобулин имел усиленную эффекторную функцию, например, ADCC. Неограничивающие примеры эффекторных клеточных функций включают ADCC, антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), фагоцитоз, опсонизацию, опсонофагоцитоз, связывание клеток, образование розеток, связывание C1q и CDC.

В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к химерным антителам к HER2/neu, которые содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или имеет повышенную ADCC-активность и/или повышенное связывание с FcγRIIIA (CD16A), по результатам измерения с помощью способов, известных специалисту в настоящей области техники и проиллюстрированных в настоящем документе. Анализы ADCC, применяемые в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть NK-зависимыми или макрофагозависимыми.

В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к молекулам, которые специфически связывают PD-1 и содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или имеет уменьшенную ADCC-активность и/или уменьшенное связывание с FcγRIIIA (CD16A), по результатам измерения с помощью способов, известных специалисту в настоящей области техники и проиллюстрированных в настоящем документе. Анализы ADCC, применяемые в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть NK-зависимыми или макрофагозависимыми. В соответствии с дополнительными предпочтительными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к молекулам, которые специфически связывают PD-1 и содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант придает или имеет уменьшенную С DC-активность и/или уменьшенное связывание с C1q, по результатам измерения с помощью способов, известных специалисту в настоящей области техники и проиллюстрированных в настоящем документе.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, изменение аффинности или эффекторной функции является по меньшей мере 2-кратным, предпочтительно по меньшей мере 4-кратным, по меньшей мере 5-кратным, по меньшей мере 6-кратным, по меньшей мере 7-кратным, по меньшей мере 8-кратным, по меньшей мере 9-кратным, по меньшей мере 10-кратным, по меньшей мере 50-кратным или по меньшей мере 100-кратным относительно сравниваемой молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения, вариантный Fc-участок специфически связывает один или несколько FcR с аффинностью, которая по меньшей мере на 65%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 125%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 175%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 225% или по меньшей мере на 250% больше, чем у молекулы, содержащей Fc-участок дикого типа Такие измерения можно осуществлять с помощью in vivo или in vitro анализа, и в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, in vitro анализами, такими как анализы ИФА или на основе поверхностного плазмонного резонанса.

В соответствии с различными вариантами осуществления, молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариант оказывает агонистическое действие по меньшей мере на одну активность рецептора FcγR или антагонистическое действие по меньшей мере на одну активность рецептора FcγR. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, молекулы содержат вариант, который оказывает агонистическое (или антагонистическое) действие на одну или несколько активностей FcγRIIB, например, опосредуемую В-клеточным рецептором передачу сигнала, активацию В-клеток, пролиферацию В-клеток, выработку антител, приток внутриклеточного кальция у В-клеток, прогрессирование клеточного цикла, FcγRIIB-опосредуемое ингибирование передачи сигнала FcεRI, фосфорилирование FcγRIIB, SHIP-рекрутинг, SHIP-фосфорилирование и ассоциацию с Shc, или активность одной или нескольких последующих молекул (например, МАР-киназы, JNK, р38 или Akt) в пути сигнальной трансдукции с участием FcγRIIB. В соответствии с другим вариантом осуществления молекулы содержат вариант, который оказывает агонистическое (или антагонистическое) действие на одну или несколько активностей FcεRI, например, активацию тучных клеток, мобилизацию кальция, дегрануляцию, выработку цитокинов или высвобождение серотонина,

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекулы содержат Fc-участок, содержащий домены или участки от двух или более изотипов IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Различные изотипы IgG характеризуются различными физическими и функциональными свойствами, включая период полужизни в сыворотке, связывание комплемента, аффинности связывания FcγR и активности эффекторных функций (например, ADCC, CDC и т.д.), из-за различий в аминокислотных последовательностях их шарнира и/или Fc-участков, например, как описано в работах Flesch, В.K. and Neppert, J. (1999) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G," J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel, M.S. et al. (1993) "Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody " J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel, M.S. et al. (1991) "Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; , M. et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies," J. Exp. Med 166:1351-1361. Такой тип вариантного Fc-участка можно использовать отдельно или в комбинации с аминокислотной модификацией для воздействия на Fc-опосредованную эффекторную функцию и/или активность связывания. В комбинации аминокислотная модификация и шарнир/Fc-участок IgG могут проявлять сходную функциональность (например, повышенную аффинность в отношении FcγRIIA) и могут действовать аддитивно или, что более предпочтительно, синергически, модифицируя эффекторную функциональность молекулы по настоящему изобретению относительно молекулы по настоящему изобретению, содержащей Fc-участок дикого типа. В соответствии с другими вариантами осуществления, аминокислотная модификация и Fc-участок IgG могут проявлять противоположную функциональность (например, соответственно повышенную и пониженную аффинность в отношении FcγRIIA) и могут действовать, селективно ослабляя или уменьшая специфическую функциональность молекулы по настоящему изобретению относительно молекулы, не содержащей Fc-участок или содержащей Fc-участок дикого типа того же изотипа.

В соответствии с предпочтительным конкретным вариантом осуществления молекулы содержат вариантный Fc-участок, причем указанный вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-участка дикого типа, так чтобы указанная молекула имела измененную аффинность в отношении FcR, при условии, что указанный вариантный Fc-участок не имеет замены в положениях, которые непосредственно контактируют с FcγR, по результатам кристаллографического и структурного анализа взаимодействий Fc-FcR, таких как описанные в работе Sondermann, P. et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc GammaRIII Complex, "Nature 406:267-273. Примерами положений в Fc-участке, которые непосредственно контактируют с FcγR, являются аминокислотные остатки 234-239 (шарнирный участок), аминокислотные остатки 265-269 (петля В/С), аминокислотные остатки 297-299 (петля С'/Е) и аминокислотные остатки 327-332 (петля F/G). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению содержат вариантные Fc-участки, которые содержат модификацию по меньшей мере одного остатка, которая не создает непосредственного контакта с FcγR, по результатам кристаллографического и структурного анализа, например, не находится в сайте связывания Fc-FcγR.

Вариантные Fc-участки хорошо известны из уровня техники, и в соответствии с настоящим изобретением, можно применять любой известный вариант Fc для придания или модификации эффекторной функции, проявляемой молекулой по настоящему изобретению, содержащей Fc-участок (или его часть), согласно результатам функционального анализа, например, в NK-зависимом или макрофагозависимом анализе. Например, варианты Fc-участка, которые были выявлены как изменяющие эффекторную функцию, раскрыты в области конструирования антител, и любой подходящий раскрытый в ней вариант можно применять в молекулах по настоящему изобретению.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекулы содержат вариантный Fc-участок, имеющий одну или несколько аминокислотных модификаций в одном или нескольких участках, при этом модификация(-ии) изменяет (относительно Fc-участка дикого типа) соотношение аффинностей вариантного Fc-участка к активирующему FcγR (такому как FcγRIIA или FcγRIIIA) относительно ингибирующего FcγR (такого как FcγRIIB):

Если вариант Fc имеет соотношение аффинностей более 1, то способы по настоящему изобретению особенно полезны при осуществлении терапевтического или профилактического лечения заболевания, нарушения или инфекции или ослаблении их симптома, когда необходима повышенная эффективность эффекторной клеточной функции (например, ADCC), опосредованной FcγR, например, злокачественной опухоли или инфекционного заболевания. Если вариант Fc имеет соотношение аффинностей менее 1, способы по настоящему изобретению особенно полезны при осуществлении терапевтического или профилактического лечения заболевания или нарушения или ослаблении их симптома, когда необходима пониженная эффективность эффекторной клеточной функции, опосредованной FcγR, например, аутоиммунных или воспалительных нарушений. В таблице 3 приведены иллюстративные одиночные, двойные, тройные, четверные и пятикратные мутации, у которых соотношение аффинностей либо превышает, либо меньше 1, и больше информации об этих мутациях можно найти в области конструирования антител.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 или 330 и предпочтительно на один или несколько из следующих остатков: А240, 1240, L241, L243, Н244, N298, I328 или V330. В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376,416, 419,430, 434, 435,437,438 или 439 и предпочтительно на один или несколько из следующих остатков: Н280, Q280, Y280, G290, S290, Т290, Y290, N294, K295, Р296, D298, N298, Р298, V298,1300 или L300.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках, которые связывают FcγR с измененной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Предпочтительно, вариантный Fc-участок имеет любой из следующих остатков: А256, N268, Q272, D286, Q286, S286, А290, S290, А298, М301, A312, Е320, М320, Q320, R320, Е322, А326, D326, Е326, N326, S326, K330, Т339, А333, А334, Е334, Н334, L334, М334, Q334, V334, K335, Q335, А359, А360 или А430.

В соответствии с другим вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках, которые связывают FcγR (посредством его Fc-участка) с уменьшенной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437,438 или 439.

В соответствии с другим вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках, которые связывают FcγR (посредством его Fc-участка) с усиленной аффинностью, любые аминокислотные модификации (например, замены) приходятся на любые из положений 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 или 430. В соответствии с другим вариантом осуществления, в вариантных Fc-участках, которые связывают FcγRIIA с увеличенной аффинностью, находятся любые из следующих остатков: А255, А256, А258, А267, А268, N268, А272, Q272, А276, А280, А283, А285, А286, D286, Q286, S286, А290, S290, М301, Е320, М320, Q320, R320, Е322, А326, D326, Е326, S326, K330, А331, Q335, А337 или А430.

Предпочтительные варианты включают одну или несколько модификаций в любых положениях: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 или 332.

Особенно предпочтительные варианты включают одну или несколько модификаций, выбранных из групп A-AI:

Еще одни особенно предпочтительные варианты включают одну или несколько модификаций, выбранных из групп 1-105:

В соответствии с одним вариантом осуществления, молекула, которая специфически связывает HER2/neu (например, антитело к HER2/neu), и/или молекула, которая специфически связывает PD-1 (например, антитело к PD-1), будут содержать вариантный Fc-участок, имеющий по меньшей мере одну модификацию в Fc-участке. В соответствии с одним вариантом осуществления, молекула, которая специфически связывает HER2/neu (например, антитело к HER2/neu), будет содержать вариантный Fc-участок, имеющий по меньшей мере одну модификацию, которая усиливает связывание с FcγRIIA и/или усиливает ADCC-активность относительно того же антитела, которое содержит Fc-участок дикого типа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, вариантный Fc-участок содержит:

(A) по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L;

(B) по меньшей мере две замены, выбранные из группы, состоящей из:

(1)F243L и P396L;

(2)F243L и R292P; и

(3) R292P и V305I;

(1) F243L, R292P и Y300L;

(2) F243L, R292P и V305I;

(3) F243L, R292P и P396L; и

(4) R292P,V305I и P396L;

(D) по меньшей мере четыре замены, выбранные из группы, состоящей из:

(1) F243L, R292P, Y300L и P396L; и

(2) F243L, R292P, V305I и P396L; или

(E) по меньшей мере пять замен, выбранных из группы, состоящей из:

(1) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L; и

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, вариантный Fc-участок содержит замены из:

(A) F243L, R292P и Y300L;

(B) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L; или

В соответствии с одним вариантом осуществления, молекула, которая специфически связывает PD-1 (например, антитело к PD-1), будет содержать вариантный Fc-участок, имеющий по меньшей мере одну модификацию, которая уменьшает связывание с FcγRIIIA (CD16A) и/или уменьшает ADCC-активность относительно того же антитела, которое содержит Fc-участок дикого типа. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вариантный Fc-участок содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L234A, L235A, D265A, N297Q и N297G, причем указанная нумерация соответствует EU системе нумерации по Kabat В соответствии с конкретным вариантом осуществления, вариантный Fc-участок содержит замену из L234A и L235A.

