Штамм "a/chicken/primorsk/419/2018 h9n2" вируса гриппа птиц рода alphainfluenzavirus вида influenza a virus подтипа h9 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа а подтипа h9

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма вируса гриппа птиц типа А подтипа Н9 сем. Orthomyxoviridae, рода Alphainfluenzavirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №113 - деп / 19-3 - КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Представленный штамм репродуцируется в 10-суточных куриных эмбрионах СПФ-кур, где достигает инфекционного титра не менее 10,13 lg ЭИД₅₀/см³. В составе инактивированной вакцины штамм обладает выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, вызывая выработку специфических антител, улавливаемых в ИФА и РТГА. Представленный штамм может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н9. 5 табл., 5 пр. 1 ил.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа Н9 и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц подтипа Н9, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н9.

Грипп птиц (ГП) представляет собой острую инфекционную вирусную болезнь птиц, характеризующуюся поражением органов пищеварения, дыхания, высокой летальностью. Различные штаммы вируса гриппа птиц могут вызывать от 10 до 100% гибели среди инфицированных и поражать одновременно несколько видов птиц.

Согласно международной классификации International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) релиз Master Species List 2018b.v2 вирусы гриппа отнесены к семейству Orthomyxoviridae (по классификации ICTV - 00.046, по классификации The National Center for Biotechnology Information (NCBI) ID: 11308), включающего 7 родов: Alphainfluenzavirus (A), Betainfluenzavirus (B), Deltainfluenzavirus (D), Gammainfluenzavirus (C), Isavirus, Quaranjavirus, Thogovirus. Вирус гриппа птиц относится к роду Alphainfluenzavirus (ID: 197911), виду Influenza A virus (ID 00.046.0.01.001).

Принадлежность штамма вируса гриппа к роду определяется консервативными элементами генома, задающими антигенные характеристики нуклеокапсидов.

Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм 60-180 нм. Встречаются нитевидные формы вирионов до 200-350 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы - до 8%.

В настоящее время вирусы гриппа птиц (ВГП) разделяют на 16 подтипов по гемагглютинину (H1-H16) и 9 подтипов по нейраминидазе (N1-N9) (13). Вирусы гриппа всех подтипов были выделены от птиц с различными комбинациями гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Однако, в 2012 и в 2013 гг. появились данные о двух новых подтипах гемагглютинина и нейраминидазы - H17N10 и H18N11. В Гватемале (Северная Америка) было выделено несколько изолятов вируса гриппа подтипа H17N10 от летучих мышей (4), и в Перу (Южная Америка) выделили изолят вируса гриппа H18N11 также от летучей мыши (14). Согласно литературным данным, от птиц вирус гриппа указанных подтипов не выделяли.

Вирусы гриппа обладают огромной экологической пластичностью за счет высоких темпов эволюции, связанных с изменчивостью их генома (11). Естественными носителями вируса птичьего гриппа являются дикие водоплавающие и морские птицы, являющиеся резервуаром почти всех подтипов гриппа за исключением H17N10 и H18N1, которые были найдены у рукокрылых (5). Взаимоотношение различных подтипов вирусов гриппа у диких птиц существенно не отражается на состоянии популяции хозяев, но занос вируса в неадаптированные популяции сельскохозяйственных птиц приводит к тяжелым эпизоотиям с экономическим ущербом. Прежде всего это относится к вирусу гриппа птиц подтипов Н5, Н7 и Н9 (2, 16).

Вирус гриппа типа А подтипа Н9 (А/Н9), относящийся к низковирулентным вирусам гриппа, был впервые выделен в 1966 году от птиц в США в штате Висконсин. С тех пор он не только распространился по всему миру, но и значительно расширил круг хозяев (6, 7). С середины 90-х годов прошлого века он стал вызывать вспышки заболевания среди домашней птицы. В материковой части Китая вирус гриппа А/Н9 впервые был выделен в 1994 году и в последнее десятилетие стал наиболее распространенным подтипом вируса гриппа среди домашней птицы (12, 17). Хотя вирусы гриппа А/Н9 классифицируются как низковирулентные, но их широкое распространение среди птиц привело к большим экономическим потерям в птицеводстве из-за значительного понижения яйценоскости и высокой смертности, вызванной ко-инфекцией с другими патогенами (6, 12).

