Микроструктуризированный коллагеновый материал для получения связно-дисперсных дермальных имплантов
Владельцы патента RU 2735176:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НИАРМЕДИК ПЛЮС" (RU)
Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно к способу получения мелкодисперсного коллагенового материала и продукту, полученному таким способом. Способ получения мелкодисперсного коллагенового материала, состоящего из нитевидных частиц, характеризующихся не менее чем 4-кратным преобладанием длины над шириной, в количестве не менее чем 35% от общего числа частиц, включает последовательные проводимые стадии: измельчения влажного коллагенсодержащего сырья до волокнистых тяжей, высушивания полученных волокнистых тяжей, измельчения высушенных тяжей путем стригально-режущего помола с получением порошка, измельчения полученного порошка путем ударно-истирающего помола, извлечение мелкодисперсного коллагенового материала. Полученный продукт предназначен для получения инъекционных дермальных имплантов. Технический результат - получение дермальных имплантов с улучшенными реологическими и биоинтеграционными свойствами. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 пр., 9 ил.
Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно к способу получения мелкодисперсного коллагенового материала, состоящего из нитевидных частиц в количестве не менее чем 35% от общего числа частиц, предназначенного для получения инъекционных дермальных имплантов.
Предпосылки изобретения
Одним из основных направлений научных исследований в области косметологии, дерматологии, пластической и реконструктивной хирургии является разработка и оптимизация различных способов коррекции паталогических, возрастных и эстетических инволюционных изменений кожи. В настоящее время широкое распространение получили малоинвазивные методы терапии, основанные на инъекционном введении имплантов, состоящих из водных растворов или дисперсий полимеров как биологического, так и синтетического происхождения, обладающих варьирующими показателями вязкоэластичности и устойчивости к биодеградации. Терапевтическое действие инъекционных имплантов такого типа основано на механическом восполнении функции инволютированных мягких тканей, увеличении упругости тканей за счет удержания в них тканевой жидкости, а также стимуляции выработки резидентными или привлеченными из кровотока клетками ростовых факторов, стимулирующих новообразование и/или ремоделирование аутологичной соединительной ткани дермы.
Наибольшее распространение получили инъекционные импланты на основе нативной или химически стабилизированной гиалуроновой кислоты, представляющей собой отрицательно заряженный полимер биологического происхождения. Благодаря наличию отрицательного заряда молекул, данные биосовместимые материалы способны удерживать в тканях большое количество жидкости, а также формировать вязкоэластичный гидрогель. Материалы на основе гиалуроновой кислоты могут быть предварительно стабилизированы сшивающими агентами с целью использования в процедурах контурной пластики. В литературе опубликовано большое количество работ, посвященных свойствам и применению инъекционных имплантов на основе гиалуроновой кислоты (Gold M.H. Use of hyaluronic acid fillers for the treatment of the aging face. Clin.. Interv. Aging. 2007, v. 2, № 3, pp. 369-376; Attenello N.H., Maas C.S. Injectable fillers: review of material and properties. Facial. Plast. Surg. 2015, v. 31, № 1, pp. 29-34). Также из предшествующего уровня техники известно множество различных вариантов исполнения данных медицинских изделий, в качестве неисчерпывающего примера можно привести некоторые из них: WO2013040242A2, US8357795B2, US20110171286A1. Менее распространенными являются импланты, содержащие другие отрицательно заряженные полимеры, например, карбоксиметилцеллюлозу.
Несмотря на широкое распространение в клинической практике, эффективность и безопасность, инъекционные импланты на основе отрицательно заряженных полимеров имеют значительный недостаток, проявляющийся в их чрезмерном набухании, часто приводящем к неудовлетворительным эстетическим результатам, таким как неправильное контурирование и отечность. Альтернативой таким изделиям могут являться импланты, образованные водными дисперсиями биосовместимых водонерастворимых полимеров, обладающих меньшим поверхностным зарядом, и как следствие, не подверженных избыточному набуханию. Наиболее часто в качестве последних используют коллаген - основной белок волокнистого внеклеточного матрикса соединительных тканей.