В соответствии с альтернативным вариантом, используют Fc-участок, который изначально характеризуется пониженным (или практически отсутствующим) связыванием с FcγRIIIA (CD16A) и/или уменьшенной эффекторной функцией (относительно связывания, которым характеризуется Fc-участок IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, молекула, которая специфически связывает HER2/neu (например, антитело к HER2/neu), и/или молекула, которая специфически связывает PD-1 (например, антитело к PD-1), будет содержать Fc-участок IgG2 (SEQ ID NO: 50) или Fc-участок IgG4 (SEQ ID NO: 52), необязательно без С-концевых аминокислотных остатков. При использовании Fc-участка IgG4 настоящее изобретение также относится к введению стабилизирующей мутации, такой как S228P, которая пронумерована согласно EU системе нумерации по Kabat (Lu et al., (2008) "The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation," J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969), для уменьшения случаев обмена цепями. В Fc-участок IgG4 могут быть введены и другие стабилизирующие мутации, известные из уровня техники (Peters, Р. et al., (2012) "Engineering an Improved lgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability," J. Biol. Chem. 287:24525-24533; PCT патентная публикация WO 2008/145142). В соответствии с конкретным вариантом осуществления, молекула, которая специфически связывает PD-1 (например, антитело к PD-1), будет содержать Fc-участок IgG4 и мутацию S228P.

В соответствии с другими вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к применению любого известного из уровня техники варианта Fc, такого как раскрытые в работе Jefferis, R. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma R1, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, MP. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4" J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CDS Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; патенты США №№5624821, 5885573, 6194551, 7276586 и 7317091; и РСТ патентные публикации WO 00/42072 и WO 99/58572. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению дополнительно содержат один или несколько сайтов гликозилирования с тем, чтобы к молекуле ковалентно присоединялись один или несколько углеводных фрагментов. Предпочтительно, молекулы по настоящему изобретению с одним или несколькими сайтами гликозилирования и/или одной или несколькими модификациями в Fc-участке придают или имеют повышенную антителоопосредованную эффекторную функцию например, повышенную ADCC-активность, по сравнению с немодифицированной молекулой. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, настоящее изобретение дополнительно относится к молекулам, содержащим одну или несколько модификаций аминокислот, которые известны как непосредственно или опосредовано взаимодействующие с углеводным фрагментом Fc-участка, включая без ограничения аминокислоты в положениях 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 и 301. Аминокислоты, которые непосредственно или опосредовано взаимодействуют с углеводным фрагментом Fc-участка, известны из уровня техники, см., например, работу Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation" Immunol. Lett. 44:111-17.

В соответствии с другим вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к молекулам, которые были модифицированы внесением одного или нескольких сайтов гликозилирования в один или несколько сайтов молекул, предпочтительно без изменения функциональности молекул, например, активности связывания с целевым антигеном или FcγR. Сайты гликозилирования могут быть внесены в вариабельный и/или константный участок молекул по настоящему изобретению.

Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к способам модификации углеводного содержимого молекулы по настоящему изобретению путем добавления или удаления сайта гликозилирования. Способы модификации углеводного содержимого антител (и молекул, содержащих домены антитела, например, Fc-участок) хорошо известны из уровня техники и охватываются настоящим изобретением, см., например, патент США №6218149, ЕР 0359096 В1; патентную публикацию США №2002/0028486, WO 03/035835; патентную публикацию США №2003/0115614; патент США №6218149; патент США №6472511; все из которых включены в настоящий документ в полном их объеме посредством ссылки. В соответствии с другими вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к способам модификации углеводного содержимого молекулы по настоящему изобретению путем удаления одного или нескольких эндогенных углеводных фрагментов молекулы. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к сдвигу сайта гликозилирования Fc-участка антитела путем модификации положений, прилегающих к 297. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, настоящее изобретение относится к модификации положения 296 так, чтобы гликозилировалось положение 296, а не положение 297.

Эффекторную функцию можно модифицировать с помощью таких методик, которые описаны в области техники конструирования антител, или другими способами. Например, можно ввести цистеиновый остаток(остатки) в Fc-участок, тем самым обеспечивая возможность образования межцепочечной дисульфидной связи в этом участке, в результате чего образуется гомодимерное антитело, которое может характеризоваться улучшенной способностью к интернализации и/или повышенным комплементзависимым цитолизом клеток и ADCC. См. работы Caron, Р.С.et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies" J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity" J. Immunol. 148(9):2918-2922. Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также можно получить с помощью гетеробифункциональных сшивающих линкеров, как описано в работе Wolff, Е.А. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice" Cancer Research 53:2560-2565. Альтернативно, может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные Fc-участки и, таким образом, может иметь повышенные комплементзависимые литические и ADCC-характеристики (Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge" Anti-Cancer Drug Design 3:219-230.

E. Конъюгаты с полипептидами

Молекулы по настоящему изобретению могут быть рекомбинантно слиты или химически конъюгированы (включая как ковалентные, так и нековалентные конъюгации) с гетерологичными полипептидами или их частями с образованием слитых белков. Предпочтительно, молекула по настоящему изобретению (особенно антитело) слито по меньшей мере с 10, по меньшей мере с 15, по меньшей мере с 20, по меньшей мере с 25, по меньшей мере с 30, по меньшей мере с 40, по меньшей мере с 50, по меньшей мере с 60, по меньшей мере с 70, по меньшей мере с 80, по меньшей мере с 90 или по меньшей мере со 100 аминокислотами гетерологичного полипептида с образованием необходимого слитого белка. Слияние не обязательно должно быть прямым, а может происходить посредством линкерных последовательностей. Молекулы (например, антитела и полипептиды) можно конъюгировать с терапевтическим средством для модифицирования определенного биологического ответа, оказания влияния (например, увеличения) на период полувыведения из сыворотки терапевтического средства или нацеливания терапевтического средства на конкретную субпопуляцию клеток. Для облегчения очистки их также можно слить с маркерными последовательностями (например, гексагистидиновым пептидом или меткой «flag»). Методики конъюгирования таких терапевтических частиц с антителами хорошо известны; см., например, работу Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd ed., Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.).

Дополнительные слитые белки можно создать с помощью методик перетасовки генов, перетасовки мотивов, перетасовки экзонов и/или перетасовки кодонов (в совокупности называемых «перетасовкой ДНК»). Перетасовку ДНК можно использовать для изменения активности молекул по настоящему изобретению (например, антител с более высокими значениями аффинности и более низкими значениями скорости диссоциации). Молекулы по настоящему изобретению или кодирующие их нуклеиновые кислоты можно дополнительно изменить, подвергнув их неспецифическому мутагенезу методом ПЦР с внесением ошибок, случайной нуклеотидной вставки или другими способами перед рекомбинированием. Одну или несколько частейполинуклеотида, кодирующего молекулу по настоящему изобретению, можно рекомбинировать с одним или несколькими компонентами, мотивами, отрезками, частями, доменами, фрагментами и т.д. одной или нескольких гетерологичных молекул.

F. Диатела и диатела DART®

Настоящее изобретение также относится к диателам и перенацеливающим реагентам с двойной аффинностью (и, в частности, к диателам DART® (MacroGenics, Inc.)). Соответственно, настоящее изобретение дополнительно относится к молекулам диател (особенно диател DART®), которые содержат по меньшей мере две связанных ковалентной связью полипептидных цепи, которые формируют по меньшей мере два эпитоп-связывающих сайта, один из которых специфически связывается с HER2/neu, а второй из них связывается с рецептором клеточной поверхности (или его лигандом), который регулирует иммунную контрольную точку. Предпочтительно, такие диатела будут связываться с HER2/neu и PD-1. В частности, настоящее изобретение относится к диателам и DART, содержащим антигенсвязывающие домены из антитела к HER2/neu и антитела к PD-1.

Конструирование и построение гомодимерных диател и стабильных, связанных ковалентной связью гетеродимерных немоноспецифических диател описано, например, в патентных публикациях США №№2013-0295121, 2010-0174053 и 2009-0060910; публикациях европейских патентов №№ ЕР 2714079, ЕР 2601216, ЕР 2376109, ЕР 2158221 и РСТ публикациях WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538, WO 2008/157379, WO 2006/113665 и Sloan, D.D. et al. (2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells," PLoS Pathog. 11(1 l):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) "Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform" Blood 127(1): 122-131; Chi chili, G.R. et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates" Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma" Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold" Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor CytolysisAndin vivo B-Cell Depletion" J. Mol. Biol. 399(3):436-449; Marvin, J.S. et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, "Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications " Prot Engr. Des. Sel. 17:21-27; Holliger, P. etal. (1993) "’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448. Каждая полипептидная цепь молекулы диатела содержит V_L участок и V_H участок, из одних и тех же или различных антител, которые ковалентно связаны так, чтобы домены не могли подвергаться самосборке. Взаимодействие двух полипептидных цепей будет приводить к образованию двух пар V_L-V_H, формируя два эпитоп-связывающих сайта, т.е. двухвалентную молекулу. Домены можно разделить пептидным линкером, а полипептидные цепи можно сконструировать таким образом, чтобы они содержали по меньшей мере один цистеиновый остаток на каждой цепи с тем, чтобы могли образовываться межцепочечные дисульфидные связи для стабилизации диатела.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, первая полипептидная цепь диатела содержит:

(i) домен (А), содержащий участок связывания вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичного к эпитопу HER2/neu;

(ii) домен (В), содержащий участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичного к эпитопу PD-1; и

(iii) необязательно домен (С).

Вторая полипептидная цепь такого диатела содержит:

(i) домен (D), содержащий участок связывания вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфичного к такому эпитопу PD-1;

(ii) домен (Е), содержащий участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфичного к такому эпитопу HER2/neu; и

(iii) необязательно домен (F).

Домены (А) и (В) диатела не связываются друг с другом с формированием эпитоп-связывающего сайта. Аналогичным образом, домены (D) и (Е) диатела не связываются друг с другом с формированием эпитоп-связывающего сайта. Вместо этого, домены (А) и (Е) диатела связываются друг с другом с формированием сайта связывания, который связывает эпитоп HER2/neu, и домены (В) и (D) диатела связываются друг с другом с формированием сайта связывания, который связывает эпитоп PD-1.

В альтернативном варианте вариабельные домены первой и второй полипептидных цепей могут меняться на противоположные так, чтобы первая полипептидная цепь диатела содержала:

(i) домен (А), содержащий участок связывания вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфичного к эпитопу PD-1;

(ii) домен (В), содержащий участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфичного к эпитопу HER2/neu; и

(iii) необязательно домен (С);

а вторая полипептидная цепь такого диатела содержала:

(i) домен (D), содержащий участок связывания вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичного к такому эпитопу HER2/neu;

(ii) домен (Е), содержащий участок связывания вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичного к такому эпитопу PD-1; и

(iii) необязательно домен (F).

В такой конфигурации с заменой доменов на противоположные, домены (А) и (Е) диатела связываются друг с другом с формированием сайта связывания, который связывает эпитоп PD-1, и домены (В) и (D) диатела связываются друг с другом с формированием сайта связывания, который связывает эпитоп HER2/neu.

При наличии домены (С) и (F) связаны друг с другом ковалентной связью. Домены (С) и (F) могут быть способствующими образованию гетеродимера доменами, которые облегчают взаимодействие первой и второй полипептидных цепей. Домены гетеродимеризации, полезные при получении диател, описаны, например, в РСТ публикациях WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538, WO 2008/157379 и WO 2006/113665, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Домены (С) и/или (F) могут содержать Fc-домен или его часть (например, домен СН2 или домен СН3). Fc-домен или его часть могут быть получены из иммуноглобулина любого изотипа или аллотипа, в том числе без ограничения IgA, IgD, IgG, IgE и IgM. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, Fc-домен (или его часть) получены из IgG. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, изотипом IgG является IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или его аллотип. В соответствии с одним вариантом осуществления, молекула диатела содержит Fc-домен, при этом Fc-домен содержит домен СН2 и домен CH3, независимо выбранные из любого типа иммуноглобулина (т.е. Fc-домена, содержащего домен СН2, полученный из IgG, и домен CH3, полученный из IgE, или домен CH2, полученный из IgG1, и домен СН3, полученный из IgG2 и т.д.). Fc-домен может быть сконструирован в полипептидной цепи, входящей в состав молекулы диатела по настоящему изобретению, в любом положении относительно других доменов или частей указанной полипептидной цепи (например, Fc-домен или его часть может быть С-концевым по отношению как к домену VL, так и к домену VH полипептидной цепи, или он может быть N-концевым по отношению как к домену VL, так и к домену VH, или он может быть N-концевым по отношению к одному домену и С-концевым по отношению к другому (т.е. между двумя доменами полипептидной цепи) и т.д.).