В Российской Федерации в феврале 2012 года в одном из птицеводческих хозяйств Дальневосточного региона РФ наблюдалась вспышка респираторной болезни с повышенным отходом, вызванная вирусом гриппа птиц А/Н9 (2). В течение 2012-2017 гг. периодически выявляли антитела к антигену Н9 от диких птиц (Республика Тыва). В 2017 году были выявлены антитела в сыворотках крови диких птиц из Кировской области. Также в 2017-18 гг. был обнаружен вирус гриппа птиц у диких перелетных птиц в Томской области и в Хабаровском крае. В 2018 году на птицефабрике в Приморском крае, в Амурской области у диких уток и в 2019 году на территории Челябинской области был выявлен вирус гриппа А/Н9. Все эти случаи свидетельствуют о циркуляции вируса гриппа подтипа Н9 в популяциях домашних и диких птиц на Дальнем Востоке. Следует отметить, что Приморский край граничит непосредственно с Китаем, являющимся лидером по количеству вспышек гриппа птиц подтипа H9N2 (2). В настоящее время на территории России установлена циркуляция вируса подтипа А/Н9 всех трех генетических сублиний (G1, Y280, Y439), относящихся к европейской линии.

Известны штаммы вируса гриппа птиц, используемые для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (3-12).

Известен штамм A/chicken/Israel/215/2007 вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (3).

Известен штамм A/turkey/Wisconsin/1/1966 вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (6).

Известен штамм A/Quail/Hong Kong/G1/1997 вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).

Известен штамм A/Chicken/Beijing/1/1994 вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).

Известен штамм A/chicken/HongKong/Y439/1997 вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (12).

Известен штамм A/chicken/Shanghai/F/1998 (Ck/SH/F/98) вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (9).

Известен штамм A/Chicken/Hong Kong/G9/1997 вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (8).

Известен штамм A/Chicken/Shandong/01/2008 вируса гриппа птиц, используемый для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (18).

Таким образом, для производства диагностических и вакцинных препаратов используются штаммы вируса гриппа птиц, относящиеся к линиям G1 (A/Quail/Hong Kong/G1/1997, A/chicken/Israel/215/2007), Y280 (A/chicken/Shanghai/F/1998) и Y439 (A/chicken/HongKong/Y439/1997). Однако все они имеют ряд недостатков. Основная масса штаммов вирусов была выделена более десяти лет назад и антигенно отличается от ныне существующих вариантов.

Техническая проблема заключается в расширении арсенала штаммов вируса гриппа птиц типа А подтипа Н9, обладающих инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих иммуногенные свойства после инактивации, обеспечивая тем самым получение чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту домашней птицы против гомологичного вируса.

Указанная проблема решена путем получения штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц, используемого для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н9.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2018 г. из проб, поступивших из птицефабрики Приморского края РФ. Вследствие вирусовыделения из гомогената внутренних органов от кур был получен штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц.

Штамм прошел 3 пассажа на 10-суточных СПФ-куриных эмбрионах. Способен вызывать гибель эмбрионов кур в течение 48-72 ч инкубации.

Подтип H9N2 идентифицирован методами полимеразно-цепной реакции (ПЦР), нуклеотидного секвенирования, в РТГА (реакция торможения гемагглютинации) и РИНА (реакция ингибиции нейраминидазной активности).

При проведении филогенетического анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА участка 1414-1572 п.н. было установлено, что исследуемый изолят принадлежит к генетической линии Y-280/G9-like, широко распространенной на территории Китая и сопредельных государств Юго-Восточной Азии.