Существует два подхода к изготовлению коллагеновых инъекционных имплантов. Первый основан на получении дисперсий коллагена, выделенного из соединительных тканей ферментативным методом. Частично солюбилизированный коллаген в составе данных препаратов при введении в ткани полимеризуется с образованием массы, заполняющей недостающий объем. Так из предшествующего уровня техники известен способ (US3940043) аугментации соединительных тканей млекопитающих при помощи раствора коллагена, полимеризующегося in situ. На основе указанного патента выпускался инъекционный имплант торговой марки ZYDERM, широко применявшийся в косметологии в 80-х годах XX века до начала внедрения инъекционных препаратов на основе гиалуроновой кислоты. Существенным недостатком имплантов из полимеризованного коллагена является часто наблюдаемое резкое уменьшение их объема в течение нескольких суток после процедуры введения, вызванное синерезисом материала и неспособностью противостоять деформациям, возникающим в подвижных тканях. Данное неблагоприятное явление обусловлено низким уровнем механических взаимодействий, между микрофибриллами реполимеризованного коллагена.
Вторым способом получения инъекционных коллагеновых имплантов является гидратация мелкодисперсных частиц высушенного белка в водном растворе, осуществляемая непосредственно перед введением. Для данной цели может быть использован как коллаген, выделенный из тканей животных различными химическими методами, так и очищенный волокнистый внеклеточный матрикс соединительных тканей со значительным количественным преобладанием коллагена в нативной форме. Так, известны мелкодисперсные материалы, предназначенные для получения инъекционных имплантов, торговых марок Nithya (Euroresearch, Италия) и Cymetra (LifeCell, США), представляющие собой измельченные коллаген I типа лошади и волокнистый внеклеточный матрикс дермы кожи человека, соответственно. Коллагеновый материал в составе данных изделий в поставляемой для потребителя форме предупакован во флаконы или шприцы и требует предварительной регидратации физиологическим раствором непосредственно перед имплантацией. Основным недостатком представленных на рынке мелкодисперсных материалов на основе частиц коллагена, предназначенных для получения инъекционных имплантов, является их низкая абсорбирующая способность, приводящая к неравномерной гидратации при изготовлении импланта непосредственно перед использованием, затрудняющая последующее инъекционное введение. Кроме того, инъекционные импланты, получаемые из данных материалов, имеют недостаточный для противостояния провисанию тканей уровень вязкоэластичности, а также низкую долю пространств между частицами коллагена в общем объеме импланта, что препятствует достаточному и равномерному прорастанию в него аутологичной соединительной ткани.
Описанные выше недостатки мелкодисперсных коллагеновых инъекционных материалов возникают вследствие преимущественно равносторонней формы частиц коллагена в их составе (частицы имеют близкие значения длины, ширины и толщины).. Так, равносторонняя форма частиц материала обуславливает низкую удельную площадь поверхности твердой дисперсной фазы имплантов, вследствие чего не формируется достаточного количества капиллярных пространств, необходимых для впитывания жидкости при гидратации, а также врастания соединительной ткани в гидратированный материал после имплантации. Кроме того, равносторонняя форма частиц не позволяет обеспечить достаточный уровень их механических взаимодействий для придания гидратированному материалу требуемых вязкоупругих свойств за счет создания связнодисперсной системы.
Охарактеризованная проблема может быть решена путем создания мелкодисперсных коллагеновых материалов, включающих выраженную количественную фракцию нитевидных (волокнистых) частиц, морфологически характеризующихся как волокна или фибриллы со значительным преобладанием длины над шириной, как правило, не менее чем 4-кратным. Наличие нитевидных частиц в коллагеновом материале, предназначенном для получения инъекционных имплантов, будет способствовать: 1) улучшению его эргономических свойств, так как переплетение нитевидных частиц в составе материала формирует трехмерную структуру с большой объемной долей капиллярных пространств, за счет чего значительно упрощается его гидратация; 2) повышению вязкоэластичности полученного из него импланта вследствие механических взаимодействий переплетающихся нитевидных частиц друг с другом; 3) улучшению биоинтеграционных свойств импланта за счет наличия пространств между переплетающимися частицами, в которые возможно прорастание новообразованной соединительной ткани, сопровождающееся выработкой аутологичных волокон коллагена резидентными или привлеченными из кровотока клетками.