Fc-домены в полипептидных цепях молекул диатела преимущественно димеризируются, что приводит к формированию молекулы диатела, которая характеризуется иммуноглобулиноподобными свойствами, например, Fc-FcγR взаимодействиями. Fc-содержащие диатела могут быть димерами, например, состоять из двух полипептидных цепей, каждая из которых содержит домен VH, домен VL и домен Fc. Димеризация указанных полипептидных цепей приводит к получению двухвалентного диатела, содержащего Fc-домен, хотя и со структурой, отличающейся от структуры немодифицированного двухвалентного антитела. Такие молекулы антител будут характеризоваться измененными фенотипами относительно иммуноглобулина дикого типа, например, измененным периодом полужизни в сыворотке, свойствами связывания и т.д. В соответствии с другими вариантами осуществления, молекулы диател, содержащие Fc-домены, могут быть тетрамерами. Такие тетрамеры содержат две «более тяжелые» полипептидные цепи, т.е. полипептидную цепь, содержащую VL, VH и Fc-домен, и две «более легкие» полипептидные цепи, т.е. полипептидную цепь, содержащую VL и VR Более легкие и более тяжелые цепи взаимодействуют с формированием мономера, и указанные мономеры взаимодействуют посредством их неспаренных Fc-доменов с формированием Ig-подобной молекулы. Такое Ig-подобные диатело является четырехвалентным.

Для формирования тетраспецифической молекулы диатела, которое описано выше, необходимо взаимодействие четырех различных полипептидных цепей. Такие взаимодействия сложны к достижению с надлежащей эффективностью в пределах одноклеточной рекомбинантной продуцирующей системы из-за множества вариантов потенциальных ошибочных спариваний цепей. Одним решением для уменьшения вероятности ошибочных спариваний является разработка мутаций типа «выступ-во-впадину» в требуемых парах полипептидных цепей. Такие мутации благоприятствуют гетеродимеризации относительно гомодимеризации. Например, что касается Fc-Fc-взаимодействий, аминокислотная замена (предпочтительно замена на аминокислоту, содержащую объемную боковую группу, образующую «выступ», например, триптофан), может быть введена в домен СН2 или СН3 с тем, чтобы стерическое влияние препятствовало взаимодействию с аналогично мутированным доменом и принуждало мутированный домен образовывать пару с доменом, в который методом инженерии была встроена комплементарная или согласующаяся мутация, т.е. «впадина» (например, замена на глицин). Такие наборы мутаций можно методом инженерии встроить в любую пару полипептидов, входящую в состав молекулы диатела, и дополнительно встроить в любую часть полипептидных цепей указанной пары. Способы белковой инженерии для облегчения гетеродимеризации относительно гомодимеризации хорошо известны их уровня техники, в частности, в отношении инженерии иммуноглобулиноподобных молекул, и охватываются настоящим документом (см., например, Ridgway et al. (1996) "’Knobs-lnto-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, и Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, "J. Immunol. Methods 296:95-101; каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном ее объеме.

Настоящее изобретение также относится к молекулам диател, содержащим вариантные Fc-домены или вариантные шарнирные-Fc-домены (или их часть), причем вариантный Fc-домен содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, замену, вставку, делецию) относительно сопоставимого Fc-домена дикого типа или шарнирного-Fc-домена дикого типа (или его части). Молекулы, содержащие вариантные Fc-домены или шарнирные-Fc-домены (или их часть) (например, антитела) в норме имеют измененные фенотипы относительно молекул, содержащих Fc-домены дикого типа или шарнирные-Fc-домены дикого типа или их части. Вариантный фенотип может экспрессироваться в виде измененного периода полу жизни в сыворотке, измененной стабильности, измененной восприимчивости к клеточным ферментам или измененной эффекторной функции, что определяют по результатам NK-зависимого или макрофаг-зависимого анализа. Модификации Fc-домена, выявленные как изменяющие эффекторную функцию, описаны выше.

Настоящее изобретение также относится к молекулам, содержащим шарнирный домен. Шарнирный домен может быть получен из иммуноглобулина любого изотипа или аллотипа, в том числе IgA, IgD, IgG, IgE и IgM. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, шарнирный домен получен из IgG, причем изотипом IgG является IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или их аллотип. Указанный шарнирный домен может быть встроен методами инженерии в полипептидную цепь, входящую в состав молекулы диатела, вместе с Fc-доменом так, чтобы молекула диатела содержала шарнирный-Fc-домен. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, шарнир и Fc-домен независимо выбраны из любого изотипа иммуноглобулина, известного из уровня техники и проиллюстрированного в настоящем документе. В соответствии с другими вариантами осуществления, шарнир и Fc-домен разделены по меньшей мере одним другим доменом полипептидной цепи, например, доменом VL. Шарнирный домен, или необязательно шарнирный-Fc-домен, может быть встроен методами инженерии в полипептид по настоящему изобретению в любом положении относительно других доменов или частей указанной полипептидной цепи. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, полипептидная цепь по настоящему изобретению содержит шарнирный домен, при этом шарнирный домен находится на С-конце полипептидной цепи, причем указанная полипептидная цепь не содержит Fc-домен. В соответствии с еще одними вариантами осуществления, полипептидная цепь по настоящему изобретению содержит шарнирный-Fc-домен, при этом шарнирный-Fc-домен находится на С-конце полипептидной цепи. В соответствии со следующими вариантами осуществления, полипептидная цепь по настоящему изобретению содержит шарнирный-Fc-домен, при этом шарнирный-Fc-домен находится HaN-конце полипептидных цепей.

Без привязки к конкретному механизму действия, молекулы диател по настоящему изобретению характеризуются повышенной терапевтической эффективностью, относительно известных из уровня техники терапевтических антител, отчасти, из-за способности диатела специфически связываться с клеткой-мишенью, которая имеет пониженный уровень экспрессии конкретного антигена (например, Her2/neu или PD-1), например, благодаря способности диатела оставаться на клетке-мишени дольше из-за повышенной авидности взаимодействия диатело-эпитоп. Таким образом, диатела по настоящему изобретению особенно полезны при лечении, предупреждении или контроле заболевания или нарушения, такого как злокачественная опухоль, в подгруппе, которая имеет низкие уровни экспрессии целевого антигена в популяции клеток-мишеней.

Молекулы диател могут быть получены с помощью различных способов, в том числе синтеза белка de novo и рекомбинантной экспрессией нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие белки. Необходимые последовательности нуклеиновых кислот могут быть получены рекомбинантными способами (например, ПЦР-мутагенезом ранее полученного варианта необходимого полинуклеотида) или с помощью твердофазного синтеза ДНК. Предпочтительно применяют рекомбинантные способы экспрессии. В связи с вырожденностью генетического кода каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулина кодирует несколько последовательностей нуклеиновых кислот, и настоящее изобретение относится ко всем нуклеиновым кислотам, кодирующим связывающие белки, которые описаны в настоящем документе.

G. Получение антител

Антитела по предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения можно произвести или получить любым из множества способов. Например, такие антитела можно получить из плазмы, синтетическим способом, рекомбинантным способом или трансгенным способом посредством клетки (например, гибридомной культуры) и т.д. Получение синтетических белков было описано, например, в работе Dawson, Р.Е. et al. (2000) "Synthesis Of Native Proteins By Chemical Ligation, " Annu. Rev Biochem. 69:923-960; Wilken, J. et al. (1998) "Chemical Protein Synthesis" Curr. Opin. Biotechnol. 9(4):412-426; и в работе Kochendoerfer, G.G. et al. (1999) "Chemical Protein Synthesis, "Curr. Opin. Chem. Biol. 3(6):665-671.

Антитела могут быть получены рекомбинантно путем сначала выделения антител, полученных из животных-хозяев, получения последовательности генов и применения последовательности генов для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ, бомбардировку микрочастицами, липофекцию и инфекцию (например, где вектор является инфекционным агентом, таким как вирус коровьей оспы). Выбор вводящихся векторов или полинуклеотидов зачастую будет зависеть от особенностей клетки-хозяина

Для выделения генов, кодирующих представляющее интерес антитело, полипептид или белок, можно применять любые клетки-хозяева, способные к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК. Неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают без ограничения клетки COS, HeLa и СНО. Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне приблизительно в 5 раз превышающем, более предпочтительно в 10 раз превышающем, еще более предпочтительно в 20 раз превышающем уровень соответствующего представляющего интерес эндогенного антитела или белка, при наличии, у клетки-хозяина. Скрининг клеток-хозяев в отношении специфического связывания с HER2/neu или PD-1 осуществляют иммуноанализом или FACS. Получение антител посредством клеточной (например, гибридомной) культуры описано, например, в работе Laffly, Е. et al. (2005) "Monoclonal And Recombinant Antibodies, 30 Years After…," Hum. Antibodies. 14(1-2):33-55; Aldington, S. et al. (2007) "Scale-Up Of Monoclonal Antibody Purification Processes" J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):64-78; S.S. Farid (2006) J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):8-18; Birch, J.R. et al. (2006) "Antibody Production" Adv. Drug Deliv. Rev. 58(5-6):671-685; Even, M.S. et al. (2006) "Serum-Free Hybridoma Culture: Ethical, Scientific And Safety Considerations" Trends Biotechnol. 24(3): 105-108; Graumann, K. et al. (2006) "Manufacturing Of Recombinant Therapeutic Proteins In Microbial Systems" Biotechnol. J. 1(2): 164-86; в патенте США №7121239; и патентных публикациях США №20070037216 и №20040197866.

Другим способом, который может быть использован, является экспрессия последовательности антител в растениях (например, табаке) или в трансгенном молоке. Были раскрыты подходящие способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке (см., например, Peeters, K. et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants" Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int Rev. Immunol 13:65-93; и Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157).

Из уровня техники известны подходящие способы получения производных антител, например, гуманизированных, оптимизированных, одноцепочечных и т.д. Производные антител, имеющие, например, повышенную аффинность к их антигену, могут быть получены с помощью способов фагового дисплея. Технология, называемая созреванием аффинности, предусматривает использование мутагенеза или «прогулки» по CDR и повторного отбора с использованием родственного антигена для выявления антител, которые связываются с более высокой аффинностью к антигену по сравнению с исходным или родительским антителом (см., например, Glaser, S.M. et al. (1992) "Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System" J. Immunology 149:3903; Wu, H. et al. (1998) "Stepwise in vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An AlphaV Beta3-mAb," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037-6042; Yelton, D.E. et al. (1995) "Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunology 155:1994-2004; Schier, R et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity anti-c-erbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site " J. Mol. Bio. 263:551-567).

Полностью человеческие антитела (также называемые целиком человеческими антителами) можно получить с применением трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать эндогенные гены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, но могут экспрессировать человеческие гены тяжелой и легкой цепи. Обзор этой технологии получения человеческих антител описан, например, в работе Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int Rev. Immunol. 13:65-93, и в патенте США №5633425. Полностью человеческие антитела также можно получить с помощью других методик, известных в настоящей области техники, в том числе библиотек фагового дисплея (которые описаны в работе Hoogenboom, H.R. et al. (1991) "By-Passing Immunisation. Human Antibodies From Synthetic Repertoires Of Germline V_H Gene Segments Rearranged In Vitro" J. Mol. Biol. 227:381, и в работе Marks, J.D. et al. (1991) "By-Passing Immunization. Human Antibodies From V-Gene Libraries Displayed On Phage" J. Mol. Biol. 222:581) или «направленного отбора» (который описан, например, в работе Jespers, L.S. et al. (1994) "Guiding The Selection Of Human Antibodies From Phage Display Repertoires To A Single Epitope Of An Antigen" Biotechnology 12:899-903). Для получения гуманизированных или человеческих антител также можно применять трансгенных животных, которые предназначены для выработки более желательного (например, полностью человеческих антител) или более робастного иммунного ответа Примерами такой методики являются XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Фримонт, Калифорния) и HUMAB-MOUSE® и ТС MOUSE™ (обе от Medarex, Inc., Принстон, Нью-Джерси).