По фрагменту гена НА наиболее генетически близкими оказались последовательности вирусов гриппа птиц подтипа H9N2, выделенные в Китае (98,2-99,0% совпадений), а также последовательности вирусов гриппа птиц подтипа H9N2, выделенные на территории стран Юго-Восточной Азии (98-99% совпадений).

Сайт расщепления гемагглютинина содержит основные аминокислоты и имеет структуру RSSR/GLF, что позволяет охарактеризовать вирус как потенциально низковирулентный.

Штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса ГП типа А, подтипа H9N2, депонирован 10 апреля 2019 г. в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» под регистрационным номером №113 - деп/ 19-3 - КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и для приготовления биопрепаратов для специфической профилактики и диагностики гриппа птиц.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении (фиг. 1). На фиг. 1 представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса гриппа птиц подтипа Н9. Дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностей участка гена гемагглютинина.

Показано, что исследуемый штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 принадлежит к обширной линии штаммов Y280, впервые выявленных на территории Юго-Восточной Азии в 1997 г.

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:

SEQ ID №1: представляет последовательность нуклеотидов фрагмента гена гемагглютинина штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2;

SEQ ID №2: представляет последовательность аминокислот фрагмента гемагглютинина штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2.

Исследования основывались на определении первичной структуры фрагмента гена гемагглютинина (НА) испытуемого образца штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами и изолятами вируса гриппа птиц подтипа H9N2. В результате секвенирования была определена нуклеотидная (273 н.о.) и аминокислотная (91 а.о.) последовательности фрагмента гена НА штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2. Сайт расщепления гемагглютинина штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц имеет структуру RSSR/GLF, что позволяет охарактеризовать вирус как потенциально низковирулентный.

Штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологическая характеристика

Штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, подтипу H9N2 и обладает морфологическими признаками, характерными для вируса гриппа типа А.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц около 100 нм; нитевидные частицы около 17 нм в диаметре, длиной 250 нм и более. На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (до 14 нм), образованные гомотримерами НА. В промежутках между кластерами НА у вирусов типа А размещаются молекулы NA.

Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.

Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 н.о.; №2 - чуть менее 2350 н.о.; №3, как правило, - 2250 н.о.; №4 - 1780 н.о.; №5 - 1575 н.о.; №6 - 1420 н.о.; №7 - 1050 н.о.; №8 - 900 н.о.

На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся

повторяющиеся отрезки, причем повторы 5' -концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5' -AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3' -конце. Кроме того, 3' -концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [ICTV-International Committee on Taxonomy of Viruses].

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H9N2.

Гемагглютинирующая активность штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц к подтипу Н9. Титр специфической сыворотки составил 6 log₂. Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц (ВГП) подтипа H5N2 («IZSVe», Италия).

Биотехнологические свойства

Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) и иммуноферментным анализом (ИФА). Так, через 14 и 28 дней после двухкратной иммунизации цыплят инактивированной вакциной из штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц в прививном объеме 1,0 см³/гол средний титр антител по группе к НА, обеспечивающим реакцию торможения гемагглютинации, составил 3,2 log₂ и 7,3 log₂, соответственно; титр антител, определяемых методом ИФА, составил 3500 и 10262, соответственно (таблица 5).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц типа А подтипа Н9 является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 250×10⁶ Д.

Геном вируса гриппа представлен однонитевой РНК негативной полярности в виде 8 нитей (сегментов) в комплексе с белком нуклеопротеина (NP).

Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм около 100 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы - до 8%.

Антигенная вариабельность и таксономическая классификация вируса основана на идентификации двух основных поверхностных белков -гемагглютинина и нейраминидазы.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает. Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.

Патогенные свойства

Вирулентность - низкая (не вызывает гибель зараженной птицы в дозе 10^7,0 ЭЛД₅₀).