Инъекционные коллагеновые импланты, содержащие фракцию нитевидных частиц, могут быть изготовлены в виде готовых для применения гидратированных форм при помощи специализированного промышленного или лабораторного оборудования - гомогенизаторов-диспергаторов. Данные формы в отличие от имплантов торговых марок Nithya и Cymetra не нуждаются в проведении ручной прегидратации материала пользователем. Так, например, из предшествующего уровня техники (RU 2627844) известен способ получения не требующей предварительной регидратации суспензионной формы измельченного децеллюляризованного внеклеточного матрикса с регулируемым размером его структурных компонентов, который описывает возможность «разволокнения» пучков волокон в составе частиц измельченного коллагенового матрикса до пучков меньшего порядка и волокон, имеющих морфологические характеристики нитевидных частиц. При этом «разволокнение» осуществляется путем чередования циклов перемешивания и диспергирования в жидкой среде в гомогенизаторе-диспергаторе погружного или циркуляционного типов. Однако данный способ требует использования технологически сложного дорогостоящего оборудования. Что более важно, гидратированные коллагеновые продукты, по сравнению с сухими формами, требуют пониженной температуры хранения, имеют меньший срок годности, что приводит к увеличению себестоимости, затруднению их транспортировки и реализации, и как следствие, снижению экономической эффективности их производства. В связи с этим в настоящее время сохраняется необходимость разработки доступных промышленно применимых способов получения мелкодисперсных эргономичных коллагеновых материалов, содержащих фракцию нитевидных частиц, предназначенных для предварительной гидратации конечным пользователем, с целью получения дермальных имплантов с улучшенными реологическими и биоинтеграционными свойствами.
Краткое изложение сущности изобретения
Поставленная задача решена в результате разработки способа получения мелкодисперсного коллагенового материала, состоящего из нитевидных частиц в количестве не менее чем 35% от общего числа частиц, отличающегося тем, что способ включает последовательно проводимые стадии:
- измельчения влажного коллагенсодержащего сырья до волокнистых тяжей,
- высушивания полученных волокнистых тяжей,
- измельчения высушенных тяжей путем стригально-режущего помола с получением порошка,
- измельчения полученного порошка путем ударно-истирающего помола,
- извлечение мелкодисперсного коллагенового материала.
В конкретном варианте воплощения предложенного способа стадию измельчения влажного коллагенсодержащего сырья до волокнистых тяжей осуществляют при помощи электромеханического измельчителя, содержащего шнековый вал, нож и выходную ситовую вставку.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа стадию высушивания полученных волокнистых тяжей осуществляют путем равномерного обдува очищенным воздухом.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа стадию высушивания полученных волокнистых тяжей осуществляют лиофильно.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа стадию измельчения высушенных тяжей путем стригально-режущего помола с получением порошка осуществляют на режущей мельнице, содержащей измельчительную камеру, включающую подвижный и неподвижные ножи, а также вставную ситовую кассету, в несколько этапов с последовательным уменьшением диаметра отверстий сита.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа стадию измельчения полученного порошка путем ударно-истирающего помола осуществляют на роторной мельнице, оснащенной ротором с зубьями и вставным кольцевым ситом, в несколько этапов с последовательным уменьшением диаметра отверстий сита при прохождении потока воздуха через измельчительную камеру.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа мелкодисперсный коллагеновый материал выводят из камеры роторной мельницы при помощи сепаратора циклонного типа.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа все операции получения мелкодисперсного коллагенового материала проводят при температуре 15-25°С.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа высушивание волокнистых тяжей проводят до конечного содержания влаги менее 16% по массе, предпочтительно, менее 10% по массе.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа качестве сырья используют фибриллярный коллаген, выделенный из тканей позвоночных животных и человека.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа измельчение тяжей на режущей мельнице проводят в два этапа с последовательным использованием вставных ситовых кассет, первое из которых имеет диаметр отверстий 100-1000 мкм, более предпочтительно 300-600 мкм, а второе имеет диаметр отверстий 80-400 мкм, наиболее предпочтительно 100-250 мкм.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа измельчение порошка на роторной мельнице проводят в два этапа с последовательным использованием вставных кольцевых сит, первое из которых имеет диаметр отверстий 50-380 мкм, более предпочтительно 100-160 мкм, а второе имеет диаметр отверстий 20-130 мкм, наиболее предпочтительно 70-100 мкм.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа заключительное измельчение порошка на роторной мельнице проводят с использованием вставного кольцевого сита с трапециевидной формой отверстий.
В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа измельчение порошка на роторной мельнице проводят при скорости вращения ротора от 6000 до 20000 об/мин, наиболее предпочтительно при 9000-15000 об/мин.
Еще одним объектом настоящего изобретения является продукт, полученный указанным выше способом, предназначенный для получения инъекционных дермальных имплантов.