Настоящее изобретение относится к модификациям описанных в настоящем документе антител (т.е. антител к HER2/neu и антител к PD-1), в том числе к функционально эквивалентным антителам и слитым полипептидам, которые не оказывают существенного влияния на свойства таких молекул, а также к вариантам, которые характеризуются повышенной или уменьшенной активностью. Модификация полипептидов является обычной практикой в настоящей области техники и не нуждается в подробном описании в настоящем документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или несколькими делениями или добавлениями аминокислот, которые не оказывают значительного пагубного влияния на функциональную активность, или с применением химических аналогов. К аминокислотным остаткам, которые могут быть консервативно заменены друг другом, относятся без ограничения глицин/аланин, серин/треонин, валин/из о лейцин/лейцин, аспарагин/глутамин, аспарагиновая кислота/глутаминовая кислота, лизин/аргинин и фенилаланин/тирозин. К таким полипептидам также относятся гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Предпочтительно, аминокислотные замены будут консервативными, т.е. внесенная в результате замены аминокислота будет обладать такими же химическими свойствами, что и исходная аминокислота. Такие консервативные замены известны из уровня техники, и их примеры были приведены выше. Аминокислотные модификации могут варьировать от изменения или модификации одной или нескольких аминокислот до полной реорганизации участка, такого как вариабельный участок. Изменения в вариабельном участке могут изменять аффинность и/или специфичность связывания. Другие способы модификации предусматривают применение известных в настоящей области методик связывания, включая без ограничения ферментативные средства, окислительное замещение и хелатирование. Модификации можно применять, например, для прикрепления меток для иммуноанализа, такого как прикрепление радиоактивных фрагментов для радиоиммунологического анализа. Модифицированные полипептиды получают с помощью общепринятых в настоящей области техники процедур, и их можно подвергнуть скринингу с помощью известных в настоящей области техники стандартных анализов.

Н. Характеристика связывающих молекул

Связывающие молекулы, такие как антитела, могут быть охарактеризованы различными способами. В частности, антитела можно проанализировать в отношении способности специфически связываться с антигеном, например, HER2/neu, PD-1, или, если молекула содержит Fc-участок (или его часть), то в отношении способности формировать Fc-FcγR взаимодействия, т.е. специфического связывания Fc-участка (или его части) с FcγR.

К иммуноанализам, которые можно применять для анализа специфического связывания, перекрестной реактивности и Fc-FcγR взаимодействий, относятся без ограничения системы конкурентного и неконкурентного анализа с использованием таких методик, как вестерн-блоты, радиоиммунологические анализы, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализы «сэндвич»-типа, анализы иммунопреципитации, реакции преципитации, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунохроматографические анализы, анализы иммунодиф фузии, анализы агглютинации, анализы фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы и иммуноанализы с использованием белка А и т.д. (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY).

Аффинность связывания с целевым антигеном обычно измеряют или определяют с помощью стандартных анализов взаимодействий между антителом и антигеном, такими как конкурентные анализы BIAcore, анализы насыщения или иммунологические анализы, такие как ИФА или RIA. Для иммунологических или функциональных анализов с целью характеристики молекул по настоящему изобретению можно использовать сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS) с использованием любой методики, известной специалистам в настоящей области техники. Анализы на основе поверхностного плаз ионного резонанса можно применять для характеристики кинетических параметров связывания антигенсвязывающего домена или Fc-FcγR.

Охарактеризовать связывание с FcγR молекулами, содержащими Fc-участок (или его часть) и/или содержащими эпитоп-связыватощий домен, специфичный к FcγR, можно согласно способам, описанным в области техники конструирования антител. Анализы эффекторных функций клеток хорошо известны, например, которые описаны в работе Perussia, В. et al. (2000) "Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells" Methods Mol. Biol. 121:179-192; Lehmann, A.K. et al. (2000) "Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry," J. Immunol. Methods 243(1-2):229-242; Baggiolini, M. et al. (1998) "Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity," Experientia 44(10): 841-848; Brown, E.J. (1994) "In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction," Methods Cell Biol. 45:147-164; и Munn, D.H. et al. (1990) "Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor," J. Exp. Med. 172:231-237.

VII. Способы лечения

Молекулы, которые специфически связываются с HER2/neu, и молекулы, которые специфически связывают рецептор клеточной поверхности (или его лиганд), который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (особенно PD-1), можно применять для терапевтических целей у индивидуумов со злокачественной опухолью или другими заболеваниями. В соответствии с одним вариантом осуществления, молекулы, имеющие такую специфичность связывания, вводят одновременно, в контексте настоящего документа такое «одновременное» введение предназначено для обозначения:

(A) введения одной фармацевтической композиции, которая содержит как молекулу, которая специфически связывает HER2/neu, так и молекулу, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности (или его лиганд), который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (в частности, PD-1). Такие молекулы могут быть одной и той же молекулой (например, диателом) или могут отличаться (например, антитело к HER2/neu или его антигенсвязывающий фрагмент и антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент);

или

(B) раздельного введения двух или более фармацевтических композиций, причем одна из этих композиций содержит молекулу, которая специфически связывает HER2/neu, а другая композиция из этих композиций содержит молекулу, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности (или его лиганд), который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (в частности, PD-1), при этом эти композиции вводят в пределах 24-часового периода.

В соответствии со вторым вариантом осуществления используют две различные молекулы и молекулы вводят «последовательно» (например, вводят антитело к HER2/neu, а позднее вводят антитело к PD-1 или наоборот). При таком последовательном введении вторую вводимую композицию наиболее предпочтительно вводят по меньшей мере через 24 часа или позже после введения первой вводимой композиции.

Проведение терапии или «лечения» относится к любым признакам успеха при лечении или облегчении повреждения, патологии или состояния, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как смягчение, ремиссия, ослабление симптомов или облегчение переносимости пациентом повреждения, патологии или состояния, замедление скорости перерождения или ухудшения, что делает конечную точку перерождения менее изнурительной или улучшает физическое или психическое состояние пациента. Лечение или облегчение симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах, в том числе результатах физического обследования, психоневрологический обследований и/или психиатрической оценки.

В число предпочтительных субъектов для лечения входят животные, наиболее предпочтительно виды млекопитающих, такие как люди или другие приматы и домашние животные, такие как собаки, кошки и т.п., которые являются субъектом с заболеванием или другими патологическими состояниями. «Пациент» обозначает субъекта, предпочтительно млекопитающего (в том числе человека).

В соответствии с одним вариантом осуществления, моноклональное антитело к HER2/neu и моноклональное антитело к PD-1 можно применять для иммунотерапии, направленной на клетки злокачественной опухоли различных тканей, экспрессирующие HER2/neu, и, в частности, клетки такой злокачественной опухоли, как злокачественная опухоль молочной железы, глиобластома, карцинома шейки матки, метастатическая колоректальная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль желудка, гепатоклеточная карцинома, лейкоз, злокачественная опухоль легкого, метастатическая меланома, васкуляризированная злокачественная опухоль поджелудочной железы и метастатическая злокачественная опухоль предстательной железы. Такая иммунотерапия может, например, быть достаточной для уменьшения клеточного деления клетки злокачественной опухоли, задержки развития (например, начала развития и увеличения размеров) метастазов и/или для стимуляции активности иммунной системы на клетки злокачественной опухоли.

Понятно, что молекулы вводят в концентрации, которая способствует связыванию в физиологических (например, in vivo) условиях. Молекулы (например, антитела или диатела) можно вводить с дополнительными средствами, которые усиливают или направляют собственный иммунный ответ индивидуума, такими как средство, которое усиливает ADCC.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления, одну или несколько таких молекул (например, антител или диател) можно конъюгировать с радиоактивной молекулой, токсином (например, калихемицином), химиотерапевтической молекулой, липосомами или другими везикулами, содержащими химиотерапевтические соединения, и ввести их нуждающемуся в таком лечении индивидууму для нацеливания этих соединений на клетку злокачественной опухоли, содержащую антиген, распознаваемый антителом, и, таким образом, устранить клетки злокачественной опухоли или пораженные клетки. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, антитело (например, антитело к HER2/neu) интернализируется клеткой, несущей HER2/neu на своей поверхности, тем самым доставляя конъюгированную частицу в клетку для индукции терапевтического эффекта, а молекула, которая специфически связывается с рецептором клеточной поверхности (или его лигандом), участвующим в регуляции иммунной контрольной точки (особенно PD-1), способствует активации иммунной системы.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления, такие молекулы (например, антитела или диатела) можно использовать в качестве адъювантной терапии во время хирургического удаления опухоли с целью задержки, подавления или предупреждения развития метастаз. Молекулы также можно вводить до операции (неоадъювантная терапия) для уменьшения размера опухоли и, таким образом, обеспечения возможности проведения или упрощения хирургической операции, сохранения ткани во время хирургической операции и/или уменьшения любого физического недостатка, являющегося следствием хирургической операции

Антитела к HER2/neu по настоящему изобретению особенно полезны для лечения и/или предупреждения заболевания или нарушения, где необходима эффекторная функция клеток (например, ADCC), опосредованная FcγR (например, при злокачественной опухоли). Например, антитела к HER2/neu по настоящему изобретению могут связывать антиген клеточной поверхности и FcγR (например, FcγRIIIA) на иммунной эффекторной клетке (например, NK-клетке), стимулируя эффекторную функцию (например, ADCC, С DC, фагоцитоз, опсонизацию и т.д.) против указанной клетки. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, антитела к HER2/neu по настоящему изобретению особенно пригодны для лечения злокачественных опухолей. Эффективность стандартной терапии моноклональными антителами зависит от полиморфизма FcγR у субъекта Cartron, G. et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIa Gene," Blood 99:754-758; Weng, W.K. et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment С Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma," J Clin Oncol. 21(21):3940-3947. Эти рецепторы экспрессируются на поверхности эффекторных клеток и опосредуют ADCC. Высокоаффинные аллели повышают способность эффекторных клеток опосредовать ADCC. В частности, антитела к HER2/neu по настоящему изобретению содержат вариантный Fc-участок, который характеризуется повышенной аффинностью к FcγR (относительно Fc-участка дикого типа) на эффекторных клетках, таким образом являясь более эффективными иммунотерапевтическими реагентами для пациентов, независимо от полиморфизма FcγR у них.

VIII. Поддающиеся лечению нарушения

К числу иллюстративных нарушений, которые можно лечить с помощью различных вариантов осуществления по настоящему изобретению, относятся без ограничения пролиферативные нарушения и конкретно злокачественная опухоль (и даже более конкретно экспрессирующая HER2/neu злокачественная опухоль). В соответствии с различными вариантами осуществления, настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения, предупреждения или контроля заболевания или нарушения у субъекта, предусматривающим введение субъекту терапевтически эффективного количества молекулы, которая специфически связывает HER2/neu, и молекулы, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности (или его лиганд), который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (например, PD-1). Например, молекулы по настоящему изобретению особенно полезны для предупреждения, ингибирования, уменьшения роста или регрессии первичных опухолей и метастазирования клеток злокачественной опухоли. Несмотря на то, что не подразумевается, что молекулы по настоящему изобретению ограничены конкретным механизмом действия, молекулы по настоящему изобретению могут опосредовать эффекторную функцию против клеток злокачественной опухоли, способствовать активации иммунной системы против клеток злокачественной опухоли, сшивать антигены клеточной поверхности и/или рецепторы на клетках злокачественной опухоли и усиливать апоптоз или передачу отрицательных в отношении роста регуляторных сигналов или их комбинацию, что приводит в результате к устранению опухоли и/или к уменьшению опухоли.