Контагиозность - контагиозен. Неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Определение подтиповой антигенной характеристики штамма проводили с помощью перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции ингибиции нейраминидазной активности (РИНА) с референтными гипериммунными сыворотками к антителам 16 Н-типов вируса ГП и с референтными сыворотками против гриппа птиц подтипов N1-N2 по нейраминидазе. Образцы вирусной суспензии исследовали предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) для определения гемагглютинирующей активности вируса. Активность штамма ВГП A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 в РГА составила 9 log₂. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку крови кур производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты представлены в таблице 1 и таблице 2.

В РТГА гемагглютинирующая активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность образца штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц к подтипу Н9. Титр сыворотки составил 6 log₂.

В РИНА нейраминидазная активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к ВГП подтипа H5N2 («IZSVe», Италия).

Согласно результатам серологических исследований штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 был отнесен к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2.

Для выявления генома вируса ГП из проб тканей птиц и экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) зараженных эмбрионов кур выделяли общую РНК, которую использовали для постановки обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Первичную индикацию гена М проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), используя праймеры M25F, M124R и флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд М64. С помощью классической ОТ-ПЦР амплифицировали фрагмент гена НА. Методом секвенирования была определена нуклеотидная последовательность фрагмента (273 н.о.) гена НА штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 и соответствующая ей аминокислотная последовательность (91 а. о.). Было установлено, что по фрагменту гена НА к штамму вируса гриппа птиц A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 наиболее близкими оказались последовательности вирусов гриппа А птиц подтипа Н9, выделенные на территории стран Юго-Восточной Азии (98-99% совпадений). Сайт расщепления гемагглютинина штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 имеет структуру RSSR/GLF, что позволяет охарактеризовать вирус как потенциально низковирулентный.

Таким образом, на основании серологических и молекулярно-биологических исследований установлена принадлежность штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H9N2.

Пример 2.

Для использования штаммов вируса в качестве контрольных штаммов при заражении в целях контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, а также для использования в качестве диагностического и производственного необходимо получить штамм вируса с высокой инфекционной активностью. Для определения инфекционной активности из вирусного материала готовили ряд десятикратных последовательных разведений (от 10^-1 до 10^-10). Каждое разведение вируса инокулировали в аллантоисную полость четырем 10-суточным СПФ-куриным эмбрионам (КЭ) в объеме 0,2 см³. Четырем эмбрионам контрольной группы вводили ФБР тем же способом в объеме 0,2 см³. Специфичность гибели подтверждали в реакции гемагглютинирующей активности (РГА) исследованием экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) от каждого зараженного эмбриона. Титр вируса в образце определяли по методу Кербера и выражали в единицах ЭИД₅₀/см (таблица 3).

Таким образом, инфекционная (in vivo) активность штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц при 10-кратном титровании в СПФ-КЭ составила 10,13 lg ЭИД₅₀/см³.

Пример 3.

Для использования штамма для контроля антигенной и иммуногенной активности, а так же для приготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н9 необходимо получить штамм, свободный от контаминации чужеродными вирусами, бактериями и грибами. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Метод контроля стерильности». Отсутствие контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV, том 1, с. 1201-1222.

В результате исследований установлено, что штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами. В результате испытаний с применением методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) было установлено, что штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц не контаминирован вирусами ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК), инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), реовирусом птиц и содержит в своем составе только геном вируса гриппа птиц типа А подтипа H9N2.

Пример 4.

Изучали патогенные свойства штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц на цыплятах 40-суточного возраста. В опыте использовали птицу яичного кросса. Штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц вводили цыплятам внутримышечно в объеме 1,0 см³ с инфекционной активностью 10⁷ ЭИД₅₀/см³. В результате эксперимента характерных клинических признаков заболевания (угнетенное состояние, взъерошенность оперения, отказ от корма и т.д.) у цыплят не наблюдалось, гибели зараженной птицы не было отмечено.