Технический результат настоящего изобретения достигается за счет сочетанного последовательного применения технологий стригально-режущего и ударно-истирающего сухого помола высушенных волокнистых тяжей, полученных из коллагенсодержащего сырья. На этапе стригально-режущего помола за счет фибриллярной упорядоченной структуры коллагена в измельчаемом материале предельное напряжение создается преимущественно в направлении продольной укладки его волокон, что приводит к формированию частиц с низкой сферичностью. На этапе ударно-истирающего помола частицы с низкой сферичностью при истирании разрушаются с формированием частиц нитевидной морфологии в количестве не менее чем 35% от общего числа частиц. При этом под нитевидными подразумеваются частицы, морфологически характеризующиеся как волокна или фибриллы со значительным преобладанием длины над шириной, как правило, не менее чем 4-кратным. Под длиной понимается максимальный линейный размер частицы, а под шириной - максимальный размер частицы, измеренный под прямым углом к длине.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 показана сканирующая электронная микрофотография порошка коллагенсодержащего сырья, полученного путем измельчения по технологии стригально-режущего помола на универсальной режущей мельнице Pulverisette 19.
На Фиг.2 показана микроструктура мелкодисперсного коллагенового материала, полученного способом, описанным в настоящем изобретении. Изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии при увеличении 500х (слева) и 2000х (справа).
На Фиг.3 показан внешний вид мелкодисперсного коллагенового материала, полученного способом, описанным в настоящем изобретении, упакованного в стеклянный флакон.
На Фиг.4 показаны светомикроскопические препараты мелкодисперсного коллагенового материала, полученного способом, описанным в настоящем изобретении (А), а также сравнительного мелкодисперсного коллагенового материала, полученного путем помола только на режущей мельнице (Б).
На Фиг. 5 показана диаграмма, иллюстрирующая распределение частиц мелкодисперсного коллагенового материала, полученного способом, описанным в настоящем изобретении (темные столбцы), а также сравнительного мелкодисперсного коллагенового материала, полученного путем помола только на режущей мельнице (светлые столбцы), по значению отношения продольного диаметра к поперечному.
На Фиг.6 показан процесс гидратации мелкодисперсного коллагенового материала, полученного способом, описанным в настоящем изобретении, (А) и сравнительного коллагенового материала, полученного путем помола только на режущей мельнице, (Б) после добавления физиологического раствора.
На Фиг.7 показан гидратированный мелкодисперсный коллагеновый материал, полученный способом, описанным в настоящем изобретении, после переноса из флакона в одноразовый шприц (сверху), а также одноразовый стерильный шприц с материалом, подготовленный к инъекционному введению (снизу).
На Фиг.8 показаны результаты реологического исследования в осцилляционном тесте образцов гидратированного мелкодисперсного коллагенового материала, полученного способом, описанным в настоящем изобретении (А), а также гидратированного сравнительного коллагенового материала, полученного путем помола только на режущей мельнице (Б).
На Фиг.9 показаны гистологические срезы тканей в области подкожной имплантации гидратированного мелкодисперсного коллагенового материала, полученного способом, описанным в настоящем изобретении (А), а также гидратированного сравнительного коллагенового материала, полученного путем помола только на режущей мельнице (Б). Окрашивание гематоксилином и эозином. Черными треугольниками (▲) обозначены частицы имплантированного мелкодисперсного коллагенового материала, черными стрелками указаны волокна новообразованного аутологичного коллагена, звездочками (*) обозначены микрососуды, прорастающие в толщу импланта.
Подробное описание изобретения
Описанный в настоящем изобретении мелкодисперсный коллагеновый материал с улучшенными капиллярными свойствами, предназначенный для получения инъекционных дермальных имплантов с повышенными вязкоэластичными и биокондуктивными характеристиками, может быть изготовлен из исходного сырья, основным компонентом которого является белок коллаген фибриллярного типа. Наилучшим образом для получения материала подходит очищенный от клеточных компонентов волокнистый внеклеточный матрикс оформленных или неоформленных плотных волокнистых соединительных тканей позвоночных животных и человека, поскольку волокна коллагена в данных тканях упорядоченно уложены в составе пучков. В качестве менее предпочтительного исходного коллагенсодержащего сырья могут быть взяты препараты коллагена фибриллярного типа, выделенные и очищенные согласно различным опубликованным методикам. Все операции по получению мелкодисперсного коллагенового материала предпочтительно проводить при комнатной температуре в диапазоне от +15 до +25°С.
Используемое сырье должно быть во влажном состоянии измельчено до волокнистых тяжей при помощи электромеханического измельчителя стандартной конструкции, содержащего шнековый вал, нож и выходную ситовую вставку. Желательно, чтобы диаметр отверстий выходной ситовой вставки, определяющий диаметр тяжей, был менее 7 мм. В случае если для приготовления материала используется высушенное коллагенсодержащее сырье, то оно должно быть предварительно увлажнено путем помещения в стерильную воду для инъекций на 1-12 часов.
