Способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином

Авторы патента:

Брюхин Геннадий Васильевич (RU)

Солянникова Дарья Рашидовна (RU)

Тестов Роман Михайлович (RU)

Минина Елена Евгеньевна (RU)

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

G01N1/30 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2733451:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине. Описан способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином. Проводят цитологическое исследование назального секрета или индуцированной мокроты при окраске 0,5% водным раствором бромфенолового синего с последующей иммерсионной микроскопией. При микроскопии эозинофилы определяются как клетки, содержащие крупные темно-фиолетовые гранулы с неокрашенной цитоплазмой и ядром. Затем проводят полуколичественную оценку визуализируемых эозинофилов от 1 до 3 баллов, где «3» балла соответствует полному заполнению цитоплазмы гранулами без светлых промежутков, «2» балла соответствует наличию немногочисленных просветов между гранулами, «1» балл соответствует единичным гранулам цитоплазмы. После чего проводят подсчет среднего коэффициента насыщения эозинофилов бромфенол-положительными гранулами. Технический результат - возможность избирательной оценки содержания в эозинофилах катионных протеинов, являющихся главным фактором повреждения слизистых оболочек дыхательных путей при аллергическом воспалении. 6 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано в клинической аллергологии и иммунологии, гистологии, патологической физиологии при исследовании содержания катионных протеинов в эозинофилах мокроты и мазка со слизистой оболочки носа у пациентов с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой.

В настоящий момент общепринятой методикой изучения цитологии дыхательных путей является микроскопия мазка со слизистой оболочки носа (или микроскопия мокроты), окрашенного по методу Романовского-Гимзе, в котором подсчитываются нейтрофилы и эозинофилы не менее чем в 10 полях зрения, при подсчете не менее 200 клеточных элементов.

Данный метод успешно используется в медицине, однако имеет ряд недостатков. Во-первых, показатели цитологии динамичны и способны изменяться в течение суток, что требует неоднократного повтора исследования. Во-вторых, количественные показатели клеток в ряде случаев не коррелируют с выраженностью (тяжестью) клинических симптомов.

В основу изобретения положена задача нивелировать указанные недостатки, путем оценки функциональной активности клеток, а не их количества.

Эозинофильные катионные протеины являются главным фактором, приводящим к повреждению клеток слизистых оболочек дыхательных путей при аллергическом воспалении [Колобовникова, Ю.В. Эозинофил в норме и при патологии/ Ю.В. Колоборовникова, О.И. Новицкий. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2014. - 124 с.], в связи с чем, количество данных протеинов в клетках может отражать интенсивность воспалительного процесса и коррелировать с тяжестью клинической картины.

В предлагаемом способе цитологического изучения секретов слизистых оболочек дыхательных путей впервые используется окраска водным раствором бромфенолового красителя и оценка количественного содержания бромфенол-положительных гранул в эозинофилах.

Применение данного способа возможно не только для диагностики аллергической природы воспаления, что можно осуществить и при известных методиках исследования, но также для оценки интенсивности воспалительного процесса и ответа на медикаментозную терапию.

Способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином включает в себя:

1. Биологический материал (мазок со слизистой носа или мокрота) нанести тонким слоем на предметное стекло (фиг. 1).

2. Высушить при комнатной температуре строго в горизонтальном положении.

3. Зафиксировать в 95% этилового спирта (нанести 1-2 капли 95% этилового спирта на мазок) (фиг. 2).

4. Высушить мазок.

5. Окрасить 0,5% водным раствором бромфенолового синего (так, чтобы весь биоматериал был покрыт красителем) в течение 20 минут (фиг. 3).

6. Тщательно промыть в дистиллированной воде и высушить на воздухе (фиг. 4).

7. Осуществить иммерсионную микроскопию при увеличении не менее ×1000. При микроскопии эозинофилы определяются как клетки, содержащие крупные темно-фиолетовые гранулы с неокрашенной цитоплазмой и ядром (фиг. 5).

8. Оценить визуализируемые эозинофилы полуколичественно от 1 до 3 баллов, где «3» балла соответствуют полному заполнению цитоплазмы гранулами без светлых промежутков (фиг. 6, В)., «2» балла - наличию немногочисленных просветов между гранулами (фиг. 6, Б)., «1» балл - единичным гранулам цитоплазмы (фиг. 6, А).

9. Провести расчет насыщения эозинофилов бромфенол-положительными гранулами (среднего коэффициента насыщения эозинофилов) в условных единицах с помощью модифицированной формулы Астальди-Верга (1957). Для этого число клеток с одинаковым содержанием гранул умножить на соответствующее данной группе число баллов, сумма этих произведений делится на общее количество подсчитанных эозинофилов. Пример расчета: в мазке выявлено 10 эозинофилов, оцененных на «1 балл», 20 эозинофилов, оцененных на «2 балла» и 30 эозинофилов, оцененных на «3 балла».

Расчет:

Механизм действия основан на переходе красителя в окрашенную форму при связывании с катионными белками.