Антитела со сниженной аффинностью к FcγRIIB и с повышенной аффинностью к FcγRIIIA и/или FcγRIIA могут приводить к усиленной активации ответа на связывание FcγR и, таким образом, обладают повышенной терапевтической эффективностью для лечения и/или предупреждения развития злокачественной опухоли. К неограничивающим примерам злокачественных опухолей, поддающихся лечению с помощью представленных в настоящем документе способов, относятся острая миелоидная лимфома, карцинома надпочечника, аденокарцинома, базальноклеточная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль мочевого пузыря, злокачественная опухоль костей, саркома костей и соединительных тканей, злокачественная опухоль головного мозга, злокачественная опухоль молочной железы, бронхиальная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль шейки матки, хориокарцинома, хронический лимфоцит арный лейкоз, хронический миелолейкоз, злокачественная опухоль толстой кишки, колоректальная злокачественная опухоль, эндотелиальная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль пищевода, злокачественная опухоль глаза, злокачественная опухоль фаллопиевых труб, злокачественная опухоль желчного пузыря, злокачественная опухоль желудочно-кишечного тракта, глиома, волосатоклеточный лейкоз, гепатома, болезнь Ходжкина, злокачественная опухоль внутрипеченочных желчных протоков, злокачественная опухоль суставов, саркома Капоши, злокачественная опухоль почки, злокачественная опухоль глотки, злокачественная опухоль печени, лейкоз, злокачественная опухоль легкого, лимфобластный лейкоз, лимфома, злокачественная мезотелиома, медуллобластома, меланома, мезотелиома, злокачественная опухоль среднего уха, множественная миелома, миелома, злокачественная миксома, злокачественная опухоль носовой полости, злокачественная опухоль носоглотки, нейробластома, неходжкинская лимфома, немелкоклеточная злокачественная опухоль легкого, злокачественная опухоль носа, злокачественная опухоль ротовой полости, злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль поджелудочной железы, злокачественная опухоль полового члена, злокачественная опухоль брюшной полости, злокачественная опухоль глотки, злокачественная опухоль гипофиза, злокачественная опухоль предстательной железы, злокачественная опухоль прямой кишки, почечная злокачественная опухоль, злокачественная опухоль слюнных желез, злокачественная опухоль кожи, саркома мягких тканей, плоскоклеточная карцинома, злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль яичек, злокачественная опухоль щитовидной железы, злокачественная опухоль органов мочевой системы, злокачественная опухоль матки, злокачественная опухоль влагалища, злокачественная опухоль семенников, злокачественная опухоль женских наружных половых органов и опухоль Вильма.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, злокачественной опухолью является гематопоэтическая злокачественная опухоль или связанная с кровью злокачественная опухоль, такая как лимфома, лейкоз, миелома, лимфблейкоз, злокачественная опухоль селезенки и злокачественная опухоль лимфатических узлов. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, злокачественной опухолью является В-клеточная злокачественная опухоль, такая как, например, лимфома высокой, промежуточной или низкой степени злокачественности (в том числе В-клеточная лимфома, такаякак, например, лимфома Беркитта, диффузная крупноклеточная лимфома, фолликулярная лимфома, лимфома Ходжкина, лимфома из клеток мантийной зоны, лимфома из клеток маргинальной зоны, В-клеточная лимфома слизистой лимфоидной ткани, неходжкинская лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома и Т-клеточные формы лимфомы) и лейкозы (в том числе хронический лимфоцитарный лейкоз, такой как В-клеточный лейкоз (CD5+ В-лимфоцитов), хронический миелоидный лейкоз, лимфоидный лейкоз, такой как острый лимфобластный лейкоз, миелодисплазия, миелоидный лейкоз, такой как острый миелоидный лейкоз и вторичный лейкоз), множественная миелома, такая как плазмацитома, и другие гематологические и/или В-клеточные или Т-клеточные злокачественные опухоли. Другими иллюстративными злокачественными опухолями являются злокачественные опухоли дополнительных гематопоэтических клеток, включая полиморфоядерные лейкоциты, такие как базофилы, эозинофилы, нейтрофилы и моноциты, дендритные клетки, тромбоциты, эритроциты и натуральные киллеры.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, злокачественной опухолью является злокачественная опухоль, в которой сверхэкспрессируется HER2/neu. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, злокачественной опухолью является злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль желудка, злокачественная опухоль предстательной железы, злокачественная опухоль матки, злокачественная опухоль яичника, злокачественная опухоль толстой кишки, эндотелиальная злокачественная опухоль, карцинома надпочечника, немелкоклеточная злокачественная опухоль легкого, злокачественная опухоль головы и шеи, злокачественная опухоль гортани, злокачественная опухоль печени, почечная злокачественная опухоль, глиобластома или злокачественная опухоль поджелудочной железы, в которой сверхэкспрессируется HER2/neu.

IX. Фармацевтические композиции

Для введения в качестве «активных ингредиентов» фармацевтической композиции можно применять различные составы с молекулами по настоящему изобретению (например, антителами или диателами). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, такие молекулы можно вводить в чистом виде. Кроме фармакологически активного средства(средств) композиции по настоящему изобретению могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие наполнители и вспомогательные вещества, которые хорошо известны в настоящей области техники и являются относительно инертными веществами, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества или которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые можно применять в фармацевтических целях для доставки в место действия. Например, наполнитель может придавать форму или консистенцию или выполнять роль разбавителя. Подходящие наполнители включают без ограничения стабилизирующие средства, смачивающие и эмульгирующие средства, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие средства, буферы и усилители проникновения в кожу. Композиции могут быть представлены в любой подходящей форме, например, в таблетках, пилюлях, порошках, пастилках, саше, облатках, настойках, суспензиях, эмульсиях, растворах, сиропах, аэрозолях (в виде твердого вещества или в виде жидкой среды), мазях, содержащих, например, до 10 мас. % активного соединения, мягких и твердых желатиновых капсулах, суппозиториях, стерильных инъекционных растворах и стерильных упакованных порошках, помимо прочих неограничивающих альтернатив. Такие композиции можно получить с помощью любого известного способа, например, путем смешивания активного ингредиента с носителем(носителями) или наполнителем(наполнителями) в стерильных условиях.

Подходящие составы для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, в виде водорастворимых солей. Кроме того, можно вводить суспензии активных соединений, подходящих для масляных инъекционных суспензий. К подходящим липофильным растворителям или носителям относятся жирные масла, например, кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии и включают, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Необязательно, суспензия также может содержать стабилизаторы. Для инкапсулирования средства для доставки в клетку также можно применять липосомы.

Фармацевтический состав для системного введения в соответствии с настоящим изобретением может быть составлен для энтерального, парентерального введения или местного применения. Фактически, все три типа состава можно применять одновременно для осуществления системного введения активного ингредиента. Наполнители, а также составы для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственных средств, изложены в работе Remington: The Science And Practice Of Pharmacy, 21^st Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishing (2005). Подходящие составы для перорального введения включают твердые или мягкие желатиновые капсулы, пилюли, таблетки, в том числе таблетки с покрытием, настойки, суспензии, сиропы или ингаляционные формы и их формы с контролируемым высвобождением. Обычно эти средства составляют для введения путем инъекции (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.), хотя также можно применять другие формы введения (например, пероральную, чрезслизистую и т.д.). Соответственно, молекулы по настоящему изобретению (например, антитела к HER2/neu, антитела к PD-1) предпочтительно объединяют в комбинацию с фармацевтически приемлемыми средами, такими как солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и т.п.

Фармацевтические композиции также можно составить таким образом, чтобы обеспечить быстрое, продолжительное или замедленное высвобождение их активных ингредиентов после введения пациенту с использованием процедур, известных в настоящей области техники. Физические и химические характеристики композиций по настоящему изобретению можно модифицировать или оптимизировать в соответствии с уровнем техники в зависимости от способа введения и конкретного подлежащего лечению заболевания или нарушения. Композиции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, в герметично закрытой емкости или как часть набора, который может включать в себя инструкции по применению и/или множество стандартных лекарственных форм.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления, терапевтические средства могут быть включены в композицию, например, путем инкапсуляции в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или слитый белок, опосредованного рецептором эндоцитоза (см., например, Wu G.Y. and Wu С.Н. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DMA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструирования нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д. В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, терапевтические средства поставляют в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытой емкости, и их можно ресуспендировать, например, водой или солевым раствором до соответствующей концентрации для введения субъекту.

Предпочтительно терапевтическое средство поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытой емкости в стандартной дозе по меньшей мере 5 мг, более предпочтительно по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг или по меньшей мере 75 мг. Лиофилизированный порошок следует хранить при температуре от 2°С до 8°С в его исходной емкости, а молекулы следует вводить парентерально в пределах 12 часов, предпочтительно в пределах 6 часов, в пределах 5 часов, в пределах 3 часов или в пределах 1 часа после ресуспендирования. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления, терапевтические средства поставляют в жидкой форме в герметично закрытой емкости с указанием количества и концентрации терапевтического средства. Предпочтительно, жидкую форму поставляют в герметично закрытой емкости по меньшей мере 1 мг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/кг, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 150 мг/мл, по меньшей мере 200 мг/мл молекул.

При необходимости введения более одного терапевтического средства, средства можно составить вместе в одном и том же составе или можно составить в раздельных композициях. Следовательно, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекула, которая специфически связывает HER2/neu, и молекула, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности (или его лиганд), который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (например, PD-1), составляют вместе в одной фармацевтической композиции. В соответствии с альтернативными вариантами осуществления, молекулы составляют в отдельных фармацевтических композициях.

X. Наборы

Композиции также могут быть включены в набор. Набор может включать, в соответствии с неограничивающими аспектами, фармацевтическую композицию, содержащую терапевтическое средство, инструкции по применению и/или другие компоненты. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, набор может включать готовую для введения композицию. К емкостям наборов можно отнести бутылку, дозатор, упаковку, отделение или другие типы емкостей, в которых может быть размещен компонент. Емкость может содержать знаки на своей поверхности. Знаками, например, могут быть слово, фраза, аббревиатура, изображение или символ. Емкости могут дозировать предопределенное количество компонента (например, композиций по настоящему изобретению). Композиция может быть дозирована в спрее, аэрозоле или в жидкой форме или в полутвердой форме. Емкости могут иметь механизмы для распыления, прокачки или сжатия. В соответствии с некоторыми аспектами набор может включать в себя шприц для введения композиций по настоящему изобретению.

Если в наборе содержится более одного компонента, они могут быть упакованы вместе, или такой набор также обычно будет содержать вторую, третью или другие дополнительные емкости, в которые могут быть отдельно помещены дополнительные компоненты. Наборы по настоящему изобретению также могут включать емкость, в которой размещены компоненты, плотно уложенные для коммерческой продажи. Такие емкости могут включать в себя изготовленные литьем под давлением или выдувным формованием пластиковые емкости, в которых хранятся необходимые бутылки, дозаторы или упаковки. Набор может также включать в себя инструкции по использованию компонентов набора, а также по применению любых других композиций, соединений, средств, активных ингредиентов или объектов, не включенных в набор. Инструкции могут включать варианты, которые могут быть реализованы. Инструкции могут включать в себя пояснение, как, например, применять, использовать и хранить продукты или композиции.

XI. Введение и дозировка

Доступны различные пути введения композиций по настоящему изобретению. Конкретный выбранный способ будет зависеть, конечно, от конкретного выбранного терапевтического средства, независимо от того, предназначено ли введение для предупреждения, диагностики или лечения заболевания, тяжести подвергаемого лечению медицинского нарушения и дозы, необходимой для терапевтической эффективности. Способы по настоящему изобретению можно осуществлять на практике с применением любого способа введения, который является приемлемым с медицинской точки зрения и дает эффективные уровни активных соединений, не вызывая неприемлемых с клинической точки зрения побочных эффектов. К таким способам введения относятся без ограничения пероральный, трансбуккальный, подъязычный, ингаляционный, чрез слизистый, ректальный, интраназальный, местный, глазной, периокулярный, внутриглазной, трансдермальный, подкожный, внутриартериальный, внутривенный, внутримышечный, парентеральный или инфузионный методы. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, может быть необходимо локальное введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению в нуждающуюся в лечении область; это можно осуществить, например, путем без ограничения локальной инфузии, путем инъекции или посредством имплантата, причем указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или желатинообразный материал, включая мембраны, такие как мембраны Sikalastic, или волокна

Применяемый в контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» означает общее количество каждого активного компонента фармацевтической композиции или способа, которое является достаточным для того, чтобы наблюдалась значимая польза для пациента, т.е. излечение или облегчение хронических состояний, уменьшение симптомов, увеличение скорости излечения таких состояний или поддающееся обнаружению изменение уровней вещества в обработанной или окружающей ткани. Применительно к отдельному активному ингредиенту, вводимому отдельно, этот термин обозначает только такой ингредиент. Применительно к комбинации термин относится к объединенным в комбинацию количествам активных ингредиентов, которые приводят в результате к терапевтическому эффекту, независимо от того, вводят ли их в комбинации, последовательно или одновременно.