Полученные волокнистые тяжи должны быть помещены в лотки или другую подходящую емкость и высушены при равномерном обдуве очищенным воздухом в ламинарном шкафу или другом аналогичном оборудовании или лиофильно до конечного содержания влаги менее 16% по массе, предпочтительно, менее 10% по массе. Для контроля влажности при высушивании могут быть использован электронный анализатор влагосодержания.
Высушенные тяжи коллагенсодержащего сырья подвергают сочетанному последовательному измельчению на режущей и роторной мельницах.
На первой стадии тяжи измельчают на мельнице режущего типа, производящей измельчение материала по технологии стригально-режущего помола. Конструкция мельницы должна содержать измельчительную камеру, включающую подвижный и неподвижные ножи, а также вставную ситовую кассету с отверстиями, регулирующими размер получаемых частиц измельченного материала. Например, может быть использована Универсальная режущая мельница Pulverisette 19 (Fritsch, Германия).
Предпочтительно проведение стригально-режущего помола в два этапа с последовательным использованием вставных сит с уменьшающимся диаметром отверстий. Так, предпочтительно, чтобы диаметр отверстий сита на первом этапе помола составлял 100-1000 мкм, более предпочтительно 300-600 мкм; на втором этапе - 80-400 мкм, наиболее предпочтительно 100-250 мкм.
На стадии помола коллагенсодержащего сырья на режущей мельнице происходит формирование частиц, преимущественно характеризующихся низкой сферичностью. Это обусловлено тем, что за счет фибриллярной упорядоченной структуры коллагена в измельчаемом материале предельное напряжение создается в большей степени в направлении продольной укладки его волокон.
Полученный порошок на следующей стадии подвергают измельчению на мельнице роторного типа, производящей измельчение материала по технологии ударно-истирающего помола. Конструкция оборудования должна содержать измельчительную камеру, включающую ротор с зубьями и вставное кольцевое сито с отверстиями, регулирующими размер получаемых частиц измельченного материала. Также конструкция мельницы должна содержать систему, обеспечивающую постоянное принудительное прохождение потока воздуха через измельчительную камеру во избежание перегрева материала в измельчительной камере, а также циклонный сепаратор для сбора частиц материала после измельчения. Например, может быть использована быстроходная роторная мельница Pulverisette 14 (Fritsch, Германия).
Измельчение на роторной мельнице предпочтительно проводят в два этапа с последовательным использованием вставных кольцевых сит с уменьшающимся диаметром отверстий. Так, предпочтительно, чтобы диаметр отверстий сита на первом этапе помола составлял 50-380 мкм, более предпочтительно 100-160 мкм; на втором этапе - 20-130 мкм, наиболее предпочтительно 70-100 мкм. Для увеличения эффективности процесса истирания частиц на заключительном этапе помола на роторной мельнице может быть использовано вставное кольцевое сито с трапециевидной формой отверстий. Скорость вращения ротора мельницы при помоле должна обеспечивать эффективное измельчение частиц, но в то же время неприводить к избыточному нагреву материала, вызывающему необратимую денатурацию белка. Предпочтительная скорость вращения ротора составляет от 6000 до 20000 об/мин, наиболее предпочтительная от 9000 до 15000 об/мин. Во избежание перегрева материала следует проводить постепенное добавление порошка в измельчительную камеру мельницы небольшими порциями.
На стадии ударно-истирающего помола порошка на роторной мельнице происходит истирание частиц за счет ударного воздействия ротора, вращающегося с высокой скоростью. При этом частицы с низкой сферичностью разрушаются с преимущественным формированием нитевидных частиц.
На заключительном этапе полученный мелкодисперсный коллагеновый материал выводится из измельчительной камеры мельницы при помощи потока воздуха в собирающую емкость сепаратора циклонного типа.
Структура мелкодисперсного коллагенового материала, предназначенного для получения инъекционных дермальных имплантов, может быть охарактеризована методами оптической и электронной микроскопии. Анализ образцов материала при помощи лазерного дифракционного анализатора размера частиц является нерепрезентативным вследствие неправильной формы частиц, а также образования конгломератов нитевидными частицами.
Далее мелкодисперсный коллагеновый материал может быть расфасован в фармацевтическую упаковку, позволяющую проведение его предварительной гидратации перед использованием. В качестве такой упаковки может быть использован стеклянный флакон, укупоренный резиновой пробкой и колпачком, или шприц для предварительного наполнения, оснащенный герметичной заглушкой.