Таким образом, штамм A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц является низковирулентным.

Пример 5.

Для получения иммунных сывороток крови к штамму A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 приготовили вакцину. Для изготовления вакцины использовали адъювант Montanide ISA 70 (SEPPIC, Франция). Для приготовления антигена использовали экстраэмбриональную жидкость зараженных СПФ-КЭ с инфекционной активностью 10,13 ЭИД₅₀/см³, при этом гемагглютинирующая активность составляла значение 6 log₂. Для инактивации инфекционных свойств вируса гриппа птиц использовали бета-пропиолактон (БПЛ). Для этого из исходного раствора БПЛ готовили рабочий 10%-ный раствор на стерильной деминерализованной воде. В сосуд с вируссодержащей жидкостью вносили рабочий раствор БПЛ до конечной концентрации 0,05%. Сосуд с содержимым инкубировали при температуре (18-26)°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании на шейкере. После окончания процесса инактивации вирусный материал помещали в бытовой холодильник (4-8)°С, предварительно из сосуда отбирали пробу материала в объеме 5,0 см³ для проведения исследований по определению полноты инактивации вируса и стерильности материала. После подтверждения полноты инактивации готовили серию лабораторного образца вакцины. Для этого смешивали 30 частей антигена с заданными характеристиками и 70 частей адъюванта. Эмульсию получали на гомогенизаторе 3000 об/мин. Провели иммунизацию цыплят 40-суточного возраста внутримышечно в прививном объеме 1,0 см³ на голову. На 14 и 28 сутки после вакцинации у иммунизированных птиц отбирали кровь и исследовали на наличие специфических антител к вирусу гриппа птиц типа А подтипа Н9 в ИФА и РТГА (таблица 4, 5).

Результаты исследований свидетельствуют о выраженной антигенной активности лабораторного образца вакцины на основе штамма A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2 вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа Н9, т.к. установлено наличие специфических антител к вирусу гриппа типа А в ИФА и антигемагглютининов к вирусу гриппа подтипа H9N2.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа Н9 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н9»:

1. Каверин Н.В., Львов Д.К., Щелканов М.Ю. / Ортомиксовирусы. Руководство по вирусологии. - М.: МИА, 2013. С. 307-313.

2. Низкопатогенный грипп птиц, вызванный вирусом подтипа Н9. Обзор литературы. / Варкентин А.В., Волков М.С., Ирза В.Н. - В.: Труды федерального центра охраны здоровья животных, 2014, Т. 12 (1). С. 41-53.

3. Antigenic Cartography of Н9 Avian Influenza Virus and Its Application to Vaccine Selection/ Y. Wang, I. Davidson, R. Fouchier, E. Spackman - Avian Diseases, 2015. Vol. 60(1s). - P. 218-225.

4. Avian Influenza Virus. Springer Protocols / E. Spackman - L.: Methods in Molecular Biology, 2014. Vol. 1161. - P. 425.

5. A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA Tong SX, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DAA, et al., 2012. V 109. P. 4269-4274.

6. A Global Perspective on H9N2 Avian Influenza Virus / T. P. Peacock, J. James, J. E. Sealy and M. Iqbal. - Viruses, 2019. Vol. 11. - P. 620- 628.

7. A novel genotype H9N2 influenza virus possessing human H5N1 internal genomes has been circulating in poultry in eastern China since 1998 / Zhang P., Tang Y., Liu X.. - J. Virol, 2009. Vol. 83. - P. 8428-8438.

8. Evolution and Molecular Epidemiology of H9N2 Influenza A Viruses from Quail in Southern China, 2000 to 2005./ K. M. Xu, K. S. Li, G. J. D. Smith, J. W. Li, H. Tai, J. X. Zhang, R. G. Webster, J. S. M. Peiris, H. Chen and Y. Guan. - Journal of Virology, 2007/ Vol. 81(6), p. 2635-2645.