Точная доза, которая будет использованав составах по настоящему изобретению, будет зависеть от пути введения и от тяжести состояния, и должна определяться на усмотрение практикующего клинициста и с учетом обстоятельств для каждого пациента, и может быть определена с помощью стандартных клинических методик. Эффективные дозы (т.е. дозы, достаточные для эффективного лечения, предупреждения или облегчения одного или нескольких симптомов, связанных с нарушением) можно экстраполировать из кривых зависимости «доза-ответ», полученных из тест-систем in vitro или на животных моделях. Конкретный режим дозирования, т.е. доза, время и повторение, будет, таким образом, зависеть от конкретного индивидуума и истории болезни такого индивидуума, а также от пути введения. Дозировку и частоту введения молекулы по настоящему изобретению можно уменьшить или изменить путем усиления их поглощения и/или проникновения в ткань, как, например, путем липидизации.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, терапевтические средства по настоящему изобретению вводят в периодичных режимах дозирования либо путем непрерывной инфузии, либо частого введения без длительных периодов покоя. Такое периодичное введение может предусматривать дозирование с постоянными интервалами без периодов покоя. Как правило, терапевтические средства, в частности, цитотоксические средства, применяют в более низких дозах. Такие режимы дозирования охватывают постоянное ежедневное введение относительно низких доз в течение длительных периодов времени, которое может минимизировать токсические побочные эффекты и исключать периоды покоя. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, терапевтические средства вводят постоянной низкой дозой или непрерывной инфузией в диапазоне от приблизительно 24 часов до приблизительно 2 дней, до приблизительно 1 недели, до приблизительно 2 недель, до приблизительно 3 недель, до приблизительно 1 месяца, до приблизительно 2 месяцев, до приблизительно 3 месяцев, до приблизительно 4 месяцев, до приблизительно 5 месяцев, до приблизительно 6 месяцев. Специалист-онколог может оптимизировать схемы таких режимов дозирования.

Предпочтительно, молекулы по настоящему изобретению вводят с применением режима лечения, предусматривающего одну или несколько доз, при этом режим лечения назначают на период 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней или 7 дней. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, режим лечения предусматривает периодическое введение доз эффективного количества таких молекул (например, введение дозы на 1-й день, 2-й день, 3-й день и 4-й день заданной недели и не введение доз этой молекулы в другие дни недели. В частности, охватывается введение таких молекул на 5-й день, 6-й день и 7-й день той же недели. Обычно имеет место 1, 2, 3, 4, 5 или более курсов лечения. Каждый курс может иметь такой же режим или другой режим лечения.

В соответствии с другим вариантом осуществления, вводимую дозу повышают на протяжении первой четверти, первой половины или первых двух третей или трех четвертей режима(-ов) (например, на протяжении первого, второго или третьего режима лечения из 4 курсов) до тех пор, пока достигают суточного профилактически или терапевтически эффективного количества молекулы.

Дозировку таких молекул, вводимых пациенту, можно рассчитать для применения в качестве монотерапии. Альтернативно, молекулу можно применять в комбинации с другими терапевтическими композициями, и вводимая пациенту дозировка будет ниже, чем при применении указанных молекул в качестве монотерапии. Дозировка таких молекул (или комбинации таких молекул), вводимая пациенту, обычно составляет по меньшей мере приблизительно 1,0 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг массы тела или по меньшей мере приблизительно 20 мг/кг массы тела, В случае антител, к которым относится настоящее изобретение, вводимая пациенту дозировка обычно составляет от 1,0 мг/кг до 100 мг/кг массы тела пациента. Предпочтительно, вводимая пациенту дозировка составляет от 1,0 мг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела, от 1,0 мг/кг массы тела до 10 мг/кг массы тела, от 1,0 мг/кг массы тела до 5 мг/кг массы тела, от 2,0 мг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела или от 5 мг/кг массы тела до 20 мг/кг массы тела пациента. В соответствии с одним вариантом осуществления, вводимая пациенту дозировка составляет от 6 мг/кг массы тела до 18 мг/кг массы тела. В соответствии с другим вариантом осуществления, вводимая пациенту дозировка составляет 6 мг/кг массы тела, 10 мг/кг массы тела, 15 мг/кг массы тела или 18 мг/кг массы тела. Рассчитанную дозу будут вводить, исходя из массы тела пациента на исходном уровне лечения. Значительное (≥10%) изменение массы тела от исходного уровня или массы при установившемся плато должно приводить к перерасчету дозы.

В альтернативном варианте, фиксированную дозировку таких молекул (или комбинации таких молекул) вводят пациенту независимо от массы тела. В случае антител, к которым относится настоящее изобретение, вводимая пациенту фиксированная дозировка обычно составляет от 50 мг до 500 мг. Предпочтительно, вводимая пациенту фиксированная дозировка составляет от 50 мг до 300 мг, от 100 мг до 300 мг или от 100 мг до 200 мг. В соответствии с одним вариантом осуществления, вводимая пациенту фиксированная дозировка составляет 200 мг.

В определение дозы, как правило, будут вносить свой вклад такие эмпирические факторы, как период полужизни. Для продления периода полужизни антитела и предупреждения атаки антитела иммунной системы хозяина можно применять антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела. Частоту введения можно определить и корректировать в ходе курса терапии, и в ее основе лежит уменьшение количества клеток злокачественной опухоли, поддержание уменьшения клеток злокачественной опухоли, уменьшение пролиферации клеток злокачественной опухоли или замедлении развития метастаз. В альтернативном варианте, могут подойти составы с замедленным непрерывным высвобождением антител к HER2/neu. Из уровня техники известны различные составы и устройства для достижения замедленного высвобождения.

XII. Комбинированные терапии

Настоящее изобретение дополнительно относится к введению молекулы, которая специфически связывает HER2/neu, и молекулы, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности (или его лиганд), который вовлечен в регуляцию иммунной контрольной точки (например, PD-1), в дополнительной комбинации с другими видами терапии, известными специалистами в настоящей области техники, для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, аутоиммунного заболевания, воспаления или инфекционного заболевания, в том числе без ограничения современными стандартными и экспериментальными химиотерапевтическими средствами, гормональными терапевтическими средствами, биологическими терапевтическими средствами, иммунотерапевтическими средствами, средствами лучевой терапии или хирургическим вмешательством. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, молекулы по настоящему изобретению (например, антитела к HER2/neu и антитела к PD-1 по настоящему изобретению) вводят в комбинации с терапевтически или профилактически эффективным количеством одного или нескольких терапевтических средств, известных специалистам в области лечения и/или предупреждения развития злокачественной опухоли, в частности, злокачественной опухоли, экспрессирующей HER2/neu.

Применяемый в контексте настоящего документа термин «комбинация» обозначает применение более чем одного терапевтического средства. Применение термина «комбинация» как не ограничивает порядок, в котором терапевтические средства вводят субъекту с нарушением, так и не означает, что эти средства вводят точно в одно и то же время, а скорее подразумевается, что антитело или полипептид по настоящему изобретению и другое средство вводят млекопитающему в последовательности и в пределах такого временного интервала, чтобы антитело или полипептид по настоящему изобретению могли действовать вместе с другим средством, обеспечивая повышенный благоприятный эффект, чем если бы их вводили иным образом. Например, каждое терапевтическое средство (например, химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию или биологическую терапию) можно вводить в одно и то же время или последовательно в любом порядке в различные моменты времени; тем не менее, если их не вводить в одно и то же время, их следует вводить достаточно близко по времени с тем, чтобы получить необходимый терапевтический или профилактический эффект. Каждое терапевтическое средство можно вводить отдельно, в любой подходящей форме и любым подходящим путем, например, одно - пероральным путем, а другое - парентеральным.

В соответствии с различными вариантами осуществления, первое терапевтическое средство можно вводить до (например, за 5 минут до, 15 минут до, 30 минут до, 45 минут до, 1 час до, 2 часа до, 4 часа до, 6 часов до, 12 часов до, 24 часа до, 48 часов до, 72 часа до, 96 часов до, 1 неделю до, 2 недели до, 3 недели до, 4 недели до, 5 недель до, 6 недель до, 8 недель до или 12 недель до), одновременно с или после (например, через 5 минут после, 15 минут после, 30 минут после, 45 минут после, 1 час после, 2 часа после, 4 часа после, 6 часов после, 12 часов после, 24 часа после, 48 часов после, 72 часа после, 96 часов после, 1 неделю после, 2 недели после, 3 недели после, 4 недели после, 5 недель после, 6 недель после, 8 недель после или 12 недель после) введения второго (или последующего) терапевтического средства субъекту с нарушением. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, два или более средства вводят за одно посещение пациента или с интервалом не более 12 часов друг от друга, не более 24 часов друг от друга или не более 48 часов друг от друга.

Несмотря на то, что, как рассмотрено выше, можно использовать различные пути дозирования и введения для доставки комбинации молекулы, которая специфически связывает HER2/neu, и молекулы, которая специфически связывает рецептор клеточной поверхности или его лиганд, который регулирует иммунную контрольную точку, нуждающимся в них субъектам-реципиентам, в соответствии с настоящим изобретением, некоторые комбинации, пути дозирования и введения являются особенно предпочтительными для применения при таком лечении. Особенно предпочтительным при таком дозировании и введении является применение вариантного химерного антитела 4D5 по настоящему изобретению (например, маргетуксимаба) в комбинации с антителом к PD-1 по настоящему изобретению (например, пембролизумабом).

Комбинацию дозы вариантного химерного антитела 4D5 и дозы антитела к PD-1 можно вводить один или несколько раз (при этом каждое введение в таком режиме комбинированного лечения в настоящем документе называют «циклом»), каждый из которых будет включать введение от 6 до 18 мг, предпочтительно 6 мг, 10 мг, 15 мг или 18 мг вариантного химерного антитела 4D5 на кг массы тела пациента и от 1 до 10 мг, предпочтительно 1 мг, 2 мг, 3 мг или 10 мг антитела к PD-1 на кг массы тела пациента или фиксированной дозы 200 мг антитела к PD-1. Наиболее предпочтительно цикл будут проводить раз в три недели (±3 дня) до тех пор, пока не будут наблюдать ремиссию заболевания или неуправляемую токсичность.

В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 (например, маргетуксимаб) и антитело к PD-1 (например, пембролизумаб) вводят субъекту путем IV инфузии раз в три недели (±3 дня) в течение периода по меньшей мере 1 месяца или более, по меньшей мере 3 месяцев или более, или по меньшей мере 6 месяцев или более, или по меньшей мере 12 месяцев или более. Особенно предпочтительна продолжительность лечения по меньшей мере 6 месяцев или более, или в течение по меньшей мере 12 месяцев или более, или до тех пор, пока не будут наблюдать ремиссию заболевания или неуправляемую токсичность. При таком IV введении вариантное химерное антитело 4D5 и антитело к PD-1 можно вводить совместно или последовательно. В соответствии с особенно предпочтительными вариантами осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 и антитело к PD-1 вводят субъекту последовательно путем IV инфузии с интервалом не более 24 часов. При таком последовательном введении вариантное химерное антитело 4D5 можно вводить до или после введения антитела к PD-1.

Особенно предпочтительно вводить субъекту несколько доз комбинации вариантного химерного антитела 4D5 и антитела против PD-1. Таким образом, режим лечения может предусматривать 1 цикл, по меньшей мере 2 цикла или более 2 циклов, по меньшей мере 3 цикла или более 3 циклов, по меньшей мере 4 цикла или более 4 циклов, по меньшей мере 5 циклов или более 5 циклов или по меньшей мере 6 циклов или более 6 циклов. Дозировка каждого антитела в каждом таком цикле может быть одной и той же или может отличаться от предшествующей введенной дозировки. Так, например, терапия может предусматривать введение «первой» (или «ударной») дозы вариантного химерного антитела 4D5 с последующей пониженной «второй» дозой вариантного химерного 4D5 антитела.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят первой дозой примерно 6, 10, 15 или 18 мг/кг с последующим введением второй более низкой дозы, причем вторую дозу вводят приблизительно через три недели (±3 дня) после введения первой дозы. Например, если первая доза вариантного химерного антитела 4D5 составляет примерно 18 мг/кг массы тела, вторая доза будет меньше 18 мг/кг массы тела (например, примерно 3 мг/кг массы тела, примерно 6 мг/кг массы тела, примерно 8 мг/кг массы тела, примерно 10 мг/кг массы тела или примерно 15 мг/кг массы тела). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, вводят дополнительные последующие дозы вариантного химерного антитела 4D5, причем последующие дозы вводят через три недели (±3 дня) после введения второй дозы или предшествующей последующей дозы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, последующие дозы вводят в той же концентрации, что и вторая более низкая доза. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления, в течение всего курса лечения вводят одинаковую дозу вариантного химерного антитела 4D5.