Для обеспечения стерильности материал может быть подвергнут стерилизации в конечной упаковке. Подходящими методами являются радиационная стерилизация, а также стерилизация оксидом этилена.
Область применения
Мелкодисперсный коллагеновый материал с улучшенными капиллярными свойствами, предназначенный для получения инъекционных дермальных имплантов с повышенными вязкоэластичными и биокондуктивными характеристиками, полученный способом, описанным в настоящем изобретении, можно применять в области косметологии, дерматологии, пластической и реконструктивной хирургии для инъекционного введения в соединительные ткани с целью коррекции проявлений их физиологической и патологической атрофии, а также восстановления или коррекции объема (аугментации).
Пример
В данном примере для изготовления мелкодисперсного коллагенового материал с улучшенными капиллярными свойствами, предназначенного для получения инъекционных дермальных имплантов с повышенными вязкоэластичными и биокондуктивными характеристиками, в качестве исходного коллагенсодержащего сырья был использован очищенный щелочным методом волокнистый внеклеточный матрикс плотной волокнистой неоформленной соединительной ткани, а именно дермы кожи, крупного рогатого скота. Преобладающим компонентом сырья являлся коллаген I типа, что было подтверждено методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле.
Пласты матрикса пропускали через электромеханический роторно-ножевой измельчитель MG700 (Kenwood, Япония), оснащенный выходной ситовой вставкой с диаметром отверстий 5 мм.
Полученные волокнистые тяжи равномерно размещали на очищенных пластиковых поддонах и помещали под ламинарный поток воздуха в оборудовании КОЧ «Ламинар-С» (Ламинарные Системы, Россия) на 72 часа при комнатной температуре. По завершении высушивания контролировали влажность материала при помощи электронного влагомера MB23 (OHAUS, США), которая составила 5,1%.
Далее высушенные тяжи ступенчато измельчали на универсальной режущей мельнице Pulverisette 19 (Fritsch, Германия) по технологии стригально-режущего помола. Конструкция оборудования включала измельчительную камеру, подвижный и неподвижные ножи, вставную ситовую кассету с отверстиями. На первом этапе тяжи измельчали при диаметре отверстий вставного сита в 500 мкм. Затем измельченный материал повторно пропускали через мельницу с установленным вставным ситом с диаметром отверстий в 200 мкм. Перед следующей стадией измельчения проводили морфологическую характеристику порошка методом сканирующей электронной микроскопии. Для этого образцы напыляли золотом, толщиной 5 нм и получали электронные микрофотографии в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ на микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, США). Анализ полученных изображений выявил, что образцы состояли из частиц, имеющих преимущественно уплощенную планкообразную форму с закругленными краями (Фиг.1). Длина (dmax) частиц составляла 200-850 мкм. Толщина (dmin) частиц находилась в промежутке 50-400 мкм, и в большинстве случаев была значительно меньше длины, что характерно для большинства объектов с низкой сферичностью (dmax/dmin˃˃1).
Далее порошок подвергали ступенчатому измельчению на роторной мельнице Pulverisette 14 (Fritsch, Германия) по технологии ударно-истирающего помола. Конструкция оборудования включала измельчительную камеру, оснащенную ротором с зубьями и вставным кольцевым ситом. Измельчительная камера имела соединение с вакуумным вытяжным устройством через циклонный сепаратор для обеспечения воздушного потока через камеру и сбора частиц измельченного материала соответственно. На первом этапе порошок измельчали при скорости вращения ротора 10000 об/мин и установленном вставном кольцевом сите с диаметром отверстий 120 мкм. Измельченный материал собирали в емкость циклонного сепаратора и повторно пропускали через мельницу при той же скорости вращения ротора и вставном кольцевом сите с диаметром отверстий 80 мкм.
Изготовленный мелкодисперсный коллагеновый материал окончательно выводили из камеры мельницы в емкость циклонного сепаратора и расфасовывали в стеклянные флаконы. Флаконы укупоривали резиновой пробкой и комбинированным колпачком из алюминия с легкосъемной пластиковой крышкой при помощи полуавтоматического устройства для укупоривания (Випс-Мед, Россия) (Фиг.3).
Для обеспечения стерильности коллагеновый материал в конечной упаковке подвергали радиационной стерилизации дозой 14 кГр.
Далее проводили микроскопическую характеристику материала методами электронной и световой микроскопии.