Пример конкретного осуществления

Пример 1

Пациент А., 16 лет, впервые поступил на обследование в аллергологическое отделение, диагноз J45.9 - астма неуточненная. При поступлении до начала базисной терапии было выполнено цитологическое исследование индуцированной мокроты, а также определялся средний коэффициент насыщения эозинофилов катионным протеином. Результат:

Через 7 дней от начала лечения ингаляционными кортикостероидами выполнено повторное цитологическое исследование с определением среднего коэффициента насыщения эозинофилов катионным протеином. Результат:

На фоне приема базисной терапии, несмотря на отсутствие существенных количественных изменений цитологического состава, отмечено снижение содержания катионного протеина в эозинофилах мокроты, что говорит о положительной динамике на фоне лечения.

Способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином, включающий окраску мазка 0,5% водным раствором красителя бромфеноловым синим, последующую иммерсионную микроскопию, где при микроскопии эозинофилы определяются как клетки, содержащие крупные темно-фиолетовые гранулы с неокрашенной цитоплазмой и ядром, оценку визуализируемых эозинофилов полуколичественно от 1 до 3 баллов, где «3» балла соответствует полному заполнению цитоплазмы гранулами без светлых промежутков, «2» балла соответствует наличию немногочисленных просветов между гранулами, «1» балл соответствует единичным гранулам цитоплазмы, и подсчет среднего коэффициента насыщения эозинофилов бромфенол-положительными гранулами.

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для экспресс-диагностики связи кисты поджелудочной железы с протоковой системой. Осуществляют оценку состояния ее содержимого.

Способ экспресс-диагностики связи кисты поджелудочной железы с протоковой системой // 2733171

Способ прогнозирования развития хориоамнионита у женщин с обострением цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности и угрозой невынашивания // 2733168

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству. Способ прогнозирования развития хориоамнионита у женщин с обострением цитомегаловирусной инфекции во втором триместре беременности и угрозой невынашивания заключается в том, что у женщин во втором триместре беременности с угрозой невынашивания определяют маркеры обострения цитомегаловирусной инфекции в баллах (А), содержание в сыворотке крови интерлейкина – 6 (IL-6) (пг/мл) (В); толщину плаценты при её ультразвуковом исследовании в баллах (С), проводят оценку клинико-эхографических признаков угрозы невынашивания в баллах (N), а затем прогнозируют развитие хориоамнионита с помощью дискриминантного уравнения: D = -1,085×А - 0,870×В - 2,056×С - 0,504×N, где D – дискриминантная функция, и при D равном или больше -15,86 прогнозируют отсутствие риска развития хориоамнионита, при D меньше -15,86 прогнозируют развитие хориоамнионита.

Способ прогнозирования риска развития гематогенных метастазов у больных немелкоклеточным раком легкого после операции // 2733160

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии и может быть использовано для определения риска развития гематогенного метастазирования у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) после проведения радикального оперативного лечения.