Предпочтительно, чтобы антитела не вводили в виде IV струйной или болюсной инъекции, а вместо этого чтобы такое введение осуществляли путем IV инфузии. Таким образом, предпочтительно антитела разводят в инфузионном мешке, содержащем подходящий разбавитель, например, 0,9% хлорид натрия. Поскольку возможны инфузионные или аллергические реакции, рекомендуют премедикацию для предупреждения таких инфузионных реакций, и при введении антител следует соблюдать предосторожности в отношении анафилактической реакции. Особенно предпочтительно, чтобы IV инфузию вводили субъекту в течение периода от 30 минут до 24 часов. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, IV инфузию предпочтительно вводят в течение периода 30-180 минут, или 30-120 минут, или 30-90 минут, или в течение периода 60 минут или в течение меньшего периода, если у субъекта не наблюдают признаки или симптомы побочной инфузионной реакции.

Соответственно, настоящее изобретение относится к предпочтительному способу лечения злокачественной опухоли, при этом способ предусматривает введение нуждающемуся в том субъекту вариантного химерного антитела 4D5 в дозировке приблизительно 6-18 мг/кг массы тела и антитела к PD-1 в фиксированной дозировке приблизительно 200 мг, причем каждое из антител вводят каждые три недели (±3 дня). В соответствии с одним вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 6, 10, 15 или 18 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 6 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозировке 200 мг. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 10 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозировке приблизительно 200 мг. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 15 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозировке приблизительно 200 мг. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 18 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозировке приблизительно 200 мг. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 и антитело к PD-1 вводят с помощью IV инфузии в пределах 24-часового периода. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, злокачественная опухоль представляет собой экспрессирующую HER2/neu злокачественную опухоль. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой пидилизумаб. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой ЕН12.2Н7. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой hPD-1 mAb 2. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой hPD-1 mAb 7. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой b.PD-1 mAb 9. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой hPD-1 mAb 15. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 выбрано из антител, представленных в таблице 1.

Настоящее изобретение относится к другому предпочтительному способу лечения злокачественной опухоли, при этом способ предусматривает введение нуждающемуся в том субъекту вариантного химерного антитела 4D5 в дозировке приблизительно 6-18 мг/кг массы тела и антитела к PD-1 в дозировке приблизительно 1-10 мг, причем каждое из антител вводят каждые три недели (±3 дня). В соответствии с одним вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 6, 10, 15 или 18 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 1, 2, 3 или 10 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 6 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 1 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 6 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 2 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 6 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 10 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 10 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 1 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 10 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 2 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 10 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 10 мг/кг массы тела В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 15 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 1 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 16 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 2 мг/кг массы тела. В соответствии со следующим вариантом осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 вводят в дозировке приблизительно 15 мг/кг массы тела, а антитело к PD-1 вводят в дозировке приблизительно 10 мг/кг массы тела. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 и антитело к PD-1 вводят путем IV инфузии в пределах 24-часового периода. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, злокачественная опухоль представляет собой экспрессирующую HER2/neu злокачественную опухоль. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой пидилизумаб. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой ЕН12.2Н7. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой hPD-1 mAb 2. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой hPD-1 mAb 7. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой hPD-1 mAb 9. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 представляет собой hPD-1 mAb 15. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов осуществления, вариантное химерное антитело 4D5 представляет собой маргетуксимаб, а антитело к PD-1 выбрано из антител, представленных в таблице 1.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления, терапевтические средства вводят субъекту циклично. Такая цикличная терапия предусматривает введение первого средства в течение некоторого периода времени с последующим введением второго средства и/или третьего средства в течение некоторого периода времени и повторение этого последовательного введения. Цикличная терапия может уменьшить развитие резистентности к одному или нескольким видам терапии, позволить избежать побочных эффектов или уменьшить их количество и/или повысить эффективность лечения. Типичные циклы проводят с частотой приблизительно раз в неделю, приблизительно раз в 10 дней, приблизительно раз в две недели и приблизительно раз в три недели. Каждый цикл может предусматривать по меньшей мере 1 неделю покоя, по меньшей мере 2 недели покоя, по меньшей мере 3 недели покоя. Количество проводимых циклов составляет от приблизительно 1 до приблизительно 12 циклов, чаще от приблизительно 2 до приблизительно 10 циклов и чаще от приблизительно 2 до приблизительно 8 циклов.

В соответствии с одним вариантом осуществления для лечения нарушения, связанного с пролиферацией клеток, молекулу по настоящему изобретению (например, антитело к HER2/neu, антитело к PD-1) конъюгируют с или вводят в дополнительной комбинации с другим терапевтическим средством, таким как без ограничения алкилирующее средство (например, мехлорэтамин или цисплатин), ингибитор ангиогенеза, антрациклин (например, даунорубицин/дауномицин или доксорубицин), антибиотик (например, дактиномицин, блеомицин или антрамицин), антитело (например, антитело к VEGF, такое как бевацизумаб (продаваемый под названием AVASTIN® от компании Genentech, Inc.), антитело к EGFR, такое как панитумумаб (продаваемый под названием VECTIBIX™ от компании Amgen, Inc.), или антитело к интегрину, такое как натализумаб (продаваемый под названием TYSABRI® от компаний Biogen Idee и Elan Pharmaceuticals, Inc.)), антиметаболит (например, метотрексат или 5-фторурацил), антимитотическое средство (например, винкристин или паклитаксел), цитоксин (например, цитостатическое или цитопатическое средство), средство гормональной терапии (например, селективный модулятор рецепторов эстрогена (например, тамоксифен или ралоксифен), ингибитор ароматаз, аналог рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, прогестаген, адренокортикостероид, эстроген, андроген, противоэстрогеновое средство, блокирующее андрогеновый рецептор средство, ингибитор 5-альфа-редуктазы, ингибитор продуцирования продуктов надпочечников и т.д.), ингибитор матричной металлопротеиназы, радиоактивный элемент (например, источники альфа-излучения, источники гамма-излучения и т.д.) или любое другое химиотерапевтическое средство.

К неограничивающим примерам подходящих ингибиторов ангиогенеза относятся АВТ-627; ангиостатин (фрагмент плазминогена); ангиозим; антиангиогенный антитромбин III; Bay 12-9566; бенефин; бевацизумаб; BMS-275291; бисфосфонаты; хрящевой ингибитор (CDI); CAI; фрагмент комплемента CD59; СЕР-7055; Col 3; комбретастатин А-4; эндостатин (фрагмент коллагена XVIII); ингибиторы фарнезилтрансферазы (FTI); фрагменты фибронектина; gro-beta; галофугинон; гепариназы; фрагмент гепаринового гексасахарида; HMV833; человеческий хорионический гонадотропный гормон (hCG); IM-862; интерферон альфа/бета/гамма; интерферон-индуцируемый белок (IP-10); интерлейкин-12; крингл 5 (фрагмент плазминогена); маримастат; ингибиторы металлопротеиназы (TIMP); 2-метоксиэстрадиол; MMI270 (CGS 27023A); MoAb IMC-1C11; неовастат; NM-3; панзем; PI-88; плацентарный ингибитор рибонуклеаз; ингибитор активатора плазминогена; тромб оцитарный фактор-4 (PF4); приномастат; 16 кДа фрагмент пролактина; пролиферин-родственный белок (PRP); РТК 787/ZK 222594; ретиноиды; солимастат; скваламин; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; тетрагидрокортизол-S; тетратиомолибдат; талидомид; тромбоспондин-1 (TSP-1); TNP-470; трансформирующий фактор роста-бега (TGF-b); васкулостатин; вазостатин (фрагмент кальретикулина); ZD6126 и ZD6474.

К неограничивающим примерам дополнительных антител для лечения нарушения, связанного с пролиферацией клеток, относятся антитела к 17-1А, αvβ₃, AFP, CD3, CD18, CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, CEA, CTLA-4, ДНК-ассоциированные белки, рецептор EGF, Ер-САМ, ганглиозид GD2, gpIIIb/IIIa, gp72, HLA-DR 10-бета, антиген HLA-DR, IgE, ганглиозид GD3, MUC-1, nuC242, антиген РЕМ, антиген SK-1, опухолевый антиген СА125, опухолевый антиген MUC1, VEGF и VEGF-рецептор.

XIII. Примеры

Теперь, после описания в общих чертах настоящего изобретения, то же самое будет более понятным при обращении к приведенным далее примерам, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не указано иное.

ПРИМЕР 1

Определение аффинности с помощью BIACore

Кинетические параметры связывания элюированных и очищенных антител анализировали с помощью анализа BIAcore (устройства BIAcore® 1000, BIAcore Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси) и ассоциированного с ним программного обеспечения. HER-2 иммобилизовали на одной из четырех проточных ячеек (проточной ячейке 2) поверхности сенсорного чипа посредством химии связывания аминогрупп (путем модификации карбоксиметильных групп смесью NHS/EDC), так чтобы на поверхности иммобилизировалось приблизительно 1000 единиц ответа (RU) рецептора. После этого непрореагировавшие активные сложноэфирные группы «блокировали» инъекцией 1 М Et-NH2. После получения подходящей поверхности ch4D5-FcWT (Fc дикого типа), ch4D5 и трастузумаб (контроль) вводили инъекцией в концентрации 6,25-200 нМ на поверхность со скоростью потока 70 мл/мин. в течение 180 секунд.

После сбора всего набора данных полученные в результате кривые связывания глобально аппроксимировали и рассчитывали константы скорости реакции и кажущуюся равновесную константу связывания с использованием поставляемых производителем компьютерных алгоритмов, которые описаны в BIAevaluation Software Handbook, доступной от BIAcore, Inc. На фиг. 3 приведены в графическом виде результаты анализа SPR, а в таблице 4 приведены рассчитанные константы.

ПРИМЕР 2

Апоптоз

Различные линии клеток инкубировали в течение ночи с ch4D5 и ch4D5-FcMT1. Апоптоз анализировали с помощью анализа FACS, а результаты приведены в таблице 5.

ПРИМЕР 3

Пролиферация

Включение [³Н]тимидина ([³H]TdR) в ДНК использовали в качестве биохимического показателя пролиферации клеток SKBR3 для сравнения влияний различных химерных антител 4D5 по настоящему изобретению. Изучали эффектны ch4D5-Ag, ch4D5 и Ch4D-FcMT1 на клетки CD16-158F+ и CD16-158V+ и сравнивали их с контролями. Результаты изображены на фиг. 4.

ПРИМЕР 4

Противоопухолевая активность у мышей (модель злокачественной опухоли молочной железы)

Противоопухолевую активность различных антител изучали на модели злокачественной опухоли молочной железы с применением нетрансгенных и трансгенных (hCD16A) мышей. Пятидесяти Balb/c RAG2-/- нетрансгенным мышам вводили инъекцией подкожно (sc) на 0-й день клетки злокачественной опухоли молочной железы JMT-1. Мышей разделяли на пять групп по 10 мышей в каждой и каждую неделю в течение 8 недель внутрибрюшинно (IP) обрабатывали посредством ch4D5 N297Q, ch4D5-Fc дикого типа, ch4D5-FcMT1, cb4D5-FcMT2 или PBS (отрицательного контроля). Развитие опухоли отслеживали два раз а в неделю с помощью штангенциркуля, а массу опухоли оценивали по следующей формуле: масса опухоли = (длина × ширина²)/2. Результаты показаны на фиг. 5. Двадцати трем Balb/c RAG2-/- mCD16-/- hCD16A+ трансгенным мышам вводили инъекцией s.c. на 0-й день клетки злокачественной опухоли молочной железы JIMT-1. Мышей разделяли на три группы и каждую неделю в течение 8 недель внутрибрюшинно (IP) обрабатывали посредством ch4D5-Fc дикого типа (n=8), ch4D5-FcMT1 (n=8) или PBS (отрицательного контроля; n=7). Развитие опухоли отслеживали два раза в неделю с помощью штангенциркуля, а массу опухоли оценивали по следующей формуле: масса опухоли = (длина × ширина²)/2. Результаты показаны на фиг. 6.