Сканирующее электронно-микроскопическое исследование структуры полученного мелкодисперсного коллагенового материала показало, что в его составе в объемном отношении преобладают частицы, характеризующиеся нитевидной морфологией. Длина частиц значительно варьирует от 5 до 250 мкм, толщина нитевидных частиц составляет 1-10 мкм (Фиг.2). Также в толще материала встречаются отдельные пластинчатые, сферические и цилиндрические частицы размером 10-50 мкм. Измерение размера частиц методом световой микроскопии и последующее вычисление распределения частиц по отношению продольного диаметра к поперечному вывило, что 36,2% от общего числа частиц имели значение данного отношения более 4 (Фиг.5).
Для проведения дальнейших сравнительных эксплуатационных, реологических и имплантационных in vivo исследований был выбран сравнительный образец коллагенового материала с сопоставимым размером частиц, не содержавший выраженную фракцию нитевидных частиц, полученный путем измельчения порошка только на режущей мельнице Pulverisette 19. Длина частиц в полученном образце составляла 10-280 мкм. Толщина частиц находилась в диапазоне 1-250 мкм (Фиг.4). Отношение продольного диаметра к поперечному более 4 имело лишь 0,4% частиц от общего числа (Фиг.5). Материал расфасовывали в том же количестве в аналогичные флаконы и подвергали радиационной стерилизации в тех же условиях.
Проводили сравнительную оценку эргономичности (полноты, равномерности) гидратации полученных мелкодисперсных коллагеновых материалов при получении из них инъекционных дермальных имплантов. Для этого через резиновую крышку вносили во флаконы одинаковый объем стерильного физиологического раствора хлорида натрия и выдерживали в течение 10-и минут при периодическом интенсивном встряхивании (1 раз в 2 минуты).
Мелкодисперсный коллагеновый материал, содержащий выраженную фракцию нитевидных частиц, полученный согласно методу, описанному в настоящем изобретении быстро гидратировался, достигая практически полной гомогенности через 10 минут после добавления физраствора (Фиг.6 А) Гидратированный материал, описанный в настоящем изобретении, легко мог быть отобран из флакона в стерильный одноразовый шприц и подготовлен таким образом к инъекционной имплантации (Фиг.7).
В свою очередь сравнительный коллагеновый материал за время испытания гидратировался неравномерно, образовывал комки, не формировал гомогенный инъекционный имплант (Фиг.6 Б). Материал не мог быть аспирирован в одноразовый шприц через иглу.
Важной характеристикой инъекционных имплантов являются вязкостно-эластические свойства, определяемые при помощи методов реометрии. В частности, общепринято, что импланты обладающие большим значением модуля упругости при сдвиге (G’) лучше противостоят сдвиговым деформация кожи, вследствие чего оказывают более выраженный эффект лифтинга и аугментации (Sundaram H., Voigts B., Beer K., Meland M. Comparison of the rheological properties of viscosity and elasticity in two categories of soft tissue fillers: calcium hydroxylapatite and hyaluronic acid. Dermatol. Surg. 2010, v. 36, pp. 1859-1865). Реологические свойства полученных гидратированных образцов исследовали при помощи модульного реометра MRC72 (Anton Paar, Австрия) с применением измерительной геометрии плита-плита, расстоянии между плитами 2 мм, температуре 25°С, в режиме осцилляции в диапазоне угловых частот 0,1-100 рад/сек при амплитуде деформации, находящейся в диапазоне линейной вязкоупругости.
Реологическое исследование показало, что значение коэффициента механических потерь (tanδ) инъекционного импланта, полученного из коллагенового материала, изготовленного методом, описанным в настоящем изобретении, находилось в диапазоне 0,36-0,39, что характеризует его как вязкоупругое тело. В то же время значение данного показателя у сравнительного импланта находилось в диапазоне 0,9-5,0, что свидетельствует о том, что в большем диапазоне угловых частот образец ведет себя как вязкоупругая жидкость. Значение динамического модуля упругости при сдвиге (G’) импланта, содержащего нитевидные частицы находилось в диапазоне 180-630 Па, тогда как у образца сравнения его значение было значительно меньше и составляло 5,4-6,1 Па (Фиг.8). Полученные данные свидетельствуют о более выраженной вязкоупругости материала с нитевидными частицами, что позволяет ему эффективнее противостоять сдвиговым деформациям при имплантации.