9. Evolution of H9N2 avian influenza virus in embryonated chicken eggs with or without homologous vaccine antibodies./ Jin H., Wang W., Yang X., Su H., Fan J., Zhu R., Wang S., Shi H., Liu X. - Veterinary Research, 2018. Vol. 14 (71). P. 2-11.

10. Genetic characterization of HA gene of low pathogenic H9N2 influenza viruses isolated in Israel during 2006-2012 periods / I. Shkoda, N. Golender, [et al.]. - Virus Genes, 2013. Vol. 46. - P. 255-263.

11. Genome sequencing and phylogenetic analysis of three avian influenza H9N2 subtypes in Guangxi / Xie Z., Dong J., Tang X., [et al.]. - Virol. Sin. 2009. Vol. 24. - P. 2985-2988.

12. Genotypic evolution and epidemiological characteristics of H9N2 influenza virus in Shandong Province, China./ Li Y., Liu M., Sun Q., Zhang H., Zhang H., Jiang S., Liu S., Huang Y. - Poultry Science, 2019. Vol. 98(9), P. 3288-3495.

13. Infection with avian influenza viruses / OIE. Terrestrial Animal Health Code, 2019. Chapter 10.4. - URL: https://www.oie.int/standard-setting/terrestrial-code/access-online.

14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals / OIE. Avian influenza (infection with avian influenza viruses), 2018. Chapter 3.3.4. URL: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pdf

15. New World Bats Harbor Diverse Influenza A Viruses./ Suxiang Tong, Xueyong Zhu, Yan Li, Mang Shi, Jing Zhang,et al. PLoS Pathog., 2013 V 9(10), P. 1-12.

16. Phylogenetic analysis of influenza A viruses of H9 haemagglutinin subtype / Banks J., Speidel E.C., Harris P.A., Alexander D.J. - Avian Pathol., 2000. Vol. 29. - P. 353-360.

17. Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa, and Australasia, 2002-2006 / Alexander D.J. - Avian Diseases, 2007. Vol. 51. - P. 161-166.

18. The PA Subunit of the Influenza Virus Polymerase Complex Affects Replication and Airborne Transmission of the H9N2 Subtype Avian Influenza Virus. /Mengchan Hao, Shaojie Han, Dan Meng, Rong Li, Jing Lin, Meng Wang, Tong Zhou and Tongjie Ch.. -Viruses., 2019 V 11(1), P. 2-12.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Federal Governmental Budgetary Institution «Federal Center for Animal Health» (FGBI « ARRIAH»)

<120> Штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza А virus подтипа Н9 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н9

<160> 2

<210> 1

<211> 273

<212> РНК

<213> вирус гриппа птиц

<400> 1

AATCTAATAG CTCCATGGTA TGGATACATT CTTTCAGGAA AGAGCCATGG CAGAATTCTG 60

AAGACTGATT TAAAAAGGGG TAGCTGCACA GTGCAATGTC AGACAGAGAA AGGTGGCTTA 120

AACACAACAC TGCCATTCCA AAATGTAAGT AAGTATGCAT TTGGAAACTG CTCAAAATAC 180

ATTGGCATAA AGAGTCTCAA ACTTGCAGTT GGTCTGAGGA ATGTGCCTTC TAGATCTAGT 240

AGAGGACTAT TCGGGGCCAT AGCAGGGTTT ATA 273

<210> 2

<211> 91

<212> ПРТ

<213> вирус гриппа птиц

<400> 2

Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly Tyr Ile Leu Ser Gly Lys Ser 15

His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr 30

Val Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro 45

Phe Gln Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr 60

Ile Gly Ile Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val 75

Pro Ser Arg Ser Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 90

Ile 91

<---

Штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2, сем. Orthomyxoviridae, род Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа Н9, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» под регистрационным номером: №113 - деп / 19-3 - КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н9.