ПРИМЕР 5

Противоопухолевая активность у мышей (модель злокачественной опухоли яичника)

Противоопухолевую активность различных антител изучали на модели злокачественной опухоли яичника с применением нетрансгенных и трансгенных (hCD16A) мышей. 22 R3-/- N/N нетрансгенным мышам из воспроизводственного резервата MacroGenics вводили инъекцией s.c. в 0-й день клетки злокачественной опухоли яичника SKOV-3. Мышей разделяли на четыре группы и каждую неделю в течение 8 недель внутрибрюшинно (IP) обрабатывали посредством ch4D5 N297Q (n=5), ch4D5-Fc дикого типа (n=6), ch4D5-FcMT1 (n=6) или PBS (отрицательного контроля; n=5). Развитие опухоли отслеживали два раза в неделю с помощью штангенциркуля, а массу опухоли оценивали по следующей формуле: масса опухоли = (длина × ширина²)/2. Эффект такого лечения на выживаемость показан на фиг. 7, секции А. 32 R3-/- N/N hCD16A+ трансгенными мышами из воспроизводственного резервата MacroGenics вводили s.c. в 0-й день клетки злокачественной опухоли яичника SKOV-3. Мышей разделяли на четыре группы и каждую неделю в течение 8 недель внутрибрюшинно (IP) обрабатывали посредством ch4D5 N297Q (n=8), ch4D5-Fc дикого типа (n=8), ch4D5-FcMT1 (n=8) или PBS (отрицательного контроля; n=8). Развитие опухоли отслеживали два раза в неделю с помощью штангенциркуля, а массу опухоли оценивали по следующей формуле: масса опухоли = (длина × ширина²)/2. Эффект такого лечения на выживаемость показан на фиг. 7, секции В. 96 mCD16-/- huCD16A FoxN1-/- (nu/nu) трансгенными мышами из воспроизводственного резервата MacroGenics вводили s.c. в 0-й день клетки злокачественной опухоли яичника SKOV-3. Мышей разделяли на шесть групп по 16 мышей в каждой и каждую неделю в течение 8 недель внутрибрюшинно (IP) обрабатывали посредством ch4D5-FcMT3, ch4D5-FcMT1, ch4D5-FcMT4, ch4D5, ch4D5Ag или PBS (отрицательного контроля). Развитие опухоли отслеживали два раза в неделю с помощью штангенциркуля, а массу опухоли оценивали по следующей формуле: масса опухоли = (длина × ширина²)/2. Эффект такой обработки на выживаемость показан на фиг. 8.

ПРИМЕР 6

Анализы ADCC на различных линиях клеток злокачественной опухоли

На фиг. 9 проиллюстрировано репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание различных линий клеток злокачественных опухолей по HER2/neu. Клеточные линии ранжировали в соответствии с их интенсивностью окрашивания по HER2/neu, как указано в наборе для проведения теста на HER2/neu, продаваемом под названием DAKO HerceptTest™ (DakoCytomation, Глоструп, Дания): отсутствие окрашивания по HER2/neu (оценка DAKO=0); слабое окрашивание по HER2/neu (оценка DAKO=1+); умеренное окрашивание по HER2/neu (оценка DAKO=2+); и сильное окрашивание по HER2/neu (оценка DAKO=3+). На секциях А-М представлены различные линии клеток, которые показаны в таблице 6.

Было протестировано несколько антител ch4D5, включая антитела ch4D5 с Fc-вариантными доменами, в отношении их способности опосредовать ADCC на линиях клеток злокачественной опухоли, в том числе ch4D5-FcMT1, ch4D5-FcMT2, ch4D5-FcMT3, ch4D5-FcWT (Fc дикого типа), ch4D5 N297Q и трастузумаб (в качестве контроля). Данные действительных анализов (SR≤20% MR, AICC≤50% MR) изложены в таблице 7, где оценочные показатели EC₅₀ считали действительными только в том случае, если модель соответствовала максимальному лизису >20%. Сравнение параметров EC₅₀ и максимального лизиса проводили путем постановки вопроса, были ли наилучшие подобранные значения, полученные для Fc-оптимизированных антител, статистически различными от тех, которые были получены для антитела ch4D5 с Fc дикого типа с помощью F-критерия для суммы квадратов. Данные также согласовывались с сигмоидальными моделями доза-ответ, как показано на фиг. 10-13.

ПРИМЕР 7

Активность моноклональных антител к ко-стимулирующим мишеням или мишеням, которые являются контрольными точками, на пролиферацию Т-клеток

В контексте алло-MLR-анализа у Т-клеток индуцировали пролиферацию в ответ на несоответствие по HLA (Latchman, Y.E. et al. (2004) "PD-L1-Deficient Mice Show That PD-L1 On T-Cells, Antigen-Presenting Cells, And Host Tissues Negatively Regulates T-Cells." Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(29): 10691-10696; Wang, W. et al. (2008) "PD-L1/PD-1 Signal Deficiency Promotes Allogeneic Immune Responses And Accelerates Heart Allograft Rejection" Transplantation 86(6):836-44) или в ответ на митогенную/фармакологическую стимуляцию. Известно, что агонистические антитела, которые нацелены на костимулирующие молекулы, индуцируют пролиферативные ответы путем повторного усиления передачи Т-клеточных сигналов и стабилизации факторов транскрипции, которые способствуют эффекторной функции у Т-клеток или управляют ею (Melero, I. et al. (2013) "Agonist Antibodies to TNFR Molecules That Costimulate TandNK Cells" Clin. Cancer Res. 19(5):1044-1053). Аналогичным образом, антагонистические антитела, которые нацелены на ключевые молекулы контрольных точек, которые оказывают отрицательную регуляцию на Т-клеточные ответы (ингибиторы контрольных точек), могут индуцировать пролиферативные ответы путем поддержания функции передачи сигналов и эффекторной функции у Т-клеток и тем самым повышения противоопухолевого иммунитета (Саресе, D. et al. (2012) "Targeting Costimulatory Molecules to Improve Antitumor Immunity" J. Biomed. Biotech. 2012:926321). Эффект моноклональных антител к костимулирующим мишеням или мишеням, которые являются контрольными точками, на пролиферацию в ответ на аллоантиген можно легко измерить в краткосрочных реакциях смешанных культур лимфоцитов (алло-MLR) путем отслеживания включения ³Н-тимидина. Для выявления способности антител к ингибиторам контрольных точек усиливать пролиферацию, получали mAb к PD-1 или mAb к LAG-3, очищали их и экзогенно добавляли в начале алло-MLR-анализа в количестве 20,10, 5,2,5 и 1,25 мкг/мл (фиг. 14). В конце 5-6 дней 96-луночный планшет импульсно обрабатывали ³Н-тимидином и культивировали в течение 18 часов для измерения пролиферации. Несколько контрольных антител к PD-1, LAG-3 и CTLA-4 человека оценивали по их способности повышать пролиферацию Т-клеток в ответ на стимуляцию алло-антигеном. Как показано на фиг. 15, добавление PD-1 mAb 1 (5С4 (BMS-936558), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, ламбролизумаба) или PD-1 mAb 3 (ЕН12.2Н7; Dana Farber) в начале aurro-MLR-анализа индуцировало сильную пролиферацию Т-клеток по сравнению с изотипическим контрольным антителом IgG1 или контрольными лунками, содержащими клетки-респондеры и стимуляторы. В лунках, которые содержали только облученные клетки-стимуляторы, не наблюдали пролиферации. Несмотря на то, что наблюдали дозозависимый пролиферативный ответ, в случае PD-1 mAb 4 (СТ-011; CureTech, ВАТ-1) наблюдали минимальную пролиферацию по сравнению с PD-1 mAb 1 (5С4 (BMS-936558), PD-1 mAb 2 (MK-3475; Merck, ламбролизумабом) или PD-1 mAb 3 (ЕН12.2Н7; Dana Farber). Небольшой дозозависимый пролиферативный ответ наблюдали также в случае с LAG-3 mAb 1 (25F7, BMS-986016, Medarex/BMS), которое аналогично сравнивали с ипилимумабом Yervoy®, mAb к CTLA-4 (Bristol-Myers Squib).

ПРИМЕР 8

Исследование с повышением дозы маргетуксимаба и пембролизумаба

Исследование с повышением дозы проводили для определения максимальной переносимой дозы (MTD) или максимальной вводимой дозы (MAD) (если MTD не определена) повышающихся доз маргетуксимаба, вводимого в комбинации с фиксированной дозой, равной примерно 200 мг, пембролизумаба. За этим могла последовать фаза расширения когорты для дополнительного определения безопасности и начальной эффективности комбинации с дозой маргетуксимаба, установленной в исследовании с повышением дозы. Как маргетуксимаб, так и пембролизумаб вводили раз в 3 недели. Оба средства вводили в один и тот же день, причем сначала вводили пембролизумаб, а затем маргетуксимаб. Каждый цикл терапии определяли как 3 недели, в которых маргетуксимаб и пембролизумаб давали в 1-й день. Оценки опухолей можно проводить во время исследования, предпочтительно в конце каждых двух циклов обработки (т.е. каждые 6 недель [конец 2-го, 4-го, 6-го и т.д. циклов]).

Маргетуксимаб можно оценить за две последовательные повышающиеся дозы, примерно 10 мг/кг массы тела и примерно 15 мг/кг массы тела, в комбинации с 200 мг пембролизумаба у пациентов когорты. Если было определено, что MTD была превышена в когорте первой дозы, может быть использована когорта с уменьшением дозы для оценки более низкой дозы маргетуксимаба (6 мг/кг) в комбинации с 200 мг пембролизумаба В ходе части исследования, связанной с повышением дозы, может быть исследована более высокая доза маргетуксимаба (например, 18 мг/кг).

В ходе фазы расширения когорты привлекали дополнительных пациентов и давали им маргетуксимаб в MTD (или MAD), установленной на фазе исследования, связанной с повышением дозы, в комбинации с 200 мг пембролизумаба.

Все упомянутые в настоящем описании публикации и патенты включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная посредством ссылки в полном ее объеме. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с конкретными вариантами его осуществления, будет понятно, что его можно подвергнуть дополнительным модификациям, и настоящая заявка подразумевается как охватывающая любые варианты, применения или адаптации настоящего изобретения, согласно, в целом, принципам настоящего изобретения, и включающая такие отклонения от настоящего раскрытия, которые входят в общеизвестную или общепринятую практику в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и которые могут быть применимы к основным признакам, изложенным выше в настоящем документе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Macrogenics, Inc.

Wigginton, Jon Marc

Pandya, Naimish Bharat

Lechleider, Robert Joseph

Koenig, Scott

Bonvini, Ezio

<120> Combination Therapy for the Treatment of Cancer

<130> 1301.0120PCT

<150> US 62/175,039

<151> 2015-06-12

<150> US 62/211,109

<151> 2015-08-28

<160> 87

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide Encoding light chain of preferred Variant Chimeric

4D5 Antibodies

<400> 1

gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc 60

atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca 120

ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 300

ggtaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain of preferred Variant Chimeric 4D5 Antibodies

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(107)

<223> Light Chain Variable Domain of Murine 4D5 Antibody

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Asn Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chimeric 4D5 VL region

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light Chain Variable Domain of Humanized 4D5 Antibody

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 1353

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide Encoding Chimeric 4D5 heavy chain having a

wild-type Fc Region

<400> 6

caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60

tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180

gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300

ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

<210> 7

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chimeric 4D5 heavy chain having a wild-type Fc Region

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 8

<211> 1353

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polynucleotide Encoding heavy chain of a Variant Chimeric 4D5

Antibody having the FcMT1 variant Fc Region

<400> 8