Для оценки биосовместимости и кондуктивных свойств исследуемые гидратированные мелкодисперсные коллагеновые материалы в количестве 250 мкл инъекционно имплантировали субдермально мышам линии Balb/C. Через месяц после имплантации животных выводили из эксперимента, ткани в области введения материалов иссекали и подвергали гистологическому исследованию. Патоморфологический анализ не выявил признаков воспаления в области имплантации образцов. В подкожной соединительной ткани присутствовали частицы инъецированных коллагеновых материалов (Фиг.9). Между частицами импланта, полученного из коллагенового материала, произведенного способом, описанным в настоящем изобретении, располагались пространства, в которых выявлялись тонкие новообразованные коллагеновые волокна, а также капилляры, врастающие в толщу импланта (Фиг.9). Врастание аутологичной соединительной ткани выявлялось во всей толще имплантированного материала. Частицы сравнительного импланта в свою очередь располагались гораздо плотнее друг к другу. Врастание соединительной ткани наблюдалось лишь в небольших областях по периферии импланта. В центральной области в промежутках между частицами выявлялись единичные клетки моноцитарно/макрофагальной линии дифференцировки (Фиг.9). Полученные результаты свидетельствуют об увеличенной биокондуктивной способности импланта, полученного из коллагенового материала, содержащего выраженную фракцию нитевидных частиц.
1. Способ получения мелкодисперсного коллагенового материала, состоящего из нитевидных частиц, характеризующихся не менее чем 4-кратным преобладанием длины над шириной, в количестве не менее чем 35% от общего числа частиц, отличающийся тем, что способ включает последовательные проводимые стадии:
- измельчения влажного коллагенсодержащего сырья до волокнистых тяжей,
- высушивания полученных волокнистых тяжей,
- измельчения высушенных тяжей путем стригально-режущего помола с получением порошка,
- измельчения полученного порошка путем ударно-истирающего помола,
- извлечение мелкодисперсного коллагенового материала.
2. Способ по п.1, где стадию измельчения влажного коллагенсодержащего сырья до волокнистых тяжей осуществляют при помощи электромеханического измельчителя, содержащего шнековый вал, нож и выходную ситовую вставку.
3. Способ по п.1, где стадию высушивания полученных волокнистых тяжей осуществляют путем равномерного обдува очищенным воздухом.
4. Способ по п.1, где стадию высушивания полученных волокнистых тяжей осуществляют лиофильно.
5. Способ по п.1, где стадию измельчения высушенных тяжей путем стригально-режущего помола с получением порошка осуществляют на режущей мельнице, содержащей измельчительную камеру, включающую подвижный и неподвижные ножи, а также вставную ситовую кассету, проходящую в несколько этапов с последовательным уменьшением диаметра отверстий сита.
6. Способ по п.1, где стадию измельчения полученного порошка путем ударно-истирающего помола осуществляют на роторной мельнице, оснащенной ротором с зубьями и вставным кольцевым ситом, в несколько этапов с последовательным уменьшением диаметра отверстий сита при прохождении потока воздуха через измельчительную камеру.
7. Способ по п.5, где мелкодисперсный коллагеновый материал выводят из камеры роторной мельницы при помощи сепаратора циклонного типа.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где все операции получения мелкодисперсного коллагенового материала проводят при температуре 15-25оС.
9. Способ по п.3, где высушивание волокнистых тяжей проводят до конечного содержания влаги менее 16% по массе, предпочтительно, менее 10% по массе.
10. Способ по п.1, где в качестве сырья используют фибриллярный коллаген, выделенный из тканей позвоночных животных и человека.
11. Способ по п.5, где измельчение тяжей на режущей мельнице проводят в два этапа с последовательным использованием вставных ситовых кассет, первое из которых имеет диаметр отверстий 100-1000 мкм, более предпочтительно 300-600 мкм, а второе имеет диаметр отверстий 80-400 мкм, наиболее предпочтительно 100-250 мкм.
12. Способ по п.6, где измельчение порошка на роторной мельнице проводят в два этапа с последовательным использованием вставных кольцевых сит, первое из которых имеет диаметр отверстий 50-380 мкм, более предпочтительно 100-160 мкм, а второе имеет диаметр отверстий 20-130 мкм, наиболее предпочтительно 70-100 мкм.
13. Способ по п.12, где заключительное измельчение порошка на роторной мельнице проводят с использованием вставного кольцевого сита с трапециевидной формой отверстий.
14. Cпособ по п.6, где измельчение порошка на роторной мельнице проводят при скорости вращения ротора от 6000 до 20000 об/мин, наиболее предпочтительно при 9000-15000 об/мин.
15. Продукт, полученный способом по любому из пп. 1-13, предназначенный для получения инъекционных дермальных имплантов.