Способ диагностики острого коронарного синдрома // 2733077

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к способу диагностики острого коронарного синдрома. Способ включает формирование базы данных, содержащей информацию о результатах клинического анализа крови пациентов с острым коронарным синдромом и здоровых людей группы контроля, которую в дальнейшем используют для обучения нейронных сетей, после чего осуществляют взятие цельной венозной крови обследуемого пациента, перемешивают пробу крови, затем производят исследование клинического анализа крови на автоматическом гематологическом анализаторе, после этого результаты исследования копируют с анализатора в виде FCS-файлов и переносят на персональный компьютер для предварительной обработки и машинного анализа, причем предварительная обработка включает перевод оператором при помощи программного обеспечения, позволяющего работать с FCS-файлами, графических изображений в виде скатерограмм анализа крови пациента в цифровой эквивалент - вектор, который содержит информацию обо всех исследованных клетках в виде данных их расположения по осям скатерограммы X и Y, при этом оператор с учетом морфологических показателей представленных на анализ клеток крови дифференцирует их на три субпопуляции: нейтрофилы, лимфоциты и моноциты, после чего полученный результат в цифровом эквиваленте сохраняют в отдельный файл программы для работы с электронными таблицами, затем в вышеуказанном цифровом эквиваленте скатерограммы анализа крови пациента - векторе отсекают последние элементы, а именно координаты клеток, так, чтобы количество элементов обследуемого пациента соответствовало количеству элементов пациентов, результаты которых находятся в предварительно сформированной базе данных, после чего все элементы векторов обследуемого пациента объединяются последовательно в один общий глобальный вектор Vglob, затем стандартизируют полученный вектор путем вычитания из глобального вектора обследуемого пациента среднего значения соответствующих векторов из предварительно сформированной базы данных и последующего деления на стандартное отклонение соответствующих векторов базы данных, затем применяют метод главных компонент для уменьшения размерности признаков с n элементов до 2-4 главных компонент {Xn}, сохранив при этом как можно больше изменчивости признаков, посредством программного обеспечения для математических вычислений, в результате получают сокращенный вектор, затем производят стандартизацию с помощью описанных выше действий уже сокращенного вектора до вида , после чего применяют ансамбль из нейронных сетей, которые обучают на предварительно сформированной базе данных пациентов с острым коронарным синдромом и здоровых людей группы контроля путем внесения информации в программное обеспечение для машинного анализа об их результатах клинического анализа крови и окончательного диагноза - «острый коронарный синдром» или «здоров», при этом количество нейронных сетей в ансамбле зависит от результатов оценки точности предсказания окончательного диагноза и составляет от 1 до 10, при этом используют композиции алгоритмов, каждый из которых параллельно обучают на подпространстве обучающей выборки из предварительно сформированной базы данных пациентов с острым коронарным синдромом и здоровых людей группы контроля, причем из множества обучающей выборки отбирают от 1 до n подмножеств путем случайного выбора элементов с повторениями в каждом из наблюдений подмножества, чтобы затем передать их математическим моделям для анализа с последующей агрегацией данных в ансамбль и расчета вероятности положительного диагноза, при этом подмножества рассматривают как репрезентативные и независимые значения истинного распределения данных, и на каждом из подмножеств обучают нейронную сеть как модель, при этом применяют ансамблевый метод, причем после обучения нейронных сетей и их агрегации в ансамбль проверяется их точность на тестовой выборке, при этом по итогу обучения нейронных сетей и приемлемому результату тестирования, при условии ошибки результатов оценки менее 5%, аналогичным образом производят исследование клинического анализа крови обследуемого пациента, а для оценки положительного диагноза в процентах строят график, где используют поля вероятности для классификации диагнозов в двухмерном подпространстве, которые представляют собой оси абсцисс и ординат, соответствующих главным компонентам, причем указанные поля рассматривают как зрение нейронных сетей для неизвестных случаев, при этом диагноз обследуемому пациенту ставят следующим образом: если результаты пациента окажутся в области графика, выделенной для отрицательного диагноза, то ансамбль нейронных сетей выдаст наиболее высокую вероятность для отрицательного диагноза, если в области графика, выделенной для положительного диагноза - наиболее высокую вероятность для положительного диагноза - острый коронарный синдром.

Способ расчета риска развития прогрессии плоскоклеточного рака гортани // 2732976

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, может быть использовано для оценки риска развития прогрессии заболевания при лечении пациентов с плоскоклеточным раком гортани.

Способ молекулярной количественной детекции локальной распространенности немелкоклеточного рака легкого методом двойного иммунофлуоресцентного окрашивания нормальной и опухолевой ткани органа // 2732973

Изобретение относится к области медицины. Способ иммунофлуоресцентной детекции локальной распространенности опухолевого процесса при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) включает приготовление одноклеточной суспензии из образца ткани НМРЛ, фиксацию в 4% растворе формалина, отмывку с помощью фосфатного буфера рН=7,4, инкубацию с красителем ДНК Hoechst 33258, двойную отмывку от антител с помощью 0,05% раствора БСА в фосфатном буфере рН=7,4, проведение анализа флуоресценции на проточном цитофлуориметре, при этом инкубацию проводят одновременно с двумя типами первичных антител – кроличьи антитела к TUBB3 и мышиные антитела к цитокератинам, при этом первичные антитела к TUBB3 и цитокератину добавляют одновременно и инкубируют в течение ночи при температуре +4°С, и одновременно с двумя типами вторичных антител - антикроличьи антитела, конъюгированные с красителем DyLight 650, и антимышиные антитела, конъюгированные с DyLight 488, строят точечные гистограммы, сравнивают уровни экспрессии TUBB3 в эпителиальных клетках опухоли и окружающей нормальной ткани, где повышенная экспрессия TUBB3 характеризует локальную распространенность опухолевого процесса при НМРЛ.

Способ прогнозирования высокого риска рецидива у пациенток с ib стадией рака шейки матки, получивших комбинированное лечение // 2732769

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования высокого риска рецидива у пациенток с IB стадией рака шейки матки, получивших комбинированное лечение.

Способ коррекции реперфузионно-ишемического повреждения при резекции почки по поводу локализованного рака в условиях тепловой ишемии // 2732765

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, а именно к коррекции реперфузионно-ишемического повреждения при резекции почки по поводу локализованного рака в условиях тепловой ишемии.

Способ оценки метастатического поражения сигнального лимфатического узла при ранних формах плоскоклеточного рака полости рта // 2732700

Изобретение относится к способам патоморфологической оценки метастатического поражения. Способ оценки метастатического поражения сигнального лимфатического узла при ранних формах плоскоклеточного рака полости рта включает выполнение серийно-ступенчатых срезов сигнального лимфатического узла с последующим иммуногистохимическим исследованием.

Контейнер для сухих химических реагентов // 2733122

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложена микрофлюидная система, контейнер и способ транспортировки лиофилизированных химикатов.